Abstract
Экзосомы небольшие пузырьки размером от 30 до 100 нм, которые выпускаются как конститутивно и после стимуляции из различных типов клеток. Их можно найти в ряде биологических жидкостей и, как известно, несут различные белки, липиды и молекул нуклеиновых кислот. Первоначально думали, чтобы быть немного больше, чем резервуары для сотовой мусора, роли регулирующих экзосом биологические процессы и в более заболеваний оценены.
Некоторые методы были описаны для выделения экзосомы из сотовой медиакультуры и биологических жидкостях. Из-за их небольшого размера и низкой плотности, дифференциального центрифугирования и / или ультрафильтрации являются наиболее часто используемые методы для выделения экзосома. Тем не менее, в плазме ВИЧ-1 инфицированных содержит как экзосомы и вирусные частицы ВИЧ, которые похожи по размеру и плотности. Таким образом, эффективность разделения экзосом от ВИЧ вирусных частиц в плазме крови человека былвызов.
Для решения это ограничение, мы разработали процедуру модифицированную Cantin др. др., 2008 для очистки экзосом из частиц ВИЧ в плазме крови человека. Градиенты скорости иодиксанола были использованы для разделения экзосомы из ВИЧ-1 частиц в плазме ВИЧ-1-инфицированных. Вирусные частицы были идентифицированы р24 ELISA. Экзосомы были определены на основе маркеров экзосома ацетилхолинэстеразы (АХЭ), и антигенов CD9, CD63, CD45 и. Наша процедура градиент дали экзосома препараты, свободные от вирусных частиц. Эффективная очистка экзосом из человеческой плазмы позволило нам изучить содержание плазмы крови экзосом и исследовать их иммунную модулирующее потенциал и другие биологические функции.
Introduction
Эпидемия ВИЧ-1 по-прежнему имеет значительное влияние во всем мире. В 2013, примерно в 35 миллионов человек по всему миру, живущих с ВИЧ, и 2,1 млн из них были вновь инфицированных 1. Превентивные стратегии и расширение доступа к антиретровирусной терапии, было полезно в сокращении общего заражения ВИЧ. Тем не менее, отдельные группы населения по-прежнему испытывает подъемы в приобретении ВИЧ 1. Таким образом, существует необходимость в постоянных усилиях по борьбе с этой эпидемией.
Один из самых сильных предсказателей прогрессирования ВИЧ-инфекции является хроническая иммунная активация (ЦРУ) 2-10. Определено упорно высоких уровнях обнаруживаемых цитокинов и повышенных маркеров экспрессии на поверхности Т-лимфоцитов, ЦРУ было обусловлено: I) непрерывной дендритных клеток типа I IFN 11; (II) прямое иммунная активация обусловлен белков ВИЧ Tat, Nef и gp120 12; (III) Транслокация бактериальных белков в кишечнике связаны иммунных клеток 6. Тем не менее, точный механизм (ы), лежащий в основе хронической, системная активация иммунной ВИЧ-инфекции в еще предстоит в полной мере выяснены.
Наша исследовательская группа и др продемонстрировали роль в патогенезе экзосом ВИЧ 15-18. Наша группа установила, что белок Nef выводится из инфицированных клеток в экзосом 15, и exosomal Неф (exNef) присутствует в плазме ВИЧ-инфицированных лиц на уровне нг 18. Мы показали, что прохожего CD4 + Т-клетки подвергаются exNef привело активации индуцированной клеточной гибели, зависящей от CXCR4 пути 19, 20. Кроме того, моноцитов / макрофагов были резистентны к exNef-индуцированного апоптоза, но выставлены измененные клеточные функции и экспрессии цитокинов. Совсем недавно, наша группа, показанные экзосомы, выделенные из плазмы ВИЧ-инфицированных содержат множество провоспалительных цитокинов. Марихуанаrther, наивные одноядерные клетки периферической крови подвергаются плазмы крови экзосом от ВИЧ-инфицированных пациентов, вызванных выражение CD38 на клетках наивно и центральной памяти CD4 + и CD8 + Т. Это, вероятно, способствует системного воспаления и размножения вирусов через активацию 21 наблюдателем клеток, и предполагает, что экзосомы играют важную роль в патогенезе ВИЧ.
При исследовании роли экзосом в патогенезе ВИЧ-инфекции, одной из проблем является разработка методов эффективного отдельных экзосомы из частиц ВИЧ, сохраняя при этом содержание exosomal а также их функциональная иммунная способность модуляторный. Несколько методов были описаны для выделения экзосомы из культуры клеток и биологических жидкостях 22,23. Из-за их малого размера и низкой плотности (экзосомы плавать при плотности 1,15 - 1,19 г / мл), дифференциальное ультрацентрифугирования и / или ультрафильтрации являются наиболее часто используемые методы для изоляции экзосома 23.Тем не менее, ВИЧ-инфицированные клетки и культуральные супернатанты плазмы пациентов содержать как экзосомы и ВИЧ-1 вирусные частицы. Экзосомы и ВИЧ-1 частицы очень похожи по размеру и плотности. Кроме того, пользуясь выражением уникальных exosomal маркеров, таких как CD63, CD45, CD81 и, экзосомы были выделены с использованием методов улавливания иммуноаффинная 23. Эта процедура может отделить от вируса экзосом. Тем не менее, недостатком этого метода является жесткой привязанности антител к очищенных экзосом, которые могут помешать оценке иммуномодулирующим потенциалом экзосом в культуре.
Для преодоления этих ограничений, мы разработали процедуру очистки экзосом из частиц ВИЧ в плазме крови человека модифицированных с Cantin и коллегами, используя 22 градиентов скорости Иодиксанол. Экзосомы найдено отделить в низкой плотности / верхний фракции иодиксанола градиентов, тогда как вирусные частицы отделены в высоко-плотность / нижние фракции. Вирусные частицы были определены р24 ELISA и экзосомы были определены с использованием маркеров экзосома боль, CD9, CD63, CD45 и. Верхние фракции низкой плотности, собранные содержится экзосомы которые были отрицательными для заражения ВИЧ-1 р24. Эффективное очищение и разделение экзосом из частиц ВИЧ в плазме крови человека позволяет точно рассмотрении содержания экзосомы, полученных из человеческой плазмы, а также при исследовании их иммунной модулирующего потенциала и диагностическое и прогностическое значение экзосом в ВИЧ-1 патогенезе.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Общая схема процедуры выделения экзосом и очистки обеспечивается на рисунке 1. Цельная кровь была получена от здоровых доноров-добровольцев и у ВИЧ-инфицированных лиц, не получающих антиретровирусную theraoy лечащего Надежда клиника Университета Эмори и инфекционный программу заболевание системы здравоохранения Грейди в Атланте, штат Джорджия. Это исследование было одобрено институциональных наблюдательных советов Университета Эмори и Морхаус в Школе медицины. Все лица, участвующие в исследовании, дали письменное информированное согласие и.
1. Подготовка экзосомы из плазмы крови
- Человек забор крови и обработки
- Сбор 10 мл периферической крови из вены в пробирок ЭДТА крови (содержащей 18 мг калия EDTA), и осторожно инвертируют в пять раз перемешать.
- Центрифуга трубки забора крови при 1000 х г в течение 20 мин при комнатной температуре, чтобы осадить клетки крови. Используйте стерильную пипеткуте передавать фракции плазмы (4-5 мл) в 25 мл коническую пробирку. Развести плазму с 10 мл 1 X PBS. Откажитесь клетки крови (эритроциты и лейкоциты, также известные как РВМС) в соответствующим образом маркированы контейнер для биологически опасных отходов.
ПРИМЕЧАНИЕ: В случае незараженных образцов донорской крови, РВМС могут быть зарезервированы для дальнейшего использования (см процедуру IV.2, ниже). - Храните образцы плазмы при температуре 4 ° С за короткий срок (2-3 дня) или при -80 ° С на более длительный срок хранения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Принесите любые замороженные образцы плазмы до 4 ° С перед дальнейшей обработкой.
- Подготовка экзосома фракции из плазмы
- Центрифуга плазмы при 10000 х г в течение 30 мин при 4 ° С для удаления остатков клеток. Использование стерильного серологические пипетки для передачи очищенной плазмы супернатант в 25 мл чистой ультрацентрифужную пробирку. Откажитесь от гранул в контейнер для биологически опасных.
- Центрифуга очищенную плазму при 100000 х г в течение 2ч при 4 ° С для удаления крупных пузырьков. Снимите 100000 XG супернатант тщательно с помощью пипетки, и выбросить в биологической отходов. Ресуспендируют осадок 100000 х г в 1 мл PBS в 1X чистую пробирку и инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин, осторожно вращая, чтобы сместить и отдельные частицы.
- Вымойте приостановлено 100000 XG экзосом / вирусов гранул путем добавления 25 мл PBS. Аккуратно инвертировать трубу на пять раз, чтобы смешать, затем центрифуги снова при 100000 х г в течение 2 ч при 4 ° С. Откажитесь от моющего раствора PBS в контейнер для биологически опасных отходов.
- Ресуспендируют осадок 100000 х г в 1 мл PBS 1 X и инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин закрученного аккуратно, чтобы сместить и растворить осадок.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если это не возможно, чтобы приступить непосредственно к градиент шага Иодиксанол, хранить осадок, содержащий экзосомы и вирусные частицы, при 4 ° С в течение 1-2 дней, пока на стадии иодиксанол градиента.
2. Очистка экзосомы
- Создание 6% -18% VELOCности градиенты иодиксанола использованием двухкамерного градиента бывшего аппарата.
- Подготовка 6% и 18% растворы в Иодиксанол реагента, поставляемые в виде 60% раствора в воде, путем разбавления в PBS. Внесите 5,5 мл 18% -ного раствора в камеру перемешивали и пипетки 5,5 мл 6% раствора в резервуар камеры. Включите мешалкой, открыть кран и позволяют каждому градиент стечь в 14 мл ультрацентрифужную пробирку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Либо использовать сразу или хранить подготовленные градиенты O / N при 4 ° С до использования. - Тщательно слой 1 мл экзосом / раствора вируса на верхней части каждой 11 мл с градиентом. Центрифуга градиентов 250000 х г в течение 2 ч при 4 ° С, используя SW40Ti Бакет ротора.
- Добавьте двенадцать (12) 1.5 мл микроцентрифужных трубки. Удалить 1,0 мл из верхней части градиента, и передать трубки # 1. Перенесите оставшиеся 1мл фракции в пробирки 2-12 в последовательном порядке.
Примечание: Самый верхний фракции таким образом, будет # 1, в нижней фракции, # 12. УлицаРуды градиентные фракции при 4 ° С. Очищенные экзосомы, которые должны быть во фракциях 1-3 в верхней части градиента, стабильны в течение 3-4 недель при хранении при 4 ° С.
- Подготовка 6% и 18% растворы в Иодиксанол реагента, поставляемые в виде 60% раствора в воде, путем разбавления в PBS. Внесите 5,5 мл 18% -ного раствора в камеру перемешивали и пипетки 5,5 мл 6% раствора в резервуар камеры. Включите мешалкой, открыть кран и позволяют каждому градиент стечь в 14 мл ультрацентрифужную пробирку.
3. Характеристика экзосома
- Ацетилхолинэстераза (АХЭ) Анализ активность
- Подготовьте 100 мМ субстрата запас путем смешивания ацетилтиохолиниодида 28,9 мг в 1 мл PBS 1X. Магазин субстрат акций при -20 ° C до 1 месяца.
- Подготовьте 10 мм, цвет индикатора запаса путем смешивания бензойная кислота 39.6mg и бикарбонат натрия 15 мг в 10 мл 1X PBS. Магазин цвет индикатора фондового при 4 ° С до двух недель.
- Подготовка анализа реагента путем смешивания 1X PBS, подложки, и цветовой индикатор в соотношении 100: 2: 5 (например, 10 мл 1X PBS + 200 мкл субстрата + 500 мкл цветовой индикатор).
- Передача 50 мкл из каждой 1,5 мл фракции градиента трубы (обозначено 1-12, от процедуры III.3) в лунки microtite 96-луночногог пластина. Подготовка дубликатов скважин для каждого образца градиента.
- Подготовьте набор стандартов, сначала делая мкЕд / мл AChE акции 2000 в PBS. Сделать одиннадцати (11) 2-кратных серийных разведений этого запаса и добавить 50 мкл каждого разбавления в отдельную лунку микротитрационного планшета, так, чтобы стандарт # 1 = 2000 мкЕд / мл, # 2 = 1,000 мкЕд / мл, # 3 = 500 мкЕд / мл и т.д. до # 12 = 0,98 мкЕд / мл. Стандарты двенадцать АХЭ, таким образом, занимают одну строку в планшет для анализа 96-а.
- Добавить 200 мкл смеси реагентов для анализа в каждую лунку и инкубируют 20 мин (в темноте) при комнатной температуре, чтобы позволить развитие цветной продукта реакции. Измерить активность AChE на длине волны 450 нм с использованием флуоресцентного микропланшет-ридера.
Примечание: Процент исходного материала, остающегося после очистки экзосома оценивается АХЭ анализе по нефракционированного плазмы.
- Иммуноблот анализ
- Отдельные белки в градиентных фракций 1-12 (из ProcedЮр 2.1.3) с помощью SDS-PAGE на 4-20% Трис-HCl сборных гелей при 100 х 1 ч. Передача белков в геле на нитроцеллюлозную мембрану с использованием электрооптического блоттинга клеточного переноса в соответствии с инструкциями изготовителя. Разрешить переводы, чтобы уничтожить в течение 12-16 ч (O / N) на 350В.
- Удалить мембрану из промокательной аппарата и промыть в Трис-солевом буфере (TBS) в течение 5 мин. Блок 5% обезжиренного молока в TBS TTBS (0,1% Tween 20) в течение 1 ч при встряхивании при комнатной температуре.
- Инкубируйте мембрану с первичными антителами, специфичными к экзосомы (CD9, CD45, CD63) или ВИЧ-1 капсидного белка (P24) в 5% обезжиренного молока при встряхивании при 4 ° С в течение 12-16 ч (O / N). Растворы первичных антител для иммуноблоттинга в диапазоне от 1: 2000 -1: 5000.
- Промыть блот в TTBS в течение 20 мин с последующей инкубацией с разведении 1: 2000 пероксидазой хрена (HRP) с анти-IgG (вторичного антитела), в 5% обезжиренного молока в течение 1 часа при комнатной температуре. Вымойте блот 3 раза TTBS, 10 мин на промывку.
- Сохранение изображений в формате TIFF, как файлы, которые можно просматривать в Adobe Photoshop. Выполните денситометрии анализ с использованием ImageJ полос программное обеспечение (Национальные Институты Здоровья, Bethesda, MD).
- Анализ цитокинов
- До цитокинов анализа, нарушить иммунных комплексов, которые обычно присутствуют в человеческой плазме диссоциации кислоты и лизировать экзосомы от детергентом. Анализ оба исходных образцов плазмы и очищенные препараты экзосома.
- К 100 мкл человеческой плазмы 100 мкл 0,33 N HCl и инкубировать при 37 ° С в течение 1 часа. Добавить 100 мкл 0,33 N NaOH, чтобы нейтрализовать кислоты обрабатывают плазмой. Добавить к обеим нейтрализованный плазме и очищенный экзосома образцы Triton X-100, к Интернетнал концентрация 1%, чтобы вызвать лизис экзосом.
- Для этого теста (флуоресцентный процедуры шарик на основе), использовать магнитные шарики предварительно покрыты антителами производителем. Используйте специально разработанный панель покрытых антителами бисером антигуманных цитокинов; приведены в таблице 1. вихре покрытых антителами магнитных шариков из набора для анализа цитокинов в течение 30 сек и добавляют 50 мкл бисер в каждую лунку 96-луночного планшета для использования в анализе.
- Подготовьте серию разведений стандартов в стандартной плазмы буфера (оба содержатся в наборе цитокинов анализа), как описано в руководстве по эксплуатации набора для анализа цитокинов, чтобы генерировать стандартную кривую 8-точечное.
- Добавить 150 мкл промывочного буфера 1X (из комплекта) в каждую лунку и мыть бисером, используя магнитную шайбу шарик, как описано в руководстве. Добавить 25 мкл буфера для анализа плазмы (от комплекта) в каждую лунку. Добавить 25 мкл стандартов и образцов для всех скважин, используемых в анализе. Добавить 25 мкл плазмыОбразец буфера негативных скважин управления. Печать и встряхните пластину на 700 оборотов в минуту в течение 60 мин при комнатной температуре и инкубировать O / N при 4 ° С.
- Добавить 150 мкл промывочного буфера 1X в каждую лунку и мыть плиту (как в шаге 3.3.4, выше). Добавить 25 мкл антител обнаружения в каждую лунку, печать и встряхните пластину на 700 оборотов в минуту в течение 30 мин при комнатной температуре. Повторите этап промывки.
- Добавить 50 мкл стрептавидин раствора (SAPE, из комплекта) в каждую лунку, печать и встряхните пластину на 700 оборотов в минуту в течение 30 мин при комнатной температуре. Повторите плита моет как в 3.3.4.
- Добавить 120 мкл буфера для чтения (с комплектом) в каждую лунку и встряхивают в лабораторном шейкере при настольной 700 оборотов в минуту в течение 5 мин при комнатной температуре, чтобы позволить флуоресцентный сигнал для разработки. Читайте пластину на ридере в соответствии с указаниями изготовителя.
- Для того, чтобы счет на сумму экзосом потерянных во время процедуры изоляции, использовать следующее уравнение: [(оригинал чтения / объем плазмы) х 66,6 = регулируется чтения цитокинов].
- До цитокинов анализа, нарушить иммунных комплексов, которые обычно присутствуют в человеческой плазме диссоциации кислоты и лизировать экзосомы от детергентом. Анализ оба исходных образцов плазмы и очищенные препараты экзосома.
4. Анализ на иммуномодулирующего потенциала
- Приготовление питательной среды с экзосома-обедненного фетальной бычьей сыворотки
- Центрифуга 500 мл фетальной бычьей сыворотки (FBS) при 100000 х г в течение 20 ч при 4 ° С для осаждения загрязняющих экзосомы и микровезикулы. Осторожно снимите и сохраните экзосома обедненного FBS супернатант. Откажитесь от гранул в биологической отходов.
- Смешайте 20% от экзосома обедненного FBS супернатанта с 500 мл Roswell Park Memorial института 1640 (RPMI 1640) среде. Фильтры среды, через мембранный фильтр 0,45 мкм.
- Добавить стрептомицин (100 ед / мл), пенициллин (100 Ед / мл), L-глутамин (2 мМ), HEPES-солевом буферном растворе (10 мкм) и IL-2 (20 Е / мл) к фильтруемой среды.
- Культура клеток и экзосома экспозиции
- Expose экзосомы донорским мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС), полученных от здоровых добровольцев клиники. Приостановить РВМС вподготовлен культуральной среды и подсчет клеток с помощью счетчика клеток / частиц (по стандартной методике завода-изготовителя).
Примечание: РВМС получают в процессе подготовки плазмы, описанной выше (шаг 1.2). - Использование подготовленную среду от процедуры 4.1.3, совместно культуры 3.0 х 10 6 (РВМС) с 1 мкг / мл объединенных экзосом из трех (3) ВИЧ-1 серопозитивных или трех (3) ВИЧ-1 серонегативных лиц в общей объеме 1 мл в лунки планшета для культивирования 12-луночного (с крышкой). Инкубируйте культур в течение 48 ч при 37 ° С.
- Подготовка РВМС необработанных культурах и культурах, обработанных конканавалином A (Con A; 5 мкг / мл) в качестве отрицательного и положительного контроля, соответственно, как описано выше (4.2.2). Инкубируйте все культуры РВМС в течение 48 ч при 37 ° С.
- Непосредственно перед сбором клеток, подготовки разведений следующих флуорохромом конъюгированные моноклональные антитела: Alexa Fluor 700-меченого анти-CD3 (разведение 1: 400), allophycocyAnin (АРС) / цианин 7 (Cy7), меченным анти-CD4 (1: 400), перидинина хлорофилла белкового комплекса, меченного анти-CD4 (1: 400), V450-меченого анти-CD8 (1: 400), биотин меченными анти-CD45RA (1: 1000), фикоэритрин (РЕ) / Cy7 меченных анти-CD62L (1: 1000), ПЭ / цианин 5 (Су5), меченным анти-CD38 (1: 200), ПЭ-Техас красно меченными анти-стрептавидин (1: 2000), а ПЭ / Су5 меченных мыши IgG1k контрольного изотипа (1: 200).
- После 48 ч инкубации, собирать РВМС. Промыть РВМС в PBS, чтобы удалить экзосомы и окрашивают клетки инкубировали в течение 1 часа при 4 ° С с отдельными флуорохромом помечены антител. Анализ окрашенных РВМС с помощью проточной цитометрии для количественного выражения хемокинов (как описано 21).
- Expose экзосомы донорским мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС), полученных от здоровых добровольцев клиники. Приостановить РВМС вподготовлен культуральной среды и подсчет клеток с помощью счетчика клеток / частиц (по стандартной методике завода-изготовителя).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Экзосомы эффективно очищен от ВИЧ-1-инфицированных человеческой плазмы. Изоляты экзосомы, идентифицированные ацетилхолинэстеразы (AChE) активности, отделены в более низкую плотность фракций 1-3 в верхней части иодиксанола градиентов, тогда как вирусные частицы, которые были определены ВИЧ-1 антиген p24 , отделены в более высокой плотности фракций (10-12, в нижней). Наличие экзосом было дополнительно подтверждено идентификации иммуноблот экзосом маркеров АХЭ, CD9, CD45, CD63 и, так и электронной микроскопией (рисунок 2).
Провоспалительных цитокинов и хемокинов, связанные с повышенным и существенно в экзосомы ВИЧ-1 серопозитивных индивидуумов. Очищенные экзосомы и нефракционированного плазмы от инфицированных ВИЧ-1 и ВИЧ-серонегативных 1 особи были проанализированы на 21 цитокинов / хемокинов мультиплексной анализа. Все 21 цитокинов / химиоkines были обнаружены в экзосом, выделенных из ВИЧ-1-инфицированных лиц. Кроме того, их уровни были значительно повышены по сравнению с плазмой и экзосом из ВИЧ-1 серонегативных управления (таблица 1).
Экспрессия CD38 была увеличена на поверхности клеток, подвергшихся экзосом от ВИЧ-1 серопозитивных лиц. МНПК от неинфицированных людей-доноров были выставлены в течение 48 часов, чтобы объединенных экзосом от ВИЧ-1 серопозитивных или серонегативных лиц и оценивали уровни активации маркера CD38 на CD4 + и CD8 + Т-клетки через проточной цитометрии. Мы заметили, что на 48 часов после контакта, CD38 выражения на поверхности наивного и центральной памяти клетки CD4 + и CD8 + Т-были значительно повышены в Т-клетках, подвергнутых экзосом от ВИЧ-1-инфицированных лиц по сравнению с ВИЧ-отрицательным лечения экзосома и лечить управления (Рисунок 3).
Рисунок 1. Схематическое изображение изоляции экзосома от ВИЧ-1-инфицированных человеческой плазме. (А) 10 мл периферической крови брали из ВИЧ-1 seropositve и серонегативных индивидуумов. (B) сбора трубки ЭДТА крови центрифугировали при 1000 х г в течение 20 мин при комнатной температуре. (С) отделенную плазму переносили в 50 мл конические пробирки и разводили ½ с 1x PBS и (D) центрифугировали 10,000 мкг в течение 30 мин. (E) супернатант переносили в пробирки и Ультрацентрифуга (F) центрифугировали при 10000 х г в течение 2 ч. (G, H) Супернатант отбрасывали и осадок экзосом ресуспендировали и промывали в 1 мл PBS 1X. (I) После центрифугирования супернатант удаляли, а осадок повторно суспендировали в 1 мл PBS и 1x накладывается на 6-18% градиентом скорости иодиксанол и (J) центрифугировали при 250000 х г в течение 2 ч. (К) После центрифугирования 1 мл фракций из верхней части к нижней части градиента были TRAnsferred 1,5 мл пробирки и анализировали на содержание АХЭ и иммуноблот-анализа. (L) Фракции 2 и 3 были чем объединены и разбавлены 4 мл PBS и 1X (М) центрифугировали при 400000 х г в течение 2 ч. (N), После центрифугирования супернатант отбрасывали, а осадок ресуспендировали в 1 мл PBS 1X для анализа про-воспалительных цитокинов и хемокинов выражения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Экзосомы эффективно очищен из человеческой плазмы. Индивидуальный иодиксанола градиентом скорости фракций из ВИЧ-серопозитивных индивидуумов или серонегативных подвергали (А) ферментативного количественного анализа для ацетилхолинэстеразы (AChE), и (В) Вестерн-блот-анализа для exosomal маркеров CD9, CD45 и CD63 и вирусный белок р24 и были (С) immunolabeled с анти-CD63 и исследуют с электронной микроскопии, чтобы подтвердить получение очищенных экзосомах (С). (Рис с Konadu др 2014 21, используемого разрешения). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. Анализ на иммуномодулирующего потенциала. МНПК от ВИЧ-1 серонегативных лиц были подвержены либо объединенных экзосом из плазмы ВИЧ-1 серопозитивных (ВИЧ + Exo) или серонегативных (ВИЧ Exo) физические лица, не лечить, или лечить с 5 мкг / мл конканавалин А (Кон А) в качестве положительного контроля. Через 48 ч экспозиции, наивный (CD45RA + / CD62L +), Центральный (ТКМ; CD45RA- / CD62L +) и эффектов (ТЭМ; CD45RA- / CD62L-) Памяти CD4 + и CD8 + Т-клетки анализировали на экспрессию CD38 методом проточной цитометрии. Концентрация экзосома был нормированная общего белка и добавляют в 1 мкг / мл. Усы представляют среднее +/- SEM из шести независимых доноров. Разница между группами были проверены на статистическую значимость по One Way ANOVA тест. * Р <0,05, ** р <0,01, *** р <0,001, **** р <0,0001. (Рис с Konadu др 2014 21, используется с разрешения). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Таблица 1. Анализ очищенных экзосом и всей плазмы от ВИЧ-1 серопозитивных и серонегативных лиц для про-воспалительных цитокинов и хемокинов выражения. Р <0,05, ** р <0,01, *** р <0,001, **** р <0,0001. (Рис с Konadu др 2014 21, используемого разрешения). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Хронический активации иммунной (CIA) и истощение CD4 + Т-клеток являются двумя важными признаками инфекции ВИЧ-1. Они были созданы в качестве предсказателей для патогенеза, с ЦРУ является лучшим предиктором. Тем не менее, основные механизмы вождения хроническое системное иммунную активацию и CD4 + T клеток снижение до сих пор полностью не выяснены. Мы и другие лаборатории разработали убедительные доказательства, что экзосомы выделяемые из ВИЧ-1-инфицированных клеток играют роль в обоих признаков.
Продолжающийся интерес как состав и функции внеклеточного пузырьков привело к публикации различных методов выделения экзосома обеих культур клеток средств массовой информации и биологических жидкостях 24-26. Тем не менее, является препятствием для исследования роли экзосом в ВИЧ-1 патогенезе был эффективным разделение экзосом от ВИЧ-1 частиц, сохраняя способность расследовать как содержание экзосома и функциональную активность. Мы разработали протоCol для очистки экзосом от ВИЧ-1 частиц в плазме человека, используя градиенты скорости иодиксанол. ВИЧ-положительные доноры, используемые в данном исследовании не получили антиретровирусную терапию и образцы плазмы, используемые для этих экспериментов, содержащихся от 1500 до 400000 вирусных частиц / мл в среднем 206.000 вирусных частиц / мл 21. Таким образом, мы показали, что экзосомы в плазме ВИЧ-1 инфицированных может быть эффективно отделена от ВИЧ-1 вирусных частиц, даже когда вирус нагрузки высока. Хотя похожи по размеру и плотности, экзосомы отделены в низкой плотности / верхних фракций Иодиксанол градиентов по сравнению с вирусными частицами, которые отделены в высокой плотности / нижние фракции. В экзосомы полученные способом иодиксанол градиента высокоочищенный и свободный от загрязняющих внеклеточных белков. Чистоту изолированной популяции экзосомы было подтверждено с помощью p24 ELISA, и вестерн-блот анализ ВИЧ-1 p24 капсидного белкаа также Западной анализа для exosomal маркеров, боль, CD9, CD45, CD63 и. Использование этих маркеров в соответствии с недавно опубликованным руководящих принципов для идентификации экзосома 27.
Более физиологически отношение к иммунной активации, очищенные от экзосомы ВИЧ-1-инфицированных лиц были обнаружены цитокины / хемокины при значительно более высоких концентрациях, чем экзосом из ВИЧ-1 серонегативных управления. Кроме того, экзосомы от инфицированных ВИЧ-1 индивидуумов были биологически активный, демонстрируя способность индуцировать увеличение уровней маркера активации CD38, на поверхности клеток наивным и центральной памяти CD4 + и CD8 + Т. В совокупности, эти данные свидетельствуют о том, что механизм может управлять постоянное иммунную активацию во время ВИЧ-инфекции.
Результаты мы смогли получить, используя нашу экзосома процесс очистки, который объединяет дифференциального центрифугирования и иодиксанол разделение градиент скорости показать значениеиспользования высокоочищенные экзосомы для физиологических и функциональных биопробы. Процедура имеет определенные просчеты и недостатки. Значительное количество из экзосомы, часто большинство исходного материала, рассчитанное измерений AChE активности, теряются во время процесса. Кроме того, процедура также занимает много времени и требует доступа к дорогостоящего оборудования. И, наконец, поколение иодиксанола градиентов с использованием градиента Фромер аппарат требует значительных практике для обеспечения воспроизводимости. Альтернативный способ градиентного поколения может быть подготовить серии градуированных иодиксанола решений, а затем тщательного наслоение растворов в центрифужные пробирки и инкубировали O / N, чтобы градиенты, чтобы сформировать. Тем не менее, мы не проверяли эту альтернативу.
Экспериментальный протокол, описанный здесь для выделения и разделения экзосом от ВИЧ-1 частиц в плазме крови человека является эффективным методом для обеспечения чистоты эксosomes. Использование этого метода привело к захватывающих направлений для будущего исследования о роли экзосом ВИЧ-1 и патогенеза может быть в равной степени используются в запросах для других биологических процессов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Vacutainer EDTA tubes (10ml) | Becton Dickinson | 368589 | pink top tubes |
| Lymphoprep Ficoll reagent | Cosmo Bio | AXS-1114545 | |
| Optiprep iodixanol reagent | Sigma | D1556 | |
| 14ml ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 344060 | ultraclear tubes |
| Gradient Former Model 485 | BIO-RAD | 165-4120 | |
| Acetylthiocholine iodide | Sigma | 1480 | |
| Benzoic Acid | Sigma | D8130 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Acetyl Cholinesterase | Sigma | C3389 | |
| 96-well clear microtiter plate | Medical Supply Partners | TR5003 | |
| SpectraMax 190 microplate reader | Molecular Devices | 190 | Fluorescent plate reader |
| Criterion Gel Electrophoresis Cell | BIO-RAD | 165-6001 | |
| Transblot Gel | BIO-RAD | 170-3910 | |
| Transfer Cell | |||
| Tris-HCl Criterion precast gels | BIO-RAD | 567-1093 | |
| Anti-CD45 antibody | Abcam | Ab10558 | |
| CD63 Antibody (H-193) | Santa Cruz Biotech, Inc. | SC-15363 | |
| CD9 Antibody (H-110) | Santa Cruz Biotech, Inc. | SC-9148 | |
| Rabbit pAb p24 HIV-1 | ImmunoDX, LLC | 1303 | |
| Nitrocellulose membrane | BIO-RAD | G1472430 | |
| Tris Buffered Saline | BIO-RAD | 170-6435 | |
| HRP-conjugated IgG (H+L) secondary antibody | Thermo Scientific | 31460 | Goat-Anti-Rabbit |
| HRP-conjugated IgG (H+L) secondary antibody | Thermo Scientific | 31430 | Goat-Anti-Mouse |
| Western Blotting Luminol Reagent | Santa Cruz Biotech, Inc. | SC-2048 | |
| GE LAS-4010 Imager | GE Healthcare | LAS-4010 | |
| Human Procarta Cytokine Immunoassay Kit | Affymetrix | N/A | Custom immunoassay panel |
| Bio-Plex 200 Immunobead Reader | BIO-RAD | 171-000201 | |
| Coulter Z2 Particle Counter | Beckman Coulter | 383552 | Cell counter |
| Alexa Fluor 700-labeled anti-CD3 | BD Bioscience (UCHT1) | 300424 | |
| APC/Cy7-labeled anti-CD4 | Biolegend (OKT4) | 317418 | |
| PerCP-labeled anti-CD4 | BD Bioscience (RPA-T8) | 550631 | |
| V450-labeled anti-CD8 | BD Bioscience (RPA-T8) | 560347 | |
| Biotin-labeled anti-CD45RA | BD Bioscience (HI100) | 555487 | |
| PE/Cy7-labeled anti-CD62L | Biolegend (DREG-56) | 304822 | |
| PE/Cy5-labeled anti-CD38 | Biolegend (HIT2) | 303508 | |
| APC/Cy7-labeled anti-HLADR | Biolegend (L243) | 307618 | |
| PE-Texas Red-labeled anti-streptavidin | BD Bioscience | 551487 | |
| PE/Cy5-labeled mouse IgG1K | Biolegend (MOPC-21) | 400116 | |
| APC/Cy7-labeled mouse IgG2aK | Biolegend (MOPC-173) | 400229 |
References
- Joint United Nations Programme on HIV/AIDS(UNAIDS). UNAIDS Report on the Global AIDS Epidemic. , Geneva Switzerland. (2013).
- Levacher, M., Hulstaert, F., Tallet, S., Ullery, S., Pocidalo, J. J., Bach, B. A. The significance of activation markers on CD8 lymphocytes in human immunodeficiency syndrome: staging and prognostic value. Clin Exp Immun. 90, 376-382 (1992).
- Giorgi, J. V., Liu, Z., Hultin, L. E., Cumberland, W. G., Hennessey, K., Detels, R. Elevated levels of CD38+ CD8+ T cells in HIV infection add to the prognostic value of low CD4+ T cell levels: results of 6 years of follow-up. The Los Angeles Center, Multicenter AIDS Cohort Study. J Acq Immun Def Synd. 6, 904-912 (1993).
- Bofill, M., et al. Increased numbers of primed activated CD8+CD38+CD45RO+ T cells predict the decline of CD4+ T cells in HIV-1-infected patients. AIDS. 10, 827-834 (1996).
- Liu, Z., Cumberland, W. G., Hultin, L. E., Prince, H. E., Detels, R., Giorgi, J. V. Elevated CD38 antigen expression on CD8+ T cells is a stronger marker for the risk of chronic HIV disease progression to AIDS and death in the Multicenter AIDS Cohort Study than CD4+ cell count, soluble immune activation markers, or combinations of HLA-DR and CD38 expression. J Acq Immun Def Synd. 16, 83-92 (1997).
- Douek, D. C., Roederer, M., Koup, R. A. Emerging concepts in the immunopathogenesis of AIDS. Annu Rev Med. 60, 471-484 (2009).
- Roberts, L., et al. Plasma cytokine levels during acute HIV-1 infection predict HIV disease progression. AIDS. 24, 819-831 (2010).
- Mueller, Y. M., et al. Interleukin-15 increases effector memory CD8+ T cells and NK Cells in simian immunodeficiency virus-infected macaques. J Virol. 79, 4877-4885 (2005).
- Picker, L. J., et al. IL-15 induces CD4 effector memory T cell production and tissue emigration in nonhuman primates. J Clin Invest. 116, 1514-1524 (2006).
- Mueller, Y. M., et al. IL-15 treatment during acute simian immunodeficiency virus (SIV) infection increases viral set point and accelerates disease progression despite the induction of stronger SIV-specific CD8+ T cell responses. J Immunol. 180, 350-360 (2008).
- O'Brien, M., Manches, O., Bhardwaj, N. Plasmacytoid dendritic cells in HIV infection. Adv Exp Med Biol. 762, 71-107 (2013).
- Chihara, T., et al. HIV-1 proteins preferentially activate anti-inflammatory M2-type macrophages. J Immunol. 188, 3620-3627 (2012).
- Johnstone, R. M., Adam, M., Hammond, J. R., Orr, L., Turbide, C. Vesicle formation during reticulocyte maturation. J Bio Chem. 262, 9412-9420 (1987).
- Meckes Jr, D. G., Raab-Traub, N. Microvesicles and viral infection. J. Virol. 85, 12844-12854 (2011).
- Campbell, T. D., Khan, M., Huang, M. B., Bond, V. C., Powell, M. D. HIV-1 Nef protein is secreted into vesicles that can fuse with target cells and virions. Ethn. Dis. 18 (2 Suppl 2), S2-S9 (2008).
- Muratori, C., et al. Massive Secretion by T Cells Is Caused by HIV Nef in Infected Cells and by Nef Transfer to Bystander Cells. Cell Host. Microbe. 6, 218-230 (2009).
- Lenassi, M., et al. HIV Nef is Secreted in Exosomes and Triggers Apoptosis in Bystander CD4 T Cells. Traffic. 11, 110-122 (2009).
- Raymond, A. D., et al. HIV Type 1 Nef Is Released from Infected Cells in CD45+ Microvesicles and Is Present in the Plasma of HIV-Infected Individuals. AIDS Res Hum Retrovir. 27, 167-178 (2011).
- James, C. O., Huang, M. B., Khan, M., Garcia-Barrio, M., Powell, M. D., Bond, V. C. Extracellular Nef Protein Targets CD4+ T Cells for Apoptosis by Interacting with CXCR4 Surface Receptors. Journal of Virology. 78, 3099-3109 (2004).
- Huang, M. B., Jin, L. L., James, C. O., Khan, M., Powell, M. D., Bond, V. C. Characterization of Nef-CXCR4 Interactions Important for Apoptosis Induction. Journal of Virology. 78, 11084-11096 (2004).
- Konadu, K. A., et al. Association of cytokines with exosomes in the plasma of HIV-1-seropositive individuals. Journal of Infectious Diseases. , (2014).
- Cantin, R., Diou, J., Belanger, D., Tremblay, A. M., Gilbert, C. Discrimination between exosomes and HIV-1: purification of both vesicles from cell-free supernatants. J Immunol Methods. 338, 21-30 (2008).
- Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. J Extracellular Vesicles. 2, 20360 (2013).
- Lässer, C., Eldh, M., Lötvall, J. Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes. J. Vis. Exp. (59), e3037 (2012).
- McDonald, M. K., Capasso, K. E., Ajit, S. K. Purification and microRNA Profiling of Exosomes Derived from Blood and Culture Media. J. Vis. Exp. (76), e50294 (2013).
- Kanchi Ravi, R., Khosroheidari, M., DiStefano, J. K. A Modified Precipitation Method to Isolate Urinary Exosomes. J. Vis. Exp. (95), e51158 (2015).
- Lötvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. J Extracell Vesicles. 3, 26913 (2014).
