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Chemistry

उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी मिलकर प्रवाह जगमगाहट से radiolabeling और Phosphoinositides की सेलुलर स्तर की मात्रा

Published: January 6, 2016 doi: 10.3791/53529
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Chemistry and Biology, Program in Molecular Science, Ryerson University
* These authors contributed equally

Summary

Phosphoinositides जिसका रिश्तेदार बहुतायत तेजी से विभिन्न उत्तेजनाओं के जवाब में परिवर्तन लिपिड संकेत दे रहे हैं। यह लेख निकासी और deacylation द्वारा पीछा 3 एच म्यो -inositol साथ पाचन लेबलिंग कोशिकाओं द्वारा phosphoinositides की बहुतायत को मापने के लिए एक विधि का वर्णन है। निकाले ग्लिसरो-inositides तो उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी द्वारा अलग और प्रवाह जगमगाहट द्वारा मात्रा कर रहे हैं।

Protocol

नोट: पाठ में विस्तार से नीचे खमीर में PtdInsPs को मापने के लिए एक विधि का वर्णन है। यह लेबलिंग खमीर 3 एच म्यो -inositol के साथ कोशिकाओं को निकालने और deacylating लिपिड और fractionate और deacylated PtdInsPs यों के लिए एक एचपीएलसी-क्षालन प्रोटोकॉल के लिए प्रयोगात्मक जानकारी प्रदान करता है। अनुकूलन और अब एचपीएलसी-क्षालन प्रोफाइल की आवश्यकता होती है स्तनधारी कोशिकाओं में PtdInsPs की कि लेबलिंग, deacylation, संकल्प और मात्रा का ठहराव कृपया ध्यान दें। हम चर्चा में पहलुओं में से कुछ पर चर्चा की है, हालांकि ये विवरण, कहीं और पाया जा सकता है। कुल मिलाकर, कार्यप्रणाली लिपिड, deacylate निकालने और खमीर दिया जाता है और चित्रा 1 में सचित्र है से पानी में घुलनशील ग्रो-InsPs निकालने के लिए।

खमीर में लेबलिंग और विश्लेषण PtdInsPs के लिए 1. प्रोटोकॉल

  1. सेल संस्कृति और radiolabeling
    1. निरंतर पूरा सिंथेटिक में झटकों के साथ 30 डिग्री सेल्सियस पर खमीर तनाव SEY6210 की एक 20 मिलीलीटर तरल संस्कृति विकसितमध्य लॉग चरण या लगभग 0.6-0.7 के 600 एनएम (आयुध डिपो 600) पर एक ऑप्टिकल घनत्व के लिए मीडिया।
      नोट: इस 3 एच म्यो -inositol समावेश प्रभावित कर सकता है के रूप में YPD मीडिया का प्रयोग न करें। यह संस्कृति आकार 2-3 एचपीएलसी रन के लिए पर्याप्त सामग्री उपलब्ध कराना चाहिए।
    2. खमीर कोशिकाओं के 10-14 ओवर ड्राफ्ट की कुल गोली एक 12 मिलीलीटर में 5 मिनट के दौर नीचे ट्यूब के लिए 800 XG पर centrifugation द्वारा (एक आयुध डिपो 600 = 1 के साथ 1 मिलीलीटर संस्कृति ~ 1x10 7 कोशिकाओं में शामिल है कि ध्यान दें)। Inositol मुक्त मीडिया (IFM) के 2 मिलीलीटर के साथ Resuspend (IFM रचना के लिए 1 टेबल देखें)।
    3. Centrifugation दोहराएँ और मीडिया महाप्राण। IFM के 440 μl के साथ गोली Resuspend और 15 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं।
    4. प्रत्येक नमूने के लिए 3 एच म्यो -inositol (1 μl = 1 μCi) के 60 μl जोड़ें और लगातार झटकों के साथ 1 घंटा 3 के लिए 30 डिग्री सेल्सियस के बढ़ते तापमान पर सेते हैं।
      सावधानी: 3 एच म्यो -inositol एक रेडियोधर्मी दोस्त हैउचित प्रशिक्षण के बाद नियंत्रित किया जाना चाहिए कि रियाल। इसके अलावा, 3 एच-युक्त सामग्री के साथ संपर्क करना है कि सभी उपभोग्य उचित रूप से निपटारा किया जाना चाहिए और रेडियोधर्मी कचरे के रूप में नामित।
      नोट: विकास तापमान बदला जा सकता है जब तक कि सभी उपभेदों ही तापमान में बड़े हो रहे हैं तुलना करने के लिए के रूप में आवश्यक के रूप में।
    5. 9% परक्लोरिक एसिड के 500 μl और एसिड के 200 μl युक्त एक microcentrifuge ट्यूब सेल निलंबन (500 μl) स्थानांतरण कांच के मोती धोया। उलटा द्वारा मिक्स और 5 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं।
    6. 10 मिनट के लिए शीर्ष गति से नमूना भंवर और कांच के मोती से बचने के लिए एक जेल लोडिंग टिप का उपयोग कर एक नया microcentrifuge ट्यूब lysates हस्तांतरण।
    7. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 12,000 XG पर नमूना गोली और सतह पर तैरनेवाला महाप्राण।
    8. ठंडा 100 मिमी EDTA के 1 मिलीलीटर में स्नान sonication द्वारा गोली Resuspend। पहले की तरह फिर से गोली।
  2. Deacylation और निकासी हौसले 2.3 मेथनॉल के मिलीलीटर, 40% methylamine की 1.3 मिलीलीटर, 1-butanol की 0.55 मिलीग्राम और पानी की 0.80 मिलीग्राम के संयोजन से deacylation अभिकर्मक के 5.0 मिलीलीटर तैयार करते हैं। मिश्रण को पलटना।
  3. EDTA Aspirate और पानी के 50 μl में गोली sonicate।
  4. Deacylation अभिकर्मक के 500 μl जोड़ें और मिश्रण करने के लिए sonicate। 20 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं।
  5. एक गर्मी ब्लॉक में 53 डिग्री सेल्सियस पर 50 मिनट के लिए गर्मी लिपिड। 3 घंटा या हे / n पर वैक्यूम centrifugation द्वारा पूरी तरह से नमूने सूखी।
    1. एक रासायनिक जाल वैक्यूम सेंट्रीफ्यूज और हवा में प्रवेश करने से वाष्प को रोकने के लिए वैक्यूम पंप के बीच स्थापित किया गया है कि सुनिश्चित करें।
  6. स्नान sonication द्वारा पानी की 300 μl के साथ गोली Resuspend और 20 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं। 3 घंटा या हे / एन के लिए वैक्यूम centrifugation द्वारा नमूने सूखी। एक बार फिर इस चरण को दोहराएँ।
  7. पानी के 450 μl के साथ गोली Sonicate। यह निकासी के दौरान जलीय चरण है।
  8. हौसले extractio के 10 मिलीलीटर की तैयारी8.0 ईथर का 1-butanol मिलीलीटर, 1.6 मिलीग्राम और एथिल वह स्वरूप की 0.40 मिलीलीटर जोड़कर एन अभिकर्मक। मिश्रण को पलटना।
  9. जलीय चरण के लिए निष्कर्षण अभिकर्मक के 300 μl जोड़ें। भंवर 5 मिनट के लिए शीर्ष गति से मिश्रण और 2 मिनट के लिए शीर्ष गति (18,000 XG) पर centrifugation द्वारा परतों अलग।
  10. शीर्ष कार्बनिक परत, इंटरफेस है, और गोली से परहेज करते हुए एक नया microfuge ट्यूब में नीचे जलीय परत लीजिए। ताजा निष्कर्षण अभिकर्मक के साथ दो बार अधिक जलीय चरण की निकासी को दोहराएं।
  11. पूरी तरह से वैक्यूम centrifugation द्वारा एकत्र जलीय परत सूखी। स्नान sonication द्वारा पानी की 50 μl में गोली फैलाने।
  12. एक 6 मिलीलीटर पॉलीथीन जगमगाहट शीशी में जगमगाहट तरल पदार्थ के 4 मिलीलीटर करने के लिए प्रत्येक नमूना के 2 μl जोड़ें। एक खुली खिड़की का उपयोग कर तरल जगमगाहट से प्रत्येक नमूने में (सीपीएम) में गिनती की संख्या निर्धारित है।
  13. एचपीएलसी के लिए तैयार है जब तक -20 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों की दुकान।
  • इसका विभाजनएचपीएलसी द्वारा 3 एच ग्लिसरो-inositides
    1. Degassing के बाद एक बोतल शीर्ष 0.22 माइक्रोन वैक्यूम फिल्टर, साथ ultrapure पानी का 1 एल छान कर बफर तैयार करें।
    2. पानी में 1 एम अमोनियम फॉस्फेट द्विक्षारकीय (ए पी एस, मेगावाट 132.06) के एक 1 एल समाधान बनाकर बफर बी को तैयार है और फॉस्फोरिक एसिड के साथ 3.8 पीएच को समायोजित करें। Degassing के बाद एक बोतल शीर्ष 0.22 माइक्रोन वैक्यूम फिल्टर के साथ अमोनियम फॉस्फेट फ़िल्टर।
    3. एक वसंत लोड 250 μl छोटी मात्रा डालने के साथ शीशी एमएल 2 outfitting द्वारा इंजेक्शन शीशी इकट्ठे। 10 लाख सीपीएम लोड और 55 μl की कुल मात्रा के लिए पानी जोड़ें। पानी के 55 μl के साथ एक खाली शीशी तैयार करें।
    4. एक PTFE / सिलिकॉन सेप्टा के साथ outfitted पेंच टोपी के साथ शीशियों (लाल पक्ष शीशी के अंदर का सामना करना पड़) टोपी। खाली शीशी के साथ शुरू, एचपीएलसी के ऑटो नमूने ट्रे में प्रत्येक शीशी रखें।
    5. बफर प्रवाह को नियंत्रित करता buffers और नियंत्रण नमूना injecti degasses कि एक एचपीएलसी और संबद्ध सॉफ्टवेयर का प्रयोग करेंपर। Scintillant प्रवाह दर को विनियमित करने के लिए एक ऑनलाइन प्रवाह सिंटिलेटर और उसके संबंधित सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें और 3 एच-क्षय संकेत नजर रखने के लिए।
      1. 250 मिमी x 4.6 मिमी के आयाम और एचपीएलसी में 5 माइक्रोन सिलिका राल युक्त के साथ एक सक्सेना तरल क्रोमैटोग्राफी स्तंभ का प्रयोग करें। प्रदूषणों से इंजेक्शन को रोकने के लिए एक स्तंभ गार्ड के साथ स्तंभ संगठन।
      2. प्रवाह सिंटिलेटर में एक 3 एच-संगत 500 μl प्रवाह सेल स्थापित करें।
        नोट: Fractionation Chemstation सॉफ्टवेयर द्वारा या अन्य व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एचपीएलसी सिस्टम के साथ नियंत्रित एक Agilent 1200 इन्फिनिटी श्रृंखला एचपीएलसी प्रणाली के साथ किया जा सकता है। एचपीएलसी eluent के प्रवाह जगमगाहट लौरा सॉफ्टवेयर या अन्य व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्रवाह सिंटिलेटर या संगत सॉफ्टवेयर के द्वारा नियंत्रित एक β राम प्रवाह सिंटिलेटर के साथ किया जा सकता है।
    6. 100% बफर ए के साथ 1.0 मिलीग्राम / मिनट की एक प्रवाह दर पर चतुर्धातुक पंप को प्रारंभ
    7. एचपीएलसी पर एक संतुलन प्रोफ़ाइल सेट करें5 के लिए 5 मिनट, 100-1% बी के लिए 5 मिनट, 100% बी के लिए 5 मिनट, 1-100% बी के लिए 1% बफर बी: बफ़र ए और बी की ढाल ("एक संतुलन प्रोटोकॉल" यह कहते हैं) को नियंत्रित करने के लिए मिनट, 20 मिनट के लिए 1% बी। 400 बार, 1.0 मिलीग्राम / मिनट प्रवाह की दर, और 30 मिनट चलाने के समय में दबाव सीमा निर्धारित करें।
    8. बफ़र ए और बी की ढाल (इस "प्रोटोकॉल" कॉल) को नियंत्रित करने के लिए एचपीएलसी पर एक क्षालन प्रोफ़ाइल (चित्रा 2) की स्थापना: 40 मिनट के लिए 5 मिनट, 1-20% बी के लिए 1% बी, 20-100% 10 मिनट के लिए 20 मिनट, 1% बी के लिए 5 मिनट, 100-1% बी के लिए 10 मिनट, 100% बी के लिए बी। 400 बार, 1.0 मिलीग्राम / मिनट प्रवाह की दर, और 90 मिनट चलाने के समय में दबाव सीमा निर्धारित करें।
    9. प्रवाह सिंटिलेटर पर एक का पता लगाने प्रोटोकॉल 2.5 मिलीग्राम / मिनट की एक जगमगाहट द्रव का प्रवाह दर और एक 8.57 सेकंड ध्यान केन्द्रित करना, समय के साथ 60 मिनट के लिए चलाने के लिए (इस "प्रोटोकॉल एक पहचान" कहते हैं) की स्थापना की।
    10. ई के द्वारा पीछा किया, पर पानी खाली "प्रोटोकॉल एक संतुलन 'के साथ शुरू करने के लिए एचपीएलसी पर एक स्वचालित इंजेक्शन अनुक्रम कार्यक्रमACH "प्रोटोकॉल एक" पर नमूना radiolabelled। जब तैयार अनुक्रम को प्रारंभ।
    11. रन संतुलन प्रोटोकॉल पर अब भी है, के साथ नमूने के सभी उपाय करने के लिए प्रवाह सिंटिलेटर पर एक बैच बनाने के लिए "प्रोटोकॉल एक का पता लगाने।" शुरू करने के लिए प्रवाह सिंटिलेटर ट्रिगर, जबकि प्रत्येक नया नमूना के इंजेक्शन एचपीएलसी पर "प्रोटोकॉल एक" प्रारंभ होगा "एक का पता लगाने प्रोटोकॉल।"
    12. सभी रन के पूरा होने पर, एचपीएलसी, स्तंभ फ्लश और 1.0 मिलीग्राम / मिनट प्रवाह की दर पर 30 मिनट के लिए 100% बफर के साथ सिंटिलेटर प्रवाह।
  • डेटा विश्लेषण
    1. लौरा सॉफ्टवेयर या क्रोमैटोग्राफी स्पेक्ट्रा यों कर सकते हैं कि किसी भी अन्य सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें। इस खंड में वर्णित चरणों में 3 चित्र में चित्रित कर रहे हैं।
    2. "फाइल", "ओपन" पर क्लिक करके फ़ाइलें खोलें, और प्रत्येक नमूना के लिए कच्चे डेटा फ़ाइल का चयन करें।
    3. "Chromatograms" टैब में, Zoओम में कम चोटियों (1000 के बारे में गिना जाता है [वाई अक्ष]) समय संकल्प बरकरार रखते हुए की प्रत्येक फैलाने के लिए। यदि आवश्यक हो तो प्रत्येक व्यक्ति के शिखर में ज़ूम।
    4. "आरओआई जोड़ें" उपकरण का उपयोग विश्लेषण के लिए चोटियों में से प्रत्येक को हाइलाइट करें। (4,5 29 मिनट पर 20 मिनट, ग्रो-इन (3,5) पी 2 में 18 मिनट, ग्रो-Ins4P पर 10 मिनट, ग्रो-Ins3P पर माता पिता का ग्रो इन और ग्रो इन: क्षालन के समय तक चोटियों को पहचानें 32 मिनट पर) पी 2।
    5. "क्षेत्रों टेबल" टैब में, प्रत्येक चोटी की "क्षेत्र (मायने रखता है)" रिकॉर्ड है। समय और "अंत (मिमी: एस एस)" प्रत्येक चोटी का समय: "(एसएस मिमी) शुरू" पर ध्यान दें।
    6. पृष्ठभूमि घटाव के लिए समय का एक ही राशि में फैले चोटी से सटे एक क्षेत्र पर प्रकाश डाला। इसी चोटी से गिनती की संख्या घटाना।
    7. ("कुल PtdIns की%" के रूप में व्यक्त) पैतृक ग्रो-इन्स के खिलाफ प्रत्येक चोटी के क्षेत्र मानक के अनुसार। फिर, "एन के रूप में व्यक्त नियंत्रण हालत के खिलाफ प्रत्येक प्रयोगात्मक हालत (चोटियों में से प्रत्येक को सामान्यगुना वृद्धि) "नियंत्रित करने के लिए की तुलना में।
      नोट: प्रत्येक चोटी का सामान्यीकरण भी कुल मायने रखता है के खिलाफ किया जा सकता है लेकिन माता-पिता की ग्रो-इन्स बहुत अधिक प्रचुर मात्रा में अन्य सभी PtdInsPs से अधिक है क्योंकि परिणाम समान हो जाते हैं।
    8. "... के रूप में सहेजें", "फाइल" दबाकर Chromatographs के लिए डेटा निर्यात, और चुन फ़ाइल स्वरूप "सीएसवी (अल्पविराम से अलग)"। एक स्प्रेडशीट पर डेटा प्लॉट और आवश्यक के रूप में प्रस्तुत करते हैं।

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    Representative Results

    इस विधि का प्रयोग, खमीर PtdInsPs पाचन 3 एच म्यो -inositol साथ लेबल रहे थे। लेबलिंग के बाद, फॉस्फोलिपिड फॉस्फोलिपिड deacylation और पानी में घुलनशील ग्रो-InsPs (चित्रा 1) की निकासी के द्वारा पीछा किया, परक्लोरिक एसिड के साथ उपजी थे। इस स्तर पर, यह PtdIns की तरह बहुत कम बहुतायत PtdInsPs के लिए पर्याप्त संकेत करने वाली शोर अनुपात सुनिश्चित करने के लिए तरल जगमगाहट से निकाले ग्रो-InsPs के साथ जुड़े कुल रेडियोधर्मी संकेत यों के लिए महत्वपूर्ण है (3,5) पी 2; 5-10 लाख सीपीएम की कुल इंजेक्शन होना चाहिए। खमीर कोशिकाओं केवल चार PtdInsPs दिखा रहे हैं के बाद से (चित्रा 2) के रूप में वर्णित है, संकल्प एक 1 घंटा क्षालन विधि के साथ प्राप्त किया जा सकता है।

    Δ और vac14 Δ खमीर म्यूटेंट लेबल और प्रोसेस किया गया atg18 इधर, जंगली प्रकार, PtdIns में परिवर्तन (3,5) पी 2, वीं का विश्लेषण करने के लिएई खमीर 16,19,27 में PtdInsPs के कम से कम प्रचुर मात्रा में। चित्रा -4 ए-सी, 3 एच जुड़े संकेत चोटियों उत्पादित सभी तीन उपभेदों के लिए क्षालन प्रोफ़ाइल में के रूप में मनाया। माता पिता का ग्रो-इन्स चोटी पहले elutes (8-9 मिनट; 3 चित्र में दिखाया गया है, लेकिन नहीं ग्रो-इन्स फॉस्फोरिलेटेड प्रजातियों के संकेत हावी रहती है के बाद से 4 चित्र में) ग्रो-Ins3P (~ 18 मिनट), Gro- द्वारा पीछा किया, क्रमशः acylated फॉस्फोलिपिड PtdIns से मेल खाती है: (00 मिनट ~ 32), Ins4P (~ 20 मिनट), ग्रो-इन (3,5) पी 2 (~ 29 मिनट) और ग्रो-इन (4,5) पी 2 PtdIns3P, PtdIns4P, PtdIns (3,5) पी 2 और PtdIns (4,5) पी 2। 4 मिनट और तुरंत माता पिता ग्रो-इन (10 मिनट) का पालन करने के लिए जाता है कि एक पर अतिरिक्त नाबालिग चोटियों के एक जोड़े हैं; इन संभावना inositol और एक गैर glycerated फॉस्फेट inositide (चित्रा 3) का प्रतिनिधित्व करते हैं। क्षालन पैटर्न एक diffe रोजगार जब सही समय अलग-अलग हो सकता है, हालांकि, सुसंगत और विशेषता हैएचपीएलसी प्रणाली और / या एक नया स्तंभ किराया।

    PtdIns (3,5) पी 2 (चित्रा 4, लाल तीर) के साथ जुड़े शिखर Δ और vac14 Δ खमीर उपभेदों atg18 जंगली प्रकार के बीच सबसे नाटकीय बदलाव आए। जंगली प्रकार की कोशिकाओं (ए) के सापेक्ष, एक बहुत बड़ी ग्रो-इन (3,5) पी 2 atg18 Δ कोशिकाओं में -associated संकेत और vac14 Δ खमीर कोशिकाओं में एक छोटे चोटी है। प्रत्येक चोटी के साथ जुड़े कुल रेडियोधर्मी संकेत यों के क्रम में, मायने रखता शिखर (चित्रा 3) के क्षेत्र के अंतर्गत एकीकृत किया गया। पूर्ण रेडियोधर्मी संकेत नमूने के बीच होती है, क्योंकि इसके अलावा, माता पिता का ग्रो-इन्स प्रजातियों (एक भी कुल मायने रखता है के खिलाफ सामान्य करने के लिए चुन सकते हैं) इसके खिलाफ सामान्य से एक आंतरिक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था। ऐसा करने से, डेटा, PtdIns (3,5) पी 2 जंगली प्रकार खमीर कोशिकाओं में PtdIns का केवल 0.07% का गठन का सुझाव है कि PtdIns जबकि (3,5) पी 2 atg18 Δ कोशिकाओं में माता पिता का PtdIns, या PtdIns में एक नाटकीय 17 गुना वृद्धि (3,5) पी जंगली प्रकार की कोशिकाओं (चित्रा -4 ए, बी और डी) के लिए 2 रिश्तेदार के 1.2% से मेल खाती है। इसकी तुलना में, PtdIns (3,5) पी 2 का स्तर VAC14 में PtdIns संकेत के केवल 0.01% खमीर कोशिकाओं, PtdIns (3,5) पी 2 (चित्रा 4C और डी) में एक 85% नुकसान -deleted था। कुल मिलाकर, इन मापों PtdIns (3,5) पी 2 जंगली प्रकार की कोशिकाओं में PtdIns के बारे में 0.1% दिखा रहा है कि प्रकाशित परिणामों के साथ समझौते में हैं, 90% vac14 डी में कम है, और atg18 डी कोशिकाओं में उच्च 10-20 गुना जंगली प्रकार की कोशिकाओं 27,29 के सापेक्ष।

    आकृति 1
    चित्रा 1. Deacylation और 3 एच-ग्रो-INSP की निकासी। Radiolabeled लिपिपरक्लोरिक एसिड में डी वेग EDTA के जलीय घोल से धोया जाता है। यह तो aspirated और deacylation अभिकर्मक जोड़ा गया है और 53 डिग्री सेल्सियस पर incubated है। deacylation प्रतिक्रिया मिश्रण निष्कर्षण अभिकर्मक के अलावा द्वारा पीछा किया, तो सूखे वैक्यूम और दो बार पानी से धोया जाता है। यह तो vortexed centrifuged और जलीय चरण एकत्र किया जाता है। निष्कर्षण कदम तीन बार जैविक और अघुलनशील को दूर करने के लिए कुल दोहराया है। 3 एच-ग्रो-INSP भी शामिल है जो पानी में घुलनशील अंश (नीला), तो सूखे और पानी के 60 μl के साथ rehydrated शून्य है। रेडियोधर्मिता की मात्रा को तरल जगमगाहट (सीपीएम) और नमूने भर में बराबर मायने रखता है एचपीएलसी में लोड कर रहे हैं द्वारा निर्धारित किया जाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    चित्र 2 <मजबूत आयनों विनिमय क्रोमैटोग्राफी द्वारा br /> चित्रा ग्रो-INSP के 3 एच-ग्रो-INSP। संकल्प के क्षालन के लिए अमोनियम फॉस्फेट बफर के 2. ढाल अमोनियम फॉस्फेट द्विक्षारकीय, पीएच 3.8 (बफर बी) के आवेदन पर निर्भर करता है। ढाल की पसंद अलग होने के लिए उपलब्ध ग्रो-INSP प्रजातियों के मिश्रण पर निर्भर करता है। प्रोटोकॉल एक केवल चार PtdInsPs के अधिकारी जो खमीर के नमूने, के लिए प्रयोग किया जाता है। चार चोटियों में से प्रत्येक के संकल्प में तेजी से वृद्धि (एनएच 4) 2 4 HPO एकाग्रता के साथ पर्याप्त है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    चित्र तीन
    चित्रा 3. PtdInsP बहुतायत के डेटा विश्लेषण के लिए अनुदेश गाइडेड। डेटा फ़ाइलों लौरा रों पर लोड कर रहे हैंoftware और नेत्रहीन chromatograph (डिफ़ॉल्ट रूप से खुला) का उपयोग कर मूल्यांकन किया। उपकरण "में जूम" का प्रयोग (क), चोटियों बढ़ाना (ख)। "आरओआई जोड़ने" उपकरण (ग) का उपयोग chromatograph पर अलग चोटियों का चयन करें। "इस क्षेत्र तालिका" टैब (घ) में, ब्याज की प्रकाश डाला क्षेत्रों से सभी परिणामी जानकारी एक एकल मेज (ई) के रूप में प्रदर्शित किया जाता है। प्रत्येक चोटी (च) के कच्चे मायने रखता है निर्यात और माता पिता का phosphatidylinositol के खिलाफ प्रत्येक PtdInsP प्रजातियों (छ) के मानक के अनुसार या कुल मायने रखता है के खिलाफ है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    चित्रा 4
    चित्रा 4. PtdIns (3,5) पी जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती खमीर कोशिकाओं में 2 स्तरों। प्रतिनिधि Chromatographs निकालने के प्रवाह जगमगाहट के लिए दिखाए गए हैंप्रोटोकॉल एक का उपयोग कर एड 3 जंगली प्रकार से एच-ग्रो-InsPs (ए), Δ atg18 (बी), और vac14Δ (सी) खमीर उपभेदों। ग्रो-इन करने के लिए इसी हित के क्षेत्रों से कच्चे मायने रखता है (3,5) पी 2 (तीर) घटाया chromatograph और पृष्ठभूमि से निकाले जाते हैं। परिणामस्वरूप मूल्यों जंगली प्रकार की तुलना में और में गुना परिवर्तन ग्रो-इन (3,5) पी 2 का स्तर (डी) के रूप में व्यक्त कर रहे हैं। में स्तर और परिवर्तन ग्रो-इन (3,5) पी 2 मूल PtdIns (3,5) पी 2 में स्तर और परिवर्तन को दिखाने के लिए व्याख्या कर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    63 मिमी MgCl2 839 माइक्रोन सीए-पैंटोथिनेट
    Inositol मुक्त मीडिया (IFM)
    27.8 मिमी (NH4) 2SO4
    2% ग्लूकोज
    0.01 मिमी KH2PO4
    1X एमिनो एसिड
    1X LPSM
    1X तत्वों का पता लगाने
    5X विटामिन
    10X कम फॉस्फेट और सल्फेट मीडिया (LPSM)
    9 मिमी CaCl2
    17 मिमी NaCl
    67 मिमी KCl
    1,000X तत्वों का पता लगाने
    8 मिमी बोरिक एसिड
    250 माइक्रोन CuSO4
    602 माइक्रोन केआई
    1.23 मिमी FeCl3
    2.65 मिमी MnSO4
    971 माइक्रोन ना-molybdate
    2.48 मिमी ZnSO4
    500X विटामिन
    4 माइक्रोन बायोटिन
    2.27 माइक्रोन फोलिक एसिड
    1.62 मिमी नियासिन
    729 माइक्रोन पी aminobenzoic एसिड
    973 माइक्रोन Pryidoxine एचसीएल
    266 माइक्रोन राइबोफ्लेविन
    593 माइक्रोन Thiamine एचसीएल

    आधार मीडिया 3 एच म्यो -inositol के साथ पूरक हो के रूप में खमीर inositol मुक्त मीडिया। खमीर कोशिकाओं की तालिका 1. संरचना IFM साथ radiolabelled कर रहे हैं। संकेत दिया समाधान का उपयोग IFM की 100 मिलीलीटर समाधान तैयार, फिल्टर आरटी पर एक बोतल शीर्ष 0.22 माइक्रोन वैक्यूम फिल्टर और दुकान का उपयोग कर बाँझ। कम फॉस्फेट और सल्फेट मीडिया (LPSM) तैयार करने के लिए संकेत दिया, लवण का उपयोग कर एक 100 मिलीलीटर समाधान उत्पन्न, फिल्टर आरटी पर एक बोतल शीर्ष 0.22 माइक्रोन वैक्यूम फिल्टर और दुकान का उपयोग कर बाँझ। तत्वों का पता लगाने के एक 1 एल 1,000x समाधान तैयार करने के लिए संकेत दिया लवण भंग। -20 डिग्री सेल्सियस पर उपयोग और / या दुकान aliquots पहले अच्छी तरह से मिलाएं। एक 1 एल 500x विटामिन समाधान तैयार करने के लिए संकेत दिया विटामिन भंग। -20 डिग्री सेल्सियस पर इस्तेमाल करते हैं और दुकान aliquots पहले अच्छी तरह से मिलाएं।

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    Discussion

    यह लेख खमीर से एचपीएलसी युग्मित प्रवाह जगमगाहट से PtdnsPs के सेलुलर स्तर यों के लिए आवश्यक प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल का विवरण। कार्यप्रणाली लिपिड प्रसंस्करण और पानी में घुलनशील 3 एच-ग्रो-InsPs, एचपीएलसी विभाजन और विश्लेषण की निकासी के द्वारा पीछा 3 एच म्यो -inositol साथ PtdInsPs, के चयापचय लेबलिंग सक्षम बनाता है। PtdIns (3,5) जंगली प्रकार, vac14 डी और atg18 डी खमीर कोशिकाओं (चित्रा 4) में पी 2 के लिए दिखाया गया है के रूप में इस विधि का प्रयोग, विभिन्न शर्तों के तहत कोशिकाओं में PtdInsPs के रिश्तेदार का स्तर, मात्रा निर्धारित किया जा सकता है।

    परिणामों का अनुकूलन और / या समस्याओं का निवारण करने के लिए किया जा सकता है कि महत्वपूर्ण कदम और संशोधनों के एक नंबर रहे हैं। PtdInsPs के विश्वसनीय मात्रा का ठहराव प्राप्त करने के लिए सबसे महत्वपूर्ण मानकों में से एक कुल रेडियोधर्मी संकेत स्तर है। आमतौर पर, एचपीएलसी में 3-5 लाख की गिनती के इंजेक्शन लगाने मज़बूती से हाय में परिवर्तन quantitate करने के लिए अक्सर पर्याप्त हैऐसे PtdIns (4,5) पी के रूप में 2 Gher बहुतायत PtdInsP प्रजातियों। हालांकि, अप करने के लिए 10 लाख की गिनती के इंजेक्शन ऐसे PtdIns (3,5) पी 2 के रूप में कम बहुतायत प्रजातियों की मात्रा का ठहराव के लिए आवश्यक हो सकता है। रेडियोधर्मी संकेत के स्तर नमूना, लेबलिंग समय और तापमान, 3 एच म्यो -inositol की एकाग्रता, PtdInsPs के कारोबार दर तैयार करने के लिए इस्तेमाल किया कोशिकाओं की कुल संख्या और अंतर्जात संश्लेषण सहित हासिल प्रभाव हो सकता है कि विभिन्न मानकों हैं की inositol, जो radiolabeled inositol के साथ प्रतिस्पर्धा करेंगे। उदाहरण के लिए, कम से कम एक समय के दोहरीकरण के लिए radiolabeling खमीर कोशिकाओं चयापचय PtdInsPs में 3 एच myo- inositol का समावेश है, लेकिन धीमी हो जाना या आवश्यक हो सकता है धीमी चयापचय गतिविधि है कि खमीर म्यूटेंट के लिए लेबलिंग समय के विस्तार के लिए अनुमति देता है। इसके अलावा, यहां वर्णित प्रोटोकॉल कोशिकाओं तो fo केंद्रित कर रहे हैं मध्य लॉग चरण के लिए हो गया है, जहां खमीर संस्कृति की एक diauxic पारी का उपयोग करता हैएक दोहरीकरण समय के साथ आर लेबलिंग। पहले से 32 किया लेकिन, जैसा कि एक समय की लंबी-अवधि जल्दी और मध्य लॉग चरण के दौरान और के लिए लेबलिंग कोशिकाओं द्वारा diauxic पारी को कम कर सकते हैं। ऐसा करने में, इन लेखकों PtdIns (3) पी, PtdIns (4) पी और diauxic पारी 32 के दौर से गुजर कोशिकाओं की तुलना में PtdIns (4,5) पी 2 का उच्च स्तर मनाया।

    रॉ 264.7 मैक्रोफेज लाइन की तरह कुछ स्तनधारी कोशिकाओं को हर 12 घंटे में डबल्स के बाद से दूसरों को नहीं सब पर 20,35,39, न्यूरॉन्स के मामले में बहुत धीमी विभाजित है, या हो सकता है, जबकि इसी तरह, स्तनधारी कोशिकाओं की लेबलिंग अवधि, अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है। इसके अलावा, एक एक आदर्श रेडियोधर्मी संकेत स्तर को प्राप्त करने के लिए 3 एच म्यो -inositol की एकाग्रता में वृद्धि कर सकते हैं। हालांकि, कुछ 3 एच म्यो -inositol 90% इथेनॉल में पैक किया जाता है कृपया ध्यान दें कि उनका कहना है कि अत्यधिक 3 एच म्यो -inositol मीडिया में इथेनॉल सामग्री में वृद्धि होगी और एक अनपेक्षित प्रभावी तरीके हो सकता हैकोशिकाओं पर सीटी। अंत में, लंबे समय तक radiolabeling भी inositol की कोशिकाओं को भूखा कर सकते हैं। यह पूरा DMEM 10 μCi / एमएल के साथ लेबल जब 0.5 माइक्रोन के 3 एच म्यो -inositol की तुलना में 40 माइक्रोन म्यो -inositol शामिल हैं, जहां स्तनधारी सेल संस्कृति में विशेष रूप से स्पष्ट है। इस प्रकार, यदि आवश्यक हो तो, बस लेबलिंग के दौरान स्तनधारी कोशिकाओं की संख्या में वृद्धि की सिफारिश की है।

    सेलुलर सेल और लिपिड प्रसंस्करण कदम भी एक इष्टतम उपज प्राप्त करने के लिए, साथ ही एचपीएलसी स्तंभ के स्वास्थ्य को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण हैं। परक्लोरिक एसिड के साथ सेल लिपिड और अन्य अणुओं की वर्षा के लिए अनुमति देता है, पहले टिशू कल्चर के लिए कार्यरत हैं और बाद में खमीर 28,33 के लिए प्रयोग किया जाता विधि। पारंपरिक मेथनॉल का उपयोग कर कुल लिपिड की निकासी की तुलना / एचसीएल / क्लोरोफॉर्म विधि, परक्लोरिक एसिड का उपयोग प्रयोगों 28 के बीच कम भिन्नता के साथ PtdIns (3,5) पी 2, सहित PtdInsPs की वसूली को बढ़ाता है। उपmethylamine का सिलसिलेवार आवेदन चरण-अलग मुक्त फैटी एसिड और बरकरार लिपिड 28,34 से होने का पानी घुलनशील ग्रो-INSP छोड़ रहा है, ग्लिसरॉल रीढ़ की हड्डी और दो ​​हाइड्रोफोबिक एसाइल श्रृंखला के बीच एस्टर बांड टूट जाता है। विशेष देखभाल निकासी चरण के दौरान आगे अवांछित कार्बनिक सॉल्वैंट्स और अघुलनशील सामग्री ले जाने से बचने के लिए लिया जाना चाहिए। यह सिस्टम रोकना दबाव spikes कारण और / या रासायनिक स्तंभ को नुकसान पहुंचा सकता है। इसके अलावा स्तंभ उपयोग से पहले अमोनियम फॉस्फेट (बफर बी) के एक उच्च एकाग्रता के लिए स्तंभ उजागर द्वारा प्रत्येक दिन की शुरुआत में वातानुकूलित किया जाना चाहिए; इस प्रकार, एक छोटी "संतुलन" प्रोटोकॉल प्रयोगात्मक नमूने चलाने से पहले कार्यरत है। चलाया जाता है कि पहले प्रयोगात्मक नमूने में ग्रो-InsPs चोटियों के एक देरी क्षालन प्रोफ़ाइल में इस कंडीशनिंग कदम परिणामों करने में विफलता।

    के रूप में अच्छी तरह से विचार करने के लिए विश्लेषण और मात्रा का ठहराव से संबंधित कई महत्वपूर्ण बातें हैं। सबसे पहले, क्षuantification में ही संकेत और प्रत्येक चोटी के क्षेत्र के एकीकरण में ही नहीं, शिखर ऊंचाई होना चाहिए। प्रत्येक चोटी के लिए पूर्ण संकेत एकीकरण के लिए एक सेल में PtdInsP बहुतायत में एक बदलाव को दर्शाती बिना नमूने और प्रयोगों के बीच काफी भिन्न हो सकते हैं, क्योंकि इसके अलावा, एक आंतरिक नियंत्रण आम तौर पर आवश्यक है। माता पिता का ग्रो-इन्स शिखर आम तौर पर इसके खिलाफ प्रत्येक ग्रो-INSP शिखर सामान्य से आंतरिक नियंत्रण के रूप में कार्यरत है। ग्रो-इन्स शिखर आम तौर पर रेडियोधर्मी संकेत का लगभग 90% रखती है और शर्तों के बीच परिवर्तन नहीं करते है। वैकल्पिक रूप से, एक के बाद एक पैतृक PtdIns प्रयोगात्मक शर्तों में एक महत्वपूर्ण परिवर्तन ग्रस्त है कि संदिग्धों है, खासकर अगर कुल मायने रखता है के खिलाफ सामान्य करने के लिए चुन सकते हैं। अंत में, कम बहुतायत PtdInsPs के लिए, पृष्ठभूमि घटाव ब्याज की चोटी (चित्रा 3 डी) के रूप में एक ही "समय के पैमाने" के साथ पास के एक गैर-चोटी के क्षेत्र को परिभाषित करने से सिफारिश की है।

    एक अंतिम विचार से संबंधित हैतीन मोनो फॉस्फोरिलेटेड और तीन बीआईएस फॉस्फोरिलेटेड प्रजातियों सहित सात PtdInsP प्रजातियों के अधिकारी जो स्तनधारी नमूनों का विश्लेषण। दुर्भाग्य से, यह पूरी तरह से PtdIns5P से PtdIns4P को हल करने के लिए मुश्किल है, और PtdIns (3,5) संयुक्त डबल चोटियों में जिसके परिणामस्वरूप स्तनधारी नमूनों में PtdIns (3,4) पी 2, से पी 2। इन चोटियों के संकल्प को बढ़ाने कि पहले प्रकाशित कई तरीके हैं। सामान्यतया, यह क्षालन की लंबाई को संशोधित करना शामिल है, अमोनियम फॉस्फेट बफर के शुरू करने से एकाग्रता, दर और कदम है जिसके द्वारा क्षालन प्रोफ़ाइल के दौरान अमोनियम फॉस्फेट बफर एकाग्रता परिवर्तन और अमोनियम फॉस्फेट बफर 33,35-38 का पीएच। शायद, सबसे सफल तरीका अलग PtdIns करने के लिए विकसित (4) पी और PtdIns (5) पी ने हाल ही में दो-मिलकर सक्सेना कॉलम और पीएच 6.0 पर एक अमोनियम फॉस्फेट बफर नियोजित जो Sarkes और Rameh 39, ने बताया था।

    सबसे तरीकों के साथ के रूप में, एचपीएलसी सी का उपयोगकोशिकाओं में PtdInsPs यों की जगमगाहट प्रवाह oupled अन्य उपलब्ध तरीकों की तुलना में फायदे और नुकसान है। उदाहरण के लिए, एचपीएलसी करने के लिए मिलकर ऑनलाइन प्रवाह जगमगाहट ग्रो-InsPs के रहते पता लगाने प्रदान करता है, लेकिन इस विधि की संवेदनशीलता को कम करने, जगमगाहट गिनती समय सीमा। वैकल्पिक रूप से, एचपीएलसी eluent अंश एकत्र करने के बजाय एक प्रवाह सिंटिलेटर में खिला के एक ऑटो पारखी के साथ हो सकता है। मैनुअल अंशों तो इस प्रकार उच्च संवेदनशीलता की पेशकश समय की लंबी अवधि के लिए एक लाइन तरल जगमगाहट काउंटर से पढ़ा जा सकता है - फिर भी, इस दृष्टिकोण अंशों की संख्या के आधार पर गहन अधिक समय लगता है और श्रम और संकल्प को कम कर देता 38,40 एकत्र । इसके अतिरिक्त, पूरे कोशिकाओं का विश्लेषण असंदिग्ध रूप से एक विशिष्ट PtdInsP के स्तर को मापता है, लेकिन यह, कि PtdInsP की subcellular वितरण में परिवर्तन के बारे में सूचित नहीं होगा, हालांकि एक सकता है Previou के रूप में उप सेलुलर विभाजन के तरीकों के लिए युगल प्रवाह जगमगाहटधूर्त 39 किया। इसकी तुलना में, PtdInsP बाध्यकारी डोमेन के एक सेल में एक PtdInsP प्रजातियों के स्थान और गतिशीलता की जांच करने के लिए उपयोगी होते हैं एफपी आधारित है, लेकिन यह भी लक्ष्य PtdInsP के अलावा अन्य कारकों के लिए बाध्य कर सकता है। इसके अलावा, यहां वर्णित विधि बहुत PtdInsPs की आणविक विविधता बढ़ जाती है जो एसाइल चेन, को नष्ट करने से PtdInsP स्तर के विश्लेषण के सरल करता है। लिपिड के deacylation एसाइल की चेन, PtdInsP 41,42 संकेत की एक underappreciated पहलू के बारे में संरचनात्मक जानकारी का एक नुकसान होता है लेकिन जब से एक ही टोकन, यह भी एक महत्वपूर्ण नुकसान है। इस बड़ी चिंता का विषय है, तो तरल क्रोमैटोग्राफी मास स्पेक्ट्रोमेट्री (नियंत्रण रेखा एमएस) 14,17 नियोजित किया जाना चाहिए करने के लिए मिलकर। हालांकि, यह समवर्ती नियंत्रण रेखा एमएस 43 से सभी PtdInsPs प्रजातियों का विश्लेषण करने के लिए वर्तमान में मुश्किल है। इस प्रकार, तरीकों का एक संयोजन सभी सात PtdInsPs प्रजातियों के स्थान, गतिशीलता, आणविक विविधता और स्तर की जांच के क्रम में सबसे अच्छा तरीका है।

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    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    1-Butanol Biobasic BC1800 Reagent grade
    Ammonium phosphate dibasic Bioshop APD001 ACS grade
    Ammonium sulfate Biobasic ADB0060 Ultra Pure grade
    Autosampler Agilent G1329B Agilent 1260 infinity series
    Biotin Sigma B4501
    Boric acid Biobasic BB0044 Molecular biology grade
    Calcium Chloride Biobasic CT1330 Ahydrous, industrial grade
    Calcium pantothenate Sigma C8731
    Copper(II) sulfate Sigma 451657 Anhydrous
    D-Glucose Biobasic GB0219 Anhydrous, biotech grade
    Dulbecco's modification of Eagle's Medium Life 11995-065 With 4.5 g/L glucose, 110 mg/L pyruate, L-glutamine
    Dulbecco's modification of Eagle's Medium MP biomedicals 0916429  With 4.5 g/L glucose, without L-gluatmine, without inositol
    EDTA Biobasic EB0107 Acid free, ultra pure grade
    Ethyl ether Caledon labs 1/10/4700 Anhydrous, reagent grade
    Ethyl formate Sigma 112682 Reagent grade
    Fetal bovine serum Wisent 080-450 US origin, premium quality, heat inactivated
    Fetal Bovine Serum, Dialyzed Life 26400044 US origin
    FlowLogic U LabLogic Systems Ltd SG-BXX-05 Scintillation fluid for flow scintillation 
    Folic acid Biobasic FB0466 USP grade
    HEPES buffer solution Life 15630080 1 M solution
    Inositol, Myo-[2-3H(N)] Perkin Elmer NET114005MC 9:1 ethanol to water
    Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine Life 51500056 100x solution
    Iron(III) chloride Sigma 157740 Reagent grade
    Laura - Chromatography data collection and analysis software LabLogic Systems Ltd Version 4.2.1.18 Flow scintillator software
    L-glutamine Sigma G7513 200 mM, solution, sterile-filtered, BioXtra, suitable for cell culture
    Magnesium Chloride Sigma M8266 Anhydrous
    Manganese sulfate Biobasic MB0334 Monohydrate, ACS grade
    Methanol Caledon labs 6701-7-40 HPLC Grade
    Methylamine solution Sigma 426466 40% (v/v)
    Monopotassium phosphate Biobasic PB0445 Anhydrous, ACS grade
    Nicotinic acid Biobasic NB0660 Reagent grade
    OpenLAB CSD ChemStation  Agilent Rev. C.01.03  HPLC software
    p-aminobenzoic acid (PABA) Bioshop PAB001.100 Free acid
    Penicillin-Streptomycin Sigma P4333 100X, liquid, stabilized, sterile-filtered, cell culture tested
    Perchloric acid Sigma 244252 ACS reagent, 70%
    PhenoSpher SAX column Phenomenex 00G-315-E0 5 µm, 80 Å, 250 x 4.6 mm
    Phosphoric acid Caledon labs 1/29/8425 Reagent grade
    Potassium Chloride Biobasic PB0440 ACS grade
    Potassium iodide Biobasic PB0443 ACS grade
    Pyridoxine hydrochloride Sigma P9755
    Quaternary pump Agilent G1311C Agilent 1260 infinity series
    Riboflavin Bioshop RIB333.100 USP grade
    Sodium Chloride Biobasic DB0483 Biotech grade
    Sodium molybdate Sigma 243655
    Thermostatted Column Compartment Agilent G1316A Agilent 1260 infinity series
    Thiamine hydrochloride Sigma T4625 Reagent grade; make solution of 0.02% (w/v), forms a suspension. mix and freeze aliquots
    Ultima Gold Perkin Elmer 6013321 Scintillation coctail for liquid scintillation counting
    Zinc sulfate Biobasic ZB2906 Heptahydrate, reagent grade
    β-RAM 4 IN/US systems Model 4 Flow scintillator - 500 µl flow cell; alternative Radiomatic Flow Scintillator Analyser by Perkin Elmer 

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    References

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    रसायन विज्ञान अंक 107 Phosphoinositides लिपिड झिल्ली की तस्करी प्रवाह जगमगाहट संकेत पारगमन radiolabeling तरल क्रोमैटोग्राफी
    उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी मिलकर प्रवाह जगमगाहट से radiolabeling और Phosphoinositides की सेलुलर स्तर की मात्रा
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    Ho, C. Y., Choy, C. H., Botelho, R.… More

    Ho, C. Y., Choy, C. H., Botelho, R. J. Radiolabeling and Quantification of Cellular Levels of Phosphoinositides by High Performance Liquid Chromatography-coupled Flow Scintillation. J. Vis. Exp. (107), e53529, doi:10.3791/53529 (2016).

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