Summary
Phosphoinositides는 상대적인 풍부 빠르게 다양한 자극에 대한 반응의 변화 지질 신호된다. 이 문서 추출 및 탈아 실화 다음 3 H-의 미오의 -inositol와 대사 라벨 세포에 의해 phosphoinositides의 풍부를 측정하는 방법을 설명합니다. 추출 글리세 inositides 후 고성능 액체 크로마토 그래피로 분리하고, 섬광 유동에 의해 정량화된다.
Protocol
주 : 텍스트가 아래에서 상세히 효모 PtdInsPs을 측정하는 방법을 설명한다. 이 라벨 효모 3 H-의 미오의 -inositol와 세포 추출 및 deacylating 지질과 분별과 탈아 실화 PtdInsPs을 정량화 할 수있는 HPLC-용출 프로토콜에 대한 실험 세부 정보를 제공합니다. 최적화 및 이상 HPLC-용출 프로파일을 요구하는 포유 동물 세포에서 PtdInsPs의 라벨, 탈아 실화, 해상도 및 정량을 유의하시기 바랍니다. 우리가 토론에서 측면의 일부를 설명하지만이 정보는 다른 곳에서 찾아 볼 수있다. 전반적으로, 방법은 지질, deacylate를 추출 효모가 주어진 그림 1에 도시에서 수용성 촉진제-InsPs를 추출합니다.
효모의 레이블과을 분석 PtdInsPs 1. 프로토콜
- 세포 배양 및 방사성 표지
- 상수가 완료 합성에서 진탕하면서 30 ℃에서 효모 균주 SEY6210 20 ㎖의 배양액을 성장미드 로그 상 또는 약 600 nm의 0.6-0.7 (OD 600)에서의 광학 밀도 매체.
참고 :이 3 H-미오 -inositol 통합에 영향을 미칠 수 있으므로 YPD 매체를 사용하지 마십시오. 이 배양은 2-3 크기 HPLC 실행을위한 충분한 재료를 제공한다. - 효모 세포의 10-14 OD 총 펠렛 (12) 용액에 5 분 둥근 바닥 튜브 800 XG에서 원심 분리하여 (OD 600 = 1 1 ml의 문화 ~ 1 × 7 세포가 포함되어 있습니다). 이노시톨없는 배지 (IFM) 2 ㎖로 재현 탁 (IFM 조성물은 표 1 참조).
- 원심 분리를 반복하고 미디어를 대기음. IFM 440 μL와 펠렛을 재현 탁하고, 15 분 동안 실온에서 배양한다.
- 각 샘플에 3 H- 미오 -inositol (1 μL = 1 μCi를) 60 μl를 추가하고 일정한 흔들림과 1 시간 3 30 ° C의 성장 온도에서 품어.
주의 : 3 H-의 미오의 -inositol는 방사성 친구입니다적절한 훈련 후 처리해야 리알. 또한, 3 H - 함유 물질과 접촉을 만드는 모든 소모품 적절히 배치되어야하고, 방사성 폐기물로 지정.
주 : 성장 온도가 변경 될 수있는 한 모든 균주는 동일한 온도에서 성장된다 비교되는 바와 같이 필요에 따라. - 9 % 과염소산 500 μL 및 산 200 μL를 함유하는 미세 원심 분리 튜브에 세포 현탁액 (500 μL)를 이동시켜 유리 비드를 세척 하였다. 반전에 의해 혼합하고 5 분 동안 얼음에 품어.
- 10 분 동안 최고 속도로 샘플을 와동과 유리 비드를 피할 겔 로딩 팁을 사용하여 새로운 마이크로 원심 튜브에 해물을 전송.
- 4 ℃에서 10 분 동안 12,000 XG에서 샘플을 펠렛과 뜨는을 대기음.
- 빙냉 100 mM의 EDTA 1 ㎖ 목욕 초음파에 의해 펠렛을 재현 탁. 이전처럼 다시 펠렛.
- 상수가 완료 합성에서 진탕하면서 30 ℃에서 효모 균주 SEY6210 20 ㎖의 배양액을 성장미드 로그 상 또는 약 600 nm의 0.6-0.7 (OD 600)에서의 광학 밀도 매체.
- 탈아 실화 및 추출
- EDTA를 대기음 및 물 50 μL에 펠렛을 초음파 처리.
- 탈아 실화 시약 500 μL를 추가하고 혼합 초음파 처리. 20 분 동안 실온에서 배양한다.
- 열 블록에 53 ° C에서 50 분 동안 열 지질. 3 시간 또는 O / N을 통해 진공 원심 분리하여 완전히 샘플을 건조시킵니다.
- 화학 트랩 진공 원심 분리기와 공기를 유입하여 증기의 발생을 방지하기 위해 진공 펌프 사이에 설치되어 있는지 확인합니다.
- 욕조 초음파에 의해 물 300 μL와 펠렛을 재현 탁하고 20 분 동안 RT에서 배양한다. 3 시간 또는 O / N 진공 원심 분리하여 샘플을 건조시킵니다. 다시 한 번이 단계를 반복합니다.
- 물 450 μL와 펠렛을 sonicate하세요. 이는 추출 동안 성상이다.
- 갓 extractio 10 ㎖를 준비8.0 에틸 에테르의 1- 부탄올 용액, 1.6 ㎖의 에틸 포르 메이트 0.40 ml를 첨가하여 N 시약. 혼합 반전.
- 수성 단계로 추출 시약 300 μl를 추가합니다. 소용돌이 5 분 최고 속도의 혼합물을 2 분 동안 최고 속도 (18,000 XG)에서 원심 분리하여 층을 분리한다.
- 상부 유기 층, 인터페이스 및 펠렛을 회피하면서 새로운 미세 원심 분리 튜브에 하부 수성층을 모은다. 신선한 추출 시약 회 더 성상의 추출을 반복한다.
- 완전 진공 원심 분리에 의해 수층을 회수 건조. 목욕 초음파로 물 50 μL에 펠렛을 분산.
- 6 ml의 폴리에틸렌 섬광 유리 병에 섬광 유체의 4 ml의 각 샘플 2 μl를 추가합니다. 열려있는 창을 사용하여 액체 섬광하여 각 샘플 (CPM)에 카운트의 수를 결정합니다.
- HPLC에 대한 준비가 될 때까지 -20 ° C에서 샘플을 저장합니다.
- 탈기 하였다 병 상단 0.22 ㎛의 진공 필터, 초순수로 1 L를 필터링하여 버퍼를 준비한다.
- 물에 1 M 암모늄 인산 (APS, MW 132.06) 1 L의 용액을 완충액 B로 준비 및 인산으로 3.8까지 pH를 조정한다. 탈기 하였다 병 상단 0.22 ㎛의 진공 필터와 인산 암모늄 필터.
- 스프링이 장착 된 250 μL 작은 볼륨 삽입과 유리 병 ㎖로 2 여비에 의해 주입 병을 조립합니다. 1000 만 노출 당 비용 (CPM)를 넣고 55 μL의 총 부피의 물을 추가합니다. 물 55 μL와 빈 유리 병을 준비합니다.
- PTFE / 실리콘 격막이 장착 스크류 캡 바이알 (적색 측이 병의 내측에 접함) 모자. 빈 유리 병을 시작으로 HPLC의 자동 샘플링 트레이에 각각의 병을 놓습니다.
- 버퍼 흐름을 제어 버퍼 및 제어 샘플 injecti을 degasses HPLC 및 관련 소프트웨어를 사용에. 섬광 유량을 조절하는 유량 온라인 신틸 레이터와 관련 소프트웨어를 사용하여 H-3 감쇠 신호를 모니터링.
- 250mm X 4.6 mm의 크기와 HPLC에 5 μm의 실리카 수지를 함유와 SAX 액체 크로마토 그래피 컬럼을 사용합니다. 오염 물질의 주입을 방지하기 위해 열 가드 컬럼을 갖추게.
- 흐름 신틸 레이터에서 3 H 호환 500 μL 흐름 전지를 설치합니다.
참고 : 분별은 Chemstation 소프트웨어 또는 기타 상업적으로 이용 가능한 HPLC 시스템과 제어 애질런트 1200 무한 시리즈 HPLC 시스템으로 수행 할 수 있습니다. HPLC 용 출제의 흐름은 신틸레이션 로라 소프트웨어 또는 다른 시판 흐름 신틸 또는 호환 소프트웨어에 의해 제어 β-RAM 흐름 신틸으로 행해질 수있다.
- 100 % 완충액 A에 1.0 ㎖ / 분의 유속으로 펌프를 초기화 급
- HPLC에 평형 프로파일을 설정5 5 분간, 100-1%의 B 5 분 100 % B에서 5 분, 1-100 %의 B 1 % 완충액 B : 버퍼 A와 B의 구배 ( "평형 프로토콜"라고 부른다)를 제어하는 분, 20 분, 1 % B. 바 (400), 1.0 ㎖ / 분 유속, 30 분 실행 시간에 압력 한계를 설정한다.
- 버퍼 A와 B의 구배 (이 "프로토콜"을 호출) 제어 HPLC에 용출 프로필 (도 2)를 설정 : 40 분 동안 5 분 내지 20 %의 B 1 % B를 20~100% 10 분, 20 분, 1 %의 B 5 분 100-1% B의 10 분, 100 % B를위한 B. 400 바, 1.0 ml / min 유속 및 90 분 실행 시간에 압력 한계를 설정한다.
- 유동 신틸 레이터에 검출 프로토콜 2.5 ㎖ / 분의 신틸레이션 유체 유량 및 8.57 초의 지속 시간으로, 60 분 동안 실행 (이것은 "프로토콜 검출"전화)를 설정한다.
- 전자 다음에 물을 비워 "프로토콜 평형"로 시작하는 HPLC에 자동 주입 순서를 프로그램ACH는 "의정서"에 샘플을 방사성 표지. 준비가되면 시퀀스를 초기화합니다.
- 실행이 평형 프로토콜에있는 동안,와 모든 샘플 측정하는 흐름 신틸 레이터에 배치 만들기 "프로토콜 탐지를." 시작 유동 신틸 트리거링 동안 각각의 새로운 샘플의 주입은 HPLC의 "프로토콜"를 초기화한다 "검출 프로토콜."
- 모든 실행의 완료시, HPLC 칼럼을 세척하고 1.0 ㎖ / 분의 유속으로 30 분 동안 100 % 완충액으로 신틸 흐름.
- 로라 소프트웨어 또는 크로마토 그래피의 스펙트럼을 정량화 할 수있는 다른 소프트웨어를 사용합니다. 이 절에서 설명하는 단계는 그림 3에 묘사되어있다.
- "파일", "열기"를 클릭하여 파일을 열고 각 샘플에 대한 원시 데이터 파일을 선택합니다.
- "크로마토 그램"탭에서, ZO엄마의 작은 봉우리 (약 1000 카운트 [y 축]) 시간 해상도를 유지하면서 각각의 스트레칭. 필요한 경우 각 피크로 확대합니다.
- "투자 수익 (ROI)을 추가"도구를 사용하여 분석을 위해 각 피크를 강조 표시합니다. (4,5을 29 분에서 20 분, 촉진제 - 인 (3,5) P 2시 18 분, 촉진제-Ins4P에서 10 분, 촉진제-Ins3P에서 부모의 촉진제-기능을하고 그로 - 인 : 용출의 시간에 피크를 확인 32 분에서) P 2.
- "지역 테이블"탭에서 각 피크의 "영역 (카운트)"을 기록합니다. 시간과 "끝 (MM : SS)"각 피크의 시간 : "(SS MM) 시작"을합니다.
- 배경 차감을 위해, 동일한 시간에 걸친 피크에 인접한 영역을 강조. 해당 피크에서 카운트의 수를 뺍니다.
- ( "총 PtdIns의 %"로 표시) 부모의 촉진제 - 인에 대한 각 피크의 면적을 정상화. 그리고, "N으로 표시 제어 조건에 대하여, 각 실험 조건 (상기 각 피크를 정상화-fold 증가) "대조군에 비해.
참고 : 각 피크의 정상화는 총 개수에 대해 수행 할 수 있지만, 부모의 촉진제-기능이 훨씬 더 풍부 다른 모든 PtdInsPs보다 이후 결과는 유사한 경향이있다. - "... 다른 이름으로 저장", "파일"을 눌러 크로마토 그래프에 대한 데이터를 내보내기를 선택 파일 형식 "을 CSV (쉼표로 구분)". 스프레드 시트의 데이터를 플롯하고 필요에 따라 제시한다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
이 방법을 사용, 효모 PtdInsPs는 대사 3 H-의 미오의 -inositol으로 표시했다. 표지 후, 인지질 및 인지질 탈아 실화 수용성 촉진제-InsPs (도 1)의 추출하여, 과염소산로 침전시켰다. 이 단계에서, 그것은 PtdIns 같은 매우 미량 PtdInsPs에 충분한 신호 대 잡음비를 보장하기 위해 액체 섬광에 의해 추출 촉진제-InsPs와 관련된 총 방사능 신호를 정량화하는 것이 중요하다 (3,5) P (2); 5-10000000 CPM이 총 분사한다. 효모 세포에만 네 PtdInsPs을 나타내고 있기 때문에 (도 2) 한 바와 같이, 해상도가 1 시간 용출 방법으로 달성 될 수있다.
Δ 및 vac14의 Δ 효모 돌연변이가 표시 및 처리 된 atg18 여기, 야생 형, PtdIns의 변화 (3,5) P 2 번째를 분석전자 효모 16,19,27에서 PtdInsPs의 적어도 풍부. 도 4A-C, 3-H 결합 된 신호의 피크를 생성 세 균주 용출 프로파일에서 관찰 된 바와 같이. 부모 촉진제 - 인 피크가 먼저 용리 (8-9 분;도 3에 도시 아니지만 촉진제 인을 인산화 종의 신호를 그늘지게 때문에도 4) 촉진제-Ins3P (~ 18 분), Gro- 이어 각각 실화 인지질의 PtdIns에 해당합니다 (00 분 ~ 32), Ins4P (~ 20 분), 촉진제 - 인 (3,5) P (2) (~ 29 분) 촉진제 - 인 (4,5) P (2) PtdIns3P, PtdIns4P, PtdIns (3,5) P 2 PtdIns (4,5) P (2). 4 분 즉시 부모 촉진제 - 인 (10 분)을 따라하는 경향이 하나의 추가 작은 봉우리의 몇 가지 있습니다; 이러한 가능성 이노시톨과 비 glycerated 포스페이트 inositide (도 3)를 나타낸다. 용출 패턴은 diffe를 사용하면 정확한 시간은 다를 수 있지만, 일관성 및 특징HPLC 시스템 및 / 또는 새 열을 임대.
PtdIns (3,5) P (2) (그림 4, 빨간색 화살표)과 관련된 피크는 Δ 및 vac14의 Δ 효모 균주 atg18 야생형 사이의 가장 극적인 변화를 겪는다. 야생형 세포 (A)에 대해, 매우 큰 촉진제 - 인 (3,5) P (2)의 atg18 Δ 세포 -associated 신호를 Δ vac14 효모 세포에서의 작은 피크가있다. 각각의 피크와 관련된 총 방사능 신호를 정량화하기 위해, 카운트는 피크 (도 3)의 영역 아래에 통합 하였다. 절대 방사성 신호가 샘플 사이에서 변화 때문에 또한, 부모의 촉진제 - 인 종 (하나는 전체 개수에 대한 정상화를 선택할 수 있습니다) 반대 정상화에 의한 내부 통제로 사용되었다. 이렇게함으로써, 데이터는,이 PtdIns (3,5) P (2)는 야생형 효모 세포에서 PtdIns의 0.07 %를 구성하는 것을 제안하면서 PtdIns (3,5) P 2 atg18의 Δ 세포에서 부모의 PtdIns, 또는 PtdIns 극적으로 17 배 증가 (3,5) P 야생 형 세포 (그림 4A, B와 D)에 2 상대의 1.2 %에 해당한다. 이에 비해, PtdIns (3,5) P (2) 레벨에서 VAC14 PtdIns 신호의 0.01 %는 효모 세포, PtdIns (3,5) P (2) (도 4C 및 D)의 85 % 손실을 -deleted이었다. 전반적으로, 이러한 측정치가 PtdIns는 (3,5) P (2) 야생 형 세포에서 PtdIns의 약 0.1 % 인 것을 보여주는 게시 된 결과와 일치한다, 90 %가 vac14 D를 감소하고, atg18의 D 세포에서 더 높은 10-20 배 야생형 세포에 대해 27, 29.
그림 1. 탈아 실화 3 H-촉진제-INSP의 추출. 방사성 표지 LIPI과염소산 D에서 침전물의 EDTA 수용액으로 세정된다. 이 후, 흡인 탈아 실화 시약을 첨가하고, 53 ° C에서 배양된다. 탈아 실화 반응 혼합물을 추출 시약을 첨가 한 후, 그 다음 진공 건조하고, 물로 두 번 세척된다. 이 후, 볼 텍싱, 원심 분리하고, 수성 상을 수집한다. 추출 공정은 세 번 불용성 유기 오염물을 제거하기 위해 총 반복된다. H-3-INSP 촉진제를 포함하는 수용성 분획 (청색), 건조시키고 물 60 μL와 진공 재수 화된다. 방사능의 양은 액체 섬광 (CPM) 및 샘플에서 동일한 카운트 HPLC에로드에 의해 결정된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
<강한 음이온 교환 크로마토 그래피에 의한 BR /> 그림 촉진제-INSP의 3 H-촉진제-INSP. 해상도의 용출에 대한 인산 암모늄 버퍼의 2 그라데이션 암모늄 인산, pH가 3.8 (버퍼 B)의 응용 프로그램에 따라 다릅니다. 구배의 선택은 분리 가능한 촉진제-INSP 종의 혼합물에 의존한다. 프로토콜은 네 PtdInsPs을 갖고 효모 샘플을 위해 사용된다. 네 개의 봉우리 각각의 해상도의 급격한 증가 (NH 4) 2 HPO 4 농도가 충분하다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. PtdInsP 풍요의 데이터 분석에 대한 지침을 안내. 데이터 파일은 로라의에로드oftware 시각적 크로마토 그래프 (기본적으로 개방)를 사용하여 평가 하였다. 툴 "에서 줌"을 사용하여 (A), 피크를 확대 (b). "투자 수익 (ROI)을 추가"도구 (C)를 사용하여 크로마토 그래프에 별개의 봉우리를 선택합니다. "지역 테이블"탭 (d)에, 관심의 강조 표시된 지역의 모든 결과 정보는 하나의 테이블 (E)로 표시됩니다. 각 피크 (F)의 원료 수를 내보내고 부모의 포스파티딜 이노시톨에 대한 각 PtdInsP 종 (g)을 정상화 또는 총 개수에 대해. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4 PtdIns (3,5) P 야생형과 돌연변이 효모 세포에서 2 레벨. 대표적인 크로마토이 추출물의 흐름에 대해 도시된다 섬광프로토콜을 사용하여 ED 3 야생형에서 H-촉진제-InsPs (A), Δ atg18 (B), 및 vac14Δ (C) 효모 균주. GRO - 인에 대응하는 관심 영역에서 로우 카운트 (3,5) P 2 (화살표)을 차감 크로마토 그래피와 배경에서 추출된다. 결과 값은 야생형에 비교에 배 변화 촉진제 - 인 (3,5) P 2 단계 (D)로 표현된다. 의 수준과 변화 촉진제는 - 인 (3,5) P (2)는 원래 PtdIns (3,5) P 2의 수준과 변화를 보여주는 것으로 해석된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 이노시톨없는 미디어 (IFM) |
| 27.8 밀리미터 (NH4) 2SO4 |
| 2 % 포도당 |
| 0.01 mM의 KH2PO4 |
| 1X 아미노산 |
| 1X LPSM |
| 1X 추적 요소 |
| 5 배 비타민 |
| 10 배 낮은 인산과 황산 미디어 (LPSM) |
| 9 밀리미터의 CaCl2 |
| 17 mM의 NaCl을 |
| 67 밀리미터의 KCl |
| 1000 배 미량 원소 |
| 8 mM의 붕산 |
| 250 μM의 CuSO4 |
| 602 μm의 KI |
| 1.23 mM의 FeCl3를 |
| 2.65 밀리미터의 MnSO4 |
| 971 μm의 나 - 몰리브덴 |
| 2.48 밀리미터의 ZnSO4 |
| 500X 비타민 |
| 4 μm의 비오틴 |
| 2.27 μm의 엽산 |
| 1.62 mM의 니아신 |
| 729 μm의 파라 아미노 벤조산 |
| 973 μm의 Pryidoxine 염산 |
| 266 μm의 리보플라빈 |
| 593 μm의 티아민 염산 |
기본 미디어가 3 H-미오 -inositol 보충로서 효모 이노시톨없는 미디어. 효모 세포의 표 1. 구성은 IFM과 방사성 표지됩니다. 표시된 솔루션을 사용하여 IFM의 100 ml의 솔루션을 준비합니다필터는 실온에서 병 상단 0.22 μm의 진공 필터와 저장소를 사용하여 소독. 저 인산 및 황산 미디어 (LPSM)을 제조하는 공정, 표시 가능한 염을 사용하여 100 mL의 용액을 생성, 필터 RT에서 병 상단 0.22 ㎛의 진공 필터 및 저장소를 사용하여 소독. 미량 원소의 1 L 1000 배 용액을 조제 지시 염을 용해. -20 ° C에서 사용 및 / 또는 저장 씩하기 전에 철저하게 섞는다. 1 L 500X 비타민 용액을 제조 나타낸 비타민을 녹인다. -20 ° C에서 사용 및 저장 분취하기 전에 철저하게 섞는다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
이 문서에서는 효모에서 HPLC 결합 흐름 섬광에 의해 PtdnsPs의 세포 수준을 정량화하는 데 필요한 실험 프로토콜을 자세히 설명합니다. 방법론은 지질 처리 및 수용성 H-3-InsPs 촉진제, HPLC 분획의 추출 및 분석 하였다 3 H-의 미오의 -inositol와 PtdInsPs의 대사 라벨링을 가능하게한다. PtdIns (3,5) 야생형, vac14 D와 atg18의 D 효모 세포 (그림 4)에서 P 2 도시 된 바와 같이이 방법을 사용하여, 다양한 조건 하에서 세포에서 PtdInsPs의 상대적 수준은 정량화 할 수있다.
결과를 최적화 및 / 또는 문제를 해결하기 위해 수행 될 수있는 중요한 단계 및 변형들이있다. PtdInsPs 신뢰성 정량을 달성하기위한 가장 중요한 파라미터 중 하나는 총 방사능 신호 레벨이다. 일반적으로 HPLC에 3-5000000 수를 주입하는 것은 확실 하이의 변화를 정량하는 것이 충분하다이러한 PtdIns (4,5) P 2와 gher 풍부 PtdInsP 종. 그러나, 최대 1000 만 카운트의 주입은 PtdIns (3,5) P 2로 낮은 풍부한 종의 정량 필요할 수 있습니다. 방사성 신호의 레벨은 샘플, 라벨링 시간 및 온도, 3 H-의 미오의 -inositol의 농도 PtdInsPs의 회전율을 제조하는데 사용되는 세포의 총 수 및 내인성 합성 포함 달성에 영향을 줄 수있는 각종 파라미터가 있습니다 의 이노시톨, 이는 방사성 표지 이노시톨과 경쟁 할 것이다. 예를 들어, 적어도 하나는 시간을 두 배로위한 방사성 표지 효모 세포는 신진 대사 PtdInsPs에 3 H-myo-를 이노시톨의 통합,하지만 느린 성장 또는 필요할 수 있습니다 느린 신진 대사 활동이 효모 돌연변이 체의 표시 시간을 연장 할 수 있습니다. 또한, 여기에 설명 된 프로토콜은 다음 fo를 세포가 집중되어있는 미드 로그 상으로 성장 된 효모 배양의 diauxic 시프트를 사용하나 두 배의 시간이 지남에 따라 R 라벨. 이전에 32 일을하지만, 하나는 시간의 긴 기간 초기와 중반 로그 단계 및 라벨링 세포에 의한 diauxic 변화를 줄일 수 있습니다. 이 과정에서, 이러한 저자는 PtdIns (3) P, PtdIns (4) P와 diauxic 변화 (32)를 겪고 세포보다 PtdIns (4,5) P 2의 높은 수준을 관찰했다.
RAW 264.7 대 식세포 라인 같은 일부 포유 동물 세포는 매 12 시간을 두 배로 때문에 다른 사람들이 전혀 20,35,39, 신경 세포의 경우와 같이 훨씬 느린 분할, 또는 할 수있는 반면 마찬가지로, 포유 동물 세포의 라벨링 기간은 최적화가 필요할 수 있습니다. 또한, 하나 이상 방사성 신호 레벨을 달성하기 위해 3 H-의 미오 -inositol의 농도를 증가시킬 수있다. 그러나 일부 3 H-의 미오의 -inositol 90 % 에탄올에 패키지되어 있으므로주의하시기 바랍니다; 추가 과도한 3 H-미오 -inositol 미디어에서 에탄올 함량을 증가하고 의도하지 않은 EFFE을 가질 수있다세포에 CT. 마지막으로, 장기의 방사선은 이노시톨의 세포를 굶어 수 있습니다. 이것은 완전한 DMEM 10 μCi를 / ㎖로 표시 할 때 0.5 μm의 3 H-의 미오의 -inositol에 비해 40 μM의 미오의 -inositol을 포함 포유 동물 세포 배양에서 특히 분명하다. 따라서, 필요한 경우, 단순히 라벨 동안 포유 동물 세포의 수를 증가 권장된다.
셀룰러 및 지질 용해 처리 단계는 최적의 수율을 얻을뿐만 아니라, HPLC 컬럼의 건강을 유지하는데 중요하다. 과염소산과 용해 지질 및 기타 거대 분자의 석출을 허용, 제 조직 배양에 이용 이상 효모 28,33 사용 방법. 기존의 메탄올을 사용하여 총 지질의 추출에 비해 / 염산 / 클로로포름있어서, 과염소산의 사용은 실험 28 사이의 작은 변화에 PtdIns (3,5) P (2)를 포함하여, PtdInsPs의 복구를 향상시킨다. 보결메틸 아민 퀀트 애플리케이션 상분리 유리 지방산 및 지질 손상에서 28, 34으로 수용성 촉진제-INSP 떠나는 글리세롤 골격과 소수성 개의 아실 쇄 사이의 에스테르 결합을 분해. 특별한주의가 추출 단계에서 앞으로 원치 않는 유기 용매 및 불용성 물질을 운반하지 않도록주의해야합니다. 이 시스템을 방해 압력 스파이크의 원인 및 / 또는 화학적으로 열 손상을 줄 수 있습니다. 또한 열은 사용 전에 인산 암모늄 (완충액 B)의 높은 농도로 컬럼을 노광함으로써 각각의 하루의 시작 부분에 조절되어야한다; 따라서, 짧은 "평형"프로토콜은 실험 샘플을 실행하기 전에 채용된다. 실행되는 첫 번째 실험 샘플의 촉진제-InsPs 피크의 지연 용출 프로파일이 조절 단계의 결과를하지 않으면.
뿐만 아니라 고려하는 분석 및 정량화에 관한 몇 가지 중요한 포인트가 있습니다. 먼저, 질문uantification 자체는 신호와 각 피크의 영역의 통합뿐 아니라 피크 높이이어야한다. 각 피크의 절대 신호 통합 셀에 PtdInsP 풍부의 변화를 반영하지 않고 샘플과 실험 사이에 상당히 다를 수 있기 때문에 또한, 내부 통제는 일반적으로 필요하다. 부모의 촉진제 - 인 피크는 일반적으로 그것에 대하여 각 촉진제-INSP 피크를 정상화하여 내부 통제로 사용된다. 촉진제 - 인 피크는 일반적으로 방사성 신호의 거의 90 %를 보유하고 조건 사이에서 변경하는 경향이되지 않습니다. 또한, 하나는 하나가 부모의 PtdIns는 실험 조건에 큰 변화를 겪고 있다고 의심 특히, 총 카운트에 정상화 할 수 있습니다. 마지막으로, 낮은 풍부한 PtdInsPs 위해, 배경 차감 관심 피크 (도 3D)와 같은 "시간 스케일"로 인근 비 피크 면적을 규정 권장된다.
마지막 고려 사항은 관련세 모노 인산화 세 비스 인산화 종 등 7 PtdInsP 종을, 소유 포유 동물 샘플의 분석. 불행히도, 완전히 PtdIns5P에서 PtdIns4P를 해결하기 어렵고, PtdIns (3,5) 연결형 더블 피크 결과 포유류 시료에서 PtdIns (3,4) P (2) P (2)에서. 이 피크의 해상도를 증가 이전에 발행 된 몇 가지 방법이 있습니다. 통상적으로,이 용출 길이를 수정 포함 암모늄 포스페이트 완충액의 출발 농도, 속도 및 단계되는 용출 프로파일 중 암모늄 포스페이트 완충액 농도 변화 및 암모늄 포스페이트 완충액 33,35-38의 pH. 아마도, 가장 성공적인 방법은 별도 PtdIns 개발 (4) P와 PtdIns (5) P가 최근 두 탠덤 SAX 열 및 pH가 6.0 암모늄 포스페이트 완충액을 사용 Sarkes 및 Rameh 39에 의해 설명되었다.
대부분의 방법과 마찬가지로, HPLC-C를 사용하여세포에서 PtdInsPs을 정량화하는 섬광 흐름 oupled하면 사용 가능한 다른 방법에 비해 장점과 단점이 있습니다. 예를 들어, HPLC에 결합 온라인 유동 촉진제는 섬광-InsPs 라이브 검출을 제공하지만, 이러한 방법의 민감도를 감소 섬광 계수 시간을 제한한다. 대안 적으로, HPLC 용출액을 분획 채취 대신 유동 신틸 레이터에 병입의 자동 샘플러로 할 수있다. 수동 분획 후 따라서 높은 감도를 제공하고 더 긴 시간에 대한 오프 - 라인 액체 섬광 계수기에 의해 판독 될 수있다 - 그럼에도 불구하고,이 방법은 분획의 개수에 따라 많이 시간이 많이 걸리고 노동 해상도 감소는 (38, 40)를 수집 . 또한, 전체 셀의 분석은 명백하게 특정 PtdInsP의 수준을 측정하지만, 그 PtdInsP의 세포 내 분포에 변화를 통지하지 않을 수 비록 하나로서 기존에 이하 세포질 분획 방법에 커플 흐름 섬광교활한 (39) 다. 이에 비해, PtdInsP - 결합 도메인은 세포에서 PtdInsP 종의 위치 및 역학을 연구하는데 유용하다 FP 계뿐만 아니라, 타겟 PtdInsP보다 다른 요소에 결합 할 수있다. 또한, 여기에 기재된 방법은 크게 PtdInsPs의 분자 다양성을 증가 아실 체인을 제거함으로써 PtdInsP 수준의 분석을 단순화시킨다. 지질의 탈아 실화는 아실 쇄 PtdInsP (41, 42)가 신호의 과소 양태에 관한 구조적 정보의 손실을 초래하지만 이후 동일한 토큰에 의해,이 또한 중요한 단점이다. 이것은 중대한 관심사 인 경우, 액체 크로마토 그래피 질량 분석 (LC-MS)을 14,17을 이용해야 결합. 그러나, 그것은 동시에 LC-MS (43)에 의해 모든 PtdInsPs 종을 분석하는 현재 어렵다. 따라서, 방법의 조합은 일곱 PtdInsPs 종의 위치, 역학, 분자 다양성과 수준을 조사하기 위해 가장 좋은 방법이다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Butanol | Biobasic | BC1800 | Reagent grade |
| Ammonium phosphate dibasic | Bioshop | APD001 | ACS grade |
| Ammonium sulfate | Biobasic | ADB0060 | Ultra Pure grade |
| Autosampler | Agilent | G1329B | Agilent 1260 infinity series |
| Biotin | Sigma | B4501 | |
| Boric acid | Biobasic | BB0044 | Molecular biology grade |
| Calcium Chloride | Biobasic | CT1330 | Ahydrous, industrial grade |
| Calcium pantothenate | Sigma | C8731 | |
| Copper(II) sulfate | Sigma | 451657 | Anhydrous |
| D-Glucose | Biobasic | GB0219 | Anhydrous, biotech grade |
| Dulbecco's modification of Eagle's Medium | Life | 11995-065 | With 4.5 g/L glucose, 110 mg/L pyruate, L-glutamine |
| Dulbecco's modification of Eagle's Medium | MP biomedicals | 0916429 | With 4.5 g/L glucose, without L-gluatmine, without inositol |
| EDTA | Biobasic | EB0107 | Acid free, ultra pure grade |
| Ethyl ether | Caledon labs | 1/10/4700 | Anhydrous, reagent grade |
| Ethyl formate | Sigma | 112682 | Reagent grade |
| Fetal bovine serum | Wisent | 080-450 | US origin, premium quality, heat inactivated |
| Fetal Bovine Serum, Dialyzed | Life | 26400044 | US origin |
| FlowLogic U | LabLogic Systems Ltd | SG-BXX-05 | Scintillation fluid for flow scintillation |
| Folic acid | Biobasic | FB0466 | USP grade |
| HEPES buffer solution | Life | 15630080 | 1 M solution |
| Inositol, Myo-[2-3H(N)] | Perkin Elmer | NET114005MC | 9:1 ethanol to water |
| Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine | Life | 51500056 | 100x solution |
| Iron(III) chloride | Sigma | 157740 | Reagent grade |
| Laura - Chromatography data collection and analysis software | LabLogic Systems Ltd | Version 4.2.1.18 | Flow scintillator software |
| L-glutamine | Sigma | G7513 | 200 mM, solution, sterile-filtered, BioXtra, suitable for cell culture |
| Magnesium Chloride | Sigma | M8266 | Anhydrous |
| Manganese sulfate | Biobasic | MB0334 | Monohydrate, ACS grade |
| Methanol | Caledon labs | 6701-7-40 | HPLC Grade |
| Methylamine solution | Sigma | 426466 | 40% (v/v) |
| Monopotassium phosphate | Biobasic | PB0445 | Anhydrous, ACS grade |
| Nicotinic acid | Biobasic | NB0660 | Reagent grade |
| OpenLAB CSD ChemStation | Agilent | Rev. C.01.03 | HPLC software |
| p-aminobenzoic acid (PABA) | Bioshop | PAB001.100 | Free acid |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | 100X, liquid, stabilized, sterile-filtered, cell culture tested |
| Perchloric acid | Sigma | 244252 | ACS reagent, 70% |
| PhenoSpher SAX column | Phenomenex | 00G-315-E0 | 5 µm, 80 Å, 250 x 4.6 mm |
| Phosphoric acid | Caledon labs | 1/29/8425 | Reagent grade |
| Potassium Chloride | Biobasic | PB0440 | ACS grade |
| Potassium iodide | Biobasic | PB0443 | ACS grade |
| Pyridoxine hydrochloride | Sigma | P9755 | |
| Quaternary pump | Agilent | G1311C | Agilent 1260 infinity series |
| Riboflavin | Bioshop | RIB333.100 | USP grade |
| Sodium Chloride | Biobasic | DB0483 | Biotech grade |
| Sodium molybdate | Sigma | 243655 | |
| Thermostatted Column Compartment | Agilent | G1316A | Agilent 1260 infinity series |
| Thiamine hydrochloride | Sigma | T4625 | Reagent grade; make solution of 0.02% (w/v), forms a suspension. mix and freeze aliquots |
| Ultima Gold | Perkin Elmer | 6013321 | Scintillation coctail for liquid scintillation counting |
| Zinc sulfate | Biobasic | ZB2906 | Heptahydrate, reagent grade |
| β-RAM 4 | IN/US systems | Model 4 | Flow scintillator - 500 µl flow cell; alternative Radiomatic Flow Scintillator Analyser by Perkin Elmer |
References
- Di Paolo, G., De Camilli, P. Phosphoinositides in cell regulation and membrane dynamics. Nature. 443 (7112), 651-657 (2006).
- Bridges, D., Saltiel, A. R.
- Botelho, R. J. Changing phosphoinositides "on the fly": How trafficking vesicles avoid an identity crisis. BioEssays. 31 (10), 1127-1136 (2009).
- Simonsen, A., Wurmser, A. E., Emr, S. D., Stenmark, H. The role of phosphoinositides in membrane transport. Curr. Opin. Cell. Biol. 13 (4), 485-492 (2001).
- Katso, R., Okkenhaug, K., Ahmadi, K., Timms, J., Waterfield, M. D. Cellular Function of Phosphoinositide 3-Kinases: Implications for Development, Immunity, Homeostasis, and Cancer. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 17, 615-675 (2001).
- Lenk, G. M., Meisler, M. H. Mouse models of PI(3,5)P2 deficiency with impaired lysosome function. Methods. Enzymo. 534, Elsevier Inc. (2014).
- Lemmon, M. A.
- Cullen, P. J., Cozier, G. E., Banting, G., Mellor, H. Modular phosphoinositide-binding domains-their role in signalling and membrane trafficking. Curr. Biol. 11 (21), R882-R893 (2001).
- Balla, T. Inositol-lipid binding motifs: signal integrators through protein-lipid and protein-protein interactions. J. Cell. Sci. 118 (Pt 10), 2093-2104 (2005).
- Burd, C. G., Emr, S. D. Phosphatidylinositol(3)-phosphate signaling mediated by specific binding to RING FYVE domains. Mol. Cell. 2 (1), 157-162 (1998).
- Lemmon, M. A., Ferguson, K. M., O'Brien, R., Sigler, P. B., Schlessinger, J. Specific and high-affinity binding of inositol phosphates to an isolated pleckstrin homology domain. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92 (23), 10472-10476 (1995).
- Scott, C. C., et al. Phosphatidylinositol-4, 5-bisphosphate hydrolysis directs actin remodeling during phagocytosis. J. Cell. Biol. 169 (1), 139-149 (2005).
- Gillooly, D. J., et al. Localization of phosphatidylinositol 3-phosphate in yeast and mammalian cells. EMBO J. 19 (17), 4577-4588 (2000).
- Haag, M., Schmidt, A., Sachsenheimer, T., Brügger, B. Quantification of Signaling Lipids by Nano-Electrospray Ionization Tandem Mass Spectrometry (Nano-ESI MS/MS). Metabolites. 2 (1), 57-76 (2012).
- Furutani, M., Itoh, T., Ijuin, T., Tsujita, K., Takenawa, T. Thin layer chromatography-blotting, a novel method for the detection of phosphoinositides. J. Biochem. 139 (4), 663-670 (2006).
- Cooke, F. T., et al. The stress-activated phosphatidylinositol 3-phosphate 5-kinase Fab1p is essential for vacuole function in. 8 (22), 1219-1222 (1998).
- Milne, S. B., Ivanova, P. T., DeCamp, D., Hsueh, R. C., Brown, H. A. A targeted mass spectrometric analysis of phosphatidylinositol phosphate species. J. Lipid. Res. 46 (8), 1796-1802 (2005).
- Rusten, T. E., Stenmark, H. Analyzing phosphoinositides and their interacting proteins. Nat. methods. 3 (4), 251-258 (2006).
- Ho, C. Y., Alghamdi, T. A., Botelho, R. J. Phosphatidylinositol-3,5-bisphosphate: no longer the poor PIP2. Traffic. 13 (1), 1-8 (2012).
- Samie, M., et al. A TRP channel in the lysosome regulates large particle phagocytosis via focal exocytosis. Dev. Cel. 26 (5), 511-524 (2013).
- Shaw, J. D., Hama, H., Sohrabi, F., DeWald, D. B., Wendland, B. PtdIns(3,5)P2 is required for delivery of endocytic cargo into the multivesicular body. Traffic. 4 (7), 479-490 (2003).
- Botelho, R. J., Efe, J. A., Emr, S. D. Assembly of a Fab1 phosphoinositide kinase signaling complex requires the Fig4 phosphoinositide phosphatase. Mol. Biol. Cell. 19, 4273-4286 (2008).
- Rudge, S. A., Anderson, D. M., Emr, S. D. Vacuole size control: Regulation of PtdIns(3,5)P2 levels by the vacuole-associated Vac14-Fig4 complex, a PtdIns(3,5)P2-specific phosphatase. Mol. Biol. Cell. 15, 24-36 (2004).
- Sbrissa, D., et al. Core protein machinery for mammalian phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate synthesis and turnover that regulates the progression of endosomal transport: Novel Sac phosphatase joins the ArPIKfyve-PIKfyve complex. J. Biol. Chem. 282 (33), 23878-23891 (2007).
- Alghamdi, T. A., et al. Vac14 protein multimerization is a prerequisite step for Fab1 protein complex assembly and function. J. Biol. Chem. 288 (13), 9363-9372 (2013).
- Ikonomov, O. C., Sbrissa, D., Fenner, H., Shisheva, A. PIKfyve-ArPIKfyve-Sac3 core complex: Contact sites and their consequence for Sac3 phosphatase activity and endocytic membrane homeostasis. J. Biol. Chem. 284 (51), 35794-35806 (2009).
- Dove, S. K., et al. Vac14 controls PtdIns(3,5)P(2) synthesis and Fab1-dependent protein trafficking to the multivesicular body. Curr. Biol. 12 (11), 885-893 (2002).
- Bonangelino, C. J., et al. Osmotic stress-induced increase of phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate requires Vac14p, an activator of the lipid kinase Fab1p. J. Cell. Biol. 156 (6), 1015-1028 (2002).
- Dove, S. K., et al. Svp1p defines a family of phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate effectors. EMBO J. 23 (9), 1922-1933 (2004).
- Efe, J. A., Botelho, R. J., Emr, S. D. Atg18 regulates organelle morphology and Fab1 kinase activity independent of its membrane recruitment by phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate. Mol. Biol. Cell. 18 (1), 4232-4244 (2007).
- Odorizzi, G., Babst, M., Emr, S. D. Fab1p Ptdlns(3)P 5-kinase function essential for protein sorting in the multivesicular body. Cell. 95 (6), 847-858 (1998).
- Duex, J. E., Nau, J. J., Kauffman, E. J., Weisman, L. S. Phosphoinositide 5-phosphatase Fig4p is required for both acute rise and subsequent fall in stress-induced phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate levels. Eukaryotic Cell. 5 (4), 723-731 (2006).
- Whiteford, C. C., Best, C., Kazlauskas, A., Ulug, E. T. D-3 phosphoinositide metabolism in cells treated with platelet-derived growth factor. Biochem J. 319 (3), 851-860 (1996).
- Murthy, P. P., et al. Evidence of two isomers of phosphatidylinositol in plant tissue. Plant physiology. 98 (4), 1498-1501 (1992).
- Zolov, S. N., et al. In vivo, Pikfyve generates PI(3,5)P2, which serves as both a signaling lipid and the major precursor for PI5P. Proc. 109 (43), 17472-17477 (2012).
- McEwen, R. K., et al. Complementation analysis in PtdInsP kinase-deficient yeast mutants demonstrates that Schizosaccharomyces pombe and murine Fab1p homologues are phosphatidylinositol 3-phosphate 5-kinases. J. Biol. Chem. 274 (48), 33905-33912 (1999).
- Tolias, K. F., et al. Type I phosphatidylinositol-4-phosphate 5-kinases synthesize the novel lipids phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate and phosphatidylinositol 5- phosphate. J. Biol. Chem. 273 (29), 18040-18046 (1998).
- Ikonomov, O. C., et al. The phosphoinositide kinase PIKfyve is vital in early embryonic development: preimplantation lethality of PIKfyve-/- embryos but normality of PIKfyve+/- mice. J. Biol. Chem. 286 (15), 13404-13413 (2011).
- Sarkes, D., Rameh, L. E. A Novel HPLC-Based Approach Makes Possible the Spatial Characterization of Cellular PtdIns5P and Other Phosphoinositides. Biochem J. 428 (3), 375-384 (2011).
- Sbrissa, D., Ikonomov, O. C., Filios, C., Delvecchio, K., Shisheva, A. Functional dissociation between PIKfyve-synthesized PtdIns5P and PtdIns(3,5)P2 by means of the PIKfyve inhibitor YM201636. Am. J. Physiol. Cel. Physiol. 303 (4), 436-446 (2012).
- D'Souza, K., Epand, R. M. Enrichment of phosphatidylinositols with specific acyl chains. Biochim. Biophys. Acta - Biomembr. 1838 (6), 1501-1508 (2014).
- Shulga, Y. V., Anderson, R. A., Topham, M. K., Epand, R. M. Phosphatidylinositol-4-phosphate 5-kinase isoforms exhibit acyl chain selectivity for both substrate and lipid activator. J. Biol. Chem. 287 (43), 35953-35963 (2012).
- Pettitt, T. R., Dove, S. K., Lubben, A., Calaminus, S. D. J., Wakelam, M. J. O. Analysis of intact phosphoinositides in biological samples. J. Lipid. Res. 47 (7), 1588-1596 (2006).
