Summary
العمل المقترح يقيم إمكانات تشخيصية لتصوير سطح مأكل صدى المباشر وتضخيمها (سبري) المقايسات، وخاصة للكشف عن المؤتلف هرمون النمو البشري في مصل الدم البشري ارتفعت، من خلال مقارنة سبري يؤدي مباشرة مع متوفرة تجاريا انزيم مرتبط المناعي فحص (ELISA) عدة.
Abstract
طرق حساسة وانتقائية للكشف عن هرمون النمو البشري (HGH) على نطاق واسع من تركيزات (مستويات عالية من 50-100 نانوغرام مل - 1 والحد الأدنى من مستويات 0.03 نانوغرام مل - 1) في تعميم الدم ضرورية إلى مستويات متغيرة يجوز يشير علم وظائف الأعضاء تغييرها. على سبيل المثال، اضطرابات النمو التي تحدث في مرحلة الطفولة يمكن تشخيصها عن طريق قياس مستويات هرمون النمو في الدم. أيضا، إساءة استخدام المؤتلف هرمون النمو في مجال الرياضة يشكل ليس فقط قضية أخلاقية ويعرض أيضا تهديدات صحية خطيرة لالمسيء. واحد استراتيجية شعبية لقياس هرمون النمو سوء الاستخدام، ويعتمد على الكشف عن نسبة 22 كيلو دالتون هرمون النمو في إجمالي هرمون النمو، وانخفاض مستويات الذاتية غير 22 كيلو دالتون بعد الخارجية المؤتلف هرمون النمو (rhGH) الإدارة. سطح التصوير بالرنين مأكل (سبري) هو أداة تحليلية تسمح المباشر (بدون تسمية) رصد والتصور من التفاعلات الجزيئية البيولوجية عن طريق تسجيل التغييرات من دائرة الهجرة والجنسية الانكسارالسابق المجاور لسطح جهاز الاستشعار في الوقت الحقيقي. في المقابل، فإن الأكثر استخداما الأسلوب اللونية، انزيم مرتبط المناعي فحص (ELISA) يستخدم الإنزيم المسمى الأجسام المضادة كشف لقياس تركيز تحليلها بشكل غير مباشر بعد إضافة المادة التي يؤدي الى تغير لونها. لزيادة حساسية الكشف، يستخدم تضخيم سبري شكل شطيرة فحص وبالقرب من نقاط الكم الأشعة تحت الحمراء (QDS) لزيادة قوة الإشارة. بعد الكشف عن سبري المباشر المؤتلف rhGH في مصل الدم البشري ارتفعت، يتم تضخيمه إشارة سبري من قبل حقن متتابعة من الكشف عن الأجسام المضادة المغلفة مع قرب ما تحت الحمراء QDS (نانو-سبري). في هذه الدراسة، تم تقييم إمكانات التشخيص من سبري المباشر وتضخيمها لقياس rhGH ارتفعت في مصل الدم البشري ومقارنة مباشرة مع قدرات المتاحة تجاريا ELISA عدة.
Introduction
هرمون النمو البشري (HGH) هو الببتيد حمض الأميني 191 (22 كيلو دالتون) التي تنتجها الغدة النخامية ومباشرة تطلق في مجرى الدم. التفاعلات بين المهاد النمو الببتيد بين الافراج عن هرمون (GHRH) والموجهة الجسدية تحفز الإفرازات نابض من هرمون النمو. ونتيجة لذلك، ومستويات هرمون النمو تختلف من أعلى مستوى في 50-100 نانوغرام / مل إلى أدنى مستوى له في نطاق 0.03 نانوغرام / مل 1. نقص أو فائض من هرمون النمو في الجسم يمكن أن تثير مجموعة واسعة من أعراض فسيولوجية غير طبيعية. على سبيل المثال، يمكن لمستويات مفرطة من هرمون النمو يؤدي إلى العملقة 2 و 3 السكري. مستويات المنضب من هرمون النمو يسبب انخفاض نسبة السكر في الدم في الأطفال حديثي الولادة، وضعف كثافة العظام والاكتئاب لدى البالغين 4.
إدارة النموذج المؤتلف من هرمون النمو (rhGH) يحسن كتلة العضلات الهزيل مع تقليل الدهون في الجسم. على هذا النحو، أصبحت هذه المادة الدواء المفضل للرياضيين المحترفين والهواة كما أنه يحسن القوة البدنية التي تمنح لأدفantage في الرياضات التنافسية. يحظر rhGH من قبل الوكالة العالمية لمكافحة المنشطات (وادا) 5،6 وبذل الكثير من الجهد من قبل وقد تركز على تطوير الاختبارات التي يمكن الكشف عن وجودها أو تأثير الابتنائية الباحثين الدوليين.
وقد انزيم مرتبط المناعي فحص (ELISA) الأسلوب المفضل لتحديد هرمون النمو في الدم الكامل (7). وعلى الرغم من ELISA هو أسلوب موثوق تقدم حساسية جيدة والانتقائية، فمن زمني نسبيا ويحتاج إلى عمالة كثيفة. وبالإضافة إلى ذلك، تعتمد ELISA على الكشف غير المباشر للهرمون النمو عن طريق استخدام علامات الأنزيمية. في المقابل، صدى مأكل السطحية (SPR) يسمح الكشف عن هرمون النمو بشكل مباشر دون استخدام تسميات في الوقت الحقيقي. مبدأ الكشف وراء SPR ينطوي على السطح الاستشعار التي تتكون من المنشور الذي المغلفة بطبقة معدنية رقيقة (الذهب أو الفضة)؛ عندما يتفاعل الضوء المستقطب أحادية اللون مع سطح المعدن، يتم إنشاء "البلازمونات السطح". الربط لتحليلهاإلى مستقبلات سطح يجمد على سطح المعدن يشوش الظروف الرنين مما أدى إلى تراجع صدى تحول، ومن ثم يمكن ربطها تركيز تحليلها. أجهزة الاستشعار مقرها SPR-هي الآن متاحة تجاريا التي تقدم في الوقت الحقيقي، والتسمية تقنية مجانية لمراقبة الجزيئية البيولوجية ملزمة الأحداث والتفاعلات الكيميائية الحيوية 10/08. وفي الآونة الأخيرة، وقد وضعت سبري في استجابة للحاجة لمضاعفة (أي رصد الأحداث ملزمة متعددة في وقت واحد)، والتي لم يكن ممكنا في أجهزة الاستشعار SPR الكلاسيكية. وهكذا، برزت سبري كأداة لمراقبة العديد من الفعاليات ملزمة في وقت واحد. وتقوم أنظمة سبري الحالية على التصوير المجهري للسطح الذي هو متحمس مع الضوء في زاوية والطول الموجي 10 محددة. ثم يتم التقاط الصورة على جهاز (CCD) مجموعة إلى جانب المسؤول.
حتى الآن، كان هناك عدد قليل من المقايسات مقرها SPR-المتقدمة للكشف عن هرمون النمو 11-14. واحد استراتيجية معينة، والمعروفة باسم طريقة الإسوي 15، تعتمد على الكشف عن نسبة 22 كيلو دالتون هرمون النمو في إجمالي هرمون النمو، وانخفاض مستويات الذاتية غير 22 كيلو دالتون بعد تناوله rhGH الخارجية. في الآونة الأخيرة، دي خوان فرانكو وآخرون 11 تقريرا عن وضع immunosensor استنادا SPR-للكشف الانتقائي للكيلو دالتون 22 و 20 كيلو دالتون إيسفورمس هرمون النمو في عينة مصل الإنسان. وقد ثبتوا الاجسام المضادة الخاصة بكل شكل الإسوي مباشرة على جهاز استشعار الذهب السماح لقياس كل من إيسفورمس في وقت واحد في حقنة واحدة مع الحد من الكشف على 0.9 نانوغرام مل -1. بدلا من ذلك، تم استخدام SPR لفحص الأجسام المضادة مع خصوصية عالية لهرمون النمو 13. إذا كان تركيز الحليلة المستهدفة إلى ما دون الحد النظام سبري للكشف (<نانومتر)، على المرء أن يلجأ إلى تضخيم إشارة سبري عبر استخدام الجسيمات النانوية (النانو سبري). وقد تم توثيق هذا التضخيم استنادا SPR جيدا في الأدب 16-19 ل Vأنواع arious الحليلة والسطوح.
في هذا العمل، تم فحص إمكانيات تحليلية لسبري ونانو سبري أجهزة الاستشعار مقرها، وخاصة للكشف عن rhGH في مصل الدم البشري ارتفعت، والمقارنة من القدرة على الكشف بشكل مباشر إلى ELISA. وسيتم استعراض المعلمات التالية واعتبر: الوقت الكشف، والحساسية، لمحة الحركي، واستنساخ وخصوصية.
Protocol
1. إعداد الحلول وعينات البروتين لسبري
- إعداد 100 مل من الملح منخفضة الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) محلول يحتوي على 10 ملي فوسفات و 150 ملي كلوريد الصوديوم، ودرجة الحموضة 7.4.
- إعداد 50 مل من الملح العالية PBS محلول يحتوي على 10 ملي فوسفات و 750 ملي كلوريد الصوديوم، ودرجة الحموضة 7.4.
- إعداد 5 مل من 10 ملي خلات الصوديوم.
- إعداد مخزون من 5 ملغ / مل ألبومين المصل البقري (BSA) المخفف في الملح منخفضة PBS الحل.
- يعد حل الأسهم المؤتلف هرمون النمو البشري (rhGH) بتركيز 1 ميكروغرام / مل في الملح منخفضة PBS الحل.
- إعداد الحلول الأسهم المضادة للrhGH والسلبية مراقبة الأجسام المضادة عند تركيز 100 ميكروغرام / مل.
2. إعداد سبري رقاقة لصفيف الأضداد
- تنظيف رقاقة صوتنة في 120 مل من محلول البيرانا استقرت (3: 1 حمض الكبريتيك المركز إلى 30٪ بيروكسيد الهيدروجين) لمدة 90 دقيقة في 50 ° C ومتابعة من قبل الشطفوصوتنة مع الماء لمدة 5 دقائق. ثم، وشطف رقاقة مع الإيثانول والجافة مع تيار النيتروجين.
- وضع رقاقة الذهب في غرفة الأشعة فوق البنفسجية / الأوزون لمدة 30 دقيقة لإزالة أي ملوثات.
- إضافة 150 ملغ من حمض 11 mercaptoundecanoic إلى 20 مل ايثانول في أنبوب اختبار يحتوي على بقضيب وغطاء الأنبوب.
- ضع الشريحة في أنبوب الاختبار والميكروويف أنبوب / رقاقة في 50 W و 50 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
- شطف رقاقة مع الإيثانول ونقع في الإيثانول لمدة 5 دقائق.
- متابعة من قبل الشطف بالماء وينقع في الماء لمدة 5 دقائق.
- إضافة 150 ملغ من 1-إيثيل 3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide إلى 20 مل من الماء في أنبوب اختبار يحتوي على بقضيب وغطاء الأنبوب. رقاقة الميكروويف كما في الخطوة 2.4.
- شطف رقاقة بالماء وينقع في الماء لمدة 5 دقائق.
- إضافة 150 ملغ من N-hydroxysuccinimide في 20 مل من الماء في أنبوب اختبار يحتوي على بقضيب وغطاء الأنبوب. رقاقة الميكروويف كما في الخطوة 2.4.
- شطف رقاقة بالماء وينقع في الماء لمدة 5 دقائق.
- استعداداتإعادة 250 ميكرومتر البولي ايثيلين جلايكول (PEG، 800 دا) في 20 مل من الماء في أنبوب اختبار يحتوي على بقضيب وغطاء الأنبوب. رقاقة الميكروويف كما في الخطوة 2.4.
ملاحظة: الميكروويف PEG800 على السطح من أجهزة الاستشعار يتم تنفيذ كخطوة حجب لمنع غير محددة وملزمة للبروتينات مصل والمجمعات النقطة الكمومية استخدامها لاحقا في التجربة. ويتحقق ذلك عن طريق PEG800 التفاعل مع مواقع الذهب العارية غير المحتلة على رقاقة. - شطف رقاقة بالماء وينقع في الماء لمدة 5 دقائق.
- إعداد 15 ميكروغرام / مل من مكافحة rhGH حل الأجسام المضادة والحل السيطرة السلبي لمكافحة المناعي G (المضادة للمفتش) وإضافة 10 ميكرولتر من كل حل الأجسام المضادة لبئر في لوحة جيدا 384.
- تصميم نمط اكتشاف في microarrayer (4 × 7 الأرباع لكل عينة) ورقاقة بقعة مع الأجسام المضادة باستخدام 500 ميكرون تفلون يميل دبوس.
- احتضان شريحة رصدت لمدة 2 ساعة على RT وتحت جو رطب من 75٪ أو أكثر.
- شطف وينقع في الماء لمدة رقاقة5 دقائق. ثم، ورقاقة الجاف مع تيار النيتروجين.
3. سبري تجربة الإعداد وحجب
- تهيئة الصك والدليل حدد. حدد الكاميرا في الوقت الحقيقي وبدء ضخ حقنة في 1 مل / دقيقة لمدة 10 مل من الماء نزع الغاز. إدراج شريحة في الصك والحفاظ على الماء عن طريق الحقن حتى تتم إزالة كافة الفقاعات.
- بعد الشطف رقاقة مع 10 مل من الماء، وبدء الحصول على الصور، ومتابعة من قبل تبديل عازلة لPBS قليل الملح والسماح لها ليتم تشغيلها في 1 مل / دقيقة لمدة 5 مل ومعدل التدفق ثم يتباطأ إلى 20 ميكرولتر / دقيقة لمدة 20 دقيقة .
- حدد الصورة يتناقض إلى حد كبير، مما يدل على الأجسام المضادة يجمد رصدت على رقاقة.
- تحديد وتعريف 400 ميكرون بقع دائرية الفردية الموافق الأجسام المضادة يجمد.
- بعد إيداع الصك يتتبع المنحنيات مأكل، واختيار زاوية العمل الذي يحتوي على أعلى منحدر في منحنيات انعكاسية.
- تدفق منطقة عازلة على التوالي في 20 ميكرولتر / دقيقة من الصورة منخفضةALT PBS من خلال النظام حتى الإشارة من كل من المواقع المختارة تستقر.
- تحميل BSA (100 ميكروغرام / مل) في إدارة عازلة في حلقة العينة (150 ميكرولتر) مع صمام حقن في موقف الحمل. ثم تبديل صمام لموقف الحقن لحقن حل للخلية التدفق.
ملاحظة: يتم حقن BSA لربط تساهمي إلى السطح التفاعلي أمين، سوف تبقى غير منضم BSA يغسل السطح من خلال العازلة الشطف. - ضخ 150 ميكرولتر من محلول 10 ملي خلات الصوديوم على سطح ومتابعة من قبل ضخ 150 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني الملح العالية.
- ضخ 150 ميكرولتر من ايثانول (1 ملم) لتنشيط سطح رد الفعل أمين.
- ضخ 150 ميكرولتر من 10 ملي خلات الصوديوم لغسل السطح.
- ثم، تبديل المخزن المؤقت تشغيل لبرنامج تلفزيوني مع 50 ميكروغرام / مل BSA بمعدل تدفق 250 ميكرولتر / دقيقة ليصبح المجموع 5 مل.
ملاحظة: 50 ميكروغرام يضاف / مل BSA إلى المخزن المؤقت الترشح لحجب إضافية من سورالوجه غير تساهمي تحتل مواقع غير محددة ويتم ذلك للحد من زيادة غير محددة وملزمة للبروتينات مصل إلى السطح. - تغيير معدل التدفق إلى 5 ميكرولتر / دقيقة والسماح لها لتحقيق الاستقرار لمدة 20 دقيقة.
4. كشف سبري من هرمون النمو البشري
- تحضير محلول بتركيز مجموعة من rhGH (30000 الغرام / مل، 250 غ / مل، و 25 جزء من الغرام / مل؛ 2.5 غ / مل و 0.25 جزء من الغرام / مل) في 10٪ مصل والمخففة في برنامج تلفزيوني يحتوي على 1 ملغ / مل BSA.
- إعداد 2: حل 1 بإضافة 1 ميكرولتر من البيوتين المسمى مكافحة rhGH الأجسام المضادة الكشف (6 ميكرومتر) إلى 3 ميكرولتر من streptavidin المغلفة في أنبوب 0.5 مل microcentrifuge لقرب نقاط الكم الأشعة تحت الحمراء (1 ميكرومتر)، واحتضان لمدة 30 دقيقة لاقتران فعالة .
- ضخ 150 ميكرولتر من هرمون النمو ارتفعت حل المصل البشري في حلقة الحقن. وهذا يؤدي إلى زيادة كبيرة في إشارة يتبعه انخفاض بطيء من المصل ملزمة غير تحديدا الشطف من السطح.
- مرة واحدة علامةآل استقرار، وغسل السطح بمحلول مكون من 450 ملي كلوريد الصوديوم المضافة إلى المخزن المؤقت قيد التشغيل.
- تمييع الحل من الأجسام المضادة كشف المضادة للrhGH والنقاط الكمومية إلى تركيز من 10 نانومتر (2: 1) مع تشغيل العازلة (PBS مع 50 ميكروغرام / مل BSA) وحقن في الخلية التدفق.
5. تحليل البيانات سبري
ملاحظة: بعد حقن rhGH ارتفعت المصل البشري والكم نقطة محسن، تحدث زيادة في تغيير الانعكاس بسبب التحول تضخيم منحنيات مأكل. هذه النتائج في صورة الفرق تظهر الصورة على نطاق والرمادي مرتبطا إشارة من على رقاقة.
- استيراد البيانات إلى برنامج تحليل البيانات. رسم إشارة سبري (٪ الانعكاسية) مقابل الوقت (ق) وتحديد الفرق بين مكافحة rhGH والبقع مراقبة الأجسام المضادة السلبية بعد غسل عالية من الملح.
6. بروتوكول ELISA (يوم 1)
- تخزين شملت جميع مكونات فحص ط ن عدة rhGH ELISA في 2-8 ° C. وهذا يشمل الأجسام المضادة لمكافحة rhGH لوحات مغلفة جيدا، ومعايير (0-5) في مصل الأغنام، وضوابط (1 و 2) في مصل الدم البشري، عازلة المترافقة، (200X) غسل العازلة، مولد اللون TMB (Tetramethylbenzidine) ووقف كاشف.
- إعداد الكواشف وتابع الطرق كما هو موضح في البروتوكول عدة ELISA التجاري.
- لأول مرة، والسماح للالأجسام المضادة لمكافحة rhGH المغلفة 96 بئرا لتدفئة لRT قبل فتح الحزمة احباط.
- ثم إزالة العدد المطلوب من شرائط 8-جيدا لفحص وختم الحزمة احباط تحتوي على الآبار المتبقية وتخزينها في 2-8 ° C.
- إعداد المعايير إعادة في 2 مل من الماء المقطر لمعيار # 0، في 1 مل من الماء المقطر لمعايير (1-5)، وفي 1 مل من الماء المقطر لعناصر (1 و 2). وفيما يلي جدول تركيزات المقابلة من المعايير والضوابط (الجدول 1):
| المعايير | تركيز (نانوغرام / مل) |
| 0 | 0 |
| 1 | 0.17 |
| 2 | 0.94 |
| 3 | 2.63 |
| 4 | 10.4 |
| 5 | 26.9 |
| السيطرة # 1 | 1.22 ± 0.33 نانوغرام / مل |
| السيطرة # 2 | 4.97 ± 1.25 نانوغرام / مل |
الجدول 1. تركيزات من المعايير والضوابط الواردة في ELISA عدة التجارية.
- إعداد العينات والتي تتكون من هرمون rhGH في مصل الدم البشري 10٪ في التخصصات التالية (الجدول 2):
| <قوي> عينة | تركيز (نانوغرام / مل) |
| 1 | 0.025 |
| 2 | 0.2 |
| 3 | 0.5 |
| 4 | 2.5 |
| 5 | 10 |
| 6 | 30 |
الجدول 2. تركيزات العينات rhGH أعدت في 10٪ مصل.
- إضافة 50 ميكرولتر من كل مستوى، ومراقبة وعينة إلى كل بئر (في يثلث). اغلاق الآبار واحتضان مع المعايير والضوابط، وrhGH عينات O / N عند 4 درجات مئوية تحت الهز لطيف.
7. بروتوكول ELISA (يوم 2)
- إزالة لوحة من شاكر واتركه حتى نستريح لRT (15-20 دقيقة) قبل الشروع في الفحص.
- إزالة مكافحة rhGH-HRP، عازلة المترافقة، غسل العازلة (200X)، مولد اللون TMB (tetramethylbenzidine)، وهوتوقف كاشف د من الثلاجة وتسمح بتنشيط RT.
- إعداد الكاشف: (وفقا لمواصفات الشركة الصانعة)
- تمييع مكافحة rhGH-HRP 40X مع العازلة المترافقة. إعداد العازلة يغسل عن طريق تمييع 200X مع الماء المقطر.
- إضافة 50 ميكرولتر من مكافحة rhGH-HRP المترافقة في كل بئر، وختم الآبار واحتضان في RT لمدة 30 دقيقة في حين يهز بلطف.
- صب الحل من الآبار وعكس لوحة والاستفادة الجافة على والأنسجة الماصة. ثم إضافة 200 ميكرولتر من غسل العازلة في كل بئر.
- صب محلول الغسيل والاستفادة الجافة على والأنسجة الماصة. كرر هذه الخطوة 3 مرات.
- إضافة 100 ميكرولتر من مولد اللون في كل بئر خلال 15 دقيقة بعد خطوة الغسيل. احتضان لمدة 30 دقيقة في RT في الظلام بينما تهز بلطف. الحلول تتحول من عديم اللون إلى اللون الأزرق.
- إضافة 100 ميكرولتر من كاشف توقف في كل بئر. الحلول تتحول من اللون الأزرق إلى اللون الأصفر. على الفور، وقراءة عشرالبريد الامتصاصية من كل بئر في 450 نانومتر باستخدام قارئ صفيحة ميكروسكوبية.
- رسم المنحنى القياسي للمعايير المقدمة (0-5). ثم رسم كثافة ضوئية من rhGH في عينات المصل 10٪ مقابل تركيز كل عينة.
Representative Results
ومقارنة أداء سبري ونانو سبري (سبري توظيف NanoEnhancers) مع ELISA للكشف عن rhGH في بيئة معقدة. ووصف الاختلافات في الإعداد لهذه الأساليب هنا لفترة وجيزة. لسبري (كشف المباشر، والشكل 1)، وثبتوا على التقاط الأجسام المضادة على السطح ثم يتم حقن العينة وتجليد تحليلها إلى السطح الاستشعار يقاس مباشرة في الوقت الحقيقي، وبطريقة خالية من التسمية. ومع ذلك، مع نانو سبري (الشكل 1)، بعد يربط الحليلة إلى السطح الاستشعار، ويتبع حقن التوالي مع نقاط الكم المغلفة مع الأجسام المضادة كشف لتضخيم إشارة سبري.
الشكل 1. التمثيل التخطيطي مقارنة الوضع المباشر (سبري) وتضخيمها واسطة (نانو-سبري) الكشف عن rhGH في ج وقد ثبتوا عينات غير مهذب. الليجندات (rhGH أو مفتش الاجسام المضادة المحددة) في شكل مجموعة على بيوشيب سبري. البروتين المستهدف (rhGh) ارتفعت في مصل الدم البشري التي أدخلت على سطح جهاز الاستشعار يتم الكشف مباشرة (سبري) وسلط الضوء بشكل متتالي مع NanoEnhancers (نانو-سبري). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
أما بالنسبة ELISA، لوحات multiwell تصل بالفعل functionalized قبل مع التقاط الأجسام المضادة ومن ثم يتم إدخال العينة وتحليلها من الفائدة ستكون ملزمة. تم تقديم الأجسام المضادة كشف تليها بالإضافة الركيزة. ثم يتم قياس الكثافة البصرية في 450 نانومتر. في هذه الدراسة، تم استخدام ELISA عدة التجارية (الشكل 2) لقياس rhGH ارتفعت في مصل الدم البشري 10٪.
8 / 53508fig2.jpg "/>
الشكل 2. التمثيل التخطيطي ELISA إجراء الفحص. هو عرض البروتين rhGH (البيضاوية الزرقاء) إلى الآبار التي تم functionalized قبل مع الاجسام المضادة (الصفراء) محددة لrhGH. يتم استبعاد التفاعلات غير محددة من قبل الشطف الآبار مع العازلة غسل تليها مقدمة من الأجسام المضادة كشف prefunctionalized مع الفجل البيروكسيديز (HRP والأرجواني). والحل تغيير في اللون بعد إضافة tetramethylbenzidine الركيزة (TMB، والذهب). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
يمثل الرقم 3 منحنى المعايرة من rhGH ارتفعت في مصل الدم البشري 10٪ ويتم رسم مقابل OD حصلت على 450 نانومتر. ولوحظ وجود استجابة خطية جيدة وأنها عازمة على الحد من الكشف أن تكون 1 نانوغرام / مل. معامل فاركان ينتقم (CV) 6.5٪ مما يشير إلى استنساخ جيدة.
الشكل 3. تحليل البيانات ELISA. تركيز rhGH ارتفعت في مصل الدم هو تآمر ضد OD حصلت على 450 نانومتر. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
بعد ذلك، تم تقييم للكشف عن rhGH ارتفعت في مصل الدم البشري مع سبري. أدى الكشف المباشر من rhGH مع المقابل منحنى تركيز الانحدار (الشكل 4)، كل نقطة تمثل متوسط قيمة الفرق انعكاسية تحسب من ثلاثة سبري منحنيات الحركية لكل تركيز. تم تحديد الحد من الكشف (اللد) ليكون 3.61 نانوغرام / مل. كان سبري الكشف المباشر فحص تكرار للغاية كما أن السيرة الذاتية للمقايسةو٪ فقط 4.1.
الرقم 4. الكشف المباشر سبري من هرمون النمو ارتفع في مصل الدم البشري 10٪، وتطبيع سبري مؤامرة الحركية الناتجة بعد حقن كميات متنوعة من هرمون النمو ارتفعت في مصل الدم البشري تليها حقن عازلة الملح العالية (خط عمودي متقطع) لإزالة غير التفاعلات -specific. منحنى تركيز التدرج تمثل الربط كميات مختلفة من هرمون النمو ارتفع في مصل الدم البشري إلى السطح الاستشعار التي تم prefunctionalized مع المعقدة البيروكسيديز هرمون النمو محددة الأجسام المضادة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
لزيادة حساسية جهاز الاستشعار البيولوجي سبري، NanoEnhancers (QDS مسبقا بين functionalized مع الأجسام المضادة كشف) وبالتتابع فيعرضوا على سطح جهاز الاستشعار من أجل تسليط الضوء على وجود rhGH ارتفعت في مصل الدم البشري. بعد الطرح الخلفية، كانت NanoEnhancers قادرة على تضخيم استجابة جهاز الاستشعار البيولوجي يصل إلى 7.9٪، ومع ذلك، مع الحد الأدنى من التغيير إشارة (المناعي G (مفتش) الأجسام المضادة -specific، وتغير 0.38٪ في انعكاسية؛ الرقم 5 على المناطق التي تسيطر عليها المصالح تصوير. كشفت سطح استشعار أن المناطق الوحيدة الفائدة التي ديهم أجسام مضادة ضد rhGH محددة يجمد خبرة أكبر تغيير على النقيض مؤيدة مباشرة مع استجابة sensorgram الحركية.
الرقم 5. الكشف عن rhGH باستخدام فحص شطيرة ارتفعت في مصل الدم البشري 10٪. سبري مؤامرة الحركية بعد حقن rhGH (30 نانوغرام / مل) في المخزن (10 ملي PBS، 150 ملي كلوريد الصوديوم، ودرجة الحموضة = 7.4) على ما قبل رقاقة -functionalized مع حمض 11 mercaptoundecanoic / rhGH-الأجسام المضادة المحددة والسيطرة مفتش الأجسام المضادة ثم سدت مع BSA تليها إضافة للكشف عن الأجسام المضادة المغلفة نقاط الكم (NanoEnhancers). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
للتدليل على الطابع العملي للجهاز الاستشعار البيولوجي نانو سبري، تم تقييم مدى القياس من rhGH في عينات الخام. أدت مجموعة عمل موسعة من 30000 خريج / مل و 0.25 جزء من الغرام / مل كرد فعل لإضافة NanoEnhancers (الشكل 6). ومن الجدير بالذكر أن كل نقطة على منحنى المعايرة وبلغ متوسط من ثلاث تجارب مستقلة. ونتيجة لذلك، تم حساب الحد الأدنى من الكشف لتكون 9.20 غ / مل وكان معامل الاختلاف 20٪.
الرقم 6.كشف النانو سبري من هرمون النمو ارتفع في مصل الدم البشري. تطبيع سبري تمثيل مؤامرة الحركي للإشارة hGH_specific_Anti-QDS تضخيم للعينات مصل الإنسان ارتفعت مع تركيزات مختلفة من هرمون النمو. A خط عمودي متقطع (الرمادي) يمثل نقطة حقن المخزن المؤقت التوالي. (ب) منحنى تركيز التدرج تمثل ملزم من NanoEnhancers (hGH_specific_Anti-QDS) بعد حقن كميات متنوعة من هرمون النمو ارتفع في مصل الدم البشري إلى السطح الاستشعار التي تم prefunctionalized مع حمض 11 mercaptoundecanoic / هرمون النمو محددة الأجسام المضادة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
بعد ذلك، تمت مقارنة التغير الذي يحدث في منحنى الانعكاسية SPR بوصفها وظيفة من تركيز بين المباشر وأسلوب الأحيائي NanoEnhancer (الشكل 7). لدي مباشر تقنية احلماية بين 25 و 0.25 جزء من الغرام / مل، بدأت إشارة إلى هضبة وهذا ليس مستغربا كما تندرج هذه التركيزات أقل من اللد من 3 نانوغرام / مل (الشكل 7). وبالمثل، للتقنية تضخيم، بدأت تركيزات أقل من اللد من 9.2 خريج إشارة / مل إلى الهضبة وأظهرت عمليا أي اختلاف.
الرقم 7. تحليل مقارن للسبري مع نانو سبري. ويصور هذا الرسم البياني شريط التغيير في المئة في انعكاسية (٪ R) بعد إدخال rhGH ارتفعت في مصل الدم البشري (الكشف المباشر) تليها حقن NanoEnhancers (كشف تضخيم) ل 30،000 جزء من الغرام / مل، 250 غ / مل، 25 جزء من الغرام / مل، 2.5 غ / مل و 0.25 جزء من الغرام / مل. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
-page = "1"> وعلاوة على ذلك، تم تقييم خصوصية جهاز الاستشعار البيولوجي نانو سبري. الذي يشبه الانسولين عامل النمو 1 ارتفعت (IGF-1) في مصل الدم البشري تم حقن كعنصر تحكم منذ هرمون النمو يحفز إفراز IGF-1 عن طريق مستقبلات هرمون النمو على غشاء الخلية الكبدية. بعد الحقن من IGF-1 في الدم، وكانت NanoEnhancers حقن بالتتابع ولم الاستجابة إشارة SPR لا تظهر أي محددة ملزمة (الشكل 8). ومع ذلك، عندما ارتفعت rhGH في عينة مصل تم حقن لنفس البقعة functionalized مع rhGH الأجسام المضادة، لوحظ تعزيز إشارة. في الختام، منصة نانو سبري وقد أثبتت خصوصية ممتازة والانتقائية للrhGH.
الرقم 8. تقييم نانو سبري الانتقائية تجاه rhGH. واستجابة جهاز الاستشعار البيولوجي نانو سبري بعد حقن rhGH (أسود) وIGF-1 (الحمراء) في الصورةمصل مؤنف. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
تم إجراء تحليل الارتباط باستخدام معامل ارتباط بيرسون لتحديد العلاقة بين كثافة إشارة سبري وELISA قيم الكثافة الضوئية (الشكل 9). واعتبر A-قيمة P <0.01 كبيرة. كما هو موضح في هذا الرسم البياني، هناك علاقة جيدة بين مستويات rhGH في مصل الدم البشري ارتفعت تقاس سبري وELISA. وكانت القيمة ص 0.9263 ل9 عينات مختلفة.
الرقم 9. بيرسون تحليل الارتباط بين ELISA ونانو سبري. يرتبط المؤامرة نانو سبري كثافة إشارة (المحور الصادي) مع الكثافة البصرية ELISA (محور س) القيم. (الكمثرىعلى معامل ارتباط ن = 9، ص = 0،9263، ص = 0.00000183). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
تم تحديد ثابت التوازن التفكك (K D) باستخدام برنامج graphpad لELISA. وكانت القيمة المحسوبة K D حوالي 79 نانومتر (الجدول 3). لا يمكن تحديد على (K أ) وإيقاف (K د) أسعار الفائدة بمقدار ELISA. ومع ذلك، باستخدام برمجيات تحليل البيانات، نتج عن طريقة الكشف المباشر مع K قيمة D من 23 PM باستخدام الكتلة الجزيئية من 22 كيلو دالتون الذي يتوافق مع جزيء واحد rhGH. وعلى نحو متقطع معدلات حسبت أن تكون 6.1 X10 7 M -1 ق -1 و 1.33 × 10 -3 ثانية -1 على التوالي. وهذا يترجم بطبيعتها أن 0.13٪ من rhGH ومجمعات الأجسام المضادة تسوس في الثانية الواحدة. أما بالنسبة لللmplified التجربة سبري، لوحظ وجود تفاعل الكلي أقوى بين NanoEnhancers وrhGH كما تقارب ملزم تحسب تقرر أن يكون 04:03. بالإضافة إلى ذلك، لوحظ وجود معدل ارتباط أقوى لNanoEnhancers وrhGH من التقاط الأجسام المضادة / rhGH، ومع ذلك يوحي معدل التفكك أن 0.26٪ من NanoEnhancer / rhGH / التقاط الأجسام المضادة تسوس في الثانية الواحدة.
| طريقة | K D (الانجذاب) | K على (سعر الفائدة على) | K د (خارج معدل) | اللد |
| ELISA | 79.45 × 10 -9 M | NA | NA | 1 نانوغرام / مل |
| سبري | 23.2 × 10 -12 M | 6.1 × 10 7 M -1 ثانية -1 | 3.61 نانوغرام / مل | |
| نانو سبري | 4.33 × 10 -12 M | 7.54 X10 8 M -1 ثانية -1 | 2.62 X10 -3 ثانية -1 | 0.0092 نانوغرام / مل |
الجدول 3. كامل تحليل البيانات الحركية. تقييم تقارب، على معدل وخارج معدل استجابات الأجسام المضادة باستخدام graphpad (ELISA)، وتحليل البيانات (سبري ونانو سبري) والبرمجيات. تم اختيار تصميم الطمع باستخدام الكتلة الجزيئية من 22 كيلو دالتون الذي يتوافق مع جزيء واحد rhGH. تم تحديد حدود الكشف عن جميع الدراسات الثلاث باستخدام اكسل.
Discussion
مستويات غير النظامية من هرمون النمو، وهو هرمون التي تحدث بشكل طبيعي، وقد تم ربط إلى العديد من الاضطرابات الصحية التي تؤثر على نمو الإنسان وتطوره. وعلاوة على ذلك، يتم استخدام الإدارة الخارجية من rhGH عادة من قبل الرياضيين، على الرغم من أنها حرام، كعامل المنشطات لتحسين أدائهم. التحديات في الكشف عن rhGH نتيجة سوء استخدام من صعوبة في التمييز خارجي هرمون النمو من شكل الذاتية. على هذا النحو، والتقنية المعتمدة حاليا للكشف عن هرمون النمو خارجي تعتمد على قياس نسبة 22 كيلو دالتون هرمون النمو الإسوي فيما يتعلق 20 كيلو دالتون الإسوي. منذ مطالب اختبار الإسوي لقياس متعددة هرمون النمو إيسفورمس في وقت واحد في غضون فترة قصيرة من الزمن في مجموعة واسعة من التركيزات، وبالتالي فإننا يعتبر منصة سبري بمثابة مباراة مثالية. بالإضافة إلى ذلك، مستوى هرمون النمو الذاتية تتقلب إلى مستوى منخفض جدا (0.03 نانوغرام / مل) في مجرى الدم لذلك يجب أن يكون نظام الكشف قادرة على قياس هذا النطاق بشكل مريح مع ارتفاع ليرة سوريةecificity. ونتيجة لذلك، ونحن التحقيق أيضا في هذه الدراسة إمكانية نانو سبري كأداة تشخيصية لهرمون النمو ومقارنة مباشرة مع سبري والمناعية الكلاسيكية ELISA.
استنادا إلى النتائج التي تم الحصول عليها من هذه الدراسة، والميزة الرئيسية للطريقة سبري ونانو سبري هي أن تركيزات rhGH يمكن قياسها بطريقة أسرع بالمقارنة مع طريقة أكثر تقليدية ELISA. وكان من مدة قياسية لقياس مستويات rhGH في عينة واحدة مع طريقة الكشف المباشر 1 ساعة في حين أن نانو سبري المطلوبة 2 ساعة بسبب الخطوات الإضافية في هذه العملية. وعموما، مع سبري ونانو سبري التجارب، قبل حقن عينة، ينصح بشدة خطوة المعايرة. وبالإضافة إلى ذلك، وحقن عينة الخام مثل النتائج مصل الإنسان في بعض التفاعلات غير محددة نتيجة لذلك لا بد من حقن عازلة عالية غسل الملح للكشف فقط تفاعلات محددة. ومن الجدير بالذكر أيضا أن خطوة غسل ضرورية للغايةبعد إدخال منع الجزيئات على سطح الاستشعار، لإزالة الجزيئات غير منضم. أما بالنسبة لمتطلبات الوقت ELISA هي أكبر بكثير (~ 16-18 ساعة) لتحليل عينة واحدة. وهناك حاجة إلى وقت أطول الحضانة كما تم تعزيز حساسية الفحص خصيصا لهذه الدراسة، كما تم التركيز على مقارنة الحد الأدنى من الكشف.
وسيكون اختيار الكيمياء السطحية تختلف من تطبيق واحد إلى آخر، وهذا يمكن أن تتحقق واحدة من قيود على تقنية سبري. في هذه الدراسة، تم تقييم مجموعة واسعة والجمع بين linkers الكيميائية والجزيئات عرقلة لتحقيق الحق في الجمع من أجل مراقبة كفاءة ملزمة المثلى من rhGH إلى السطح الاستشعار. على سبيل المثال، في هذه الدراسة، فإن الجمع بين BSA وPEG خدم أيضا في التقليل من التفاعلات غير محددة. ومع ذلك، في دراسة سابقة 17، حيث كان يجند القبض على الأبتامرات، PEG خدم وحده كأفضل جزيء حظر. المتغيراتأن كفاءة تؤثر ملزمة الحليلة ليجند هي أيضا تعتمد على درجة الحموضة، ودرجة الحرارة العازلة. لذلك، مع أي تطبيق، تحتاج إلى أن يكون الأمثل هذه المتغيرات. وبالإضافة إلى ذلك، فمن الأهمية بمكان لتحديد تركيز اكتشاف الأمثل ليجند على سطح رقاقة. يتم إجراء تجربة المعايرة مع مجموعة من تركيزات بروابط يجمد قبل البدء في الدراسة. أما بالنسبة ELISA، وكانت خطوة حاسمة في الإجراء إلى صب غسل العازلة من الآبار عن طريق التنصت على صفيحة ميكروسكوبية لأن هذا يضمن أي السائل المتبقي هو بقايا. إزالة غسل العازلة مع ماصة لم يكن كافيا كما تدخل أي السائل المتبقي مع القراءة إشارة من العينة المستهدفة.
في إشارة إلى حساسية، ELISA (1 نانوغرام / مل) تعادل سبري (3.61 نانوغرام / مل) ولكن النانو سبري (9.20 غ / مل) يحسن حساسية من قبل ثلاث درجات، وبالتالي تمكين القياسات على المستويات البيولوجية الدنيا من rhGH 0.03 نانوغرام / مل. كما ذكرنا سابقا 16،17، ويعزى تعزيز إشارة التي تعطيها NanoEnhancers إلى تأثير التحميل الجماعي والترابط القوي القائم بين fluorophores قوائم الجرد الوطنية ونشر البلازمونات السطح لالنانو فيلم الذهب. على الرغم من ذلك، يضيف نانو سبري خطوة إضافية لهذا الإجراء، هذا المستوى من الحساسية يمكن توسيع تطبيقات تكنولوجيا سبري في وسائل مختلفة.
يوفر سبري العلماء لمحة الحركي الكامل (K D، K a و K د) من الأجسام المضادة / rhGH التفاعل في حين ELISA يمكن أن التقرير القيم تقارب فقط. كان معامل الاختلاف (CV) أقل من 10٪ لسبري (4.1٪) وELISA (6.5٪)، مما يشير إلى استنساخ جيدة. إليسا وسبري القيم تقارب مختلفة لأن الأجسام المضادة القبض ثبتوا على رقاقة الاستشعار مختلفة من الأجسام المضادة يجمد في ELISA لوحة 96-جيدا. أما بالنسبة للنانو سبري لوحظ وجود قيمة CV أعلى (20٪). هناك العديد من العوامل التي يمكن أن تسهم كمصدر للERROالتمرير لتحديد CV. على سبيل المثال، مع التجربة نانو سبري يتم قياس تركيز أقل بكثير من تحليلها، إضافة NanoEnhancers يضيف خطوة أخرى في الإجراء وأجريت التجربة يدويا. وتحققت علاقة جيدة جدا بين نانو سبري وELISA للكشف عن rhGh في مصل الدم البشري ارتفعت. وأخيرا، يمكن ELISA تكون تقنية موثوق بها ولكن الطريقة نفسها وقتا طويلا مما يجعل من الصعب استخدام في الحالات التي تتطلب رصد في الوقت الحقيقي والمتنوعة، كما هو الحال مع هرمون النمو. بالإضافة إلى ذلك، ميزة أكثر جاذبية التي لم يتم التحقيق فيها بشكل مباشر في هذه الدراسة أن تقدم سبري على ELISA، هو القدرة على قياس مئات من التفاعلات في وقت واحد في الوقت الحقيقي. لذلك في المستقبل، وسيتم تقييم طريقة نانو سبري للكشف عن المؤشرات الحيوية متعددة في نفس الوقت في الوقت الحقيقي (مضاعفة) موجودة في الدم بتركيزات مختلفة من أجل دراسة إمكاناتها كأداة التشخيص السريري قابلة للحياة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Somatotropin Growth Hormone (GH1) capture antibody | Acris Antibodies | DM1015 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Bioreagents | BP671-10 | |
| Biotin labeled Somatotropin Growth Hormone (GH1) detection antibody | Acris Antibodies | AM09304BT-N | |
| 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide | TCI America | D1601 | |
| Ethanolamine | Acros Organics | 141-43-5 | |
| Ethanol | Fisher Chemicals | BP2818-4 | |
| Human HGH ELISA Kit | invitrogen | KAQ1081 | |
| Human Serum | Sigma Aldrich | H4522 | |
| Rabbit IgG Antibody | Sigma Aldrich | I5006 | |
| 11-mercaptoundecanoic acid | Sigma Aldrich | 450561 | |
| Nanostrip | Cyantek | ||
| N-hydroxysuccinimide | Sigma Aldrich | 130672 | |
| Phosphate Buffer Saline | Invitrogen | 00-3002 | |
| Polyethylene glycol (800 Da) | Sigma Aldrich | 729108 | |
| Recombinant Human Growth Hormone | Calbiochem | 869008 | |
| Sodium Acetate | Sigma Aldrich | 127-09-3 | |
| Sodium Chloride | Fisher Chemicals | 7647-14-5 | |
| Streptavidin coated near infrared quantum dots | Life Technologies | Q10171MP | |
| UV/Ozone Procleaner | Bioforce Nanosciences | ||
| Microwave reactor | CEM Corporation | Discover system | |
| SPRi-Arrayer | LabNext Xactll Microarray System | ||
| SPR biochip | HORIBA | ||
| SPRi-Lab+ | HORIBA | ||
| Synergy Mx Multimode Microplate reader | BioTek | ||
| ScrubberGen | HORIBA | Data Analysis software |
References
- Popii, V., Baumann, G. Laboratory measurement of growth hormone. Clinica Chimica Acta. 350 (1-2), 1-16 (2004).
- Higham, C. E., Trainer, P. J. Growth hormone excess and the development of growth hormone receptor antagonists. Exp Physiol. 93 (11), 1157-1169 (2008).
- Sönksen, P., Salomon, F., Cuneo, R. Metabolic effects of hypopituitarism and acromegaly. Horm Res. 36, Suppl 1. 27-31 (1991).
- Molitch, M., et al. Evaluation and Treatment of Adult Growth Hormone Deficiency: An Endocrine Society Clinical Practice Guideline. J Clin Endocrinol Metab. 91 (5), 1621-1634 (2006).
- The World Anti-Doping Code: The 2015 Prohibited List International Standard. , World Anti-Doping Agency. Available from: https://wada-main-prod.s3.amazonaws.com/resources/files/WADA-Revised-2014-Prohibited-List-EN.PDF (2015).
- The 2014 prohibited list world anti-doping code. , World Anti-Doping Agency. Available from: https://wada-main-prod.s3.amazonaws.com/resources/files/WADA-Revised-2014-Prohibited-List-EN.PDF (2014).
- Langkamp, M., Weber, K., Ranke, M. B. Human growth hormone measurement by means of a sensitive ELISA of whole blood spots on filter paper. Growth Horm IGF Res. 18 (6), 526-532 (2008).
- Rich, R. L., Myszka, D. G. Survey of the year 2007 commercial optical biosensor literature. J Mol Recognit. 21 (6), 355-400 (2008).
- Homola, J. Present and future of surface plasmon resonance biosensors. Anal Bioanal Chem. 377 (3), 528-539 (2003).
- Hoa, X. D., Kirk, A. G., Tabrizian, M. Toward Integrated Surface Plasmon Resonance Biosensors: A Review of Recent Progress. Biosens Bioelectron. 23 (2), 151-160 (2007).
- de Juan-Franco, E., Rodrìguez-Frade, J. M., Mellado, M., Lechuga, L. M. Implementation of a SPR immunosensor for the simultaneous detection of the 22K and 20K hGH isoforms in human serum samples. Talanta. 114, 268-275 (2013).
- de Juan-Franco, E., Caruz, A., Pedrajas, J. R., Lechuga, L. M. Site-directed antibody immobilization using a protein A-gold binding domain fusion protein for enhanced SPR immunosensing. Analyst. 138 (7), 2023-2031 (2013).
- Du, H., et al. Immunological screening and characterization of highly specific monoclonal antibodies against 20 kDa hGH. Bioanalysis. 4 (17), 2161-2168 (2012).
- Treviño, J., Calle, A., Rodrìguez-Frade, J. M., Mellado, M., Lechuga, L. M. Surface plasmon resonance immunoassay analysis of pituitary hormones in urine and serum samples. Clin Chim Acta. 403 (1-2), 56-62 (2009).
- Wu, Z., Bidlingmaier, M., Dall, R., Strasburger, C. J. Detection of doping with human growth hormone. Lancet. 353 (9156), 895 (1999).
- Malic, L., Sandros, M. G., Tabrizian, M. Designed biointerface using near-infrared quantum dots for ultrasensitive surface plasmon resonance imaging biosensors. Anal. Chem. 83 (13), 5222-5229 (2011).
- Vance, S. A., Sandros, M. G. Zeptomole Detection of C-Reactive Protein in Serum by a Nanoparticle Amplified Surface Plasmon Resonance Imaging Aptasensor. Sci. Rep. 4 (5129), 1-7 (2014).
- Uludag, Y., Tothill, I. E. Cancer biomarker detection in serum samples using surface plasmon resonance and quartz crystal microbalance sensors with nanoparticle signal amplification. Anal. Chem. 84 (14), 5898-5904 (2012).
- Špringer, T., Homola, J. Biofunctionalized gold nanoparticles for SPR-biosensor-based detection of CEA in blood plasma. Anal Bioanal Chem. 404 (10), 2869-2875 (2012).
