Summary
Teklif edilen iş (spri) deneyleri, özellikle de çivili insan serumu yeniden birleştirici insan büyüme hormonu saptanması için, ticari olarak temin edilebilen spri enzim-bağlı immünosorbent deneyi ile doğrudan sonuç karşılaştırarak doğrudan amplifiye yüzey plazmon rezonans görüntüleme diyagnostik potansiyele değerlendirir (ELISA) seti.
Abstract
Herbiri geniş bir derişimler aralığında insan büyüme hormonu (hGH) tespiti için hassas ve seçici yöntemleri (yüksek düzeyde 50-100 ng ml - 1 ng ve 0.03 ml minimum seviyeleri - 1) kan dolaşımında, değişken seviyeleri gereklidir may değiştirilmiş fizyolojiyi göstermektedir. Örneğin, çocukluk döneminde ortaya çıkan büyüme bozuklukları kandaki iBH'nin düzeylerini ölçerek teşhis edilebilir. Ayrıca, spor rekombinant iBH'nin kötüye sadece, aynı zamanda istismarda ciddi sağlık tehditleri sunan bir etik sorun teşkil etmektedir. Olmayan 22 kDa endojen düzeyleri eksojen rekombinant hGH (rhGH) uygulandıktan sonra damla olarak hGH kötüye ölçülmesi için bir strateji, toplam İBH 22 kDa hGH oranının tespitine dayanır. Yüzey plazmon rezonans görüntüleme (Spri) refraktif ind değişiklikleri kaydederek direkt (etiket içermeyen) izleme ve biyomoleküler etkileşimleri görselleştirme sağlar analitik bir araçtırgerçek zamanlı olarak sensör yüzeyine bitişik örn. Bunun aksine, en sık kullanılan kolorimetrik yöntem olup, enzime bağlı immünosorbent deneyi (ELISA) dolaylı bir renk değişikliği oluşturan bir alt tabaka ilavesinden sonra analit konsantrasyonunun ölçülmesi için, enzim etiketli algılama antikorlar kullanır. Saptama hassasiyetini artırmak için, çoğaltılmış spri sinyal gücünü artırmak için bir sandviç deneyi formatı ve kızıl ötesine yakın kuantum noktalar (QDS) kullanır. Çivili insan serumu rekombinant rhGH doğrudan spri saptandıktan sonra spri sinyal yakın kızılötesi QDS (Nano spri) ile kaplanmış algılama antikoru arasında sıralı enjeksiyon ile amplifiye edilir. Bu çalışmada, doğrudan ve amplifiye spri tanıma potansiyeli rhGH insan serumunda tutturuldu ve şirketinden ticari olarak temin edilebilir bir ELISA kiti yetenekleri ile karşılaştırıldığında ölçmek için değerlendirildi.
Introduction
İnsan büyüme hormonu (hGH), hipofiz bezi tarafından üretilen doğrudan kan akışına salınır, 191 amino asitli bir peptiddir (22 kDa) 'dir. Hipotalamik peptid büyüme hormonu salıveren hormon (GHRH) ve somatotropin arasındaki etkileşim hGH pulsatil salgıları indükler. Bunun bir sonucu olarak, hGH seviyesi 0,03 ng / ml aralığı 1 en düşük seviyelerine 50-100 ng / ml zirve arasında değişmektedir. Vücuttaki bir eksiklik ya da hGH aşırı anormal fizyolojik semptomlara geniş bir yol açabilir. Örneğin, hGH aşırı seviyeleri gigantism 2 ve diyabet 3 neden olabilir. HGH'nin tüketilmiş seviyeleri yetişkinlerde 4 yenidoğanlarda kan şekeri düşüklüğü ve zayıf kemik yoğunluğu ve depresyona neden olur.
Vücut yağ azaltırken hGH (rhGH) rekombinant formunun uygulanması yağsız kas kütlesini artırır. Bir zarf kazandıran fiziksel güç geliştirir gibi, bu madde profesyonel ve amatör sporcular için tercih edilen ilaç olduRekabetçi spor antage. rhGH varlığını veya anabolik etkiye algılayabilir testleri geliştirme odaklı olmuştur uluslararası araştırmacılar tarafından Dünya Anti-Doping Ajansı (WADA) 5,6 ve çok çaba ile yasaklanmıştır.
Enzim-bağlı imünosorban deneyi (ELISA), tam kan 7 iBH'nin belirlenmesi için tercih edilen bir yöntem olmuştur. ELISA iyi hassasiyet ve seçiciliği sunan güvenilir bir tekniktir rağmen, nispeten zaman ve emek yoğundur. Buna ek olarak, ELISA, enzimatik etiketler kullanılarak hGH indirekt tespiti dayanır. Bunun aksine, yüzey plazmon rezonansı (SPR) ile doğrudan gerçek zamanlı olarak alır ve etiket kullanılmaksızın hGH tespit edilmesine izin verir. SPR arkasındaki saptama prensibi ince bir metal tabaka (altın veya gümüş) kaplanmış olan bir prizma oluşan bir algılama yüzeyini içerir; monokromatik polarize ışık metal yüzeyi ile etkileşime girdiğinde, "yüzey plazmonları" oluşturulur. Bir analitin bağlanmasınınmetal yüzey üzerinde immobilize edilmiş bir yüzey reseptörüne daha sonra analit konsantrasyonu ile alakalı bir kaydırılmış rezonans daldırma ile sonuçlanan rezonans koşullarını bozan. SPR temelli biyosensörler şimdi biyomoleküler bağlayıcı olayları ve biyokimyasal reaksiyonları 8-10 izlemek için gerçek zamanlı, etiket ücretsiz teknik teklif piyasada mevcuttur. Daha yakın zamanlarda, Spri çoğullama için ihtiyacına yanıt olarak geliştirilmiştir (yani, aynı anda birden fazla bağlayıcı olayları izlemek) Klasik SPR biyosensörlerde mümkün değildi. Böylece, Spri aynı anda birkaç bağlayıcı olayları izlemek için bir araç olarak ortaya çıkmıştır. Mevcut Spri sistemler belirli bir açı ve dalga boyunda 10 de ışıkla uyarılan bir yüzeyinin mikroskopik görüntülemesi dayanmaktadır. Görüntü daha sonra bir şarj-kuplajlı aygıt (CCD) dizisi üzerine yakalanır.
Bugüne kadar, hGH 11-14 tespit etmek için geliştirilmiş bir kaç SPR bazlı deneyler yapılmıştır. Belirli bir stratejiOlmayan 22-kDa 'lık endojen düzeyleri eksojen rhGH uygulamadan sonra damla olarak, izoform yöntemi 15 olarak da bilinen, toplam İBH 22 kDa hGH oranının tespitine dayanır. Son zamanlarda, Juan-Franco ve ark., 11 22 kDa ve insan serum numunelerinde 20 kDa hGH izoform seçici saptanması için bir SPR tabanlı immunosensor gelişimi rapor de. Her izoformuna belirli monoklonal antikorlar 0.9 ng ml -1 de algılama sınırı olan tek enjeksiyon aynı anda her iki izoformların ölçümü izin altın sensörü doğrudan immobilize edildi. Seçenek olarak ise, SPR hGH 13 yüksek spesifikliği olan antikorları taramak için kullanılmıştır. Hedef analitin konsantrasyonu tespiti Spri sistemin sınırı (<nM) altına düşerse, kimse nanopartiküllerin kullanımı (Nano-Spri) üzerinden Spri sinyali kuvvetlendiren başvurmak zorundadır. Böyle SPR temelli amplifikasyon iyi v literatürde 16-19 belgelenmiştiranalitin ve yüzeylerin arious türleri.
Bu çalışmada, Spri ve Nano-Spri temelli biyosensörler analitik potansiyeli özellikle çivili insan serumunda rhGH tespiti için, muayene edildi ve ELISA doğrudan algılama yeteneğinin karşılaştırılması. Aşağıdaki parametreler gözden ve dikkate alınacaktır: algılama süresi, duyarlılık, kinetik profili, tekrarlanabilirlik ve özgüllüğü.
Protocol
Spri için Çözümler ve Protein Örneklerinin hazırlanması 1.
- 10 mM fosfat, 150 mM sodyum klorür ve pH 7.4 içeren düşük tuz, fosfat tamponlu tuz (PBS) çözeltisi 100 ml hazırlayın.
- 10 mM fosfat, 750 mM sodyum klorür ve pH 7.4 ihtiva eden yüksek tuz PBS çözeltisi 50 ml hazırlayın.
- 10 mM sodyum asetat, 5 ml hazırlayın.
- Düşük tuz çözeltisi, PBS içinde seyreltilmiş 5 mg / ml sığır serumu albümini (BSA) içindeki bir stok hazırlayın.
- Düşük tuz PBS çözeltisi içinde 1 | ig / ml'lik bir konsantrasyonda yeniden birleştirici insan büyüme hormonu (rhGH) içindeki bir stok çözelti hazırlayın.
- 100 ug / ml bir konsantrasyonda anti-rhGH ve negatif kontrol antikor stok çözelti hazırlayın.
2. Spri Chip Antikor Array hazırlanın
- 50 ° C'de 90 dakika boyunca (1, konsantre edilmiş sülfürik asit ile 30% hidrojen peroksit 3) ve durulama ile takip edin stabilize pirana çözeltisi 120 ml sonikasyon ile çip temizleme5 dakika boyunca su ile ve sonikasyon. Ardından, azot akımı ile etanol ve kuru ile çip durulayın.
- Kirleticilerin çıkması için 30 dakika boyunca, bir UV / ozon bölmesi altın çip yerleştirin.
- Bir karıştırma çubuğu ve bir tüp kap ihtiva eden bir deney tüpü içinde 20 ml etanol, 11-mercaptoundecanoic asit 150 mg ekleyin.
- 50 W test tüpü ve mikrodalga tüp / çip çip koyun ve 5 dakika boyunca 50 ° C.
- Etanol ile çip durulayın ve 5 dakika boyunca etanol içinde bekletin.
- Su ile durulanmıştır izleyin ve 5 dakika boyunca su ile ıslatın.
- Bir karıştırma çubuğu ve bir tüp kap ihtiva eden bir deney tüpü içinde 1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) karbodiimid, su 20 ml kadar 150 mg ekleyin. Adım 2.4 gibi Mikrodalga yongası.
- Su ile durulayın çip ve 5 dakika boyunca suda bekletin.
- Bir karıştırma çubuğu ve bir tüp kap ihtiva eden bir deney tüpü içinde 20 ml su içinde, N-hidroksisüksinimid 150 mg ekleyin. Adım 2.4 gibi Mikrodalga yongası.
- Su ile durulayın çip ve 5 dakika boyunca suda bekletin.
- PrepaBir karıştırma çubuğu ve bir tüp kap ihtiva eden bir deney tüpü içinde 20 ml su içinde, 250 uM, polietilen glikol (PEG 800 Da) yeniden. Adım 2.4 gibi Mikrodalga yongası.
Not: mikrodalga PEG800 sensörünün yüzeyi üzerinde serum proteinleri ve kuantum dot komplekslerinin spesifik olmayan bağlanma, daha sonra deneyde kullanılan önlemek için bloke edici bir adım olarak gerçekleştirilir. Bu PEG800 çip olmayan işgal çıplak altın siteleri ile reaksiyona sokulması ile elde edilir. - Su ile durulayın çip ve 5 dakika boyunca suda bekletin.
- Anti-rhGH antikoru solüsyon ve anti-İmmünoglobulin G (anti-IgG) negatif kontrol çözeltisi 15 ug / ml hazırlayın ve 384 gözenekli bir plakada iyi olarak, her antikor çözeltisinin 10 ul ekle.
- 500 mikron teflon kullanan antikorlarla mikro dizicinin (her bir numune için 4 x 7 kadran) ve spot yongası lekelenme desen tasarlayın pin uçlu.
- Oda sıcaklığında ve% 75 ya da daha yüksek bir nemli atmosfer altında 2 saat boyunca benekli çip inkübe edin.
- Durulayın ve suda ıslatın çip5 dak. Ardından, azot akımı ile kuru yonga.
3. Spri Deney Kurulum ve Engelleme
- Cihazı seçin ve dizin başlatılamıyor. Gerçek zamanlı kamerayı seçin ve gazı alınmış 10 ml su için 1 ml şırınga pompası / dak başlatın. Aracı haline çip takın ve tüm kabarcıklar kaldırılana kadar su enjekte edin.
- 10 ml su ile duruladıktan sonra çip, görüntü alma başlar ve düşük tuz PBS tampon geçiş devam edin ve 20 dakika boyunca / 20 ul kadar 5 ml ve daha sonra yavaş bir akış hızı için / 1 ml dk dakika çalışmasına izin .
- Çip üzerine benekli hareketsiz antikorları gösterir yüksek kontrastlı bir görüntü seçin.
- Seçin ve hareketsiz antikorlar karşılık gelen 400 mikron ayrı dairesel noktalar tanımlar.
- Alet plasmon eğrileri izleri sonra, yansıtma eğrileri en eğime sahiptir çalışan bir açı seçin.
- Düşük s 20 ul çalışan bir tampon Akış / dakSeçilen noktalar her sinyal stabilize kadar sistem üzerinden PBS alt alt.
- Yük pozisyonda enjeksiyon valfi numune döngüsü (150 ul) içinde çalışan tampon BSA (100 ug / ml) yükleyin. Sonra akış hücresi çözüm enjekte etmek için enjeksiyon konumuna valfi geçin.
Not: BSA kovalent amin reaktif yüzeyine bağlamak için enjekte edilir, geriye kalan bağlanmamış BSA tamponu durulama yüzeyi üzerinde yıkayın olacaktır. - Yüzey üzerine 10 mM sodyum asetatın bir çözeltisinin 150 ul enjekte edilir ve yüksek tuz PBS 150 ul enjeksiyon ile takip edin.
- Amin reaktif yüzeyi devre dışı bırakmak için etanolamin (1 mM), 150 ul enjekte edilir.
- Yüzeyini yıkamak için 10 mM sodyum asetat, 150 ul enjekte edilir.
- Daha sonra, 5 ml'lik bir toplam 250 ul / dk'lık bir akış oranında 50 ug / ml BSA içeren PBS çalışan tampon geçin.
Not: 50 ug / ml BSA sur ek engellenmesi için çalışan tampon ilave edilirkovalent olmayan bir şekilde spesifik olmayan yerleri işgal eden ve bu daha fazla yüzeye spesifik olmayan serum proteinleri bağlanmasını azaltma yapılır ile yüzü. - Değişim akışı 5 ul / dak oranı ve 20 dakika süreyle stabilize olmasına izin verin.
İnsan büyüme hormonu 4. Spri Algılama
- RhGH bir dizi konsantrasyonda bir çözelti hazırlayın (30,000 pg / ml, 250 ug / ml; 25 ug / mL, 2.5 ug / ml ve 0.25 ug / ml) içinde% 10 serum ve PBS 1 mg / ml BSA ihtiva eden seyreltilmiştir.
- 2 hazırlayın: biyotin 1 ul ekleyerek 1 çözeltisi etiketli anti-rhGH saptama antikorları (6 uM), bir 0.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde kızılötesi kuantum noktaları (1 uM) yakınındaki kaplanmış ve streptavidin 3 ul etkili bağlanma için 30 dakika inkübe .
- HGH enjekte 150 ul enjeksiyon döngüsü içindeki insan serum çözeltisi çivili. Bu yüzey Durulamadan spesifik olmayan şekilde bağlanmış serumdan yavaş damla ardından sinyal kuvvetli bir artış ile sonuçlanır.
- Işareti kezal çalışan tampon eklendi 450 mM sodyum klorit ihtiva eden bir çözelti ile yüzeyini yıkamak, stabilize eder.
- 10 nM (2: 1) içindeki bir konsantrasyona kadar bir anti-rhGH saptama antikorları ve kuantum noktaların çözeltisi ile seyreltilir tampon maddesi ile (PBS 50 ug / ml BSA ile) ve akış hücresi içine enjekte edilir.
5. Spri Veri Analizi
Not: rhGH enjeksiyonundan sonra insan serumu ve kuantum nokta arttırıcı çivili, yansıma değişikliği bir artış plazmon eğrilerinin güçlendirilmiş kaymasından dolayı oluşur. Bu çip üzerinde sinyaline korele bir gri görüntüsünü gösteren bir fark görüntünün sonuçlanır.
- Bir veri analiz programı veri almak. Zaman (lar) karşı Spri sinyalini (% Yansıma) arsa ve yüksek tuz yıkamadan sonra, anti-rhGH ve negatif kontrol antikor noktalar arasındaki farkı belirler.
6. ELISA Protokolü (Gün 1)
- Tüm deney bileşenleri i dahil Mağazan 2-8 ° C'de rhGH ELISA kiti. Bu anti-rhGH antikor ya serumu, insan serumunda kontroller (1 & 2), konjuge tamponu (200x), yıkama tamponu, kromojen TMB (tetrametilbenzidin) ile reaktif durdurma kaplanmış gözenekli plakalar, standart (0-5) içerir.
- Ticari ELISA kiti protokol açıklandığı gibi Kur reaktifler ve yöntemleri uygulayın.
- İlk olarak, bir anti-rhGH antikoru önceden folyo paketi açmadan oda sıcaklığına ısınmaya 96-kuyu kaplama sağlar.
- Ardından tayini için 8-kuyu şeritler istenilen sayıda kaldırmak ve 2-8 ° C'de kalan kuyuları ve mağaza içeren folyo paketi kapatın.
- Standartları için damıtılmış su, 1 ml (1-5) 'de, standart # 0 için damıtılmış su, 2 ml yeniden oluşturulması ile standartları hazırlayın, ve kontrol (1 ve 2) damıtılmış suyun 1 ml. Aşağıda standartlar ve kontroller (Tablo 1) tekabül eden konsantrasyonlarının bir tablodur:
| Standartlar | Konsantrasyon (ng / ml) |
| 0 | 0 |
| 1 | 0.17 |
| 2 | 0.94 |
| 3 | 2.63 |
| 4 | 10.4 |
| 5 | 26.9 |
| Kontrol 1. | 1,22 ± 0,33 ng / ml |
| Denetim 2. | 4.97 ± 1.25 ng / ml |
Tablo standartları ve kontroller 1. konsantrasyonları ticari ELISA kiti dahil.
- Aşağıdaki konsantrasyonları (Tablo 2)% 10 insan serumu içinde rhGH hormonu oluşur örnekleri hazırlayın:
| <strong> Örnek | Konsantrasyon (ng / ml) |
| 1 | 0.025 |
| 2 | 0,2 |
| 3 | 0.5 |
| 4 | 2.5 |
| 5 | 10 |
| 6 | 30 |
Tablo 10,% Serum hazırlanmış rhGH örneklerinin 2. konsantrasyonları.
- Her iyi (üç kez) her bir standart, kontrol ve numune 50 ul ekleyin. Kuyu Seal ve nazik sallayarak altında 4 ° C'de standartlar, kontroller ve rhGH örneklerinin O / N ile kuluçkaya yatmaktadır.
7. ELISA Protokolü (Gün 2)
- Çalkalayıcı plaka çıkarın ve deneyden önce geçmeden OS'nda (15-20 dakika) ısınmaya bırakın.
- Kaldır Anti-rhGH-HRP, konjuge tampon, yıkama tamponu (200x), Kromojen TMB (tetrametilbenzidin), birbuzdolabından d durdurma reajanı ve oda sıcaklığına ısıtıldıktan izin verir.
- Reaktif hazırlığı: (üreticinin talimatlarına göre)
- Eşlenik tamponu ile Anti-rhGH-HRP 40x seyreltilir. Distile su ile seyreltilmesi ile 200x yıkama tamponu hazırlayın.
- Her kuyuya anti-rhGH-HRP konjügatı 50 ul ekle kuyu mühür ve yavaşça çalkalayarak 30 dakika süreyle oda sıcaklığında inkübe edin.
- Kuyulardan çözüm Durusu ve plaka ters ve emici dokusu üzerine kuru dokunun. Daha sonra her kuyuya yıkama tamponu 200 ul ilave edin.
- Emici dokusu üzerine yıkama solüsyonu ve musluk kuru süzün. Bu adımı 3 kez tekrarlayın.
- Yıkama aşamasından sonra 15 dakika içinde, her bir oyuğa 100 ul kromojen ekleyin. Hafifçe çalkalanarak bir karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika süreyle inkübe edilir. Çözümler renksiz gelen mavi dönüşüyor.
- Her kuyuya durdurma tepkime maddesinin 100 ul ekle. Çözümler maviden sarıya açın. Hemen th okumakBir mikrolevha okuyucu kullanılarak her bir kuyucuğa 450 nm e absorbans.
- Sağlanan standartlara (0-5) için standart eğri çizilir. Daha sonra her bir numune konsantrasyonuna karşı% 10 serum örneklerinde rhGH optik yoğunluk çizilir.
Representative Results
Spri ve Nano-Spri (NanoEnhancers istihdam Spri) performansı karmaşık bir ortamda rhGH tespiti için ELISA ile karşılaştırılmıştır. Bu yöntemlerin kurulumunda farklılıklar kısaca açıklanmıştır. Spri (doğrudan tespiti, Şekil 1) için, kaptür antikoru bir yüzey üzerinde immobilize edilir ve sonra örnek enjekte edilir ve sensör yüzeyine analit bağlanması gerçek zamanlı ve etiket içermeyen bir şekilde, doğrudan ölçülür. Analit sensör yüzeyine bağlanan sonra ancak Nano spri (Şekil 1) ile birlikte, arka arkaya enjeksiyon spri sinyalini çoğaltmak için saptama antikorları ile kaplı kuantum noktaları takip edilmektedir.
Şekil 1. c rhGH tespiti doğrudan modu (Spri) ve güçlendirilmiş-mode (Nano-Spri) karşılaştıran bir şematik temsili Kaba örnekler. ligandlar (rhGH veya IgG spesifik antikorlar) spri Biochip üzerinde bir dizi formatında hareketsizleştirilmişlerdir. Hedef proteini (rhGH) sensörü yüzeyine tanıtıldı insan serumunda çivili doğrudan (Spri) tespit edilir ve sıralı NanoEnhancers (Nano-Spri) ile vurgulanır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
ELISA için olduğu gibi, çok çukurlu tablalar önce antikor ile ön-işlevselleştirilmiş ulaşması ve örnek ilave edilir, ilgi konusu analit bağlayacaktır. Bir saptama antikoru substrat ilave edildikten sonra ilave edilir. Daha sonra optik yoğunluk 450 nm'de ölçülür. Bu çalışmada, ticari bir ELISA kiti (Şekil 2) rhGH% 10 insan serumu çivili ölçmek için kullanılmıştır.
8 / 53508fig2.jpg "/>
Şekil 2. ELISA deneyi prosedürü şematik bir temsili. rhGH proteini (mavi ovaller) rhGH spesifik monoklonal antikorların (sarı) ile ön-işlevselleştirilmiş olan oyuklara ilave edilir. Spesifik olmayan etkileşimleri yaban turbu peroksidazı (HRP mor) ile prefunctionalized algılama antikoru tanıtımı takip yıkama tamponu ile kuyu durulanarak elimine edilir. Çözelti substrat tetrametilbenzidin (TMB, altın) eklendikten sonra renk değişecektir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3, rhGH titrasyon eğrisi% 10 insan serumu içinde bölündüğü ve 450 nm 'de elde edilen OD karşı çizilmiştir temsil eder. İyi bir lineer tepki gözlendi ve algılama limiti 1 ng / ml olarak tespit edildi. Var katsayısıiation (CV) iyi tekrarlanabilirlik düşündüren% 6.5 idi.
RhGH Şekil 3. ELISA veri analizi. Konsantrasyon 450 nm'de elde edilen OD karşı çizilen serum içinde fırladı. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Sonra, insan serumunda çivili rhGH tespiti Spri ile değerlendirildi. RhGH Doğrudan tespiti gelen konsantrasyon gradyanı eğrisi (Şekil 4) ile sonuçlanan, her nokta her bir konsantrasyon için üç Spri kinetik eğrileri hesaplanan yansıma farkı ortalama değerini temsil eder. Saptama sınırı (LOD) 3.61 ng / ml olarak tespit edildi. Spri doğrudan algılama tahlil testinin CV gibi son derece tekrarlanabilir oldusadece% 4.1 idi.
HGH Şekil 4. Direkt Sprin algılama% 10 insan serumu çivili. İBH değişik miktarlarının enjeksiyonundan sonra elde edilen normalize spri kinetik bir grafiktir, bir yüksek tuz tamponu enjeksiyon (kesikli yatay çizgi) olmayan kaldırmak için, ardından insan serumu çivili -özel etkileşimler. HGH'nin çeşitli miktarlarda bağlanmasını temsil eden bir konsantrasyon gradyanı eğrisi Biyotinlenmiş hGH özgü-Antikor ile prefunctionalized olmuştur sensör yüzeyine insan serumunda çivili. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Spri biyosensör hassasiyetini artırmak için, NanoEnhancers art arda vardır (QDS saptama antikorları ile işlevselleştirilmiş ön)rhGH varlığını vurgulamak amacıyla sensör yüzeyine troduced insan serumunda çivili. . Ilgi Görüntüleme kontrollü bölgelere Şekil 5; arka plan çıkarma sonra NanoEnhancers minimal sinyal değişikliği (İmmunoglobulin G (IgG) özgü antikor, yansıtma 0.38% değişim ile, ancak,% 7.9 kadar biyosensör cevabı yükseltmek başardık sensör yüzeyi rhGH-özel antikorlar vardır ilgi sadece bölgeleri deneyim kinetik sensorgram yanıt ile doğrudan doğrulayan en büyük kontrast değişikliği hareketsiz olduğunu ortaya koydu.
Şekil 5. Bir ön üzerine bir sandviç tahlili% 10 insan serumu çivili. Spri kinetik bir grafiktir tamponu içinde rhGH (30 ng / ml) enjekte edildikten sonra (10 mM PBS, 150 mM sodyum klorür, pH = 7.4) ile rhGH Algılama 11-mercaptoundecanoic asit / rhGH- ile işlevselleştirilmiş çipDaha sonra algılama antikor kaplı kuantum noktaları (NanoEnhancers) ilavesi ile takip BSA ile bloke spesifik antikor ve kontrol IgG antikor. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Nano-Spri biyosensör uygulanabilirliğini göstermek için, ham örneklerinde rhGH ölçüm aralığı değerlendirildi. 0,25 pg / ml / ml 30.000 pg uzatılmış bir çalışma aralığı NanoEnhancers (Şekil 6) eklenmesi için bir yanıt olarak elde edilmiştir. Bu titrasyon eğrisi üzerindeki her nokta, üç bağımsız deneyler ortalama olarak dikkati çekiyor. Sonuç olarak, düşük algılama sınırı 9,20 pg / ml olarak hesaplanmıştır ve varyasyon katsayısı% 20 oldu.
Şekil 6.HGH Nano spri algılama insan serumu çivili. Insan serum örnekleri için hGH_specific_Anti-QDS-amplifiye sinyalin Normalleştirilmiş spri kinetik bir grafiktir temsili hGH farklı konsantrasyonları ile delinmiş. (Gri) Dikey kesikli çizgi çalışan tampon enjeksiyon noktasını temsil eder. (b) hGH değişik miktarlarının enjeksiyonundan sonra NanoEnhancers (hGH_specific_Anti-QDS) bağlanmasını temsil eden bir konsantrasyon gradyanı eğrisi 11-mercaptoundecanoic asit / hGH-spesifik antikor ile prefunctionalized edilmiş sensör yüzeyine insan serumu çivili. tıklayın Burada bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için.
Daha sonra, konsantrasyonun bir fonksiyonu olarak SPR yansıtma eğrisi meydana değişikliği doğrudan ve NanoEnhancer biyolojik tayin yöntemi (Şekil 7) arasında karşılaştırılmıştır. Doğrudan de için25 ve 0.25 pg / ml arasında runma tekniği, sinyal plato başladı ve bu konsantrasyonlar 3 ng / ml (Şekil 7) LOD altına düşen bu şaşırtıcı değildir. Benzer şekilde, güçlendirilmiş teknik için, 9.2 pg / ml sinyali LOD altındaki konsantrasyonları plato başlamış ve neredeyse hiçbir değişim göstermiştir.
Şekil Nano-Spri ile Spri karşılaştırmalı analizi 7.. Bu çubuk grafik 30.000 için NanoEnhancers (kuvvetlendirilmiş algılama) enjeksiyonu takiben insan serumunda çivili rhGH girmesinden sonra yansıtma (% R) yüzde değişim (doğrudan algılama) tasvir pg / ml, 2.5 pg / ml, 250 pg / ml, 25 pg / ml ve 0.25 pg / ml. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
(Şekil 8) göstermemiştir. RhGH rhGH antikoru ile işlevselleştirilmiş aynı noktada enjekte edildi serum örneğinde çivili Bununla birlikte, sinyal artışı gözlenmiştir. Sonuç olarak, Nano-Spri platformu rhGH için mükemmel özgüllük ve seçicilik göstermiştir.
Şekil 8. rhGH doğru Nano-Spri seçicilik Değerlendirilmesi. S rhGH (siyah) ve IGF-1 (kırmızı) enjeksiyonundan sonra Nano-Spri biyosensör cevabıpiked serum. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Bir korelasyon analizi Spri sinyal yoğunluğu ve ELISA optik yoğunluk değerleri (Şekil 9) arasındaki ilişkiyi belirlemek için Pearson korelasyon katsayısı kullanılarak gerçekleştirildi. Bir p-değeri <0.01 anlamlı olarak kabul edildi. Bu grafikte gösterildiği gibi, spri ve ELISA ile ölçülmüştür kirpi insan serumundaki rhGH düzeyleri arasında iyi bir ilişki vardır. R-değeri 9 Farklı numuneler için 0,9263 oldu.
ELISA ve Nano-Spri arasındaki Şekil 9. Pearson korelasyon analizi. Arsa ELISA optik yoğunluk (x-ekseni) değerleri ile Nano-Spri sinyal yoğunluğu (y-ekseni) ilişkilidir. (Armutkorelasyon katsayısı n = 9, üzerinde r = 0,9263, p = 0,00000183). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Denge ayrılma sabiti (KD) ELISA için GraphPad Software kullanılarak belirlenmiştir. Hesaplanan K D değeri yaklaşık 79 nM (Tablo 3). (K a) ve kapalı (K d) oranları ELISA ile tespit edilemedi. Bununla birlikte, veri analiz yazılımı kullanılarak, doğrudan saptama yöntemi, bir rhGH molekülüne karşılık gelir 22 kDa molekül kütlesi ile 23 pM Kd değeri ile sonuçlandı. Ve oranlar sırasıyla kapalı 6.1 x10 7 M -1 s -1 ve 1,33 x 10 -3 sn -1 olmak hesaplanmıştır. Bu doğal çevirir saniyede rhGH ve antikor komplekslerinin çürüme 0.13%. A gelincemplified Sprin deneyi, daha güçlü bir genel etkileşim hesaplanan bağlanma afinitesi olarak NanoEnhancers ve rhGH arasında gözlenmiştir 04:03 olduğu belirlenmiştir. Buna ek olarak, daha güçlü bir bağlanma oranı yakalama antikordan daha NanoEnhancers ve rhGH gözlendi / rhGH Ancak ayrılma oranı göstermektedir saniyede NanoEnhancer / rhGH / yakalama antikoru çürüme% 0.26.
| Yöntem | KD (Affinity) | K (on-rate) | Kd (off-oranı) | LOD |
| ELISA | 79,45 x 10 -9 M | NA | NA | 1 ng / ml |
| Spri | 23.2 x 10 -12 M | 6.1 x 10 7 M -1 sn -1 | 3,61 ng / ml | |
| Nano-Spri | 4.33 x 10 -12 M | 7.54 x10 8 M -1 sn -1 | 2.62 x10 -3 sn -1 | 0,0092 ng / ml |
Afinite Tablo 3. Tam kinetik veri analizi. Değerlendirme, oran-ve off-oran GraphPad (ELISA) ve veri analizi (Spri ve Nano-Spri) yazılımını kullanarak antikor yanıtlarının. Bir rhGH molekülüne karşılık gelir 22 kDa molekül kütlesi ile avidite belirlenmesi seçildi. Algılama sınırları excel kullanan her üç çalışmalar için belirlenmiştir.
Discussion
HGH, doğal olarak oluşan bir hormon düzensiz seviyeleri insan büyüme ve gelişimini etkileyen çok sayıda tıbbi bozukluklar ile bağlantılı olmuştur. Dahası, rhGH eksojen yaygın onların performansını artırmak için doping maddesi olarak, bu yasak olsa bile, sporcular tarafından kullanılır. Endojen formdan eksojen hGH ayırt zorluk rhGH kötüye sonucu tespit Zorluklar. Bu nedenle, eksojen hGH tespit etmek için mevcut onaylanmış bir teknik 20 kDa izoformuna göre 22 kDa hGH izoformunun oranı ölçme üzerine dayanır. Birden çok hGH ölçümü için izoform testi talepleri dolayısıyla konsantrasyonları geniş bir zaman kısa bir süre içinde aynı anda izoformları yana, mükemmel bir eşleşme olarak spri platformudur. Buna ek olarak, endojen hGH seviyesi dolayısıyla algılama sistemi, yüksek sp rahatça bu aralığı ölçmek gerekir kan dolaşımında çok düşük bir seviyede (0.03 ng / ml) dalgalanmaecificity. Sonuç olarak, biz de hGH'nin için bir tanı aracı olarak bu çalışmada Nano-Spri potansiyelini araştırdık ve Spri ve klasik immunoassay ELISA ile doğrudan karşılaştırdık.
Bu çalışmadan elde edilen sonuçlara göre, spri Nano-spri yöntemin en önemli avantajı rhGH konsantrasyonları daha geleneksel bir yöntemle ELISA ile karşılaştırıldığında daha hızlı bir şekilde ölçülebilir olmasıdır. Nano Spri işleminde ek adımlar nedeniyle 2 saat gerekli ise, doğrudan algılama yöntemi ile tek bir numunede rhGH seviyelerini ölçmek için standart bir süresi 1 saat idi. Genel olarak, Spri ve Nano-Spri deneyler ile bir numunenin enjeksiyonundan önce, bir kalibrasyon adımı şiddetle tavsiye edilir. Buna ek olarak, sadece belirli bir etkileşimi ortaya çıkarmak için yüksek tuz yıkama tamponu enjekte etmek zorunludur bir sonucu olarak, bazı spesifik olmayan etkileşimlerle insan serum sonuçları gibi ham numune enjeksiyonu. Bir yıkama aşaması kesinlikle gerekli olduğunu da fazlalaştıSensör yüzeyine moleküller engelleme girmesinden sonra, bağlanmamış molekülleri kaldırın. ELISA zaman gereksinimleri gelince bir örnek analizi için (~ 16-18 saat) çok daha fazladır. Odak alt deteksiyon limiti ile karşılaştırma olarak tahlilin duyarlılığı, bu çalışma için özellikle geliştirilmiş edilen bir uzun bir enkübasyon süresi gereklidir.
Yüzey kimyasının seçimi bir uygulamadan diğerine değişir ve bu Spri tekniğinin sınırlama biri olarak gerçekleştirilebilir. Bu çalışmada, geniş ve kimyasal bağlayıcılar ve engelleme moleküllerin bir kombinasyon sensör yüzeyine rhGH optimal bağlanma etkinliğini gözlemlemek için doğru kombinasyonu elde etmek için değerlendirildi. Örneğin, bu çalışmada, BSA ve PEG kombinasyonu, spesifik olmayan etkileşimleri minimize iyi görev yaptı. Ancak, yakalama ligandı bir aptamer olan önceki bir çalışmada 17 bölgesi, PEG tek başına en iyi bloke molekül olarak görev yaptı. Değişkenlerliganda analitle etkiler bağlanma verimliliği tampon ve sıcaklık da pH değerine bağlıdır. Bu nedenle, herhangi bir uygulama ile, bu değişkenler optimize edilmesi gerekir. Buna ek olarak, bu çip yüzeyinde ligandın uygun lekelenme konsantrasyonunu belirlemek için önemlidir. Hareketsizleştirilmiş ligand konsantrasyonları bir dizi ile titrasyon deneyi çalışma başlamadan önce gerçekleştirilir. Bu rezidüel sıvı artık olduğu sağlanmalıdır olarak ELISA için olduğu gibi, prosedür çok önemli bir adımdır mikrotabla dokunarak kuyulardan yıkama tamponu süzün oldu. Herhangi bir artık sıvı, hedef numunenin sinyal okuma müdahale olarak pipet ile tampon yıkama çıkarılması yeterli değildi.
Duyarlılığı referans olarak, ELISA (1 ng / ml) spri (3.61 ng / ml), fakat nano spri (9.20 ug / ml) ile karşılaştırılabilir böylece rhGH alt biyolojik seviyelerde ölçüm sağlayan büyüklükte üç siparişleri hassasiyeti artırır 0,03 ng / ml olmuştur. Daha önce 1 bildirdiği gibi6,17, NanoEnhancers tarafından kazandırılan sinyal geliştirme kitle yükleme etkisi ve altın filmi nanoyapılarda NUR fluorophores ve çoğaltım yüzey plazmonları arasında var olan güçlü bağlantı atfedilir. Olsa bile, Nano-Spri prosedürüne fazladan bir adım ekliyor, hassasiyet bu seviyede çeşitli mağazalarında Spri teknolojisinin uygulamaları genişletmek olabilir.
ELISA tek afinite değerleri bildirebilirsiniz oysa Spri antikoru / rhGH etkileşiminin (K D, K a ve K d) bilim adamlarına tam kinetik profili sunmaktadır. Varyasyon katsayısı (CV) iyi tekrarlanabilirlik düşündüren, Spri (% 4.1) ve ELISA (% 6.5)% 10 altında olmuştur. Immobilize veya detektör çipi yakalama antikorları ELISA 96 oyuklu plaka içerisinde hareketsizleştirilmiş antikorlardan farklı olduğu için ELISA ve spri afinite değerleri farklıdır. Nano Spri gelince daha yüksek bir CV değeri (20%) gözlenmiştir. Erro kaynağı olarak katkıda bulunabilir birçok parametre vardırCV tespiti için rs. Örneğin, analit, çok daha düşük konsantrasyonu ölçülmüştür olan nano-spri deneyi ile, NanoEnhancers eklenmesi prosedüründe bir adım ekler ve deney elle uygulandı. Nano Spri ve ELISA ile çok iyi bir korelasyon sivri insan serumunda rhGH saptanması için elde edilmiştir. Son olarak, ELISA yöntemi kendisi hGH'nin olduğu gibi zor, gerçek zamanlı izleme ve çoğullama gerektiren durumlarda kullanmak için yapar zaman tüketen, ancak güvenilir bir teknik olabilir. Buna ek olarak, spri ELISA içinde yer alan bu çalışmada, doğrudan araştırılmadı daha çekici bir özelliği, aynı zamanda gerçek zaman içinde etkileşimlerin yüzlerce ölçülebilmesidir. Bu nedenle gelecekte, Nano-Spri yöntemi uygulanabilir bir klinik tanı aracı olarak potansiyel incelemek için çeşitli konsantrasyonlarda serumunda bulunan birden biyomarkerları aynı anda gerçek zamanlı olarak (çoklayıcı) tespit etmek değerlendirilecektir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Somatotropin Growth Hormone (GH1) capture antibody | Acris Antibodies | DM1015 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Bioreagents | BP671-10 | |
| Biotin labeled Somatotropin Growth Hormone (GH1) detection antibody | Acris Antibodies | AM09304BT-N | |
| 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide | TCI America | D1601 | |
| Ethanolamine | Acros Organics | 141-43-5 | |
| Ethanol | Fisher Chemicals | BP2818-4 | |
| Human HGH ELISA Kit | invitrogen | KAQ1081 | |
| Human Serum | Sigma Aldrich | H4522 | |
| Rabbit IgG Antibody | Sigma Aldrich | I5006 | |
| 11-mercaptoundecanoic acid | Sigma Aldrich | 450561 | |
| Nanostrip | Cyantek | ||
| N-hydroxysuccinimide | Sigma Aldrich | 130672 | |
| Phosphate Buffer Saline | Invitrogen | 00-3002 | |
| Polyethylene glycol (800 Da) | Sigma Aldrich | 729108 | |
| Recombinant Human Growth Hormone | Calbiochem | 869008 | |
| Sodium Acetate | Sigma Aldrich | 127-09-3 | |
| Sodium Chloride | Fisher Chemicals | 7647-14-5 | |
| Streptavidin coated near infrared quantum dots | Life Technologies | Q10171MP | |
| UV/Ozone Procleaner | Bioforce Nanosciences | ||
| Microwave reactor | CEM Corporation | Discover system | |
| SPRi-Arrayer | LabNext Xactll Microarray System | ||
| SPR biochip | HORIBA | ||
| SPRi-Lab+ | HORIBA | ||
| Synergy Mx Multimode Microplate reader | BioTek | ||
| ScrubberGen | HORIBA | Data Analysis software |
References
- Popii, V., Baumann, G. Laboratory measurement of growth hormone. Clinica Chimica Acta. 350 (1-2), 1-16 (2004).
- Higham, C. E., Trainer, P. J. Growth hormone excess and the development of growth hormone receptor antagonists. Exp Physiol. 93 (11), 1157-1169 (2008).
- Sönksen, P., Salomon, F., Cuneo, R. Metabolic effects of hypopituitarism and acromegaly. Horm Res. 36, Suppl 1. 27-31 (1991).
- Molitch, M., et al. Evaluation and Treatment of Adult Growth Hormone Deficiency: An Endocrine Society Clinical Practice Guideline. J Clin Endocrinol Metab. 91 (5), 1621-1634 (2006).
- The World Anti-Doping Code: The 2015 Prohibited List International Standard. , World Anti-Doping Agency. Available from: https://wada-main-prod.s3.amazonaws.com/resources/files/WADA-Revised-2014-Prohibited-List-EN.PDF (2015).
- The 2014 prohibited list world anti-doping code. , World Anti-Doping Agency. Available from: https://wada-main-prod.s3.amazonaws.com/resources/files/WADA-Revised-2014-Prohibited-List-EN.PDF (2014).
- Langkamp, M., Weber, K., Ranke, M. B. Human growth hormone measurement by means of a sensitive ELISA of whole blood spots on filter paper. Growth Horm IGF Res. 18 (6), 526-532 (2008).
- Rich, R. L., Myszka, D. G. Survey of the year 2007 commercial optical biosensor literature. J Mol Recognit. 21 (6), 355-400 (2008).
- Homola, J. Present and future of surface plasmon resonance biosensors. Anal Bioanal Chem. 377 (3), 528-539 (2003).
- Hoa, X. D., Kirk, A. G., Tabrizian, M. Toward Integrated Surface Plasmon Resonance Biosensors: A Review of Recent Progress. Biosens Bioelectron. 23 (2), 151-160 (2007).
- de Juan-Franco, E., Rodrìguez-Frade, J. M., Mellado, M., Lechuga, L. M. Implementation of a SPR immunosensor for the simultaneous detection of the 22K and 20K hGH isoforms in human serum samples. Talanta. 114, 268-275 (2013).
- de Juan-Franco, E., Caruz, A., Pedrajas, J. R., Lechuga, L. M. Site-directed antibody immobilization using a protein A-gold binding domain fusion protein for enhanced SPR immunosensing. Analyst. 138 (7), 2023-2031 (2013).
- Du, H., et al. Immunological screening and characterization of highly specific monoclonal antibodies against 20 kDa hGH. Bioanalysis. 4 (17), 2161-2168 (2012).
- Treviño, J., Calle, A., Rodrìguez-Frade, J. M., Mellado, M., Lechuga, L. M. Surface plasmon resonance immunoassay analysis of pituitary hormones in urine and serum samples. Clin Chim Acta. 403 (1-2), 56-62 (2009).
- Wu, Z., Bidlingmaier, M., Dall, R., Strasburger, C. J. Detection of doping with human growth hormone. Lancet. 353 (9156), 895 (1999).
- Malic, L., Sandros, M. G., Tabrizian, M. Designed biointerface using near-infrared quantum dots for ultrasensitive surface plasmon resonance imaging biosensors. Anal. Chem. 83 (13), 5222-5229 (2011).
- Vance, S. A., Sandros, M. G. Zeptomole Detection of C-Reactive Protein in Serum by a Nanoparticle Amplified Surface Plasmon Resonance Imaging Aptasensor. Sci. Rep. 4 (5129), 1-7 (2014).
- Uludag, Y., Tothill, I. E. Cancer biomarker detection in serum samples using surface plasmon resonance and quartz crystal microbalance sensors with nanoparticle signal amplification. Anal. Chem. 84 (14), 5898-5904 (2012).
- Špringer, T., Homola, J. Biofunctionalized gold nanoparticles for SPR-biosensor-based detection of CEA in blood plasma. Anal Bioanal Chem. 404 (10), 2869-2875 (2012).
