Summary
Den foreslåede arbejde vurderer den diagnostiske potentiale direkte og forstærket overflade plasmon resonans (SPRI) assays, navnlig til påvisning af rekombinant humant væksthormon i spidse humant serum, ved at sammenligne SPRI resulterer direkte med kommercielt tilgængeligt enzym-linked immunosorbent assay (ELISA) kit.
Abstract
Følsomme og selektive metoder til påvisning af humant væksthormon (hGH) over en bred vifte af koncentrationer (høje niveauer af 50-100 ng ml - 1 og minimumsniveauer for 0,03 ng ml - 1) i cirkulerende blod er afgørende som variable niveauer kan angiver ændret fysiologi. For eksempel kan vækstforstyrrelser forekommer i barndommen diagnosticeres ved at måle niveauet af hGH i blodet. Også misbrug af rekombinant hGH i sport ikke kun udgør et etisk problem, det præsenterer også alvorlige trusler mod misbrugeren sundhed. En populær strategi til måling hGH misbrug, beror på påvisningen af forholdet mellem 22 kDa hGH til den samlede hGH, som ikke-22 kDa endogene niveauer falder efter exogent rekombinant hGH (rhGH) administration. Overfladeplasmonresonans imaging (Spri) er en analytisk værktøj, der giver direkte (label-fri) overvågning og visualisering af biomolekylære interaktioner ved at registrere ændringer i det refraktive index støder op til sensoroverfladen i realtid. I modsætning hertil hyppigst anvendte kolorimetri, enzymkoblet immunosorbent assay (ELISA) anvender enzymmærkede detektionsantistoffer indirekte måling af analytkoncentration efter tilsætning af et substrat, der inducerer en farveændring. For at øge afsløring følsomhed, bruger forstærket forårsb en sandwich-assay-format og nærinfrarøde quantum dots (QDs) for at øge signalstyrken. Efter direkte forårsb påvisning af rekombinant rhGH i spidse humant serum, er forårsb signalet forstærkes af den sekventielle injektion af detektionsantistof belagt med nær-infrarød QDs (Nano-Spri). I denne undersøgelse blev den diagnostiske potentiale for direkte og forstærkes forårsb vurderet til måling rhGH tilsat i humant serum og sammenlignet direkte med mulighederne i et kommercielt tilgængeligt ELISA-kit.
Introduction
Humant væksthormon (hGH) er et 191 aminosyrer langt peptid (22 kDa), der produceres af hypofysen og frigives direkte ind i blodbanen. Interaktioner mellem hypothalamus peptid væksthormon-frigivende hormon (GHRH) og somatotropin inducere pulserende sekreter af hGH. Som et resultat, niveauer af hGH varierer fra højder i 50-100 ng / ml til lavpunkt i 0,03 ng / ml området fra 1. Mangel eller overskud af hGH i kroppen kan fremprovokere en bred vifte af unormale fysiologiske symptomer. For eksempel kan overskydende niveauer af hGH føre til gigantisme 2 og diabetes 3. Forarmet niveauer af hGH forårsage lavt blodsukker hos nyfødte, og svag knogletæthed og depression hos voksne 4.
Administrationen af rekombinant form af hGH (rhGH) forbedrer lean muskelmasse samtidig reducere kropsfedt. Som sådan, dette stof blev stof valg for professionelle og amatører, da det forbedrer fysiske styrke, som giver et advAntage i konkurrencesport. rhGH er forbudt af World Anti-Doping Agency (WADA) 5,6 og meget indsats fra internationale forskere har været fokuseret på at udvikle tests, der kan afsløre sin tilstedeværelse eller anabolske virkning.
Enzymkoblet immunosorbent assay (ELISA) har været den foretrukne metode til bestemmelse af hGH i fuldblod 7. Selv ELISA er en pålidelig teknik tilbyder god følsomhed og selektivitet, er det relativt tids- og arbejdskrævende. Desuden ELISA afhængig af indirekte påvisning af hGH ved anvendelse af enzymatiske tags. I modsætning hertil overfladeplasmonresonans (SPR) tillader påvisning af hGH direkte uden anvendelsen af etiketter i realtid. Påvisningen princip bag SPR indebærer en måleoverflade bestående af et prisme, der er belagt med et tyndt metallag (guld eller sølv); når en monokromatisk polariseret lys interagerer med metaloverfladen, er "overfladeplasmoner" genereret. Bindingen af en analyttil en overfladereceptor immobiliseret på metaloverfladen forstyrrer resonanstilstande resulterer i en forskudt resonans dip, som derefter kan korreleres til analytkoncentrationen. SPR-baserede biosensorer er nu kommercielt tilgængelige, der tilbyder en real-time, label fri teknik til at overvåge biomolekylære bindende begivenheder og biokemiske reaktioner 8-10. For nylig blev forårsb udviklet som svar på behovet for multiplexing (dvs. overvågning af flere bindende begivenheder samtidigt), hvilket ikke var muligt i de klassiske SPR biosensorer. Således har forårsb opstået som et redskab til at overvåge flere bindende begivenheder på samme tid. Aktuelle forårsb systemer er baseret på mikroskopisk billeddannelse af en overflade, der er ophidset med lys ved en bestemt vinkel og bølgelængde 10. Billedet er derefter indfanget på en ladningskoblet indretning (CCD) array.
Til dato har der været et par SPR-baserede assays er udviklet til at detektere hGH 11-14. En særlig strategi, Kendt som isoformen metode 15, beror på påvisningen af forholdet mellem 22 kDa hGH til den samlede hGH, som ikke-22-kDa endogene niveauer falder efter exogent rhGH administration. For nylig, de Juan-Franco et al. 11 rapporteret om udviklingen af et SPR-baserede immunosensor til selektiv detektering af 22 kDa og 20 kDa hGH-isoformer i humane serumprøver. Monoklonale antistoffer specifikke for hver isoform blev immobiliseret direkte på guldet sensoren tillader måling af begge isoformer samtidigt i en enkelt injektion med en detektionsgrænse på 0,9 ng ml -1. Alternativt er SPR blevet anvendt til at screene antistoffer med høj specificitet til hGH 13. Hvis koncentrationen af målanalytten falder under Spri systemets detektionsgrænse (<nM), må man ty til at forstærke forårsb signal via udnyttelsen af nanopartikler (Nano-Spri). En sådan SPR-baseret amplifikation er veldokumenteret i litteraturen 16-19 for various typer af analyt og overflader.
I dette arbejde blev det analytiske potentiale forårsb og Nano-forårsb baserede biosensorer undersøgt, især til påvisning af rhGH i spidse humant serum, og sammenligning af dets detektionsevne direkte til ELISA. Følgende parametre vil blive gennemgået og overvejet: afsløring tid, følsomhed, kinetiske profil, reproducerbarhed og specificitet.
Protocol
1. Udarbejdelse af løsninger og Protein Prøver til forårsb
- Fremstilling af 100 ml lavt saltindhold phosphatbufret saltvand (PBS) opløsning indeholdende 10 mM phosphat, 150 mM natriumchlorid, og pH 7,4.
- Forbered 50 ml højt saltindhold PBS-opløsning indeholdende 10 mM phosphat, 750 mM natriumchlorid, og pH 7,4.
- Forbered 5 ml 10 mM natriumacetat.
- Der fremstilles en bestand af 5 mg / ml bovint serumalbumin (BSA) fortyndet i lavt saltindhold PBS-opløsning.
- Der fremstilles en stamopløsning af rekombinant humant væksthormon (rhGH) i en koncentration på 1 ug / ml i lavt saltindhold PBS-opløsning.
- Forbered stamopløsninger af anti-rhGH og negativ kontrol-antistof i en koncentration på 100 ug / ml.
2. Forbered forårsb Chip for antistof Array
- Rengør chip ved lydbehandling i 120 ml stabiliseret Piranha-opløsning (3: 1 koncentreret svovlsyre til 30% hydrogenperoxid) i 90 minutter ved 50 ° C og hold ved skylningog lydbehandling med vand i 5 minutter. Derefter skylles chip med ethanol og tør med nitrogenstrøm.
- Placer guld chip i et UV / Ozon kammer i 30 min for at fjerne eventuelle forureninger.
- Tilsæt 150 mg af 11-mercaptoundecanoic syre til 20 ml ethanol i et reagensglas, der indeholder en omrører og et rør cap.
- Placer chip i reagensglasset og mikrobølgeovn rør / chip på 50 W og 50 ° C i 5 minutter.
- Skyl chip med ethanol og suge i ethanol i 5 min.
- Følg med en skylning med vand og lægges i blød i vand i 5 min.
- Tilsæt 150 mg af 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimid til 20 ml vand i et reagensglas, der indeholder en omrører og et rør cap. Mikrobølgeovn chip som i trin 2.4.
- Skyl chip med vand og lægges i blød i vand i 5 min.
- Tilsæt 150 mg N-hydroxysuccinimid i 20 ml vand i et reagensglas, der indeholder en omrører og et rør cap. Mikrobølgeovn chip som i trin 2.4.
- Skyl chip med vand og lægges i blød i vand i 5 min.
- Prepare 250 uM polyethylenglycol (PEG, 800 Da) i 20 ml vand i et reagensglas, der indeholder en omrører og et rør cap. Mikrobølgeovn chip som i trin 2.4.
Bemærk: mikrobølgeovn PEG800 på overfladen af sensoren er udført som en blokerende trin at forhindre ikke-specifik binding af serumproteiner og kvantepunkt komplekser senere anvendt i eksperimentet. Dette opnås ved PEG800 omsætning med ikke-besatte bare guld sites på chippen. - Skyl chip med vand og lægges i blød i vand i 5 min.
- Forbered 15 ug / ml anti-rhGH antistofopløsning og negativ kontrol opløsning af anti-immunoglobulin G (anti-IgG), og der tilsættes 10 pi af hver antistofopløsning til en brønd i 384 brønds plade.
- Designe spotting mønster i microarrayer (4 x 7 kvadranter for hver prøve) og spot-chip med antistoffer ved hjælp af en 500 um Teflon tippet pin.
- Inkuber plettet chip i 2 timer ved stuetemperatur og under en fugtig atmosfære af 75% eller mere.
- Skyl og suge chip i vand til5 min. Derefter tør chip med nitrogenstrøm.
3. forårsb Eksperimenter Opsætning og Blokering
- Initialiser instrumentet og vælg mappe. Vælg realtid kamera og starte sprøjtepumpen ved 1 ml / min for 10 ml afgasset vand. Sæt chip i instrumentet og holde injicere vand indtil alle bobler er fjernet.
- Efter skylning chip med 10 ml vand, begynder billedoptagelse, og følg ved at skifte pufferen til lav salt PBS og gør det muligt at køre på 1 ml / min i 5 ml og derefter langsomt strømningshastighed ned til 20 pl / min i 20 minutter .
- Vælg den meget kontrast billede, som viser de immobiliserede antistoffer spottet på chippen.
- Vælg og definere de 400 um individuelle runde pletter, der svarer til de immobiliserede antistoffer.
- Efter instrumentet sporer plasmon kurver, skal du vælge en arbejdsgruppe vinkel, der har den højeste hældning i reflektivitet kurver.
- Flow en kørende buffer ved 20 pl / min for lave sALT PBS gennem systemet, indtil signalet fra alle de udvalgte spots stabiliserer.
- Indlæse BSA (100 ug / ml) i løbebuffer i prøven loop (150 pi) med indsprøjtningsventil i fyldestilling. Derefter skifter ventilen til injektion stand til at injicere opløsningen til flowcellen.
Bemærk: BSA injiceres til kovalent at binde til det aminreaktive overflade, vil det resterende ubundne BSA vaske overfladen gennem bufferskylning. - Injicer 150 pi af en opløsning af 10 mM natriumacetat over overfladen og følge med en 150 pi injektion af høj saltkoncentration PBS.
- Injicer 150 pi ethanolamin (1 mM) for at deaktivere det aminreaktive overflade.
- Injicer 150 pi 10 mM natriumacetat at vaske overfladen.
- Derefter skifter løbebufferen til PBS med 50 ug / ml BSA ved en strømningshastighed på 250 ul / min i i alt 5 ml.
Bemærk: 50 ug / ml BSA sættes til løbebufferen for yderligere blokering af suransigt ved ikke-kovalent besætter den ikke-specifikke steder og dette gøres for yderligere at reducere ikke-specifik binding af serumproteiner til overfladen. - Skift strømningshastighed til 5 pl / min og lad den stabilisere sig i 20 minutter.
4. forårsb Påvisning af humant væksthormon
- Der fremstilles en opløsning af et sæt koncentration af rhGH (30.000 pg / ml; 250 pg / ml; 25 pg / ml; 2,5 pg / ml og 0,25 pg / ml) i 10% serum og fortyndet i PBS indeholdende 1 mg / ml BSA.
- En 2: 1 ved tilsætning af 1 pi biotin mærkede anti-rhGH detektionsantistoffer (6 uM) til 3 pi streptavidin overtrukket nærinfrarøde quantum dots (1 uM) i en 0,5 ml mikrocentrifugerør og inkuberes i 30 minutter for effektiv kobling .
- Indsprøjtes 150 pi af hGH tilsat humant serum løsning i injektionsloop. Dette resulterer i en kraftig stigning i signal efterfulgt af en langsom nedgang fra den ikke-specifikt bundet serum skylle overfladen.
- Når tegnetal stabiliserer vaskes overfladen med en opløsning af 450 mM natriumchlorid tilsat til løbebufferen.
- Løsningen af anti-rhGH antistoffer afsløring og kvantepunkter fortyndes til en koncentration på 10 nM (2: 1) med rindende buffer (PBS med 50 ug / ml BSA), og tilføre flow celle.
5. forårsb dataanalyse
Bemærk: Efter injektionen af rhGH tilsat humant serum og kvantepunkt enhancer, en stigning i reflektansændringen opstår på grund af det amplificerede forskydning af plasmon kurver. Dette resulterer i en forskel billede, der viser en gråskalabillede korrelerer med signalet på chippen.
- Importere dataene i et dataanalyse program. Plotte SPRI signal (% Reflektionsevne) versus tid (s) og bestemme forskellen mellem den anti-rhGH og negative kontrol-antistof pletter efter højt saltindhold vask.
6. ELISA-protokollen (dag 1)
- Opbevar alle assaykomponenter inkluderet in rhGH ELISA kit ved 2-8 ° C. Dette omfatter anti-rhGH-antistof coatede brønde, standarder (0-5) i fåreserum, kontrol (1 & 2) i humant serum, konjugat buffer, (200x) vaskebuffer, kromogen TMB (tetramethylbenzidin) og stop reagens.
- Opsætning reagenserne og følge fremgangsmåderne som beskrevet i den kommercielle ELISA-kit protokol.
- Først tillade anti-rhGH-antistof coatet 96 brønde til at varme op til stuetemperatur før åbning af foliepakning.
- Fjern derefter det ønskede antal 8-brønds strips til assay og forsegle folien pakke indeholder de resterende brønde og opbevares ved 2-8 ° C.
- Forbered standarder ved rekonstituering i 2 ml destilleret vand til standarden # 0, i 1 ml destilleret vand til standarder (1-5), og i 1 ml destilleret vand til kontrollerne (1 & 2). Nedenfor er en tabel over de tilsvarende koncentrationer af standarder og kontroller (tabel 1):
| Standarder | Koncentration (ng / ml) |
| 0 | 0 |
| 1 | 0,17 |
| 2 | 0,94 |
| 3 | 2,63 |
| 4 | 10.4 |
| 5 | 26,9 |
| Kontrol # 1 | 1,22 ± 0,33 ng / ml |
| Kontrol # 2 | 4,97 ± 1,25 ng / ml |
Tabel 1. Koncentrationerne af de standarder og kontroller indgår i den kommercielle ELISA-kit.
- Forberede prøverne, som består af rhGH hormon i 10% humant serum i følgende koncentrationer (tabel 2):
| <strong> Sample | Koncentration (ng / ml) |
| 1 | 0,025 |
| 2 | 0,2 |
| 3 | 0,5 |
| 4 | 2.5 |
| 5 | 10 |
| 6 | 30 |
Tabel 2. Koncentrationerne af de rhGH prøver fremstillet i 10% serum.
- Der tilsættes 50 ul af hver standard, kontrol og prøve i hver brønd (in triplo). Forsegl brøndene og inkuberes med de standarder, kontroller og rhGH prøver O / N ved 4 ° C under forsigtig omrystning.
7. ELISA-protokollen (Dag 2)
- Fjern pladen fra shaker og lad den varme op til stuetemperatur (15-20 min) før du fortsætter med analysen.
- Fjern Anti-rhGH-HRP, konjugat buffer, vaskebuffer (200x), kromogen TMB (tetramethylbenzidin), end stopreagens fra køleskabet og lad opvarmning til stuetemperatur.
- Reagens forberedelse: (ifølge fabrikantens specifikationer)
- Fortynd Anti-rhGH-HRP 40x med den konjugerede buffer. Forbered vaskebuffer ved at fortynde 200x med destilleret vand.
- Der tilsættes 50 pi anti-rhGH-HRP-konjugat til hver brønd, forsegle brøndene og inkuberes ved stuetemperatur i 30 minutter under forsigtig omrystning.
- Dekanteres løsningen fra brøndene og vend pladen og tryk tør på et absorberende væv. Derefter tilsættes 200 pi vaskepuffer i hver brønd.
- Dekanteres vaskeopløsningen og tap tør på et absorberende væv. Gentag dette trin 3 gange.
- Tilsæt 100 pi kromogen til hver brønd inden for 15 min efter vasketrinnet. Der inkuberes i 30 minutter ved stuetemperatur i mørke under forsigtig omrystning. Løsningerne vende sig fra farveløs til blå.
- Tilsættes 100 pi af stopreagens i hver brønd. Løsningerne vende sig fra blå til gul. Straks, læse the Absorbansen af hver brønd ved 450 nm under anvendelse af en mikropladelæser.
- Plot standardkurven for de leverede standarder (0-5). Derefter plotte optiske densitet af rhGH i 10% serumprøver versus koncentrationen af hver prøve.
Representative Results
Udførelsen af forårsb og Nano-Spri (Spri ansætte de NanoEnhancers) blev sammenlignet med ELISA til påvisning af rhGH i et komplekst miljø. Forskellene i opsætningen af disse metoder er beskrevet her kort. For forårsb (direkte påvisning, figur 1), er det indfangende antistof immobiliseret på overfladen og derefter prøven injiceres og binding af analytten til sensoroverfladen måles direkte i realtid og etiket-fri måde. Men med Nano-SPRI (figur 1), efter analytten binder til sensoroverfladen, et fortløbende injektion følges med quantum dots overtrukket med detektionsantistoffer at forstærke SPRI signal.
Figur 1. En skematisk fremstilling sammenligne direkte-mode (Spri) og forstærkes-mode (Nano-Spri) påvisning af rhGH ic rude prøver. ligander (rhGH eller IgG specifikke antistoffer) blev immobiliseret i et array format på SPRI biochip. Target protein (rhGH) tilsat i humant serum introduceret til sensoren overfladen er direkte detekteres (Spri) og sekventielt fremhævet med NanoEnhancers (Nano-Spri). Klik her for at se en større version af dette tal.
Som for ELISA, de flerbrøndsplader ankommer allerede pre-funktionaliseret med capture-antistof og derefter prøve indføres, vil analytten af interesse binde. En detektionsantistof indføres efterfulgt af substrattilsætning. Den optiske densitet måles derefter ved 450 nm. I denne undersøgelse blev et kommercielt ELISA-kit (figur 2) anvendt til at måle rhGH tilsat i 10% humant serum.
8 / 53508fig2.jpg "/>
Figur 2. En skematisk fremstilling af ELISA-assay procedure. rhGH protein (blå ovaler) indføres til brønde, der er blevet præ-funktionaliserede med monoklonale antistoffer (gul) er specifikke for rhGH. Ikke-specifikke interaktioner elimineres ved skylning af brøndene med vaskepuffer efterfulgt af indførelsen af et detektionsantistof prefunctionalized med peberrodsperoxidase (HRP, lilla). Løsningen vil ændre sig i farve efter tilsætning af substrat tetramethylbenzidin (TMB, guld). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 viser titreringskurven rhGH tilsat i 10% humant serum og er afbildet mod den opnåede OD ved 450 nm. En god lineær respons blev observeret og detektionsgrænsen var bestemt til at være 1 ng / ml. Koefficienten af variation (CV) var 6,5% tyder god reproducerbarhed.
Figur 3. ELISA dataanalyse. Koncentration af rhGH spiket i serum er plottet mod den opnåede OD ved 450 nm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Dernæst blev påvisningen af rhGH tilsat i humant serum vurderet med forårsb. Direkte påvisning af rhGH resulterede med den tilsvarende koncentrationsgradient kurve (figur 4), hvert punkt repræsenterer den gennemsnitlige værdi af reflektionsniveauet beregnede forskel fra tre SPRI kinetiske kurver for hver koncentration. Detektionsgrænsen (LOD) blev bestemt til at være 3,61 ng / ml. Den forårsb direkte påvisningsassay var meget reproducerbar som CV analysensvar kun 4,1%.
Figur 4. Direkte Spri detektering af hGH tilsat i 10% humant serum. Den resulterende normaliserede SPRI kinetisk plot efter injektion af forskellige mængder af hGH tilsat i humant serum efterfulgt af injektion af en puffer med højt saltindhold (stiplet lodret linie) for at fjerne ikke -specifikke interaktioner. En koncentrationsgradient kurve repræsenterer binding af forskellige mængder af hGH tilsat i humant serum til sensoren overflade, der er blevet prefunctionalized med biotinyleret hGH-specifikke-antistof. Klik her for at se en større version af dette tal.
For at øge følsomheden af forårsb biosensor, NanoEnhancers (QDs pre-funktionaliserede med antistoffer afsløring) sekventielt iintroduceret til sensoren overfladen for at fremhæve tilstedeværelsen af rhGH tilsat i humant serum. Efter baggrundssubtraktion, de NanoEnhancers var i stand til at amplificere biosensor respons op til 7,9%, dog med minimal signal ændring (Immunoglobulin G (IgG) -specifik antistof, 0,38% ændring i reflektivitet; Figur 5 på kontrollerede områder af interesse Imaging af. sensoroverfladen viste, at kun områder af interesse, der har rhGH-specifikke antistoffer immobiliseret erfaring den største kontrast ændringen underbyggende direkte med den kinetiske sensorgram respons.
Figur 5. Påvisning af rhGH ved anvendelse af et sandwich-assay tilsat i 10% humant serum. SPRI kinetisk plot efter injektionen af rhGH (30 ng / ml) i buffer (10 mM PBS, 150 mM natriumchlorid, pH = 7,4) på en præ -funktionaliserede chip med 11-mercaptoundecanoic syre / rhGH-specifikt antistof og kontrol IgG-antistof derefter blokeret med BSA efterfulgt af tilsætning af afsløring antistofovertrukne kvantepunkter (NanoEnhancers). Klik her for at se en større version af dette tal.
For at demonstrere praktiske af Nano-forårsb biosensor blev måleområde rhGH i rå prøver vurderes. En udvidet arbejdsområde fra 30.000 pg / ml til 0,25 pg / ml resulterede som reaktion på tilsætningen af NanoEnhancers (figur 6). Det er værd at bemærke, at hvert punkt på titreringskurven er beregnet som gennemsnit af tre uafhængige forsøg. Derfor blev den nedre detektionsgrænse beregnet til 9,20 pg / ml, og variationskoefficienten var 20%.
Figur 6.Nano-SPRI detektering af hGH tilsat i humant serum. Normalized SPRI kinetisk plotrepræsentation af hGH_specific_Anti-QDs-forstærkede signal til humane serumprøver tilsat forskellige koncentrationer af hGH. En lodret stiplet linje (grå) repræsenterer indsprøjtningspunktet af løbebufferen. (b) en koncentrationsgradient kurve repræsenterer bindingen af NanoEnhancers (hGH_specific_Anti-QDs) efter injektion af forskellige mængder af hGH tilsat i humant serum til sensoroverfladen, der er prefunctionalized med 11-mercaptoundecanoic syre / hGH-specifikt antistof. Klik her for at se en større version af dette tal.
Dernæst blev ændringen, der opstår i SPR reflektivitet grafisk som funktion af koncentrationen i forhold mellem den direkte og NanoEnhancer bioanalysemetoden (figur 7). For den direkte debeskyttelse teknik mellem 25 og 0,25 pg / ml, begyndte signalet at flade ud, og det er ikke overraskende, da disse koncentrationer falder under LOD på 3 ng / ml (figur 7). Tilsvarende gælder for det amplificerede teknik koncentrationer under detektionsgrænsen på 9,2 pg / ml signal begyndte at plateau og viste næsten ingen variationer.
Figur 7. En sammenlignende analyse af forårsb med nano-Spri. Dette søjlediagram viser den procentvise ændring i refleksionsevne (% R) efter indførelse af rhGH tilsat i humant serum (direkte påvisning) efterfulgt af injektion af NanoEnhancers (amplificeret detektion) til 30.000 pg / ml, 250 pg / ml, 25 pg / ml, 2,5 pg / ml og 0,25 pg / ml. Klik her for at se en større version af dette tal.
(figur 8). Men når rhGH tilsat i serumprøve blev injiceret i samme sted funktionaliseret med rhGH antistof blev signalforstaerkning observeret. Afslutningsvis har Nano-forårsb platform demonstreret fremragende specificitet og selektivitet for rhGH.
Figur 8. Vurdering af Nano-forårsb selektivitet over rhGH. Nano-SPRI biosensor respons efter injektion af rhGH (sort) og IGF-1 (rød) i spiked serum. Klik her for at se en større version af dette tal.
En korrelationsanalyse blev udført under anvendelse af Pearson korrelationskoefficienten at bestemme korrelationen mellem SPRI signalintensitet og ELISA optiske densitetsværdier (figur 9). En p-værdi på <0,01 blev betragtet som signifikant. Som illustreret i denne graf, er der en god korrelation mellem rhGH niveauer i spidse humant serum målt ved forårsb og ELISA. R-værdien var 0,9263 til 9 forskellige prøver.
Figur 9. Pearson korrelationsanalyse mellem ELISA og Nano-Spri. Plottet korrelerer Nano-forårsb signal intensitet (y-aksen) med ELISA optiske densitet (x-aksen) værdier. (Pærerpå korrelationskoefficient n = 9, r = 0,9263, p = 0,00000183). Klik her for at se en større version af dette tal.
Ligevægtsdissociationskonstanten (KD) blev bestemt under anvendelse af GraphPad software til ELISA. Den beregnede KD-værdien var ca. 79 nM (tabel 3). De på (K a) og fra (K D) satser kunne ikke bestemmes ved ELISA. Men ved hjælp af dataanalyse software, direkte påvisningsmetode resulterede med KD værdi på 23 pM under anvendelse af molekylvægten af 22 kDa, der svarer til en rhGH-molekyle. Den til og fra blev beregnet til at være 6,1 x10 7 M-1s-1 og 1,33 x 10 -3 sek -1 hhv. Dette svarer i sagens natur, at 0,13% af rhGH og antistof-komplekser henfald per sekund. Med hensyn til enmplified Spri forsøg blev en stærkere overordnet samspil observeret mellem NanoEnhancers og rhGH som den beregnede bindingsaffinitet blev bestemt til at være 04:03. Desuden blev en stærkere sammenhæng observeret for NanoEnhancers og rhGH end capture-antistof / rhGH, men dissocieringshastigheden tyder på, at 0,26% af NanoEnhancer / rhGH / indfangningsantistof henfald per sekund.
| Metode | KD (Affinity) | K a (on-sats) | Kd (off-rate) | LOD |
| ELISA | 79,45 x 10 -9 M | NA | NA | 1 ng / ml |
| Forårsb | 23.2 x 10 -12 M | 6.1 x 10 7 M -1 -1 sec | 3,61 ng / ml | |
| Nano-forårsb | 4,33 x 10 -12 M | 7,54 x10 8 M -1 -1 sec | 2.62 x10 -3 sek -1 | 0,0092 ng / ml |
Tabel 3. Fuld kinetisk analyse af data. Evaluering af affinitet, on-sats og off-rate af de antistofresponserne anvendelse af GraphPad (ELISA) og dataanalyse (Spri og Nano-Spri) software. Bestemmelsen af aviditet hjælp af molekylmasse på 22 kDa, der svarer til en rhGH-molekyle blev valgt. Grænserne for detektion blev bestemt for alle tre undersøgelser med Excel.
Discussion
Uregelmæssige niveauer af hGH, et naturligt forekommende hormon, har været forbundet med talrige medicinske lidelser, som påvirker human vækst og udvikling. Desuden er exogen administration af rhGH almindeligvis anvendes af sportsfolk, selv om det er forbudt, som doteringsmiddel at forbedre deres ydeevne. Udfordringer i påvisning rhGH misbrug skyldes vanskeligheden ved at skelne eksogene hGH fra endogene form. Som sådan, den nuværende godkendt teknik til påvisning af eksogent hGH bygger på måling af forholdet mellem 22 kDa hGH isoform i forhold til 20 kDa isoform. Eftersom isoform test krav til måling af flere hGH isoformer samtidigt inden for en kort periode i en bred vifte af koncentrationer vi derfor overvejet forårsb platform som et perfekt match. Desuden endogent hGH plan svinge til et meget lavt niveau (0,03 ng / ml) i blodstrømmen derfor detektionssystemet skal kunne måle dette område komfortabelt med høj specificity. Som et resultat, har vi også undersøgt i dette studie potentialet i Nano-forårsb som et diagnostisk værktøj til hGH og sammenlignet det direkte med forårsb og den klassiske immunoassay ELISA.
Baseret på resultater opnået fra denne undersøgelse, den største fordel af forårsb og Nano-SPRI metode er, at der kan måles rhGH koncentrationer på en hurtigere måde i forhold til den mere konventionelle metode ELISA. En standard varighed for måling rhGH niveauer i én prøve med den direkte påvisningsmetode var 1 time mens Nano-forårsb krævede 2 timer på grund af de ekstra trin i processen. Samlet set med forårsb og Nano-forårsb eksperimenter, før injektion af en prøve, en kalibrering skridt er stærkt anbefales. Hertil kommer, at injektion af en rå prøve som humant serum resulterer i nogle ikke-specifikke interaktioner som følge heraf er det nødvendigt at injicere et højt saltindhold vaskebuffer til kun afsløre specifikke interaktioner. Det er også værd at bemærke, at en vask skridt er absolut nødvendigtefter indførelsen af blokerende molekyler til sensoroverfladen, for at fjerne ubundne molekyler. Med hensyn til ELISA tidskrav er langt større (~ 16-18 timer) til analyse af en prøve. En længere inkubationstid er nødvendig, da følsomheden af assayet forøges specielt til denne undersøgelse, som fokus var at sammenligne den nedre detektionsgrænse.
Valget af overfladekemien vil variere fra et program til et andet, og dette kunne realiseres som en af begrænsningen af forårsb teknik. I denne undersøgelse blev et bredt område og kombination af kemiske linkere og blokerende molekyler vurderes for at opnå den rette kombination for at observere optimal binding effektivitet rhGH til sensoroverfladen. For eksempel, i denne undersøgelse, kombinationen af BSA og PEG fungerede godt til at minimere ikke-specifikke interaktioner. Men i en tidligere undersøgelse 17, hvor capture ligand var en aptamerer, PEG alene tjente som den bedste blokerende molekyle. Variablerneder påvirker binding effektiviteten af analytten til ligand er også pH-afhængig, puffer og temperatur. Derfor, med et program, skal optimeres disse variabler. Desuden er det vigtigt at bestemme den optimale koncentration spotting af liganden til chipoverfladen. En titrering eksperimentere med en række koncentrationer af immobiliserede ligander udføres før initiering af studiet. Som for ELISA, et afgørende skridt i den procedure, der var at dekanteres vaskebufferen fra brønde ved at trykke mikropladen da dette sikrede nogen resterende væske er tilovers. Fjernelse af buffer vask med pipette ikke var tilstrækkelig, da eventuelle rester væske blandede sig med signalet læsning af målstikprøven.
Med henvisning til følsomhed, ELISA (1 ng / ml) er sammenlignelig med forårsb (3,61 ng / ml), men nano-Spri (9,20 pg / ml) forbedrer følsomheden af tre størrelsesordener, således at målinger ved de lavere biologiske niveauer af rhGH 0,03 ng / ml. Som vi tidligere rapporteret 16,17, er forbedringen signalet bibringes af NanoEnhancers tilskrives en masse belastning virkning, og den stærke kobling, der eksisterer mellem NIR fluoroforer og udbreder overfladeplasmoner for guld film nanostrukturer. Selvom, Nano-forårsb tilføjer et ekstra trin af proceduren, kan dette niveau af følsomhed udvide anvendelser af forårsb teknologi i forskellige forretninger.
Spri giver forskerne en fuld kinetiske profil (K D, K a og K d) af antistof / rhGH interaktion mens ELISA kan rapportere kun affinitet værdier. Variationskoefficienten (CV) var under 10% for forårsb (4,1%) og ELISA (6,5%), hvilket tyder på god reproducerbarhed. ELISA og SPRI affinitet værdier er anderledes, fordi de fangantistoffer immobiliseret på sensorchippen er forskellige fra antistoffer immobiliseret i ELISA plade med 96 brønde. Med hensyn til Nano-SPRI en højere CV værdi (20%) blev observeret. Der er flere parametre, der kan bidrage som en kilde til errors til CV bestemmelse. For eksempel med Nano-forårsb eksperimentet en meget lavere koncentration af analyt der måles, tilføjelse af NanoEnhancers tilføjer endnu et skridt i proceduren og eksperimentet blev udført manuelt. En meget god korrelation mellem Nano-SPRI og ELISA blev opnået til påvisning af rhGH i spidse humant serum. Endelig kan ELISA være en pålidelig teknik imidlertid selve metoden er tidskrævende, hvilket gør det vanskeligt at bruge i situationer, der kræver tidstro overvågning og multiplexing, som det er tilfældet med hGH. Desuden et mere attraktivt funktion, der ikke blev undersøgt direkte i denne undersøgelse, SPRI tilbyder over ELISA, er evnen til at måle hundredvis af interaktioner samtidigt i realtid. Derfor vil der i fremtiden vil Nano-forårsb metoden vurderes at opdage flere biomarkører samtidigt i realtid (multiplexing) til stede i serum ved forskellige koncentrationer for at undersøge dens potentiale som en levedygtig klinisk diagnostisk værktøj.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Somatotropin Growth Hormone (GH1) capture antibody | Acris Antibodies | DM1015 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Bioreagents | BP671-10 | |
| Biotin labeled Somatotropin Growth Hormone (GH1) detection antibody | Acris Antibodies | AM09304BT-N | |
| 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide | TCI America | D1601 | |
| Ethanolamine | Acros Organics | 141-43-5 | |
| Ethanol | Fisher Chemicals | BP2818-4 | |
| Human HGH ELISA Kit | invitrogen | KAQ1081 | |
| Human Serum | Sigma Aldrich | H4522 | |
| Rabbit IgG Antibody | Sigma Aldrich | I5006 | |
| 11-mercaptoundecanoic acid | Sigma Aldrich | 450561 | |
| Nanostrip | Cyantek | ||
| N-hydroxysuccinimide | Sigma Aldrich | 130672 | |
| Phosphate Buffer Saline | Invitrogen | 00-3002 | |
| Polyethylene glycol (800 Da) | Sigma Aldrich | 729108 | |
| Recombinant Human Growth Hormone | Calbiochem | 869008 | |
| Sodium Acetate | Sigma Aldrich | 127-09-3 | |
| Sodium Chloride | Fisher Chemicals | 7647-14-5 | |
| Streptavidin coated near infrared quantum dots | Life Technologies | Q10171MP | |
| UV/Ozone Procleaner | Bioforce Nanosciences | ||
| Microwave reactor | CEM Corporation | Discover system | |
| SPRi-Arrayer | LabNext Xactll Microarray System | ||
| SPR biochip | HORIBA | ||
| SPRi-Lab+ | HORIBA | ||
| Synergy Mx Multimode Microplate reader | BioTek | ||
| ScrubberGen | HORIBA | Data Analysis software |
References
- Popii, V., Baumann, G. Laboratory measurement of growth hormone. Clinica Chimica Acta. 350 (1-2), 1-16 (2004).
- Higham, C. E., Trainer, P. J. Growth hormone excess and the development of growth hormone receptor antagonists. Exp Physiol. 93 (11), 1157-1169 (2008).
- Sönksen, P., Salomon, F., Cuneo, R. Metabolic effects of hypopituitarism and acromegaly. Horm Res. 36, Suppl 1. 27-31 (1991).
- Molitch, M., et al. Evaluation and Treatment of Adult Growth Hormone Deficiency: An Endocrine Society Clinical Practice Guideline. J Clin Endocrinol Metab. 91 (5), 1621-1634 (2006).
- The World Anti-Doping Code: The 2015 Prohibited List International Standard. , World Anti-Doping Agency. Available from: https://wada-main-prod.s3.amazonaws.com/resources/files/WADA-Revised-2014-Prohibited-List-EN.PDF (2015).
- The 2014 prohibited list world anti-doping code. , World Anti-Doping Agency. Available from: https://wada-main-prod.s3.amazonaws.com/resources/files/WADA-Revised-2014-Prohibited-List-EN.PDF (2014).
- Langkamp, M., Weber, K., Ranke, M. B. Human growth hormone measurement by means of a sensitive ELISA of whole blood spots on filter paper. Growth Horm IGF Res. 18 (6), 526-532 (2008).
- Rich, R. L., Myszka, D. G. Survey of the year 2007 commercial optical biosensor literature. J Mol Recognit. 21 (6), 355-400 (2008).
- Homola, J. Present and future of surface plasmon resonance biosensors. Anal Bioanal Chem. 377 (3), 528-539 (2003).
- Hoa, X. D., Kirk, A. G., Tabrizian, M. Toward Integrated Surface Plasmon Resonance Biosensors: A Review of Recent Progress. Biosens Bioelectron. 23 (2), 151-160 (2007).
- de Juan-Franco, E., Rodrìguez-Frade, J. M., Mellado, M., Lechuga, L. M. Implementation of a SPR immunosensor for the simultaneous detection of the 22K and 20K hGH isoforms in human serum samples. Talanta. 114, 268-275 (2013).
- de Juan-Franco, E., Caruz, A., Pedrajas, J. R., Lechuga, L. M. Site-directed antibody immobilization using a protein A-gold binding domain fusion protein for enhanced SPR immunosensing. Analyst. 138 (7), 2023-2031 (2013).
- Du, H., et al. Immunological screening and characterization of highly specific monoclonal antibodies against 20 kDa hGH. Bioanalysis. 4 (17), 2161-2168 (2012).
- Treviño, J., Calle, A., Rodrìguez-Frade, J. M., Mellado, M., Lechuga, L. M. Surface plasmon resonance immunoassay analysis of pituitary hormones in urine and serum samples. Clin Chim Acta. 403 (1-2), 56-62 (2009).
- Wu, Z., Bidlingmaier, M., Dall, R., Strasburger, C. J. Detection of doping with human growth hormone. Lancet. 353 (9156), 895 (1999).
- Malic, L., Sandros, M. G., Tabrizian, M. Designed biointerface using near-infrared quantum dots for ultrasensitive surface plasmon resonance imaging biosensors. Anal. Chem. 83 (13), 5222-5229 (2011).
- Vance, S. A., Sandros, M. G. Zeptomole Detection of C-Reactive Protein in Serum by a Nanoparticle Amplified Surface Plasmon Resonance Imaging Aptasensor. Sci. Rep. 4 (5129), 1-7 (2014).
- Uludag, Y., Tothill, I. E. Cancer biomarker detection in serum samples using surface plasmon resonance and quartz crystal microbalance sensors with nanoparticle signal amplification. Anal. Chem. 84 (14), 5898-5904 (2012).
- Špringer, T., Homola, J. Biofunctionalized gold nanoparticles for SPR-biosensor-based detection of CEA in blood plasma. Anal Bioanal Chem. 404 (10), 2869-2875 (2012).
