Summary
Phosphoinositides signaliserer lipider hvis relative overflod endres raskt i respons på ulike stimuli. Denne artikkelen beskriver en metode for å måle mengde av phosphoinositides ved metabolisk merking celler med 3 H-myo-Inositol, etterfulgt av ekstraksjon og deacylering. Ekstraherte glysero-inositides blir deretter separert ved væskekromatografi og kvantifiseres ved flow-scintillasjon.
Protocol
Merk: Teksten nedenfor beskriver i detalj en metode for å måle PtdInsPs i gjær. Det gir de eksperimentelle detaljene for merking av gjærceller med tre H- myo-Inositol, utpakking og deacylating lipider og en HPLC-eluering protokoll for å fraksjonere og kvantifisere deacylated PtdInsPs. Vær oppmerksom på at merking, deacylering, oppløsning og kvantifisering av PtdInsPs i pattedyrceller krever optimalisering og lengre HPLC-elueringsprofiler. Disse detaljene kan finnes andre steder, selv om vi diskutere noen av aspektene i diskusjonen. Totalt sett er metodikken for å ekstrahere lipider, deacylate og ekstrahere vannløselige Gro-InsPs fra gjær er gitt, og er illustrert i figur 1.
1. Protokoll for merking og Analyse PtdInsPs i gjær
- Cellekultur og radiomerking
- Dyrk en 20 ml flytende kultur av gjærstammen SEY6210 ved 30 ° C med konstant risting i fullstendig syntetiskmedia til mid-log-fase eller en optisk tetthet ved 600 nm (OD 600) på ca 0,6 til 0,7.
Merk: Ikke bruk YPD media da dette kan påvirke tre H- myo-Inositol innlemmelse. Denne størrelsen kultur skal gi tilstrekkelig materiale for 2-3 HPLC løper. - Pellet totalt 10-14 OD av gjærcellene (merk at 1 ml kultur med en OD 600 = 1 inneholder 1x10 ~ 7-celler) ved sentrifugering ved 800 xg i 5 minutter i en 12 ml rundbunnet rør. Suspender med 2 ml inositol-frie medier (IFM) (se tabell 1 for IFM sammensetning).
- Gjenta sentrifugering og aspirer media. Resuspender pellet med 440 mL av IFM og inkuber ved romtemperatur i 15 min.
- Legg 60 mL av 3 H- myo-Inositol (1 pl = 1 uCi) til hver prøve og inkuber ved den økende temperatur på 30 ° C i 1 til 3 timer med konstant risting.
Forsiktig: 3 H- myo-Inositol er et radioaktivt kompisrial som skal håndteres etter passende trening. I tillegg bør alle forbruksartikler som kommer i kontakt med 3-H-inneholdende materiale være anordnet på passende måte og betegnet som radioaktivt avfall.
Merk: Veksten Temperaturen kan endres etter behov så lenge alle stammer som skal sammenlignes er dyrket ved den samme temperatur. - Overfør cellesuspensjonen (500 pl) til et mikrosentrifugerør som inneholdt 500 ul av 9% perklorsyre og 200 ul syrevaskede glassperler. Bland ved inversjon og inkuber på is i 5 min.
- Vortex prøven på full hastighet i 10 min og overføre lysatene til et nytt mikrosentrifugerør ved hjelp av en gel-lasting spissen for å unngå at glassperler.
- Pelletere prøven ved 12 000 xg i 10 min ved 4 ° C og supernatanten aspireres.
- Resuspender pellet av badekaret sonikering i 1 ml iskald 100 mM EDTA. Pellet på nytt som før.
- Dyrk en 20 ml flytende kultur av gjærstammen SEY6210 ved 30 ° C med konstant risting i fullstendig syntetiskmedia til mid-log-fase eller en optisk tetthet ved 600 nm (OD 600) på ca 0,6 til 0,7.
- Deacylering og utvinning
- Aspirer EDTA og sonikere pelleten i 50 ul vann.
- Legg 500 pl av reagens og deacylering sonikere å blande. Inkuber ved RT i 20 min.
- Varme lipider til 50 minutter ved 53 ° C i en varmeblokk. Tørk prøvene helt av vakuum sentrifugering i løpet av tre timer eller O / N.
- Sørge for at en kjemisk felle er installert mellom vakuumsentrifuge og vakuumpumpen for å hindre damp fra å komme inn i luften.
- Resuspender pellet med 300 ul vann-bad ved ultralydbehandling og inkuber ved romtemperatur i 20 min. Tørk prøvene ved vakuumsentrifugering i 3 timer eller O / N. Gjenta dette trinnet en gang.
- Sonikere pellet med 450 ul vann. Dette er den vandige fase under ekstraksjonen.
- Fersk forberede 10 ml av extraction-reagens ved å tilsette 8,0 ml 1-butanol, 1,6 ml etyl-eter og 0,40 ml ethylformiat. Inverter å blande.
- Tilsett 300 ul av ekstraksjon reagens til den vandige fase. Vortex blandingen på full hastighet i 5 min og skille lag ved sentrifugering i full fart (18000 xg) i 2 min.
- Samle det nederste vandige laget inn i et nytt mikrofuge-rør og samtidig unngå den øverste organiske lag, grensesnittet, og pelleten. Gjenta ekstraksjon av den vandige fasen to ganger til med friskt ekstraksjon reagens.
- Fullstendig tørke samlet vandige laget av vakuum sentrifugering. Disperse pelleten i 50 ul vann-bad ved ultralydbehandling.
- Tilsett 2 ul av hver prøve til 4 ml scintillasjonsvæske i et 6 ml hetteglass av polyetylen scintillasjons. Bestem antall tellinger (i cpm) i hver prøve ved væskescintillasjon hjelp av et åpent vindu.
- Oppbevar prøvene ved -20 ° C inntil de er klare for HPLC.
- Forbered buffer A ved å filtrere en L av ultrarent vann med en flaskekork 0,22 um filter vakuum, etterfulgt av avgassing.
- Forbered buffer B ved å lage en 1 l løsning av 1 M ammonium dinatriumhydrogenfosfat (APS, MW 132,06) i vann, og justere pH til 3,8 med fosforsyre. Filtrer ammonium fosfat med en flaskekork 0,22 um filter vakuum, etterfulgt av avgassing.
- Monter hetteglass med utrusting en 2 ml hetteglass med en fjærbelastet 250 mL lite volum innsats. Last 10000000 CPM og tilsett vann til et samlet volum på 55 pl. Gjør klar en tom flaske med 55 mL vann.
- Cap hetteglassene med skrukork utstyrt med en PTFE / silikon septa (rød siden som vender mot innsiden av hetteglass). Plasser hver ampulle i auto-prøvetaking skuffen av HPLC, og starter med den tomme flasken.
- Bruk en HPLC og tilhørende programvare som styrer buffer flow, degasses buffere og kontroller sample injectipå. Bruke en elektronisk strømnings scintillator og tilhørende programvare for å regulere scintillant strømningshastigheten og for å overvåke 3 H-nedbrytning signal.
- Bruk en SAX væskekromatografi kolonne med dimensjoner på 250 mm x 4,6 mm og inneholdende 5 um silika harpiks i HPLC. Utstyre kolonnen en vakt kolonne for å unngå injeksjon av forurensninger med.
- Installere en 3 H-kompatibel 500 ul strømningscelle i strømnings scintillatoren.
MERK: Fraksjone kan gjøres med en Agilent 1200 uendelig serie HPLC system styrt av ChemStation programvare eller med andre kommersielt tilgjengelige HPLC systemer. Flow scintillation av HPLC eluent kan gjøres med en β-RAM strømnings scintillatoren styres av Laura programvare eller en annen kommersielt tilgjengelig strømnings scintillator eller kompatibel programvare.
- Initialiser kvaternære pumpe ved en strømningshastighet på 1,0 ml / min, med 100% buffer A.
- Sett opp en likevekt profil på HPLCfor å kontrollere gradient av buffere A og B (kaller dette "protokoll A likevekt"): 1% buffer B i 5 minutter, 1-100% B i 5 min, 100% B i 5 minutter, 100-1% B i 5 min, 1% B for 20 min. Still inn trykkgrensen på 400 bar, 1,0 ml / min flow rate, og 30 min kjøretid.
- Sett opp en elueringsprofil (figur 2) på HPLC for å kontrollere gradient av buffere A og B (kaller dette "Protokoll A"): 1% B i 5 minutter, 1-20% B i 40 minutter, 20-100% B i 10 minutter, 100% B i 5 minutter, 100-1% B i 20 min, 1% B for 10 min. Still inn trykkgrensen på 400 bar, 1,0 ml / min flow rate, og 90 min kjøretid.
- Sett opp en deteksjonsprotokoll på strømnings scintillatoren (kaller dette "protokoll A deteksjon") for å løpe i 60 minutter, med en scintillasjonsvæske strømningshastighet på 2,5 ml / min, og en 8,57 sek holdetiden.
- Programmere en automatisert injeksjon på HPLC-sekvensen til å begynne med vannet blank på "Protokoll A likevekt", etterfulgt av each radiomerket prøven på "Protokoll A". Initial sekvensen når du er klar.
- Mens kjøringen er fortsatt på likevekt protokollen, lage en batch på flyten scintillator å måle alle prøvene med "Protokoll A deteksjon." Injeksjonen av hver ny prøve vil initial "Protokoll A" på HPLC mens utløser strømnings scintillatoren til å begynne "protokoll A deteksjon".
- Ved fullføring av alle kjøringer, skylle HPLC kolonnen og strømme scintillator med 100% Buffer A i 30 minutter ved 1,0 ml / min strømningshastighet.
- Bruk Laura programvare eller annen programvare som kan kvantifisere kromatografi spektrene. Trinnene som er beskrevet i dette avsnittet er avbildet i Figur 3.
- Åpne filene ved å klikke på "File", "Open", og velg den rå datafilen for hver prøve.
- I "chromatograms" -kategorien, zoom i å strekke hvert av de mindre topper (omtrent 1000 tellinger [y-aksen]) samtidig beholde den tidsoppløsning. Zoome inn i hver enkelt topp hvis det er nødvendig.
- Uthev hver av toppene for analyse ved hjelp av "Legg ROI" -verktøyet. Identifisere topper etter tid Elueringsrekkefølgen: Foreldre Gro-Ins på 10 min, Gro-Ins3P på 18 min, Gro-Ins4P på 20 min, Gro-Ins (3,5) P 2 på 29 min og Gro-Ins (4,5 ) P 2 på 32 min.
- I "regioner bord" -kategorien, spille inn "området (teller)" av hver topp. Legg merke til "start (mm: ss)" tid og "end (mm: ss)" tid for hver topp.
- For bakgrunn subtraksjon, markere et område som grenser til toppen spenner over samme tidsperiode. Subtraher antall tellinger fra den tilsvarende topp.
- Normalisere arealet til hver topp mot foreldre Gro-moduler (uttrykt som "% av totale ptdins"). Deretter, normalisere hver av de topper i hver eksperimentell tilstand mot styre tilstand (uttrykt som "nfold økning i forhold til å styre ").
MERK: Normalisering av hver topp kan også gjøres mot totaltellinger, men siden den foreldre Gro-Ins er mye rikere enn alle andre PtdInsPs resultatene en tendens til å være lik. - Eksportere data for de chromatographs ved å trykke på "File", "Lagre som ...", og velg "CSV (kommaseparert)" filformat. Plotte data på et regneark og presentere som nødvendig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjelp av denne metoden, ble gjær PtdInsPs metabolsk merket med tre H- myo-Inositol. Etter merking ble fosfolipider utfelt med perklorsyre, etterfulgt av deacylering fosfolipid og ekstraksjon av den vannløselige Gro-InsPs (figur 1). På dette trinnet er det viktig å kvantifisere den totale radioaktive signal forbundet med den uttrukne Gro-InsPs ved væskescintillasjon å sikre tilstrekkelig signal-til-støy-forholdet for de meget lav-overflod PtdInsPs som ptdins (3,5) P-2; totalt 5-10 millioner CPM-er skal injiseres. Siden gjærceller utviser bare fire PtdInsPs, kan oppløsning oppnås med en 1 hr eluering metode som beskrevet (figur 2).
Her, vill-type, atg18 og vac14 Æ Æ gjærmutanter ble merket og behandlet for å analysere endringer i ptdins (3,5) P-2, the minst rikelig av PtdInsPs i gjær 16,19,27. Som observert i figur 4A-C, elueringsprofilen for alle tre stammer produserte 3 H-assosierte signaltopper. Foreldre Gro-Ins topp eluerer først (8-9 min, vist i figur 3, men ikke på figur 4, siden Gro-Ins overskygger signal fra fosforylerte art), etterfulgt av Gro-Ins3P (~ 18 min), dagligvarela- Ins4P (~ 20 min), Gro-Ins (3,5) P 2 (~ 29 min) og Gro-Ins (4,5) P 2 (~ 32: 00 min), som henholdsvis tilsvarer acylerte fosfolipider ptdins, PtdIns3P, PtdIns4P, ptdins (3,5) P 2 og ptdins (4,5) P 2. Det er et par ekstra små topper på 4 min og en som har en tendens til å umiddelbart følge foreldre Gro-Ins (10 min); disse sannsynligvis representerer inositol og en ikke-glycerated inositide fosfater (figur 3). Elusjonsmønsteret er enhetlig og karakteristisk, men den nøyaktige tid kan variere når det anvendes en diffeleie HPLC-system og / eller en ny kolonne.
Peak forbundet med ptdins (3,5) P 2 (figur 4, rød pil) gjennomgår den mest dramatiske endringen mellom villtype, atg18 Δ og vac14 Æ gjærstammer. I forhold til villtypeceller (A), er det en meget stor Gro-moduler (3,5) P 2 -associated signal i atg18 S celler, og en mindre topp i vac14 S gjærceller. For å kvantifisere den totale radioaktive signal knyttet til hver topp ble teller integrert i henhold til det området av toppen (figur 3). I tillegg, siden absolutt radioaktivt signal varierer mellom prøver, ble foreldre Gro-Ins art anvendt som en intern kontroll ved å normalisere mot den (man kan også velge å normalisere mot totale tellinger). Ved å gjøre dette, data tyder på at ptdins (3,5) P 2 utgjør bare 0,07% av ptdins i villtype gjærceller, mens ptdins (3,5) P 2 tilsvarer 1,2% av de paren ptdins i atg18 S-celler, eller en dramatisk 17-ganger økning i ptdins (3,5) P-2 i forhold til villtype-celler (figur 4A, B og D). Til sammenligning ptdins (3,5) P 2 nivåer var bare 0,01% av ptdins signal i VAC14 -deleted gjærceller, en 85% tap i ptdins (3,5) P 2 (Figur 4C og D). Samlet er disse målingene er i overensstemmelse med publiserte resultater som viser at ptdins (3,5) P-2 er ca. 0,1% av ptdins i villtype-celler, 90% redusert i vac14 D, og 10 til 20-ganger høyere i atg18 D-celler i forhold til villtypeceller 27,29.
Figur 1. deacylering og utvinning av tre H-Gro-insp. Radiomerket Lipid bunnfall i perklorsyre blir vasket med vandig oppløsning av EDTA. Dette blir så aspirert og deacylering reagens tilsatt og inkubert ved 53 ° C. Den deacylering Reaksjonsblandingen blir deretter vakuumtørket og vasket med vann to ganger, etterfulgt av tilsetning av ekstraksjon reagens. Dette blir så vortex-blandet, sentrifugert og den vandige fase oppsamlet. Ekstraksjonen trinnet ble gjentatt tre ganger for totalt å fjerne organiske og uoppløselige forurensninger. Den vannløselige fraksjon (blå), som omfatter tre H-Gro-INSP, deretter vakuumtørket og rehydrert med 60 ul vann. Mengden av radioaktivitet bestemmes av væskescintillasjon (CPM) og like tellinger over prøvene er lastet inn i HPLC. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
<br /> Figur 2. gradient av ammonium fosfatbuffer for eluering av 3 H-Gro-INSP. Oppløsning av Gro-INSP av sterk anionbytterkromatografi avhenger av anvendelsen av ammonium- hydrogenfosfat, pH 3,8 (buffer B). Valg av stigning avhenger av blandingen av Gro-INSP arter som er tilgjengelige for separering. Er protokoll A benyttes til gjærprøver, som besitter bare fire PtdInsPs. Oppløsning av hver av de fire toppene er tilstrekkelig med en rask økning i (NH 4) 2 HPO 4 konsentrasjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Guidet instruksjon for dataanalyse av PtdInsP overflod. Datafiler er lastet på Laura software og evaluert visuelt ved hjelp kromatografens (åpen som standard). Bruke "zoom inn" -verktøyet (a), forstørre toppene (b). Velg tydelige topper på kromatografen bruke "legge ROI" -verktøyet (c). I "regionen table" tab (d), er alt som følge opplysninger fra de uthevede områder av interesse vist som en enkelt bord (e). Eksportere rå tellinger av hver topp (f) og normalisere hver PtdInsP arter mot foreldre phosphatidylinositol (g) eller mot totaltellinger. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. ptdins (3,5) P-2 nivåer i vill-type og mutante gjærceller. Representative kromatografer er vist for strømmen scintillation av ekstrakteted tre H-Gro-InsPs fra villtype (A), atg18 Δ (B), og vac14Δ (C) gjærstammer som bruker protokollen a. rå teller fra regionene av interesse tilsvarer Gro-Ins (3,5) P 2 (pil) er hentet fra kromatografens og bakgrunnen trekkes fra. De resulterende verdier blir sammenlignet med villtype og uttrykt som fold-endring i Gro-moduler (3,5) P-2 nivåer (D). Nivåene og endringer i Gro-Ins (3,5) P 2 er tolket til å vise nivåer og endringer i de opprinnelige ptdins (3,5) P 2. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Inositol-frie medier (IFM) |
| 27,8 mM (NH4) 2SO4 |
| 2% Glukose |
| 0,01 mM KH2PO4 |
| 1X Aminosyrer |
| 1X LPSM |
| 1X Sporstoffer |
| 5X Vitaminer |
| 10X Lave fosfat og sulfat medier (LPSM) |
| 9 mm CaCl2 |
| 17 mM NaCl |
| 67 mM KCl |
| 1,000X Sporstoffer |
| 8 mM Borsyre |
| 250 mikrometer CuSO4 |
| 602 mikrometer KI |
| 1,23 mM FeCl3 |
| 2,65 mM MnSO 4 |
| 971 mikrometer Na-molybdat |
| 2,48 mM ZnSO4 |
| 500x Vitaminer |
| 4 mikrometer Biotin |
| 2,27 mikrometer Folic syre |
| 1,62 mM Niacin |
| 729 pM p-aminobenzosyre |
| 973 mikrometer Pryidoxine-HCl |
| 266 mikrometer Riboflavin |
| 593 mikrometer Tiamin-HCl |
Tabell 1. Sammensetning av gjær inositol-fritt medium. Gjærceller er radiomerket med IFM som basismateriale for å bli supplert med 3 H-myo-Inositol. Forbered en 100 ml løsning av IFM ved hjelp av løsninger angitt, Filter sterilisere ved hjelp av en flaske topp 0,22 mikrometer vakuum filter og oppbevar ved RT. For å forberede lav fosfat og sulfat media (LPSM), generere en 100 ml løsning ved hjelp av de angitte salter, filter sterilisere ved hjelp av en flaske topp 0,22 mikrometer vakuum filter og oppbevar ved RT. Oppløse de angitte salter for å forberede en 1 L 1,000x løsning av sporstoffer. Bland grundig før bruk og / eller store porsjoner ved -20 ° C. Oppløse de angitte vitaminer for å forberede en 1 L 500x vitamin løsning. Bland grundig før bruk og oppbevar alikvoter ved -20 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne artikkelen detaljer forsøksprotokollen som kreves for å kvantifisere cellulære nivåer av PtdnsPs ved HPLC-coupled flyt scintillasjon fra gjær. Metodikken muliggjør den metabolske merking av PtdInsPs med 3 H-myo-Inositol, etterfulgt av behandling lipid og ekstraksjon av vannløselige 3-H-Gro-InsPs, HPLC-fraksjonering og analyse. Ved hjelp av denne metode, kan de relative nivåer av PtdInsPs i celler under forskjellige betingelser kvantifiseres, slik det er vist for ptdins (3,5) P 2 i vill-type, vac14 D og D atg18 gjærceller (figur 4).
Det finnes en rekke kritiske trinn og modifikasjoner som kan gjøres for å optimalisere resultater og / eller feilsøke. En av de viktigste parametre for å oppnå pålitelig kvantifisering av PtdInsPs er den totale radioaktive signalnivået. Vanligvis injiseres 3-5 millioner tellinger i HPLC er ofte tilstrekkelig for pålitelig å kvantifisere endringer i hiGher overflod PtdInsP arter som ptdins (4,5) P 2. Imidlertid kan injeksjonen av opptil 10 millioner tellinger være nødvendig for kvantifisering av lavere overflod arter som ptdins (3,5) P-2. Det finnes ulike parametere som kan påvirke nivået av radioaktivt signal oppnådd inklusive det totale antall celler som anvendes for å fremstille prøven, merkingen tid og temperatur, konsentrasjonen av 3 H-myo-Inositol, omløpshastighet på PtdInsPs og den endogene syntesen av inositol, som vil konkurrere med radioaktivt merket inositol. For eksempel, radiomerking gjærceller i minst en dobling tid tillater metabolsk inkorporering av 3 H-myo- inositol i PtdInsPs, men utvidelse av merking tid for gjærmutanter som vokser langsommere eller har saktere metabolsk aktivitet kan være nødvendig. I tillegg er den protokoll som er beskrevet her anvender en diauxic forskyvning av gjærkultur, der cellene dyrket til midt-log fase blir deretter konsentrert for merking over en dobling tid. Imidlertid kan man redusere diauxic forskyvning ved å merke celler under tidlig og midt-log fase, og for lengre tidsperioder som tidligere har gjort 32. Ved å gjøre dette, disse forfatterne observert høyere nivåer av ptdins (3) P, ptdins (4) P og ptdins (4,5) P 2 enn celler som gjennomgår diauxic skift 32.
Likeledes kan merkingsperioden av pattedyrceller krever optimalisering siden noen pattedyrceller som RAW 264,7 makrofag-linjen dobles hver 12. time, mens andre kan dele mye langsommere, eller som i tilfelle av nerveceller, ikke i det hele tatt 20,35,39. I tillegg kan man øke konsentrasjonen av 3 H-myo-Inositol for å oppnå en ideell radiosignalnivå. Vær imidlertid oppmerksom på at noen tre H- myo-Inositol er pakket i 90% etanol, legge overdreven tre H- myo-Inositol vil øke etanolinnholdet i media og kan ha en utilsiktet effect på cellene. Endelig kan forlenges radiomerkings også sulte celler av inositol. Dette er spesielt tydelig i pattedyrcellekultur hvor fullstendig DMEM inneholder 40 uM myo-Inositol, sammenlignet med 0,5 mM 3 H- myo-Inositol når merket med 10 uCi / ml. Således, hvis det er nødvendig, er det bare å øke antallet av pattedyrceller ved merking anbefales.
De cellulære lysis og lipid behandlingstrinn er også kritisk for å oppnå et optimalt utbytte, så vel som å opprettholde helsen HPLC-kolonnen. Lysis med perklorsyre muliggjør utfelling av lipider og andre makromolekyler, en første fremgangsmåte benyttes for vevskultur og senere brukt for gjær 28,33. Sammenlignet med utvinning av totale lipider ved hjelp av tradisjonelle metanol / HCl / kloroform fremgangsmåten, anvendelse av perklorsyre forbedrer utvinning av PtdInsPs, inkludert ptdins (3,5) P-2, med mindre variasjon mellom forsøk 28. Subfølgende anvendelse av metylamin bryter esterbindinger mellom glycerol ryggraden og de to hydrofobe acylkjeder, slik at den vannløselige Gro-INSP å være fase-separert fra frie fettsyrer og lipider intakte 28,34. Spesiell forsiktighet må tas for å unngå å bære frem uønskede organiske løsemidler og uløselig materiale under utpakkingen trinn. Dette kan tilstoppe systemet, forårsaker trykkspisser og / eller kjemisk skade på kolonnen. I tillegg kolonnen må være betinget ved begynnelsen av hver dag ved å utsette kolonnen til en høy konsentrasjon av ammoniumfosfat (buffer B) før bruk; Dermed er en kort "Ekvilibrering" protokoll ansatt før du kjører eksperimentelle prøver. Unnlatelse av å gjøre dette conditioning vise resultatene i en forsinket elueringsprofilen av Gro-InsPs topper i første eksperimentelle prøven som drives.
Det er flere viktige punkter knyttet til analyse og kvantifisering å vurdere også. Først, quantification seg selv bør være en integrasjon av signalet og arealet til hver topp, ikke bare topphøyde. Dessuten er det vanligvis nødvendig en intern kontroll, fordi den absolutte signalintegrasjon for hver topp kan variere betydelig mellom prøver og eksperimenter uten å reflektere en endring i PtdInsP overflod i en celle. Foreldre Gro-Ins peak er vanligvis ansatt som den interne kontrollen ved å normal hver Gro-insp topp mot den. Gro-moduler peak holder vanligvis nesten 90% av det radioaktive signal, og ikke har en tendens til å skifte mellom tilstander. Alternativt kan man velge å normalisere mot totaltellinger, spesielt hvis man mistenker at foreldre ptdins lider en betydelig endring i forsøksbetingelsene. Til slutt, for lav overflod PtdInsPs, er bakgrunnen subtraksjon anbefales ved å definere et nærliggende non-peak område med samme "tidsskala" som toppen av interesse (Figur 3D).
En endelig vurdering knyttet tilanalyse av pattedyrprøver, som besitter syv PtdInsP arter, inkludert tre mono-fosforylerte og tre bis-fosforylerte arter. Dessverre er det vanskelig å fullt ut løse PtdIns4P fra PtdIns5P, og ptdins (3,5) P 2 fra ptdins (3,4) P 2 i pattedyrprøver, noe som resulterer i siamesiske doble topper. Det finnes flere metoder tidligere publiserte som øker oppløsningen på disse toppene. Vanligvis innebærer dette å modifisere lengden av eluering, utgangskonsentrasjonen av ammonium fosfatbuffer, hastigheten og fremgangsmåten ved hvilken ammonium fosfatbuffer konsentrasjonsendringer i elueringsprofilen, og pH av ammonium fosfatbuffer 33,35-38. Kanskje den mest vellykkede metode utviklet for å skille ptdins (4) P og ptdins (5) P ble nylig beskrevet av Sarkes og Rameh 39, som ansatt to-tandem SAX søyler og en ammonium fosfat buffer ved pH 6,0.
Som med de fleste metoder, ved bruk av HPLC-coupled strømme scintillasjons å kvantifisere PtdInsPs i celler har fordeler og ulemper sammenlignet med andre tilgjengelige metoder. For eksempel, elektronisk strømnings scintillation koplet til HPLC med levende deteksjon av Gro-InsPs men begrenser scintillasjonstelling tid, noe som reduserer følsomheten av denne metoden. Alternativt kan det være HPLC eluent-fraksjon oppsamlet med en auto-sampler i stedet for å mates inn i en strøm scintillator. De manuelle fraksjonene kan så bli lest av et off-line væskescintillasjonsteller for lengre tidsperioder, og gir dermed økt sensitivitet - ikke desto mindre er denne tilnærmingen mer tidkrevende og arbeidskrevende og reduserer oppløsningen avhengig av antallet fraksjoner oppsamlet 38,40 . I tillegg er analysen av hele celler entydig måler nivået av en bestemt PtdInsP, men det vil ikke informere om endringer i det subcellulære fordeling av det PtdInsP, selv om man kunne par strømnings scintillasjons til sub-cellulære fraksjoneringsmetoder som previouslu gjort 39. Til sammenligning FP-baserte PtdInsP-bindende områder er nyttige for å undersøke plassering og dynamikk av en PtdInsP arter i en celle, men kan også bindes til andre enn målet PtdInsP faktorer. Også fremgangsmåten som er beskrevet her forenkler analysen av PtdInsP nivåer ved å eliminere acylkjedene, som i stor grad øker den molekylære mangfoldet av PtdInsPs. Men ved den samme brikke, er det også en viktig ulempe, ettersom deacylering av lipider fører til et tap av strukturell informasjon om acylkjeden, en underappreciated aspekt av PtdInsP signale 41,42. Hvis dette er meget viktig, da væskekromatografi koblet til massespektrometri (LC-MS) bør benyttes 14,17. Imidlertid er det for tiden vanskelig å analysere alle samtidig PtdInsPs arter ved LC-MS 43. Dermed vil en kombinasjon av metoder er den beste tilnærmingen for å undersøke stedet, dynamikk, molekylær mangfold og nivåer av alle sju PtdInsPs arter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Butanol | Biobasic | BC1800 | Reagent grade |
| Ammonium phosphate dibasic | Bioshop | APD001 | ACS grade |
| Ammonium sulfate | Biobasic | ADB0060 | Ultra Pure grade |
| Autosampler | Agilent | G1329B | Agilent 1260 infinity series |
| Biotin | Sigma | B4501 | |
| Boric acid | Biobasic | BB0044 | Molecular biology grade |
| Calcium Chloride | Biobasic | CT1330 | Ahydrous, industrial grade |
| Calcium pantothenate | Sigma | C8731 | |
| Copper(II) sulfate | Sigma | 451657 | Anhydrous |
| D-Glucose | Biobasic | GB0219 | Anhydrous, biotech grade |
| Dulbecco's modification of Eagle's Medium | Life | 11995-065 | With 4.5 g/L glucose, 110 mg/L pyruate, L-glutamine |
| Dulbecco's modification of Eagle's Medium | MP biomedicals | 0916429 | With 4.5 g/L glucose, without L-gluatmine, without inositol |
| EDTA | Biobasic | EB0107 | Acid free, ultra pure grade |
| Ethyl ether | Caledon labs | 1/10/4700 | Anhydrous, reagent grade |
| Ethyl formate | Sigma | 112682 | Reagent grade |
| Fetal bovine serum | Wisent | 080-450 | US origin, premium quality, heat inactivated |
| Fetal Bovine Serum, Dialyzed | Life | 26400044 | US origin |
| FlowLogic U | LabLogic Systems Ltd | SG-BXX-05 | Scintillation fluid for flow scintillation |
| Folic acid | Biobasic | FB0466 | USP grade |
| HEPES buffer solution | Life | 15630080 | 1 M solution |
| Inositol, Myo-[2-3H(N)] | Perkin Elmer | NET114005MC | 9:1 ethanol to water |
| Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine | Life | 51500056 | 100x solution |
| Iron(III) chloride | Sigma | 157740 | Reagent grade |
| Laura - Chromatography data collection and analysis software | LabLogic Systems Ltd | Version 4.2.1.18 | Flow scintillator software |
| L-glutamine | Sigma | G7513 | 200 mM, solution, sterile-filtered, BioXtra, suitable for cell culture |
| Magnesium Chloride | Sigma | M8266 | Anhydrous |
| Manganese sulfate | Biobasic | MB0334 | Monohydrate, ACS grade |
| Methanol | Caledon labs | 6701-7-40 | HPLC Grade |
| Methylamine solution | Sigma | 426466 | 40% (v/v) |
| Monopotassium phosphate | Biobasic | PB0445 | Anhydrous, ACS grade |
| Nicotinic acid | Biobasic | NB0660 | Reagent grade |
| OpenLAB CSD ChemStation | Agilent | Rev. C.01.03 | HPLC software |
| p-aminobenzoic acid (PABA) | Bioshop | PAB001.100 | Free acid |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | 100X, liquid, stabilized, sterile-filtered, cell culture tested |
| Perchloric acid | Sigma | 244252 | ACS reagent, 70% |
| PhenoSpher SAX column | Phenomenex | 00G-315-E0 | 5 µm, 80 Å, 250 x 4.6 mm |
| Phosphoric acid | Caledon labs | 1/29/8425 | Reagent grade |
| Potassium Chloride | Biobasic | PB0440 | ACS grade |
| Potassium iodide | Biobasic | PB0443 | ACS grade |
| Pyridoxine hydrochloride | Sigma | P9755 | |
| Quaternary pump | Agilent | G1311C | Agilent 1260 infinity series |
| Riboflavin | Bioshop | RIB333.100 | USP grade |
| Sodium Chloride | Biobasic | DB0483 | Biotech grade |
| Sodium molybdate | Sigma | 243655 | |
| Thermostatted Column Compartment | Agilent | G1316A | Agilent 1260 infinity series |
| Thiamine hydrochloride | Sigma | T4625 | Reagent grade; make solution of 0.02% (w/v), forms a suspension. mix and freeze aliquots |
| Ultima Gold | Perkin Elmer | 6013321 | Scintillation coctail for liquid scintillation counting |
| Zinc sulfate | Biobasic | ZB2906 | Heptahydrate, reagent grade |
| β-RAM 4 | IN/US systems | Model 4 | Flow scintillator - 500 µl flow cell; alternative Radiomatic Flow Scintillator Analyser by Perkin Elmer |
References
- Di Paolo, G., De Camilli, P. Phosphoinositides in cell regulation and membrane dynamics. Nature. 443 (7112), 651-657 (2006).
- Bridges, D., Saltiel, A. R.
- Botelho, R. J. Changing phosphoinositides "on the fly": How trafficking vesicles avoid an identity crisis. BioEssays. 31 (10), 1127-1136 (2009).
- Simonsen, A., Wurmser, A. E., Emr, S. D., Stenmark, H. The role of phosphoinositides in membrane transport. Curr. Opin. Cell. Biol. 13 (4), 485-492 (2001).
- Katso, R., Okkenhaug, K., Ahmadi, K., Timms, J., Waterfield, M. D. Cellular Function of Phosphoinositide 3-Kinases: Implications for Development, Immunity, Homeostasis, and Cancer. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 17, 615-675 (2001).
- Lenk, G. M., Meisler, M. H. Mouse models of PI(3,5)P2 deficiency with impaired lysosome function. Methods. Enzymo. 534, Elsevier Inc. (2014).
- Lemmon, M. A.
- Cullen, P. J., Cozier, G. E., Banting, G., Mellor, H. Modular phosphoinositide-binding domains-their role in signalling and membrane trafficking. Curr. Biol. 11 (21), R882-R893 (2001).
- Balla, T. Inositol-lipid binding motifs: signal integrators through protein-lipid and protein-protein interactions. J. Cell. Sci. 118 (Pt 10), 2093-2104 (2005).
- Burd, C. G., Emr, S. D. Phosphatidylinositol(3)-phosphate signaling mediated by specific binding to RING FYVE domains. Mol. Cell. 2 (1), 157-162 (1998).
- Lemmon, M. A., Ferguson, K. M., O'Brien, R., Sigler, P. B., Schlessinger, J. Specific and high-affinity binding of inositol phosphates to an isolated pleckstrin homology domain. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92 (23), 10472-10476 (1995).
- Scott, C. C., et al. Phosphatidylinositol-4, 5-bisphosphate hydrolysis directs actin remodeling during phagocytosis. J. Cell. Biol. 169 (1), 139-149 (2005).
- Gillooly, D. J., et al. Localization of phosphatidylinositol 3-phosphate in yeast and mammalian cells. EMBO J. 19 (17), 4577-4588 (2000).
- Haag, M., Schmidt, A., Sachsenheimer, T., Brügger, B. Quantification of Signaling Lipids by Nano-Electrospray Ionization Tandem Mass Spectrometry (Nano-ESI MS/MS). Metabolites. 2 (1), 57-76 (2012).
- Furutani, M., Itoh, T., Ijuin, T., Tsujita, K., Takenawa, T. Thin layer chromatography-blotting, a novel method for the detection of phosphoinositides. J. Biochem. 139 (4), 663-670 (2006).
- Cooke, F. T., et al. The stress-activated phosphatidylinositol 3-phosphate 5-kinase Fab1p is essential for vacuole function in. 8 (22), 1219-1222 (1998).
- Milne, S. B., Ivanova, P. T., DeCamp, D., Hsueh, R. C., Brown, H. A. A targeted mass spectrometric analysis of phosphatidylinositol phosphate species. J. Lipid. Res. 46 (8), 1796-1802 (2005).
- Rusten, T. E., Stenmark, H. Analyzing phosphoinositides and their interacting proteins. Nat. methods. 3 (4), 251-258 (2006).
- Ho, C. Y., Alghamdi, T. A., Botelho, R. J. Phosphatidylinositol-3,5-bisphosphate: no longer the poor PIP2. Traffic. 13 (1), 1-8 (2012).
- Samie, M., et al. A TRP channel in the lysosome regulates large particle phagocytosis via focal exocytosis. Dev. Cel. 26 (5), 511-524 (2013).
- Shaw, J. D., Hama, H., Sohrabi, F., DeWald, D. B., Wendland, B. PtdIns(3,5)P2 is required for delivery of endocytic cargo into the multivesicular body. Traffic. 4 (7), 479-490 (2003).
- Botelho, R. J., Efe, J. A., Emr, S. D. Assembly of a Fab1 phosphoinositide kinase signaling complex requires the Fig4 phosphoinositide phosphatase. Mol. Biol. Cell. 19, 4273-4286 (2008).
- Rudge, S. A., Anderson, D. M., Emr, S. D. Vacuole size control: Regulation of PtdIns(3,5)P2 levels by the vacuole-associated Vac14-Fig4 complex, a PtdIns(3,5)P2-specific phosphatase. Mol. Biol. Cell. 15, 24-36 (2004).
- Sbrissa, D., et al. Core protein machinery for mammalian phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate synthesis and turnover that regulates the progression of endosomal transport: Novel Sac phosphatase joins the ArPIKfyve-PIKfyve complex. J. Biol. Chem. 282 (33), 23878-23891 (2007).
- Alghamdi, T. A., et al. Vac14 protein multimerization is a prerequisite step for Fab1 protein complex assembly and function. J. Biol. Chem. 288 (13), 9363-9372 (2013).
- Ikonomov, O. C., Sbrissa, D., Fenner, H., Shisheva, A. PIKfyve-ArPIKfyve-Sac3 core complex: Contact sites and their consequence for Sac3 phosphatase activity and endocytic membrane homeostasis. J. Biol. Chem. 284 (51), 35794-35806 (2009).
- Dove, S. K., et al. Vac14 controls PtdIns(3,5)P(2) synthesis and Fab1-dependent protein trafficking to the multivesicular body. Curr. Biol. 12 (11), 885-893 (2002).
- Bonangelino, C. J., et al. Osmotic stress-induced increase of phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate requires Vac14p, an activator of the lipid kinase Fab1p. J. Cell. Biol. 156 (6), 1015-1028 (2002).
- Dove, S. K., et al. Svp1p defines a family of phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate effectors. EMBO J. 23 (9), 1922-1933 (2004).
- Efe, J. A., Botelho, R. J., Emr, S. D. Atg18 regulates organelle morphology and Fab1 kinase activity independent of its membrane recruitment by phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate. Mol. Biol. Cell. 18 (1), 4232-4244 (2007).
- Odorizzi, G., Babst, M., Emr, S. D. Fab1p Ptdlns(3)P 5-kinase function essential for protein sorting in the multivesicular body. Cell. 95 (6), 847-858 (1998).
- Duex, J. E., Nau, J. J., Kauffman, E. J., Weisman, L. S. Phosphoinositide 5-phosphatase Fig4p is required for both acute rise and subsequent fall in stress-induced phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate levels. Eukaryotic Cell. 5 (4), 723-731 (2006).
- Whiteford, C. C., Best, C., Kazlauskas, A., Ulug, E. T. D-3 phosphoinositide metabolism in cells treated with platelet-derived growth factor. Biochem J. 319 (3), 851-860 (1996).
- Murthy, P. P., et al. Evidence of two isomers of phosphatidylinositol in plant tissue. Plant physiology. 98 (4), 1498-1501 (1992).
- Zolov, S. N., et al. In vivo, Pikfyve generates PI(3,5)P2, which serves as both a signaling lipid and the major precursor for PI5P. Proc. 109 (43), 17472-17477 (2012).
- McEwen, R. K., et al. Complementation analysis in PtdInsP kinase-deficient yeast mutants demonstrates that Schizosaccharomyces pombe and murine Fab1p homologues are phosphatidylinositol 3-phosphate 5-kinases. J. Biol. Chem. 274 (48), 33905-33912 (1999).
- Tolias, K. F., et al. Type I phosphatidylinositol-4-phosphate 5-kinases synthesize the novel lipids phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate and phosphatidylinositol 5- phosphate. J. Biol. Chem. 273 (29), 18040-18046 (1998).
- Ikonomov, O. C., et al. The phosphoinositide kinase PIKfyve is vital in early embryonic development: preimplantation lethality of PIKfyve-/- embryos but normality of PIKfyve+/- mice. J. Biol. Chem. 286 (15), 13404-13413 (2011).
- Sarkes, D., Rameh, L. E. A Novel HPLC-Based Approach Makes Possible the Spatial Characterization of Cellular PtdIns5P and Other Phosphoinositides. Biochem J. 428 (3), 375-384 (2011).
- Sbrissa, D., Ikonomov, O. C., Filios, C., Delvecchio, K., Shisheva, A. Functional dissociation between PIKfyve-synthesized PtdIns5P and PtdIns(3,5)P2 by means of the PIKfyve inhibitor YM201636. Am. J. Physiol. Cel. Physiol. 303 (4), 436-446 (2012).
- D'Souza, K., Epand, R. M. Enrichment of phosphatidylinositols with specific acyl chains. Biochim. Biophys. Acta - Biomembr. 1838 (6), 1501-1508 (2014).
- Shulga, Y. V., Anderson, R. A., Topham, M. K., Epand, R. M. Phosphatidylinositol-4-phosphate 5-kinase isoforms exhibit acyl chain selectivity for both substrate and lipid activator. J. Biol. Chem. 287 (43), 35953-35963 (2012).
- Pettitt, T. R., Dove, S. K., Lubben, A., Calaminus, S. D. J., Wakelam, M. J. O. Analysis of intact phosphoinositides in biological samples. J. Lipid. Res. 47 (7), 1588-1596 (2006).
