Summary
Den föreslagna arbetet bedömer den diagnostiska potentialen direkt och förstärkt surface plasmon resonance imaging (SPRI) analyser, särskilt för detektion av rekombinant humant tillväxthormon i spetsiga humant serum, genom att jämföra SPRI resultat direkt med kommersiellt tillgänglig enzymkopplad immunosorbentanalys (ELISA) utrustning.
Abstract
Känsliga och selektiva metoder för upptäckt av humant tillväxthormon (hGH) över ett brett spektrum av koncentrationer (höga halter av 50-100 ng ml - 1 och miniminivåer för 0,03 ng ml - 1) i cirkulerande blodet är viktigt eftersom varierande nivåer kan visar förändrat fysiologi. Till exempel kan tillväxtrubbningar som förekommer i barndomen diagnostiseras genom att mäta nivåerna av hGH i blod. Även missbruk av rekombinant hGH inom idrotten utgör inte bara en etisk fråga det presenterar också allvarliga hälsorisker till förövaren. En populär strategi för att mäta hGH missbruk, förlitar sig på detektion av förhållandet mellan 22 kDa hGH totala hGH, som icke-22 kDa endogena nivåer tappar efter exogen rekombinant hGH (rhGH) administrering. Surface plasmon resonance imaging (SPRI) är ett analytiskt verktyg som möjliggör direkt (label-free) övervakning och visualisering av biomolekylära interaktioner genom att spela in förändringar i brytnings indfd anslutning till sensorytan i realtid. I motsats härtill den mest använda kolorimetrisk metod, enzymkopplad immunabsorberande analys (ELISA) använder enzymmärkta antikroppar detektions att indirekt mäta analytkoncentrationen efter tillsats av ett substrat, som inducerar en färgförändring. För att öka detektionskänslighet, använder förstärkt SPRI en sandwichanalys format och nära infraröda kvantprickar (QDs) för att öka signalstyrkan. Efter direkt SPRI detektion av rekombinant rhGH i spetsiga humant serum är spri signalen förstärks av sekventiell injektion av antikroppsdetektion belagd med nära infraröd QDs (Nano-SPRI). I denna studie, bedömdes den diagnostiska potentialen direkt och förstärkt SPRI för mätning av rhGH spetsade i humanserum och jämföras direkt med funktionerna i ett kommersiellt tillgängligt ELISA-kit.
Introduction
Humant tillväxthormon (hGH) är ett 191 aminosyrapeptid (22 kDa) som produceras av hypofysen och direkt släpps ut i blodomloppet. Interaktioner mellan hypotalamus peptiden tillväxthormonfrigörande hormon (GHRH) och somatotropin inducera pulserande utsöndringar av hGH. Som ett resultat, nivåer av hGH varierar från toppar i 50-100 ng / ml till dalar i 0,03 ng / ml intervallet 1. Brist eller överskott av hGH i kroppen kan framkalla ett brett spektrum av onormala fysiologiska symptom. Till exempel, kan höga nivåer av hGH leda till gigantism 2 och diabetes 3. Utarmat nivåer av hGH orsaka lågt blodsocker hos nyfödda, och svag bentäthet och depression hos vuxna 4.
Administrationen av rekombinant form av hGH (rhGH) förbättrar muskelmassa samtidigt minska kroppsfett. Som sådan, detta ämne blev drogen av valmöjligheten för professionella och amatöridrottare som det förbättrar fysisk styrka som ger en advantage i tävlingsidrott. rhGH är förbjuden enligt World Anti-Doping Agency (WADA) 5,6 och mycket arbete med internationella forskare har fokuserat på att utveckla tester som kan upptäcka sin närvaro eller anabol effekt.
Enzymkopplad immunosorbentanalys (ELISA) har varit den föredragna metoden för bestämning av hGH i helblod 7. Även är ELISA en tillförlitlig teknik som erbjuder god känslighet och selektivitet, är det relativt tids- och arbetskrävande. Dessutom ELISA förlitar sig på indirekta detektion av hGH genom att använda enzymatiska taggar. Däremot ytplasmonresonans (SPR) medger detektion av hGH direkt utan användning av etiketter i realtid. Detektionsprincipen bakom SPR innebär en mätyta som består av ett prisma som är belagd med ett tunt metallskikt (guld eller silver); när en monokromatisk polariserat ljus samverkar med metallytan, är "ytplasmoner" genereras. Bindningen av en analyttill en ytreceptor immobiliserad på metallytan stör resonans tillstånd som leder till en skiftad resonans dopp, vilken sedan kan korreleras till analytkoncentrationen. SPR-baserade biosensorer är nu kommersiellt tillgängliga som erbjuder en realtid, etikett fri teknik för att övervaka biomolekylära bindnings händelser och biokemiska reaktioner 8-10. På senare tid har Spri utvecklats som svar på behovet av multiplexering (dvs. övervakning multipla bindnings händelser samtidigt), vilket inte var möjligt i klassisk SPR biosensorer. Således har spri vuxit fram som ett verktyg för att övervaka flera bindningshändelser samtidigt. Nuvarande SPRI system bygger på mikroskopisk avbildning av en yta som exciteras med ljus vid en specifik vinkel och våglängd 10. Bilden fångas sedan på en laddningskopplad anordning (CCD) matris.
Hittills har det funnits några SPR-baserade analyser utvecklats för att upptäcka hGH 11-14. En särskild strategi, Känd som isoform metod 15, förlitar sig på detektion av förhållandet mellan 22 kDa hGH totala hGH, som icke-22-kDa endogena nivåer tappar efter exogen rhGH administration. Nyligen, de et al., Juan-Franco 11 rapporterade om utvecklingen av en SPR-baserad immunosensorn för selektiv detektering av 22 kDa och 20 kDa hGH isoformer i humana serumprover. Monoklonala antikroppar som är specifika för varje isoform immobiliserades direkt på guldsensorn möjliggör mätning av båda isoformerna samtidigt i en enda injektion med en detektionsgräns på 0,9 ng ml -1. Alternativt har SPR använts för att screena antikroppar med hög specificitet för hGH 13. Om koncentrationen av målanalyten understiger SPRI systemets detektionsgränsen (<nM), måste man tillgripa förstärka SPRI signal via utnyttjandet av nanopartiklar (Nano-SPRI). Sådan SPR-baserad förstärkning har väl dokumenterade i litteraturen 16-19 för vOlika typer av analyt och ytor.
I detta arbete har den analytiska potential SPRI och Nano-SPRI baserade biosensorer undersökas, särskilt för detektion av rhGH i spetsiga humant serum, och jämförelse av dess detekteringsförmåga direkt till ELISA. Följande parametrar kommer att ses över och övervägas: upptäckt tid, känslighet, kinetisk profil, reproducerbarhet och specificitet.
Protocol
1. Beredning av lösningar och proteinprover för SPRI
- Bered 100 ml låg salt fosfatbuffrad saltlösning (PBS) lösning innehållande 10 mM fosfat, 150 mM natriumklorid och pH 7,4.
- Bered 50 ml av hög salt PBS-lösning innehållande 10 mM fosfat, 750 mM natriumklorid och pH 7,4.
- Bered 5 ml 10 mM natriumacetat.
- Förbered ett lager av 5 mg / ml bovint serumalbumin (BSA) utspätt i låg salt PBS-lösning.
- Bered en förrådslösning av rekombinant humant tillväxthormon (rhGH) i en koncentration av 1 | ig / ml i låg salt PBS-lösning.
- Bered stamlösningar av anti rhGH och negativ kontrollantikropp vid en koncentration av 100 | ig / ml.
2. Förbered SPRI Chip för Antikropp Array
- Rengör chipet genom sonikering i 120 ml stabiliserad Piranha-lösning (3: 1 koncentrerad svavelsyra till 30% väteperoxid) under 90 min vid 50 ° C och följ genom sköljningoch sonikering med vatten under 5 minuter. Sedan, skölj chip med etanol och torka med kväveström.
- Placera guldfärgade chipet i en UV / ozon kammare under 30 minuter för att avlägsna eventuella föroreningar.
- Tillsätt 150 mg av 11-mercaptoundecanoic syra till 20 ml etanol i ett provrör som innehåller en omrörarstav och ett rör lock.
- Placera chip i provröret och mikrovågsrör / chip vid 50 W och 50 ° C under 5 minuter.
- Skölj chip med etanol och njuta i etanol under 5 min.
- Följ med en sköljning med vatten och blöt i vatten under 5 minuter.
- Tillsätt 150 mg av en-etyl-3- (3-dimetylaminopropyl) karbodiimid till 20 ml vatten i ett provrör som innehåller en omrörarstav och ett rör lock. Mikrovågsugn chip som i steg 2.4.
- Skölj chip med vatten och blöt i vatten under 5 minuter.
- Tillsätt 150 mg N-hydroxisuccinimid i 20 ml vatten i ett provrör som innehåller en omrörarstav och ett rör lock. Mikrovågsugn chip som i steg 2.4.
- Skölj chip med vatten och blöt i vatten under 5 minuter.
- Prepare 250 pM polyetylenglykol (PEG, 800 Da) i 20 ml vatten i ett provrör som innehåller en omrörarstav och ett rör lock. Mikrovågsugn chip som i steg 2.4.
Obs: mikrovågsugnen PEG800 på ytan av sensorn utförs som ett blockeringssteg för att förhindra icke-specifik bindning av serumproteiner och kvantpunktkomplex senare användes i experimentet. Detta uppnås genom PEG800 omsättning med icke-ockuperade kala guld ställen på chipet. - Skölj chip med vatten och blöt i vatten under 5 minuter.
- Förbered 15 Hg / ml av anti-rhGH-antikropplösning och negativ kontrollösning av anti-immunglobulin G (anti-IgG) och tillsätt 10 fil av varje antikroppslösning till en brunn i 384 brunnar.
- Utforma spotting mönster i microarrayer (4 x 7 kvadranter för varje prov) och plats chip med antikroppar med hjälp av en 500 pm Teflon tippade stift.
- Inkubera prickiga chip för 2 timmar vid rumstemperatur och under en fuktig atmosfär av 75% eller mer.
- Skölj och njuta chip i vatten för5 min. Sedan, torr chip med kväveström.
3. SPRI Experiment Setup och Blockering
- Initiera instrumentet och välj katalog. Välj realtid kamera och börja sprutpumpen med 1 ml / min för 10 ml avgasat vatten. För in chip in i instrumentet och hålla insprutning av vatten tills alla bubblor avlägsnas.
- Efter sköljning chip med 10 ml vatten, starta bildinhämtning, och följer genom att byta bufferten till låg salthalt PBS och låt den gå vid 1 ml / min under 5 ml och därefter långsam flödeshastighet ned till 20 | j, l / min i 20 minuter .
- Välj hög kontrast bild, som visar de immobiliserade antikropparna fläckades på chipet.
- Välj och definiera de 400 pm individuella prickar som motsvarar de immobiliserade antikropparna.
- Efter instrumentet spårar plasmon kurvorna välja en arbetsvinkel som har den högsta backen i reflexionskurvor.
- Flow en löpande buffert vid 20 ul / min med låg salt PBS genom systemet tills signalen från alla valda platser stabiliseras.
- Ladda BSA (100 ^ g / ml) i löpbufferten i provslingan (150 | il) med injektionsventilen i belastningsläget. Sedan växlar ventilen till injektions position för att injicera lösningen på flödescellen.
Obs: BSA injiceras för att kovalent binda till aminen reaktiv yta, kommer den kvarvarande obundet BSA tvätta bort ytan genom buffertsköljning. - Injicera 150 pl av en lösning av 10 mM natriumacetat över ytan och följer genom en 150 | j, l injektion av hög salt PBS.
- Injicera 150 pl etanolamin (1 mM) för att deaktivera aminen reaktiv yta.
- Injicera 150 pl 10 mM natriumacetat för att tvätta ytan.
- Sedan, växla löpbufferten till PBS med 50 | ig / ml BSA vid en flödeshastighet av 250 ul / min under totalt 5 ml.
Anm: 50 | ig / ml BSA sättes till löpbufferten för ytterligare blockering av suransikte genom icke-kovalent ockuperar icke-specifika ställen och detta görs för att ytterligare minska icke-specifik bindning av serumproteiner till ytan. - Ändra flödeshastigheten till 5 | j, l / min och låt den stabiliseras under 20 minuter.
4. SPRI detektion av humant tillväxthormon
- Bered en lösning av en inställd koncentration av rhGH (30 tusen pg / ml; 250 pg / ml; 25 pg / ml; 2,5 pg / ml och 0,25 pg / ml) i 10% serum och späddes i PBS innehållande 1 mg / ml BSA.
- Bered en 2: 1-lösning genom att tillsätta 1 | il av biotinmärkt anti-rhGH-antikroppar detektions (6 iM) till 3 ^ il streptavidinbelagda i en 0,5 ml mikrocentrifugrör nära infraröda kvantprickar (1 | iM) och inkubera under 30 min för effektiv koppling .
- Injicera 150 pl hGH spiked humant serumlösning i injektionsslinga. Detta resulterar i en kraftig ökning av signal följt av en långsam nedgång från den icke-specifikt bundna serum skölja bort ytan.
- När skyltenal stabiliserar, tvätta ytan med en lösning av 450 mM natriumklorid sattes till löpbufferten.
- Späd lösningen av anti-rhGH-antikroppar detektions och kvantprickar till en koncentration av 10 nM (2: 1) med rinnande buffert (PBS med 50 pg / ml BSA) och injicera in i flödescellen.
5. SPRI Data Analysis
Anmärkning: Efter injektion av rhGH spiked humant serum och quantum dot förstärkare, uppstår en ökning av reflektansen ändring till följd av den förstärkta förskjutning av plasmon kurvorna. Detta resulterar i en skillnad bild som visar en gråskalebild som korrelerar till signalen av på chipet.
- Importera data till en dataanalysprogram. Plotta SPRI signalen (% Reflektivitet) mot tiden (s) och bestämma skillnaden mellan den anti-rhGH och negativa fläckar kontrollantikropp efter hög salttvätt.
6. ELISA Protocol (Dag 1)
- Förvara alla analys komponenter som ingår in rhGH ELISA-kit vid 2-8 ° C. Detta inkluderar anti-rhGH-antikropp belagda brunnsplattor, standarder (0-5) i fårserum, kontroller (1 & 2) i humanserum, konjugat buffert (200x) tvättbuffert, kromogen TMB (tetrametylbensidin) och stoppa reagens.
- Inställning av reagens och följa de metoder som beskrivs i den kommersiella ELISA-kit-protokollet.
- Först låta anti-rhGH-antikropp belagda 96-brunnar för att värma till RT innan du öppnar foliepaketet.
- Ta sedan bort önskat antal 8-brunnars strips för analys och återförsluta foliepaketet innehåller de återstående brunnarna och förvara vid 2-8 ° C.
- Förbered standarder genom återställande i 2 ml destillerat vatten för standard # 0 i 1 ml destillerat vatten för standarder (1-5), och i 1 ml destillerat vatten för kontrollerna (1 & 2). Nedan finns en tabell över motsvarande koncentrationerna av de normer och kontroller (tabell 1):
| Standarder | Koncentration (ng / ml) |
| 0 | 0 |
| 1 | 0,17 |
| 2 | 0,94 |
| 3 | 2,63 |
| 4 | 10,4 |
| 5 | 26,9 |
| Kontroll # 1 | 1,22 ± 0,33 ng / ml |
| Kontroll # 2 | 4,97 ± 1,25 ng / ml |
Tabell 1. Koncentrationerna av de normer och kontroller som ingår i den kommersiella ELISA-kit.
- Bereda proverna som består av rhGH hormon i 10% humanserum i följande koncentrationer (Tabell 2):
| <strong> Prov | Koncentration (ng / ml) |
| 1 | 0,025 |
| 2 | 0,2 |
| 3 | 0,5 |
| 4 | 2,5 |
| 5 | 10 |
| 6 | 30 |
Tabell 2. koncentrationer av rhGH prov som har beretts i 10% serum.
- Tillsätt 50 pl av varje standard, kontroll och prov till varje brunn (i triplikat). Täta brunnarna och inkubera med standarder, kontroller och rhGH prover O / N vid 4 ° C under försiktig skakning.
7. ELISA Protocol (Dag 2)
- Ta bort plattan från shaker och låt den värmas till RT (15-20 min) innan man går vidare med analysen.
- Ta bort Anti-rhGH-HRP, konjugat buffert, tvättbuffert (200x), kromogen TMB (tetrametylbensidin), end stoppreagens ur kylskåpet och låt värma till RT.
- Reagensberedning: (enligt tillverkarens specifikationer)
- Späd Anti-rhGH-HRP 40x med konjugat buffert. Bered tvättbufferten genom att späda 200x med destillerat vatten.
- Tillsätt 50 pl av anti-rhGH-HRP-konjugat i varje brunn, försegla brunnarna och inkubera vid rumstemperatur under 30 minuter under försiktig skakning.
- Häll lösningen från brunnarna och vänd på plattan och knacka torrt på en absorberande vävnad. Tillsätt sedan 200 | il tvättbuffert i varje brunn.
- Häll tvättlösningen och knacka torrt på en absorberande vävnad. Upprepa detta steg 3 gånger.
- Tillsätt 100 ni kromogen i varje brunn inom 15 minuter efter tvättsteget. Inkubera under 30 min vid RT i mörker under försiktig skakning. Lösningarna vänder från färglös till blått.
- Tillsätt 100 ul av stoppreagens i varje brunn. Lösningarna övergå från blått till gult. Omedelbart läs the absorbansen för varje brunn vid 450 nm med användning av en mikroplattläsare.
- Rita standardkurvan för de som standard (0-5). Rita i den optiska densiteten hos rhGH i 10% serumprov mot koncentrationen för varje prov.
Representative Results
Utförandet av SPRI och Nano-SPRI (SPRI användning av de NanoEnhancers) jämfördes med ELISA för detektion av rhGH i en komplex miljö. Skillnaderna i installationen av dessa metoder beskrivs kortfattat nedan. För SPRI (direkt detektering, fig 1), är infångningsantikroppen immobiliserad på ytan och sedan provet injiceras och bindning av analyt till sensorytan mäts direkt i realtid och etikettfritt sätt. Men med Nano-spri (figur 1), efter det att analyten binder till sensorytan, en konsekutiv injektion följs med kvantprickar belagda med detektionsantikroppar att amplifiera spri-signalen.
Figur 1. En schematisk jämförelse direktläge (SPRI) och förstärktes-mode (Nano-SPRI) för detektering av rhGH i c oförskämd prover. ligander (rhGH eller IgG specifika antikroppar) immobiliserades i en rad format på SPRI biochip. Målprotein (rhGH) spetsad i humanserum infördes till sensorytan detekteras direkt (SPRI) och sekventiellt markeras med NanoEnhancers (Nano-SPRI). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
När det gäller ELISA, de multibrunnplattor anländer redan i förväg funktion med infångningsantikropp och sedan prov införs kommer analyten av intresse binda. En detekteringsantikropp införes följt av substrattillsats. Den optiska densiteten mäts sedan vid 450 nm. I denna studie var ett kommersiellt ELISA-kit (fig 2) användes för att mäta rhGH spiked i 10% humant serum.
8 / 53508fig2.jpg "/>
Figur 2. En schematisk representation av ELISA-analysprocedur. rhGH protein (blå ovaler) införs för att brunnar som har pre-funktionaliserade med monoklonala antikroppar (gul) är specifika för rhGH. Icke-specifika interaktioner elimineras genom sköljning av brunnarna med tvättbuffert följt av införandet av en detektionsantikropp prefunctionalized med pepparrotsperoxidas (HRP, lila). Lösningen kommer att ändra färg efter tillsats av substratet tetrametylbensidin (TMB, guld). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 representerar titreringskurvan rhGH spiked i 10% humant serum och avsätts mot den erhållna OD vid 450 nm. En bra linjärt svar observerades och detektionsgränsen bestämdes till 1 ng / ml. Koefficienten variation (CV) var 6,5% vilket tyder på god reproducerbarhet.
Figur 3. ELISA uppgifter Analys. Koncentration av rhGH spetsade i serum är avsatt mot den erhållna OD vid 450 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Därefter tillsattes detekteringen av rhGH spiked i humant serum bedöms med SPRI. Direkt detektion av rhGH resulte med motsvarande koncentrationsgradient kurvan (fig 4), varvid varje punkt representerar medelvärdet av reflektionsskillnaden beräknats med tre SPRI kinetiska kurvor för varje koncentration. Detektionsgränsen (LOD) bestämdes till 3,61 ng / ml. Den SPRI direkt detektion analysen var mycket reproducerbar som CV för analysenvar bara 4,1%.
Figur 4. Direkt spri detektering av hGH spiked i 10% humant serum. Den erhållna normaliserade spri kinetisk kurva efter injektionen av olika mängder av hGH spiked i humant serum följt av injektion av en buffert med hög salthalt (streckad vertikal linje) för att avlägsna icke -specifika interaktioner. En koncentrationsgradient kurva som representerar bindningen av olika mängder av hGH spetsat i humanserum till sensorytan som har prefunctionalized med biotinylerad hGH-specifik antikropp. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
För att öka känsligheten hos den spri biosensorn, NanoEnhancers (QDs reser funktionaliserad med detektionsantikroppar) sekventiellt iintroducerats till sensorytan för att uppmärksamma förekomsten av rhGH spetsat i humanserum. Efter bakgrundssubtraktion, de NanoEnhancers kunde amplifiera biosensor respons upp till 7,9%, emellertid, med minimal signalförändring (immunoglobulin G (IgG) -specifik antikropp, 0,38% förändring i reflektionsförmåga, fig 5 av kontrollerade regioner av intresse avbildning av. sensorytan visade att endast områden av intresse som har rhGH-specifika antikroppar immobiliserade erfarenhet den största kontrastförändringen bekräftar direkt med den kinetiska sensorsvaret.
Figur 5. Detektering av rhGH med användning av en sandwich-analys spiked i 10% humant serum. Spri kinetisk kurva efter injektion av rhGH (30 ng / ml) i buffert (10 mM PBS, 150 mM natriumklorid, pH = 7,4) på en i förväg -functionalized chip med 11-mercaptoundecanoic syra / rhGH-specifik antikropp och kontroll IgG-antikroppar blockerades sedan med BSA följt av tillsats av detektionsantikroppsbelagda kvantprickar (NanoEnhancers). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
För att demonstrera genomförbarheten av Nano-SPRI biosensor, var mätområde rhGH i råprover bedömas. Ett utökat arbetsområde från 30 tusen pg / ml till 0,25 pg / ml resulterade som ett svar på tillsatsen av NanoEnhancers (Figur 6). Det är värt att notera att varje punkt på titreringskurvan medelvärdes från tre oberoende experiment. Följaktligen den lägre detektionsgränsen beräknas till 9,20 pg / ml och variationskoefficienten var 20%.
Figur 6.Nano-spri detektering av hGH spiked i humanserum. Normaliserad spri kinetisk kurva representation av hGH_specific_Anti-QDs-förstärkt signal för humana serumprover spetsat med olika koncentrationer av hGH. En vertikal streckad linje (grå) representerar insprutningspunkt löpbufferten. (b) En koncentrationsgradient kurvan som representerar bindning av NanoEnhancers (hGH_specific_Anti-QDs) efter injektion av olika mängder av hGH spiked i humant serum till sensorytan som har prefunctionalized med 11-mercaptoundecanoic syra / hGH-specifik antikropp. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Därefter tillsattes den förändring som inträffar i SPR-reflexionskurvan som en funktion av koncentrationen, jämfört mellan den direkta och den NanoEnhancer bioassay (figur 7). För direkt deskydd teknik mellan 25 och 0,25 pg / ml, började signalen till platån och det är inte förvånande eftersom dessa koncentrationer faller under LOD av 3 ng / ml (Figur 7). Likaså för den förstärkta tekniken, koncentrationer under LOD på 9,2 pg / ml signal började platå och visade nästan ingen variation.
Figur 7. En jämförande analys av SPRI med Nano-SPRI. Detta stapeldiagram visar den procentuella förändringen i reflektivitet (% R) efter införandet av rhGH spetsat i humant serum (direkt detektion) följt av injektion av NanoEnhancers (förstärkt detektions) för 30.000 pg / ml, 250 pg / ml, 25 pg / ml, 2,5 pg / ml och 0,25 pg / ml. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
(Figur 8). Men när rhGH spetsat i serumprov injicerades på samma plats funktionaliseras med rhGH antikropp, var signalförstärkning observerats. Sammanfattningsvis har Nano-Spri plattform visat utmärkt specificitet och selektivitet för rhGH.
Figur 8. Bedömning av Nano-Spri selektivitet mot rhGH. Nano-Spri biosensor svar efter injektion av rhGH (svart) och IGF-1 (röd) i spiked serum. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
En korrelationsanalys utfördes med användning av Pearson korrelationskoefficient för att bestämma sambandet mellan SPRI signalintensitet och ELISA optisk densitetsvärden (Figur 9). Ett p-värde <0,01 ansågs signifikant. Såsom visas i denna graf, finns det en god korrelation mellan de rhGH nivåerna i spetsade humanserum som uppmäts av spri och ELISA. R-värdet var 0,9263 för 9 olika prover.
Figur 9. Pearson korrelationsanalys mellan ELISA och Nano-SPRI. Handlingen korrelerar Nano-SPRI signalstyrka (y-axeln) med ELISA optisk densitet (x-axeln) värden. (Päronpå korrelationskoefficient n = 9, r = 0,9263, p = 0,00000183). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Jämviktsdissociationskonstanten (Kd) bestämdes med användning av GraphPad programvaran för ELISA. Det beräknade Kq värdet var omkring 79 nM (Tabell 3). De på (K a) och off (K d) räntor kan inte bestämmas genom ELISA. Men med hjälp av dataanalysmjukvara, direktdetektionsmetoden ledde med K D-värde av 23 pM med användning av molekylvikt på 22 kDa som motsvarar en rhGH molekyl. Den på och av Hastigheterna beräknades vara 6,1 x 10 7 M -1 s -1 och 1,33 x 10 -3 sek -1, respektive. Detta innebär i sig att 0,13% av rhGH och antikroppskomplex förfall per sekund. När det gäller enmplified SPRI experiment en starkare övergripande interaktion observerades mellan NanoEnhancers och rhGH som den beräknade bindningsaffiniteten bestämdes till 04:03. Dessutom har en starkare associationshastighet observeras för NanoEnhancers och rhGH än infångningsantikropp / rhGH, dissociationshastigheten tyder emellertid på att 0,26% av NanoEnhancer / rhGH / antikroppsinfångnings sönderfall per sekund.
| Metod | KD (Affinity) | Ka (on-rate) | Kd (off-rate) | LOD |
| ELISA | 79,45 x 10 -9 M | NA | NA | 1 ng / ml |
| SPRI | 23,2 X 10 -12 M | 6,1 x 10 7 M -1 sek -1 | 3,61 ng / ml | |
| Nano-SPRI | 4,33 X 10 -12 M | 7,54 x10 8 M -1 s -1 | 2,62 x10 -3 sek -1 | 0,0092 ng / ml |
Tabell 3. Full kinetisk dataanalys. Utvärdering av affiniteten, om ränta och off-rate av antikroppssvar med hjälp av GraphPad (ELISA) och dataanalys (SPRI och Nano-SPRI) programvara. Bestämningen av aviditet med användning av molekylmassa av 22 kDa som motsvarar en rhGH molekyl valdes. Detektionsgränserna bestämdes för samtliga tre studier med Excel.
Discussion
Oregelbundna nivåer av hGH, ett naturligt förekommande hormon, har kopplats till många medicinska sjukdomar som påverkar människors tillväxt och utveckling. Dessutom är exogen administrering av rhGH vanligen används av idrottsmän, även om det är förbjudet, som dopingmedel för att förbättra deras prestanda. Utmaningar i att upptäcka rhGH missbruk resultat från svårigheten att särskilja exogena hGH från endogena formen. Som sådan aktuell godkänd teknik för att upptäcka exogent hGH förlitar sig på mätning av förhållandet mellan den 22 kDa hGH-isoformen i förhållande till kDa isoformen 20. Eftersom isoform prov krav på mätning av flera hGH isoformer samtidigt inom en kort tidsperiod i ett brett intervall av koncentrationer, därför, vi ansåg SPRI plattformen som en perfekt match. Dessutom endogent hGH-nivå fluktuera till en mycket låg nivå (0,03 ng / ml) i blodomloppet därför detekteringssystemet måste kunna mäta detta intervall bekvämt med hög specificity. Som ett resultat, vi undersökte också i denna studie potential Nano-SPRI som ett diagnostiskt verktyg för hGH och jämförde det direkt med SPRI och klassiska immun ELISA.
Baserat på resultaten erhållna från denna studie, är den största fördelen med spri och Nano-spri metod som rhGH-koncentrationer kan mätas på ett snabbare sätt i jämförelse med den mer konventionella metoden ELISA. En standardlängden för att mäta rhGH-nivåer i ett prov med den direkta detektionsmetoden var en timme medan Nano-spri krävs två timmar på grund av att de ytterligare stegen i processen. Sammantaget, med Spri och Nano-SPRI experiment, före injektion av ett prov, ett kalibreringssteg rekommenderas starkt. Dessutom injektion av en rå prov som mänskliga serum resulterar i vissa icke-specifika interaktioner som ett resultat är det absolut nödvändigt att injicera en hög salttvättbuffert för att bara avslöja specifika interaktioner. Det är också värt att notera att ett tvättsteg är absolut nödvändigtefter införandet av blockerande molekyler till sensorytan, för att avlägsna obundna molekyler. När det gäller ELISA tidskraven är mycket större (~ 16-18 timmar) för analys av ett prov. Det behövs en längre inkubationstid som känsligheten hos analysen förbättras speciellt för denna studie, som fokus var att jämföra den nedre gränsen för detektion.
Valet av ytkemi kommer att variera från en applikation till en annan och detta kan realiseras som en av begränsning av SPRI teknik. I denna studie har ett brett utbud och en kombination av kemiska linkers och blockerande molekyler bedöms uppnå den rätta kombinationen för att observera optimal bindningseffektivitet av rhGH till sensorytan. Till exempel, i denna studie, kombinationen av BSA och PEG serveras väl i att minimera icke-specifika interaktioner. I en tidigare studie 17, där infångnings liganden var en aptamers, PEG ensam fungerat som den bästa blockeringsmolekylen. Variablernasom påverkar bindningseffektiviteten av analyt till ligand är också beroende av pH, buffert och temperatur. Därför, med alla program, dessa variabler måste optimeras. Dessutom är det viktigt att bestämma den optimala observation koncentrationen av liganden till spånytan. En titrering experiment med ett intervall av koncentrationer av immobiliserade ligander utförs före initiering av studien. När det gäller ELISA, ett avgörande steg i förfarandet var att dekantera tvättbufferten från brunnarna genom att trycka på mikro eftersom detta säker ingen kvarvarande vätska är överblivet material. Ta bort buffert tvätta med pipett var inte tillräckligt eventuella rest vätska stört signal läsning av det riktade urvalet.
Med hänvisning till känslighet, är ELISA (1 ng / ml) jämförbar med SPRI (3,61 ng / ml) men nano-SPRI (9,20 pg / ml) förbättrar känsligheten med tre tiopotenser, vilket möjliggör mätningar på lägre biologiska nivåer av rhGH 0,03 ng / ml. Som vi tidigare rapporterat en6,17 är signalförstärkning som ges av den NanoEnhancers skrivs en massbelastningseffekten och den starka kopplingen som finns mellan NIR fluoroforer och föröknings ytplasmoner för guldfilm nanostrukturer. Även om, Nano-spri ger en extra steg i förfarandet, kan denna nivå av känslighet vidga tillämpningar av SPRI teknik i olika butiker.
SPRI ger forskarna en fullständig kinetisk profil (K D, K a och Kd) av antikropp / rhGH interaktion medan ELISA kan rapportera endast affinitetsvärden. Variationskoefficienten (CV) var lägre än 10% för SPRI (4,1%) och ELISA (6,5%), vilket tyder på god reproducerbarhet. ELISA och spri affinitetsvärden är olika på grund av att infångningsantikroppar immobiliserade på sensorchipet skiljer sig från antikroppar immobiliserade i ELISA 96-brunnsplatta. Som för Nano-spri ett högre CV-värde (20%) observerades. Det finns flera parametrar som kan bidra som en källa till errors för CV beslutsamhet. Till exempel, med Nano-spri experimentet en mycket lägre koncentration av analyt som mäts, tillsats av NanoEnhancers adderar ytterligare ett steg i förfarandet och försöket genomfördes manuellt. En mycket god korrelation mellan nano-spri och ELISA uppnåddes för detekteringen av rhGH i spetsade humanserum. Slutligen kan ELISA vara en pålitlig teknik emellertid själva metoden är tidskrävande, vilket gör det svårt att använda i situationer som kräver realtidsövervakning och multiplexering, eftersom det är fallet med hGH. Dessutom har en mer attraktiv egenskap som inte undersöktes direkt i denna studie att spri erbjuder över ELISA, är förmågan att mäta hundratals interaktioner samtidigt i realtid. Därför i framtiden kommer Nano-Spri metoden utvärderas för att upptäcka flera biomarkörer samtidigt i realtid (Multiplexing) som förekommer i serum vid olika koncentrationer för att undersöka dess potential som en livskraftig klinisk diagnostiskt verktyg.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Somatotropin Growth Hormone (GH1) capture antibody | Acris Antibodies | DM1015 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Bioreagents | BP671-10 | |
| Biotin labeled Somatotropin Growth Hormone (GH1) detection antibody | Acris Antibodies | AM09304BT-N | |
| 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide | TCI America | D1601 | |
| Ethanolamine | Acros Organics | 141-43-5 | |
| Ethanol | Fisher Chemicals | BP2818-4 | |
| Human HGH ELISA Kit | invitrogen | KAQ1081 | |
| Human Serum | Sigma Aldrich | H4522 | |
| Rabbit IgG Antibody | Sigma Aldrich | I5006 | |
| 11-mercaptoundecanoic acid | Sigma Aldrich | 450561 | |
| Nanostrip | Cyantek | ||
| N-hydroxysuccinimide | Sigma Aldrich | 130672 | |
| Phosphate Buffer Saline | Invitrogen | 00-3002 | |
| Polyethylene glycol (800 Da) | Sigma Aldrich | 729108 | |
| Recombinant Human Growth Hormone | Calbiochem | 869008 | |
| Sodium Acetate | Sigma Aldrich | 127-09-3 | |
| Sodium Chloride | Fisher Chemicals | 7647-14-5 | |
| Streptavidin coated near infrared quantum dots | Life Technologies | Q10171MP | |
| UV/Ozone Procleaner | Bioforce Nanosciences | ||
| Microwave reactor | CEM Corporation | Discover system | |
| SPRi-Arrayer | LabNext Xactll Microarray System | ||
| SPR biochip | HORIBA | ||
| SPRi-Lab+ | HORIBA | ||
| Synergy Mx Multimode Microplate reader | BioTek | ||
| ScrubberGen | HORIBA | Data Analysis software |
References
- Popii, V., Baumann, G. Laboratory measurement of growth hormone. Clinica Chimica Acta. 350 (1-2), 1-16 (2004).
- Higham, C. E., Trainer, P. J. Growth hormone excess and the development of growth hormone receptor antagonists. Exp Physiol. 93 (11), 1157-1169 (2008).
- Sönksen, P., Salomon, F., Cuneo, R. Metabolic effects of hypopituitarism and acromegaly. Horm Res. 36, Suppl 1. 27-31 (1991).
- Molitch, M., et al. Evaluation and Treatment of Adult Growth Hormone Deficiency: An Endocrine Society Clinical Practice Guideline. J Clin Endocrinol Metab. 91 (5), 1621-1634 (2006).
- The World Anti-Doping Code: The 2015 Prohibited List International Standard. , World Anti-Doping Agency. Available from: https://wada-main-prod.s3.amazonaws.com/resources/files/WADA-Revised-2014-Prohibited-List-EN.PDF (2015).
- The 2014 prohibited list world anti-doping code. , World Anti-Doping Agency. Available from: https://wada-main-prod.s3.amazonaws.com/resources/files/WADA-Revised-2014-Prohibited-List-EN.PDF (2014).
- Langkamp, M., Weber, K., Ranke, M. B. Human growth hormone measurement by means of a sensitive ELISA of whole blood spots on filter paper. Growth Horm IGF Res. 18 (6), 526-532 (2008).
- Rich, R. L., Myszka, D. G. Survey of the year 2007 commercial optical biosensor literature. J Mol Recognit. 21 (6), 355-400 (2008).
- Homola, J. Present and future of surface plasmon resonance biosensors. Anal Bioanal Chem. 377 (3), 528-539 (2003).
- Hoa, X. D., Kirk, A. G., Tabrizian, M. Toward Integrated Surface Plasmon Resonance Biosensors: A Review of Recent Progress. Biosens Bioelectron. 23 (2), 151-160 (2007).
- de Juan-Franco, E., Rodrìguez-Frade, J. M., Mellado, M., Lechuga, L. M. Implementation of a SPR immunosensor for the simultaneous detection of the 22K and 20K hGH isoforms in human serum samples. Talanta. 114, 268-275 (2013).
- de Juan-Franco, E., Caruz, A., Pedrajas, J. R., Lechuga, L. M. Site-directed antibody immobilization using a protein A-gold binding domain fusion protein for enhanced SPR immunosensing. Analyst. 138 (7), 2023-2031 (2013).
- Du, H., et al. Immunological screening and characterization of highly specific monoclonal antibodies against 20 kDa hGH. Bioanalysis. 4 (17), 2161-2168 (2012).
- Treviño, J., Calle, A., Rodrìguez-Frade, J. M., Mellado, M., Lechuga, L. M. Surface plasmon resonance immunoassay analysis of pituitary hormones in urine and serum samples. Clin Chim Acta. 403 (1-2), 56-62 (2009).
- Wu, Z., Bidlingmaier, M., Dall, R., Strasburger, C. J. Detection of doping with human growth hormone. Lancet. 353 (9156), 895 (1999).
- Malic, L., Sandros, M. G., Tabrizian, M. Designed biointerface using near-infrared quantum dots for ultrasensitive surface plasmon resonance imaging biosensors. Anal. Chem. 83 (13), 5222-5229 (2011).
- Vance, S. A., Sandros, M. G. Zeptomole Detection of C-Reactive Protein in Serum by a Nanoparticle Amplified Surface Plasmon Resonance Imaging Aptasensor. Sci. Rep. 4 (5129), 1-7 (2014).
- Uludag, Y., Tothill, I. E. Cancer biomarker detection in serum samples using surface plasmon resonance and quartz crystal microbalance sensors with nanoparticle signal amplification. Anal. Chem. 84 (14), 5898-5904 (2012).
- Špringer, T., Homola, J. Biofunctionalized gold nanoparticles for SPR-biosensor-based detection of CEA in blood plasma. Anal Bioanal Chem. 404 (10), 2869-2875 (2012).
