Abstract
Exosomen sind kleine Vesikel mit einer Größe von 30 nm bis 100 nm, das sowohl konstitutiv und nach Stimulation aus einer Vielzahl von Zelltypen freigesetzt werden. Sie sind in einer Reihe von biologischen Flüssigkeiten gefunden und sind dafür bekannt, eine Vielzahl von Proteinen, Lipiden und Nukleinsäuremoleküle tragen. Anfangs angenommen, dass etwas mehr als Reservoire für Zelltrümmer werden die Rollen der Exosomen Regel biologischen Prozessen und bei Erkrankungen mehr geschätzt.
Es wurden mehrere Verfahren zum Isolieren von Exosomen aus Zellkulturmedien und biologischen Flüssigkeiten beschrieben. Aufgrund ihrer geringen Größe und Dichte, Differenz Ultrazentrifugation und / oder Ultrafiltration sind die am häufigsten verwendeten Techniken zum exosome Isolation. Ein Plasma aus HIV-1-infizierten Individuen enthalten jedoch beide Exosomen und HIV-Viruspartikel, die eine ähnliche Größe und Dichte. Somit effiziente Trennung der Exosomen aus HIV-Viruspartikeln in menschlichem Plasma wurdeeine Herausforderung.
Um diese Einschränkung zu beheben, eine Prozedur aus Cantin et modifizierten entwickelten wir. al., 2008, für die Reinigung von Exosomen aus HIV-Partikeln in menschlichem Plasma. Iodixanol Geschwindigkeitsgradienten wurden verwendet, um Exosomen aus HIV-1-Partikeln in dem Plasma von HIV-1-positiven Individuen zu trennen. Viruspartikel wurden durch p24 ELISA identifiziert. Exosomen wurden auf der Basis von Exosom Marker Acetylcholinesterase (AChE) und das CD9, CD63 und CD45-Antigene identifiziert. Unsere Gradienten Verfahren ergab Exosom Präparate frei von Viruspartikeln. Die effiziente Reinigung von Exosomen aus menschlichem Plasma ermöglichte es uns, den Gehalt an Plasma abgeleiteten Exosomen untersucht und ihre immunmodulatorische Potential und andere biologische Funktionen zu untersuchen.
Introduction
Die HIV-1-Epidemie weiterhin einen erheblichen Einfluss in der ganzen Welt haben. Ab 2013 wurden etwa 35 Millionen Menschen weltweit mit HIV leben und 2,1 Millionen von ihnen waren neu infizierten Personen 1. Präventionsstrategien und den Zugang zu antiretroviralen Therapie waren hilfreich bei der Verringerung der Gesamtübernahme von HIV. Allerdings sind einzelne Bevölkerungsgruppen weiterhin auftritt steigt in den Erwerb von HIV 1. Somit gibt es eine fortlaufende Bemühungen, diese Epidemie.
Einer der stärksten Prädiktoren HIV Fortschreiten der Krankheit ist eine chronische Immunaktivierung (CIA) 2-10. Durch anhaltend hohe nachweisbare Zytokine und erhöhte Expression Marker auf der Oberfläche von T-Lymphozyten definiert, CIA, um zurückzuführen: i) kontinuierliche dendritischen Zell Produktion von Typ-I-IFN 11; (ii) direkte Immunaktivierung durch HIV-Proteine Tat, Nef und gp120 12 angetrieben wird; (iii) Translokation von bakteriellen Proteinen in darmassoziierten Immunzellen 6. Der genaue Mechanismus (en) zugrunde liegende chronische, systemische Immunaktivierung bei HIV-Infektion bleibt jedoch vollständig aufgeklärt werden.
Unsere Arbeitsgruppe und andere haben eine Rolle von Exosomen in HIV Pathogenese 15-18 demonstriert. Unsere Arbeitsgruppe hat festgestellt, dass das Nef-Protein wird aus infizierten Zellen in Exosomen 15 ausgeschieden und exosomalen Nef (exNef) im Plasma von HIV-infizierten Personen in Nanogramm Stufen 18 vorhanden ist. Wir haben gezeigt, dass Bystander-CD4 + T-Zellen, um exNef ausgesetzt Folge aktivierungsinduzierten Zelltod abhängig von dem CXCR4-Weg 19, 20 gezeigt ist. Alternativ wurden die Monozyten / Makrophagen refraktär exNef induzierte Apoptose, aber zeigte veränderte zelluläre Funktionen und die Zytokinexpression. Aus dem Plasma von HIV-infizierten Personen isoliert jüngster Zeit hat unsere Gruppe gezeigt Exosomen enthalten eine Vielzahl von pro-inflammatorischen Zytokinen. Fuitere naive periphere mononukleäre Blutzellen von Plasma abgeleiteten Exosomen aus HIV-infizierten Patienten induzierte Expression von CD38 auf naiven und Zentralspeicher CD4 + und CD8 + T-Zellen ausgesetzt werden. Dies trägt wahrscheinlich systemische Entzündungen und Virusvermehrung durch Bystander-Zellaktivierung 21, und schlägt vor, Exosomen spielen eine bedeutende Rolle bei der HIV-Pathogenese.
Bei der Untersuchung der Rolle von Exosomen bei HIV-Pathogenese, ist eine Herausforderung, der Entwicklung von Techniken zur effizienten separaten Exosomen von HIV-Partikel unter Beibehaltung der exosomalen Inhalten sowie deren funktionale immunmodulatorische Fähigkeit. Es wurden mehrere Verfahren zum Isolieren von Exosomen aus Zellkultur und biologischen Flüssigkeiten 22,23 beschrieben. Aufgrund ihrer geringen Größe und Dichte (Exosomen schweben in einer Dichte von 1,15 bis 1,19 g / ml), Differenz Ultrazentrifugation und / oder Ultrafiltration sind die am häufigsten verwendeten Techniken zum exosome Isolation 23.HIV-infizierten Zellkulturüberständen und Patientenplasma enthalten jedoch beide Exosomen und HIV-1-Viruspartikel. Exosomen und HIV-1-Partikel sind in Größe und Dichte sehr ähnlich. Alternativ, unter Ausnutzung der Expression der eindeutige exosomalen Marker wie CD63, CD45 und CD81, Exosomen isoliert wurden mit Immunaffinitäts-Abscheideverfahren 23. Dieses Verfahren kann Virus von Exosomen trennen. Ist der Nachteil dieser Technik jedoch die dichte Befestigung von Antikörpern gegen die gereinigte Exosomen, die mit der Beurteilung der immunmodulatorischen Potenzial der Exosomen in Kultur stören könnten.
Um diese Einschränkungen zu begegnen, ein Verfahren zur Reinigung von Exosomen aus HIV-Partikeln in menschlichem Plasma von Cantin modifiziert und Mitarbeiter 22 unter Verwendung Iodixanol Geschwindigkeitsgradienten entwickelten wir. Exosomen wurden gefunden, um in der von geringer Dichte zu trennen / oberen Fraktionen von Iodixanol Gradienten, während Viruspartikel im Hoch- getrenntDichte / Unterfraktionen. Viruspartikel wurden durch p24 ELISA identifiziert und wurden unter Verwendung von Exosomen exosome Marker AChE, CD9, CD63 und CD45 identifiziert. Die oberen niedriger Dichte Fraktionen gesammelt enthaltenen Exosomen, die negativ für HIV-1 p24-Kontaminierung waren. Die effiziente Reinigung und Trennung von Exosomen aus HIV-Partikeln in menschlichem Plasma ermöglicht eine genaue Prüfung des Inhalts der Exosomen aus Humanplasma, sowie die Untersuchung ihrer immunmodulatorischen Potential und der diagnostischen und prognostischen Wert der Exosomen in HIV-1 Pathogenese abgeleitet.
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Protocol
Ein allgemeines Diagramm der Exosom Isolierungs- und Reinigungsverfahren ist in Abbildung 1 zur Verfügung gestellt. Das Vollblut wurde von gesunden freiwilligen Spendern und von HIV-positiven Personen, die nicht die antiretrovirale theraoy Teilnahme an der Hoffnung Klinik der Emory University und der ansteckenden Krankheit-Programm von Grady Health System erhalten in Atlanta, Georgia. Diese Studie wurde von der Ethikgremien von Emory University und Morehouse School of Medicine genehmigt. Alle an der Studie beteiligten Personen gaben eine schriftliche und informierte Zustimmung.
1. Herstellung von Exosomen aus Blutplasma
- Menschliches Blut Erhebung und Verarbeitung
- Sammeln von 10 ml peripherem Blut durch Venenpunktion in EDTA-Blutsammelröhrchen (enthaltend 18 mg Kalium-EDTA) und vorsichtig umgedreht fünfmal zu mischen.
- Zentrifugieren Blutentnahmeröhrchen bei 1.000 xg für 20 min bei RT pelletiert Blutkörperchen. Verwenden Sie eine sterile Pipettete, die Plasmafraktion (4-5 ml) in einen 25 ml konischen Röhrchen übertragen. Verdünnen des Plasmas mit 10 ml 1 X PBS. Entsorgen Blutzellen (rote Blutkörperchen und weiße Blutkörperchen, die auch als PBMC bekannt) in einem entsprechend gekennzeichneten Behälter für biohazard Abfälle.
HINWEIS: Im Fall von nicht-infizierten Spenders Blutproben kann die PBMC für die weitere Verwendung (siehe Verfahren IV.2, unten) reserviert werden. - Speichern die Plasmaproben bei 4 ° C für kurzfristige (2-3 Tage) oder bei -80 ° C zur Langzeitspeicherung.
HINWEIS: Bringen Sie keine gefrorenen Plasmaproben bis 4 ° C vor der weiteren Verarbeitung.
- Herstellung von Exosom Fraktion aus Plasma
- Zentrifuge Plasma bei 10.000 × g für 30 min bei 4 ° C, um Zelltrümmer zu entfernen. Verwenden Sie eine sterile serologische Pipette, um das bereinigte Plasmaüberstand in ein sauberes 25 ml Ultrazentrifugenröhrchen übertragen. Entsorgen Sie das Pellet in dem Behälter für biologischen.
- Zentrifugieren Sie die gelöscht Plasma bei 100.000 × g für 2h bei 4 ° C, um große Vesikel zu entfernen. Entfernen Sie die 100.000 xg Überstand vorsichtig mit einer Pipette, und entsorgen in biohazard Abfälle. Resuspendieren 100.000 xg Pellet in 1 ml 1X PBS in ein sauberes Röhrchen und Inkubation bei RT für 30 Minuten, wirbeln leicht zu lösen und getrennte Teilchen.
- Durch Zugabe von 25 ml PBS waschen Sie die suspendierten 100.000 xg Exosom / Viruspellet. Vorsichtig umdrehen das Rohr fünf Mal zu mischen, dann zentrifugieren wieder bei 100.000 × g für 2 Stunden bei 4 ° C. Entsorgen Sie die PBS-Waschlösung in der biohazard Abfallbehälter.
- Resuspendieren 100.000 xg Pellet in 1 ml 1 X PBS und Inkubation bei RT für 30 min vorsichtiges Schwenken zu lösen und das Pellet.
HINWEIS: Wenn es nicht möglich ist, direkt mit dem Iodixanol Gradientenstufe für 1-2 Tage bis zur Iodixanol Gradientenstufe fortzufahren, speichern das Pellet, das Exosomen und Viruspartikel, bei 4 ° C.
2. Reinigung von Exosomen
- Generieren Sie 6% -18% velockeit Steigungen Iodixanol mit einem Zweikammer-Gradientenformer Gerät.
- Vorzubereiten 6% und 18% Lösungen der Iodixanol-Reagenz in Form einer 60% igen Lösung in Wasser, durch Verdünnung in PBS zugeführt. Pipette 5,5 ml der 18% igen Lösung in die gerührte Kammer und Pipette 5,5 ml einer 6% Lösung in die Reservoirkammer. Schalten Sie den Rührer, öffnen Sie den Wasserhahn und ermöglichen jedem Gradienten in eine 14 ml Ultrazentrifugenröhrchen fließen.
HINWEIS: Verwenden Sie entweder sofort oder bereit Gradienten O / N lagern bei 4 ° C vor der Verwendung. - Sorgfältig Schicht 1 ml der Exosom / Viruslösung auf die Oberseite jeder 11 ml Gradienten. Zentrifuge Gradienten bei 250.000 × g für 2 Stunden bei 4 ° C unter Verwendung eines SW40Ti Schwenkbecherrotor.
- Beschriften Sie zwölf (12) 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Entfernen Sie 1,0 ml von der Spitze des Gradienten und Transfer zum Rohr # 1. Übertragen Sie die verbleibenden 1 ml-Fraktionen in Röhrchen 2-12 der Reihe nach.
HINWEIS: Die oberste Fraktion wird daher sein, # 1, die Sumpffraktion, # 12. StErz die Gradientenfraktionen bei 4 ° C. Die gereinigten Exosomen, die in den Fraktionen 1-3 an der Oberseite des Gradienten sein sollten, sind für 3-4 Wochen bei Lagerung bei 4 ° C gelagert.
- Vorzubereiten 6% und 18% Lösungen der Iodixanol-Reagenz in Form einer 60% igen Lösung in Wasser, durch Verdünnung in PBS zugeführt. Pipette 5,5 ml der 18% igen Lösung in die gerührte Kammer und Pipette 5,5 ml einer 6% Lösung in die Reservoirkammer. Schalten Sie den Rührer, öffnen Sie den Wasserhahn und ermöglichen jedem Gradienten in eine 14 ml Ultrazentrifugenröhrchen fließen.
3. Exosom Charakterisierung
- Acetylcholinesterase (AChE) Aktivitätstest
- Bereiten 100 mM Substrat Lager durch Mischen Acetylthiocholiniodid 28,9 mg in 1 ml 1X PBS. Shop Substrat Lager bei -20 ° C bis zu 1 Monat.
- Bereiten Sie 10 mM Farbindikator Lager durch Mischen von Benzoesäure 39.6mg und Natriumbicarbonat 15 mg in 10 ml 1X PBS. Shop Farbindikator Lager bei 4 ° C bis zu zwei Wochen.
- Vorbereitung Assayreagenz durch Mischen von 1X PBS, das Substrat und Farbindikator in einem Verhältnis von 100: 2: 5 (zum Beispiel 10 ml 1X PBS + 200 & mgr; l Substrat + 500 ul Farbindikator).
- Dann werden 50 & mgr; l von jedem 1,5 ml Gradientenfraktion Rohr (markiert 1-12 von Verfahren III.3) in die Vertiefungen einer 96-well microtiter Platte. Bereiten Sie zwei Vertiefungen für jeden Gradienten Probe.
- Bereiten Sie eine Reihe von Standards, indem zuerst eine 2000 & mgr; U / ml Schmerz Stock in PBS. Machen elf (11) 2-fach serielle Verdünnungen von diesem Lager, und fügen Sie 50 ul jeder Verdünnung auf eine einzelne Vertiefung einer Mikrotiterplatte, so dass Standard # 1 = 2,000 & mgr; U / ml, # 2 = 1000 & mgr; U / ml, # 3 = 500 & mgr; U / ml, usw. bis # 12 = 0,98 & mgr; U / ml. Die zwölf AchE Standards wird somit zu besetzen eine einzige Reihe von einem 96-Loch-Testplatte.
- Mit 200 ul Assay-Reagenz-Gemisch in jede Vertiefung und inkubiere 20 min (im Dunkeln) bei RT für die Entwicklung des gefärbten Reaktionsproduktes zu ermöglichen. Messen AChE-Aktivität bei einer Wellenlänge von 450 nm unter Verwendung eines Fluoreszenzmikroplattenlesegerät.
HINWEIS: Der Prozentsatz an beginnend nach exosome Reinigung verbleibende Material wird durch AchE Assay der fraktionierten Plasma bewertet.
- Immunblot-Analyse
- Separate Proteine in Gradientenfraktionen 1-12 (von Procedure 2.1.3) durch SDS-PAGE auf 4-20% Tris-HCl Fertiggelen bei 100 V x 1 Std. Transferproteine in dem Gel auf eine Nitrocellulosemembran unter Verwendung eines elektro Blotting Übertragungszelle nach den Anweisungen des Herstellers. Lassen Sie die Überweisungen für 12-16 h (O / N) bei 350V auslöschen.
- Entfernen Sie die Membran von der Blotapparatur und waschen in Tris-gepufferte Kochsalzlösung (TBS) für 5 min. Block mit 5% fettfreier Milch in TTBS (TBS mit 0,1% Tween 20) für 1 h bei RT durch Schütteln.
- Inkubieren der Membran mit für Exosomen (CD9, CD45, CD63) oder HIV-1-Capsid-Protein (p24) Primärantikörper in 5% fettfreier Milch unter Schütteln bei 4 ° C für 12-16 h (O / N). Verdünnungen Primärantikörper für Immunoblots von 1: 2,000 -1: 5000.
- Waschen des Blots in TTBS für 20 Minuten, gefolgt von Inkubation mit einer 1: 2000-Verdünnung von Meerrettich-Peroxidase (HRP) -konjugiertem Anti-IgG (sekundärer Antikörper), in 5% fettfreier Milch für 1 h bei RT. 3 mal mit TTBS, 10 min pro Waschgang waschen Sie den Fleck.
- Speichern Sie die Bilder als TIFF-Dateien, die in Adobe Photoshop angezeigt werden kann. Führen Densitometrie-Analyse von Bands mit ImageJ Software (National Institutes of Health, Bethesda, MD).
- Zytokin-Assay
- Vor der Zytokin-Assay stören Immunkomplexe, die normalerweise im menschlichen Plasma vorhanden durch Säuredissoziation sind und lysieren die Exosomen von Detergens-Behandlung. Assay beide Ausgangsplasmaproben und gereinigt Exosom Zubereitungen.
- Zu 100 ul humanem Plasma mit 100 & mgr; l 0,33 N HCl und bei 37 ° C für 1 Stunde. 100 l 0,33 N NaOH auf Säure behandelte Plasma neutralisieren. Hinzufügen Triton X-100, um sowohl das neutralisierte und gereinigte Plasma exosome Proben auf eine fiEndkonzentration von 1%, um die Lyse der Exosomen verursachen.
- Für diesen Assay (eine fluoreszierende Kügelchen-basierte Verfahren), Nutzung magnetische Kügelchen mit Antikörpern vom Hersteller vorbeschichtet. Verwenden Sie eine maßgeschneiderte Gruppe von Anti-Human-Zytokin-Antikörper-beschichteten Kügelchen; in Tabelle 1 aufgelistet. vortexen Antikörper-beschichteten magnetischen Perlen aus der Zytokin-Assay-Kit für 30 sec und 50 & mgr; l Kügelchen zu jeder Vertiefung einer 96-Well-Platte in dem Assay verwendet werden.
- Bereiten Sie eine Verdünnungsreihe von Standards in der Plasma-Standardpuffer (beide in der Zytokin-Assay-Kit enthalten ist), wie in der Gebrauchsanleitung für die Zytokin-Assay-Kit beschrieben, um eine 8-Punkt-Standardkurve zu erzeugen.
- Fügen Sie 150 ul 1X Waschpuffer (aus Kit) in jede Vertiefung und Waschen der Kügelchen mit einem magnetischen Kügelchen Scheibe, wie in der Anleitung beschrieben. In 25 ul Plasma-Assay-Puffer (aus Kit) in jede Vertiefung. Hinzufügen von 25 ul Standards und Proben für alle in dem Test verwendet Vertiefungen. Werden 25 ul PlasmaProbenpuffer, um Negativkontrollen. Siegel und schütteln Sie die Platte bei 700 Upm für 60 min bei RT inkubieren O / N bei 4 ° C.
- Fügen Sie 150 ul 1X Waschpuffer in jede Vertiefung und waschen Sie die Platte (wie in Schritt 3.3.4, oben). In 25 ul Nachweis-Antikörper in jede Vertiefung, Dichtung und schütteln Platte bei 700 Upm für 30 min bei RT. Wiederholen Sie den Waschschritt.
- In 50 ul Streptavidin-Lösung (SAPE von kit) in jede Vertiefung, Dichtung und schütteln Platte bei 700 Upm für 30 min bei RT. Wiederholen Sie die Platte wäscht wie in 3.3.4.
- Fügen Sie 120 ul der Lesepuffer (aus Kit) in jede Vertiefung und schütteln auf einem Labortischschüttler bei 700 Upm für 5 min bei RT, damit das Fluoreszenzsignal zu entwickeln. Lesen Platte auf dem Plattenlesegerät gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- Um für den Betrag von Exosomen während des Isolierungsverfahrens verloren Konto, verwenden Sie die folgende Gleichung: [(Originallese / Plasmavolumen) x 66,6 = eingestellt Zytokin Lesung].
- Vor der Zytokin-Assay stören Immunkomplexe, die normalerweise im menschlichen Plasma vorhanden durch Säuredissoziation sind und lysieren die Exosomen von Detergens-Behandlung. Assay beide Ausgangsplasmaproben und gereinigt Exosom Zubereitungen.
4. Assay zur Immunmodulatorische Potential
- Vorbereitung des Kulturmediums mit Exosom verarmten fötales Rinderserum
- Zentrifuge 500 ml fötales Rinderserum (FBS) bei 100.000 · g für 20 h bei 4 ° C pelletiert kontaminierenden Exosomen und Mikrovesikel. Entfernen Sie vorsichtig und speichern Sie die Exosom verarmten FBS Stand. Entsorgen Sie das Pellet in der biohazard Abfälle.
- Mähdrescher 20% der Exosom abgereicherte FBS Überstand mit 500 ml Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) Medium. Filtern das Medium durch einen 0,45 um-Membranfilter.
- Hinzufügen Streptomycin (100 U / ml), Penicillin (100 U / ml), L-Glutamin (2 mM), HEPES-gepufferter Kochsalzlösung (10 & mgr; M) und IL-2 (20 U / ml) zu dem filtrierten Medium.
- Zellkultur und Exosom Exposure
- Aussetzen Exosomen Spender periphere mononukleäre Blutzellen (PBMC) von gesunden Freiwilligen erhalten Klinik. Suspend PBMC invorbereitet Kulturmedium und zählen Sie die Zellen unter Verwendung eines Zell / Partikelzähler (nach Standardverfahren des Herstellers).
HINWEIS: Die PBMC werden in der oben beschriebenen Plasmapräparat erhalten (Schritt 1.2). - Verwendung von vorbereiteten Mediums aus Verfahren 4.1.3, Co-Kultur 3,0 x 10 6 (PBMC) mit 1 ug / ml des gepoolten Exosomen aus drei (3) HIV-1-seropositiven oder von drei (3) HIV-1-seronegativen Individuen in einer Gesamt Volumen von 1 ml in die Vertiefungen einer 12-Well-Kulturplatte (mit Deckel). Kulturen Inkubieren für 48 Stunden bei 37 ° C.
- Vorbereitung unbehandelten PBMC Kulturen und Kulturen, die mit Concanavalin A behandelt (Con A; 5 ug / ml), um als Negativ- und Positivkontrollen zu dienen, jeweils wie vorstehend beschrieben (4.2.2) beschrieben. Alle PBMC-Kulturen für 48 Stunden bei 37 ° C.
- Unmittelbar vor dem Ernten der Zellen Verdünnungen der folgenden Fluorochrom konjugierten monoklonalen Antikörpern: Alexa Fluor 700-markiertem anti-CD3 (1: 400 Verdünnung), allophycocyanin (APC) / Cyanin 7 (Cy7) -markiertem anti-CD4 (1: 400), Peridinin-Chlorophyll-Protein-Komplex-markierten anti-CD4 (1: 400), V450-markiertem anti-CD8 (1: 400), Biotin- markierten anti-CD45RA (1: 1.000), Phycoerythrin (PE) / Cy7-markierten Anti-CD62L (1: 1000), PE / Cyanin 5 (Cy5) -markierten anti-CD38 (1: 200), PE-Texas Red- markierte Anti-Streptavidin (1: 2.000) und PE / Cy5-markierten Maus IgG1k Isotypkontrolle (1: 200).
- Nach 48 Stunden Inkubationszeit ernten die PBMC. Wasch PBMC in PBS auf Exosomen für 1 h mit einzelnen Fluorochrom-markierten Antikörper zu entfernen und färben die Zellen durch Inkubation bei 4 ° C. Analysieren die gefärbten PBMC mittels Durchflusszytometrie auf die Expression von Chemokinen zu quantifizieren (wie beschrieben 21).
- Aussetzen Exosomen Spender periphere mononukleäre Blutzellen (PBMC) von gesunden Freiwilligen erhalten Klinik. Suspend PBMC invorbereitet Kulturmedium und zählen Sie die Zellen unter Verwendung eines Zell / Partikelzähler (nach Standardverfahren des Herstellers).
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Representative Results
Exosomen sind effizient von HIV-1-positive Humanplasma gereinigt. Isolated Exosomen von Acetylcholinesterase (AChE) Aktivität identifiziert, getrennt in geringerer Dichte Fraktionen 1-3 an der Spitze der Iodixanol Gradienten, während Viruspartikel, die von HIV-1-Antigen p24 identifiziert , getrennt in den höheren Dichte Fraktionen (10-12, in der Nähe der Unterseite). Die Anwesenheit von Exosomen wurde durch Immunoblot Identifizierung exosome Marker AChE, CD9, CD45 und CD63, sowie durch Elektronenmikroskopie (Abbildung 2) bestätigt.
Proinflammatorische Zytokine und Chemokine mit assoziierter und in der Exosomen von HIV-1-seropositiven Individuen signifikant erhöht. Gereinigtes Exosomen und unfraktioniertem Plasma-HIV-1-infizierten und HIV-1 seronegativen Individuen wurden 21 Zytokinen / Chemokinen durch Multiplex-Assay analysiert. Alle 21 Zytokine / Chemokines wurden in Exosomen von HIV-1-positiven Personen getrennt erfasst. Außerdem wurden ihre Niveaus signifikant im Vergleich zu Plasma- und Exosomen aus HIV-1 seronegativen Kontrollen (Tabelle 1) erhöht.
CD38-Expression auf der Oberfläche von Zellen, Exosomen aus HIV-1-seropositiven Individuen ausgesetzt erhöht. PBMCs von uninfizierten menschlichen Spendern wurden für 48 h auf gepoolt Exosomen aus HIV-1-seropositiven oder seronegativen Individuen ausgesetzt und für die Stufen des Aktivierungsmarkers CD38 auf beurteilt CD4 + und CD8 + T-Zellen durch Durchflusszytometrie. Wir beobachteten, daß von 48 Stunden nach der Exposition, CD38 Expression auf der Oberfläche von naiven als Zentralspeicher CD4 + und CD8 + T-Zellen wurden in T-Zellen, um Exosomen aus HIV-1-positiven Individuen im Vergleich zu HIV-negative exosome Behandlung und unbehandeltem ausgesetzt signifikant erhöhte steuert (Figur 3).
Abbildung 1. Schematische Darstellung der Exosom Isolation von HIV-1-positive Humanplasma. (A) 10 ml peripheres Blut wurde von HIV-1-seronegativen Individuen seropositve und gesammelt. (B) EDTA-Blutsammelröhrchen wurden bei 1.000 xg für 20 min bei RT zentrifugiert. (C) abgetrennte Plasma wurde in 50 ml konischen Röhrchen überführt und verdünnt ½ mit 1x PBS und (D) zentrifugiert 10.000 xg für 30 min. (E) Der Überstand wurde überführt, um Rohre Ultrazentrifuge und (F) bei 10.000 × g für 2 Stunden zentrifugiert. (G, H) Der Überstand wurde verworfen und das Pellet exosome resuspendiert und in 1 ml 1 × PBS gewaschen. (I) Nach der Zentrifugation wurde der Überstand verworfen und in 1 ml 1 × PBS das Pellet resuspendiert und auf 6-18% Iodixanol Geschwindigkeitsgradienten und (J) bei 250.000 · g für 2 Stunden zentrifugiert, überschichtet. (K) Nach der Zentrifugation wird 1 ml-Fraktionen von oben nach unten des Gradienten wurden tra1,5-ml-Röhrchen nsferred und AChE Inhalt und Immunoblot-Analyse analysiert. (L) Die Fraktionen 2 und 3 wurden dann vereinigt und mit 4 ml 1X PBS und (M) bei 400.000 · g für 2 Stunden zentrifugiert verdünnt. (N) Nach der Zentrifugation wurde der Überstand verworfen und das Pellet in 1 ml 1X PBS für die Analyse von pro-inflammatorischen Zytokins und Chemokinexpression resuspendiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2 Exosomen effizient aus menschlichem Plasma gereinigt. Einzelne Iodixanol Geschwindigkeitsgradienten Fraktionen aus HIV-seropositiven oder seronegativen Individuen wurden auf (A) Enzymassay auf Acetylcholinesterase (AChE) und (B) Western-Blot-Analyse für exosomalen Marker CD9, CD unterworfen45 und CD63 und virale Protein p24 und waren (C) mit Anti-CD63 immunmarkiert und mit Elektronenmikroskopie untersucht die Herstellung von gereinigtem Exosomen (C) zu bestätigen. (Abbildung von Konadu et al, 2014 21, mit freundlicher Genehmigung verwendet). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3 Assay für immunmodulatorische Potential. PBMCs von HIV-1-seronegativen Personen wurden entweder gesammelt Exosomen aus Plasma von HIV-1-seropositiven (HIV + Exo) oder seronegativ ausgesetzt (HIV-Exo) Individuen, unbehandelt oder behandelt mit 5 ug / ml Concanavalin A (Con A) als eine positive Kontrolle. Nach 48 Stunden Exposition, Naïve (CD45RA + / CD62L +), Zentralverriegelung (TCM; CD45RA- / CD62L +) und Effektorzellen (TEM; CD45RA- / CD62L-) Speicher CD4 + und CD8 + T-Zellen wurden für CD38-Expression mittels Durchflusszytometrie analysiert. Exosom-Konzentration wurde durch Gesamtprotein normalisiert, und bei 1 & mgr; g / ml zugegeben. Fehlerbalken stellen Mittelwert +/- SEM aus sechs unabhängigen Gebern. Unterschied zwischen den Gruppen wurden für die statistische Signifikanz von der One Way ANOVA-Test getestet. * P <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001, **** p <0,0001. (Abbildung von Konadu et al, 2014 21, mit Genehmigung verwendet). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Tabelle 1. Analyse von gereinigtem Exosomen und Vollplasma von HIV-1-seropositiven und seronegativen Individuen für proinflammatorische Zytokin und Chemokin-Expression. * P <0,05, ** p <0,01 *** p <0,001, **** p <0,0001. (Abbildung von Konadu et al, 2014 21, mit freundlicher Genehmigung verwendet). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Chronische Immunaktivierung (CIA) und CD4 + T-Zell-Depletion sind zwei wichtige Merkmale von HIV-1-Infektion. Sie wurden als Prädiktoren für die Pathogenese etabliert, mit der CIA, der beste Prädiktor. Doch die zugrunde liegenden Mechanismen der Fahrt chronische systemische Immunaktivierung und CD4 + T-Zell-Rückgang immer noch nicht vollständig geklärt. Wir und andere Labors haben schlüssige Beweise entwickelt, dass Exosomen von HIV-1 infizierten Zellen sezerniert spielen eine Rolle in beiden Markenzeichen.
Die anhaltende Interesse an der Komposition und Funktion der extrazellulären Vesikeln wurde in der Veröffentlichung von verschiedenen Verfahren zur Isolierung von Exosom sowohl Zellkulturmedien und biologischen Flüssigkeiten 24-26 geführt. Es wurde jedoch ein Hindernis für die Untersuchung der Rolle von Exosomen in HIV-1 Pathogenese von HIV-1-Partikeln war die effiziente Trennung der Exosomen und gleichzeitig die Fähigkeit, sowohl exosome Inhalt und funktionelle Aktivität zu untersuchen. Wir haben eine proto entwickeltcol zur Reinigung von Exosomen aus HIV-1-Partikeln in menschlichem Plasma unter Verwendung Iodixanol Geschwindigkeitsgradienten. Die HIV-positiven Spendern in dieser Studie verwendet hatte eine antiretrovirale Behandlung und die Plasmaproben auf diesen Experimenten enthielt 1500 bis 400.000 Viruspartikel / ml mit einem Durchschnitt von 206.000 Viruspartikel / ml 21 verwendet werden, nicht empfangen werden. Somit zeigen wir, dass Exosomen im Plasma von HIV-1 infizierten Individuen wirksam von HIV-1-Viruspartikel abgetrennt werden, selbst wenn die Virenbelastungen hoch sind. Obwohl eine ähnliche Größe und Dichte, in der mit niedriger Dichte / oberen Fraktionen der Iodixanol Gradienten getrennt Exosomen verglichen, um virale Teilchen, die in der hochdichten / unteren Fraktionen getrennt. Die von der Iodixanol Gradienten-Verfahren hergestellt Exosomen sind hoch gereinigt und frei von verunreinigenden extrazellulären Proteinen. Die Reinheit des isolierten Exosomen Population wurde mit p24-ELISA und Western-Blot-Analyse auf HIV-1 p24 Capsid-Protein bestätigtals auch Western-Analyse für exosomalen Marker, AChE, CD9, CD45 und CD63. Verwendung dieser Marker ist konsistent mit kürzlich veröffentlichten Richtlinien exosome Identifikations 27.
Mehrere physiologisch relevanten Immunaktivierung wurden die gereinigten Exosomen aus HIV-1 infizierten Individuen gefunden Cytokine / Chemokine bei deutlich höheren Konzentrationen als Exosomen aus HIV-1 seronegativen Kontrollen enthalten. Außerdem Exosomen aus HIV-1 infizierten Individuen biologisch aktiv waren, zeigt die Fähigkeit, erhöhte Mengen des Aktivierungsmarker CD38 zu induzieren, an der Oberfläche des vorbehandelten und Zentralspeicher CD4 + und CD8 + T-Zellen. Zusammengenommen deuten diese Daten einen Mechanismus, der anhaltende Immunaktivierung während der HIV-Infektion fahren konnte.
Die Ergebnisse konnten wir mit unserem Exosom Reinigungsverfahren, die differentielle Zentrifugation und Iodixanol Geschwindigkeitsgradienten Trennung zeigen den Wert vereint zu erhaltender Verwendung von hochgereinigten Exosomen aus physiologischen und funktionellen Bioassays. Das Verfahren hat bestimmte Fallstricke und Grenzen. Eine beträchtliche Menge der Exosomen, häufig ein Großteil des Ausgangsmaterials, wie durch Messung der AChE-Aktivität ermittelt, während des Verfahrens verloren. Darüber hinaus ist das Verfahren auch zeitaufwendig und erfordert den Zugriff auf teure Ausrüstung. Schließlich wird die Erzeugung der Iodixanol-Gradienten unter Verwendung des Gradienten Fromer Vorrichtung erfordert beträchtliche Praxis, um die Reproduzierbarkeit zu gewährleisten. Ein alternatives Verfahren zur Erzeugung Gradienten könnte darin bestehen, eine abgestufte Reihe von Iodixanol Lösungen, gefolgt von der sorgfältigen Schichtung der Lösungen in Zentrifugenröhrchen und Inkubieren O / N herzustellen, damit die Gradienten zu bilden. Wir haben jedoch diese Alternative nicht getestet.
Die zur Isolierung und Trennung von Exosomen im menschlichen Plasma hier beschriebenen HIV-1-Partikeln Experimentalprotokoll ist eine effektive Methode, um die Reinheit sicherzustellen, exosomes. Die Verwendung dieses Verfahrens wurde auf spannende Möglichkeiten für zukünftige Anfrage bezüglich der Rolle von Exosomen in HIV-1-Pathogenese geführt und könnte ebenso in Anfragen für andere biologische Prozesse verwendet werden.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Vacutainer EDTA tubes (10ml) | Becton Dickinson | 368589 | pink top tubes |
| Lymphoprep Ficoll reagent | Cosmo Bio | AXS-1114545 | |
| Optiprep iodixanol reagent | Sigma | D1556 | |
| 14ml ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 344060 | ultraclear tubes |
| Gradient Former Model 485 | BIO-RAD | 165-4120 | |
| Acetylthiocholine iodide | Sigma | 1480 | |
| Benzoic Acid | Sigma | D8130 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Acetyl Cholinesterase | Sigma | C3389 | |
| 96-well clear microtiter plate | Medical Supply Partners | TR5003 | |
| SpectraMax 190 microplate reader | Molecular Devices | 190 | Fluorescent plate reader |
| Criterion Gel Electrophoresis Cell | BIO-RAD | 165-6001 | |
| Transblot Gel | BIO-RAD | 170-3910 | |
| Transfer Cell | |||
| Tris-HCl Criterion precast gels | BIO-RAD | 567-1093 | |
| Anti-CD45 antibody | Abcam | Ab10558 | |
| CD63 Antibody (H-193) | Santa Cruz Biotech, Inc. | SC-15363 | |
| CD9 Antibody (H-110) | Santa Cruz Biotech, Inc. | SC-9148 | |
| Rabbit pAb p24 HIV-1 | ImmunoDX, LLC | 1303 | |
| Nitrocellulose membrane | BIO-RAD | G1472430 | |
| Tris Buffered Saline | BIO-RAD | 170-6435 | |
| HRP-conjugated IgG (H+L) secondary antibody | Thermo Scientific | 31460 | Goat-Anti-Rabbit |
| HRP-conjugated IgG (H+L) secondary antibody | Thermo Scientific | 31430 | Goat-Anti-Mouse |
| Western Blotting Luminol Reagent | Santa Cruz Biotech, Inc. | SC-2048 | |
| GE LAS-4010 Imager | GE Healthcare | LAS-4010 | |
| Human Procarta Cytokine Immunoassay Kit | Affymetrix | N/A | Custom immunoassay panel |
| Bio-Plex 200 Immunobead Reader | BIO-RAD | 171-000201 | |
| Coulter Z2 Particle Counter | Beckman Coulter | 383552 | Cell counter |
| Alexa Fluor 700-labeled anti-CD3 | BD Bioscience (UCHT1) | 300424 | |
| APC/Cy7-labeled anti-CD4 | Biolegend (OKT4) | 317418 | |
| PerCP-labeled anti-CD4 | BD Bioscience (RPA-T8) | 550631 | |
| V450-labeled anti-CD8 | BD Bioscience (RPA-T8) | 560347 | |
| Biotin-labeled anti-CD45RA | BD Bioscience (HI100) | 555487 | |
| PE/Cy7-labeled anti-CD62L | Biolegend (DREG-56) | 304822 | |
| PE/Cy5-labeled anti-CD38 | Biolegend (HIT2) | 303508 | |
| APC/Cy7-labeled anti-HLADR | Biolegend (L243) | 307618 | |
| PE-Texas Red-labeled anti-streptavidin | BD Bioscience | 551487 | |
| PE/Cy5-labeled mouse IgG1K | Biolegend (MOPC-21) | 400116 | |
| APC/Cy7-labeled mouse IgG2aK | Biolegend (MOPC-173) | 400229 |
References
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