Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

חקר complexation של מרקורי (II) עם Dicysteinyl Tetrapeptides ידי Ionization electrospray ספקטרומטריית המסה

Published: January 8, 2016 doi: 10.3791/53536
Automatic Translation
1, 2
1Department of Chemistry and Biochemistry, University of North Carolina at Greensboro, 2Department of Chemistry, Winston-Salem State University

Protocol

הערה: נא להתייעץ כל גיליונות הנתונים של בטיחות חומרים הרלוונטיים (MSDS) לפני השימוש. כלוריד מרקורי הוא חומר כימי רעיל. ציוד מגן אישי (כפפות, משקפי בטיחות, ומעבדה מעיל) חייבים להיות משוחק בעת המסירה ואת כל הפתרונות הקשורים. השלך פתרונות בבקבוקי פסולת כימיים מסומנים באופן ברור המיועדים למתכות כבדות.

1. הכנה של 5 מ"מ degassed אמוניום Formate המאגר, pH 7.5

  1. ממיסים .1576 גרם של חיץ formate אמוניום ב450 מיליליטר של מים כיתה HPLC. התאם את ה- pH של התמיסה מעל עם 1 חומצה פורמית M ואמוניום הידרוקסיד 1 M 7.5. העבר את הפתרון הזה לבקבוק נפח 500 מיליליטר ולהוסיף מים HPLC לקו הכיול לעשות פתרון formate אמוניום 5 מ"מ.
  2. דגה חיץ formate אמוניום 5 מ"מ מתחת מערכת ואקום במשך 10 דקות וטיהור עם ארגון. חזור פעמיים ופתרון חנות תחת ארגון. ביום שימוש, לסנן את פתרון החיץ דרך פילטר 0.2 מיקרון beforשימוש בדואר.

2. הכנה של מרקורי פתרונות כלוריד (II)

  1. לשקול את .2375 כספית גרם (II) כלוריד. לפזר אותו ב 25 מיליליטר של חיץ formate אמוניום 5 מ"מ לייצר (II) פתרון כלוריד 0.035 M כספית.
  2. להוסיף .214 מיליליטר של 0.035 פתרון M הכספית כלוריד (II) ל9.785 חיץ formate אמוניום מיליליטר של 5 מ"מ כדי ליצור פתרון M 7.5 x 10 -4. שמיכת פתרון 7.5 x 10 -4 M כספית (II) עם גז ארגון.

3. הכנת CGGC פתרון במלאי

  1. ממיסים 2.0 מ"ג של tetrapeptide dicysteinyl, CGGC, ב0.118 מיליליטר של אצטוניטריל הכיתה HPLC ולאחר מכן להוסיף 1.0647 מיליליטר של 5 מ"מ formate אמוניום, pH 7.5 חיץ שכבר degassed בארגון להניב פתרון מניות מ"מ CGGC 5.
  2. להוסיף 225 μl של פתרון מניות מ"מ CGGC 5 ל1,275 μl של pH היווצרות אמוניום 5 מ"מ 7.5 חיץ לתת פתרון M CGGC 7.5 x 10 -4.

4. הכנהשל תערובות תגובה שונות של מרקורי (II) וCGGC

  1. הכנה של 1: 0.5 יחס של כספית (II): פתרון CGGC
    1. הנח 255 μl של formate אמוניום 5 מ"מ, חיץ pH 7.5 לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר. הוסף 30 μl של פתרון כספית כלוריד (II) 7.5 x10 -4 M לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר עם חיץ formate אמוניום.
    2. מערבולת הפתרון במשך 10 שניות. ואז להוסיף 15 μl של 7.5 x 10 -4 פתרון M CGGC לmicrocentrifuge 1.5 מיליליטר. מערבולת הפתרון במשך 10 שניות. תן הפתרון לעמוד במשך 10 דקות לפני ההזרקה לתוך ספקטרומטר המסה.
  2. הכנה של 1: 1 יחס של כספית (II): פתרון CGGC
    1. הנח 240 μl של formate אמוניום 5 מ"מ, חיץ pH 7.5 לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר. הוסף 30 μl של פתרון כספית כלוריד (II) 7.5 x10 -4 M לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר עם חיץ formate אמוניום.
    2. מערבולת הפתרון במשך 10 שניות. אזלהוסיף 30 μl של 7.5 x 10 -4 פתרון M CGGC לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר. חזור באופן דומה כמפורט בסעיף 4.1.
  3. הכנת 1: 2 יחס של כספית (II): פתרון CGGC
    1. הנח 210 μl של formate אמוניום 5 מ"מ, חיץ pH 7.5 לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר. הוסף 30 μl של פתרון כספית כלוריד (II) 7.5 x10 -4 M לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר עם חיץ formate אמוניום.
    2. מערבולת הפתרון במשך 10 שניות. ואז להוסיף 60 μl של 7.5 x 10 -4 פתרון M CGGC לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר. חזור באופן דומה כמפורט בסעיף 4.1.

5. הכנת CEEC פתרון במלאי

  1. ממיסים 3.5 מ"ג של tetrapeptide dicysteinyl, CEEC, ב0.145 מיליליטר של אצטוניטריל הכיתה HPLC לפזר פפטיד. לאחר מכן להוסיף 13.067 מיליליטר של 5 formate אמוניום מ"מ, pH 7.5 חיץ שכבר degassed בארגון לייצר 0.5 מ 'פתרון M CEEC.
  2. מערבולת הפתרון עד שכל פפטיד נמס. להוסיף 1.125 מיליליטר של 0.5 מ"מ פתרון CEEC ו0.375 מיליליטר של 5 מ"מ formate אמוניום, חיץ pH 7.5 לצינור 1.5 מיליליטר microcentrifuge לתת פתרון x 10 -5 M CEEC 7.5. מערבולת עד מעורב.

6. הכנת תערובות תגובה שונות של מרקורי (II) ופתרון CEEC

  1. הכנה של 1: 0.5 יחס של הכספית (II): פתרון CEEC
    1. הנח 255 μl של formate אמוניום 5 מ"מ, חיץ pH 7.5 לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר. הוסף 30 μl של פתרון כספית כלוריד (II) 7.5 x10 -4 M לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר עם חיץ formate אמוניום.
    2. מערבולת הפתרון במשך 10 שניות. ואז להוסיף 15 μl של 7.5 x 10 -4 פתרון M CEEC לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר. חזור באופן דומה כמפורט בסעיף 4.1.
  2. הכנה של 1: 1 יחס של כספית (II): פתרון CEEC
    1. הנח 24081; L של formate אמוניום 5 מ"מ, חיץ pH 7.5 לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר. הוסף 30 μl של פתרון כספית כלוריד (II) 7.5 x10 -4 M לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר עם חיץ formate אמוניום.
    2. מערבולת הפתרון במשך 10 שניות. ואז להוסיף 30 μl של 7.5 x 10 -4 פתרון M CEEC לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר. חזור באופן דומה כמפורט בסעיף 4.1.
  3. הכנת 1: 2 יחס של כספית (II): פתרון CEEC
    1. הנח 210 μl של formate אמוניום 5 מ"מ, חיץ pH 7.5 לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר. הוסף 30 μl של פתרון כספית כלוריד (II) 7.5 x10 -4 M לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר עם חיץ formate אמוניום.
    2. מערבולת הפתרון במשך 10 שניות. ואז להוסיף 60 μl של 7.5 x 10 -4 פתרון M CEEC לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר. חזור באופן דומה כמפורט בסעיף 4.1.

7. Analyזיע תערובות התגובה של מרקורי (II) ודוגמאות CGGC ידי Orbitrap ESI ספקטרומטריית המסה

  1. הכנת ספקטרומטר מסת ESI 16
    1. צייר של סטנדרטים כיול 100 μl לתוך מזרק זכוכית 500 μl.
    2. מניחים את המזרק בעריסת המזרק של משאבת MS, לצרף את צינורות, ולהזריק לספקטרופוטומטר ההמוני.
    3. להגדיר את שם הקובץ לריצה על ידי בחירת סמל הקובץ ולהקליד את שם הקובץ.
    4. בחר כפתור נתונים לרכוש במודול רכישת נתונים ולאסוף 150 סריקות.
    5. ניתוח chromatogram כדי לאמת את הסטנדרטים כיול על ידי פתיחת מודול עיבוד נתונים של התוכנה. פתח את מודול, ללכת להגיש תפריט ובחר באפשרות "לפתוח", ובחר את הקובץ בתיבת הדו-שיח. ודא שהפסגות בchromatogram כדי לתאם את המסה לחייב יחסים של הסטנדרטים.
    6. נקה את מזרק זכוכית 500 μl על ידי ציור את מתנול הכיתה HPLC 500 μl ואז לוותר מ 'אתנול לתוך כוס.
    7. צייר את 500 μl של מתנול הכיתה HPLC לתוך מזרק הזכוכית ולשטוף את המערכת לפי צעד 7.1.2.
    8. בחר את שיטת התקנת מודול של התוכנה כדי להגדיר את הפרמטרים. בחר את תפריט מצב הסריקה ולזהות המנתח כFTMS, ולאחר מכן לחץ על "אישור". לאחר מכן על ידי לחיצה על הסמלים השונים בדף ספקטרום תצוגה בזמן אמת, להגדיר את הפרמטרים הבאים: זרימת גז שיעור נדן: 10, טמפרטורת מקור: 0, מתח נימים: 37 V, עדשת Tube: 95 V, מתח ריסוס: 4.20 קילו וולט , קצב זרימה 10.00 μl / דקה, מנתח: FTMS, מספר סריקות: 150.
  2. ריצת דגימות CGGC על ספקטרומטר מסת ESI
    1. הפעל את חיץ pH formate אמוניום 5 מ"מ 7.5.
      1. הנח 500 μl של חיץ formate אמוניום 5 מ"מ לתוך מזרק זכוכית 500 μl, למקם אותו לתוך עריסת המזרק של משאבת MS, ולצרף את צינורות.
      2. הפעל חיץ דרך צינורות במשך 1-2 דקות.
      3. להגדיר את שם הקובץ לריצהעל ידי בחירת סמל הקובץ ולהקליד את שם הקובץ.
      4. בחר כפתור נתונים לרכוש במודול ולאסוף 150 סריקות.
      5. לחץ על לחצן הפעלה כדי לעצור אוסף אחרי 150 סריקות נאספות.
      6. פתח את מודול דפדפן נתונים, ואז ללכת להגיש תפריט ובחר באפשרות "לפתוח", ובחר את הקובץ בתיבת הדו-שיח. ודא שאין בפסגות 483, 683, 1,163 ו1,363 מ '/ z נמצאות דומה לפפטיד או כספית (II) מתחמי -peptide.
    2. הפעל 1: כספית 0.5 (השני): פתרון יחס CGGC.
      1. הנח 250 μl של 1: 0.5 כספית (II): יחס CGGC של המדגם לתוך המזרק.
      2. מניחים את המזרק לתוך תושבת המזרק של משאבת MS, לצרף את צינורות, וראש המנגנון.
      3. בחר שם קובץ עבור הטווח על ידי בחירת סמל הקובץ ולהקליד את שם הקובץ.
      4. לחץ על כפתור נתונים לרכוש במודול רכישת נתונים ולאסוף 150 סריקות ולחץ על לחצן הפעלה כדי לעצור את האוסף.
      5. פתח את מודול, ללכת להגיש תפריט ובחר באפשרות "לפתוח", ובחר את הקובץ בתיבת הדו-שיח. ודא שchromatogram מכיל פסגות כוללים אחד לפפטיד CGGC לבד.
      6. שטוף את המזרק על ידי aspirating עם חיץ formate אמוניום 500 μl ולאחר מכן מחלק חיץ formate אמוניום לתוך כוס.
      7. בחר בלחצן הפסולת בטרשת הנפוצה ולשטוף את צינורות שלוש פעמים עם 500 חיץ formate אמוניום μl.
      8. שטוף את המזרק על ידי aspirating עם מתנול 500 μl ולאחר מכן מחלק מתנול לתוך כוס.
      9. לשטוף פעם אחת צינורות עם 500 מתנול μl.
      10. כפתור גלאי עומס בחר בטרשת הנפוצה.
      11. הוסף 500 μl של חיץ formate אמוניום למזרק.
      12. מניחים את המזרק לתוך תושבת המזרק של משאבת MS, לצרף את צינורות, וראש המנגנון.
      13. בחר שם קובץ עבור המאגר מנוהל על ידי בחירת סמל הקובץ ולהקליד את שם הקובץ.
      14. לִלְחוֹץכפתור נתונים לרכוש ולאסוף 150 סריקות ולאחר מכן לחץ על לחצן הפעלת התחנה.
      15. פתח את מודול דפדפן נתונים, ללכת להגיש תפריט ובחר באפשרות "לפתוח", ובחר את הקובץ בתיבת הדו-שיח. ודא שchromatogram הוא חלל של פסגות מהמ"כ הקודמת: ריצת CGGC.
    3. הפעל 1: כספית 1 (השני): פתרון יחס CGGC.
      1. הנח 250 μl של 1: 1 כספית (II): מדגם יחס CGGC לתוך המזרק.
      2. חזור באופן דומה כפי שתואר לצעדים 7.2.2.2 ל7.2.2.15.
    4. הפעל 1: 2 הכספית (II): פתרון יחס CGGC
      1. הנח 250 μl של 1: 2 כספית (II): מדגם ריכוז CGGC לתוך המזרק.
      2. חזור באופן דומה כפי שתואר לצעדים 7.2.2.2 ל7.2.2.15.

8. ניתוח תערובות התגובה של מרקורי ודוגמאות CEEC ידי Orbitrap ESI ספקטרומטריית המסה

  1. ריצת דגימות CEEC על ספקטרומטר מסת ESI
    1. הליך ניתוח חוזר (צעדים 7.1-7.2) באמצעות דגימות CEEC ותערובות תגובה של כספית (II) וCEEC ביחסי stoichiometric שונים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מחקר בוצע כדי לאפיין את ההרכב המורכב כספית-פפטיד האפשרי לשתי tetrapeptides, CGGC וCEEC (איור 1) על ידי ספקטרומטריית מסת ESI. מתחמים של כספית (II) עם CGGC או CEEC נחקרו על ידי מגיב התערובות של כספית (II) ופתרונות פפטיד בשלושה יחסים שונים טוחנות: 1: 0.5, 1: 1, ו 1: 2 (כספית (II): פפטיד) . הריכוז של כספית (II) היה 7.5 x 10 -6 M וריכוז הפפטיד מגוון בהתאם.

איור 1
1. מבני איור Dicysteinyl פפטיד. מבנים כימיים של tetrapeptides dicysteinyl, CGGC וCEEC. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

אף אוזן גרון "FO: לשמור-together.within עמודים =" 1 "> איור 2
איור 2. ESI MS של כספית (II) וCGGC ספקטרום המוני orbitrap יינון electrospray מתמיסה המכילה 7.5 x 10 -6 M Hg 2 + חיץ formate אמוניום, pH 7.5 המכיל משתנה Hg 2 +:. יחסי stoichiometric CGGC: ( ) 1: 0.5 יחס, (ב) יחס של 1: 1, ו( 1 ג): 2 יחס. ריבועי להראות דפוסי איזוטופים כספית של מתחמי כספית-פפטיד המצוין. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3. ESI MS של כספית (II) וCEEC. ספקטרום מסת יינון orbitrap electrospray מתמיסה המכילה 7.5 x 10 -6 M Hg 2 + חיץ formate אמוניום, pH 7.5 המכילים משתנה Hg 2 +: יחסי stoichiometric CEEC: (א) 1: 0.5 יחס, (ב) 1: 1 יחס, ו- (ג) 1 : 2 יחס. ריבועי להראות דפוסי איזוטופים כספית של מתחמי כספית-פפטיד המצוין. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

chromatograms ההמוני orbitrap יינון electrospray נאסף לכספית complexing (II) עם CGGC (איור 2) וCEEC (איור 3) בכספית שונות (II) לפפטיד יחסי stoichiometric (1: 0.5, 1: 1, ו 1: 2). סוגים מורכבים הכספית-פפטיד נצפו להראות פסגות שונות איזוטופים כספית (ריבועי), אשר נמצא בשימוש כדי לקבוע את המספר של יוני כספית במתחם, כמו גם את מספר deproלבני אומות. לדוגמא, הבלעה איור 1b מראה את חתימת איזוטופים כספית בadduct פפטיד-כספית, אשר תואמת את שבעת איזוטופים טבעיים העיקריים של כספית: 196 Hg (0.146%), 198 Hg (10.02%), 199 Hg (16.84%) , 200 Hg (23.13%), 201 Hg (13.22%), 202 Hg (29.80%), 204 Hg (6.85%), עם שכיחות טבעית אחוזים מצויינים בסוגריים. שני איזוטופים גדולים 200 Hg וHg 202 להראות יחס עוצמה יחסי מובהק של 2.3: 3. בהתאם לשיא איזוטופים האינטנסיבי ביותר של אשכול איזוטופ אחד-כספית זה מהווה מסת monoisotopic לadduct (m / z = 539). והוא מתואם עם שני לתאם מורכב, אשר נוצר על ידי deprotonation של שני thiols ציסטנילים ליצירת [(CGGC-2H + Hg) + H] + adduct. ניתוח זה נעשה באופן הבא:

ערך מ '/ z ל[ (CGGC-2H + Hg) + H] + הוא סוסיםאל ל( 338-2 + 202 + 1) = 539.

הבלעה איור 1 א מציגה את חתימת איזוטופים הכספית בadduct פפטיד-כספית, אשר תואם מורכב שני כספית כפי שמחושב על ידי שימוש בתכנית Chemcal ל[ (2CGGC-4H + 2Hg) + H] + (איור 4). מסת monoisotopic protonated התיאורטית מתאימה לערך מ '/ z של 1077.061, המהווה את שיא איזוטופים התשיעי באשכול איזוטופים מחושב. הבלעה איור 1 א מציגה שיא איזוטופים המקביל לערך מ' / z של 1,077.1, שהוא גם השיא התשיעי באשכול איזוטופים נצפה. לכן, adduct המקורי לאשכול איזוטופי זה ניתן להקצות ל[ (2CGGC-4H + 2Hg) + H] +.

איור 4
4. דפוסי איור תיאורטי איזוטופים ל[ (2CGGC-4H + 2Hg) + H] + sup>. דפוסי איזוטופים התיאורטי ל[ (2CGGC-4H + 2Hg) + H] + כפי שמחושב על ידי שימוש בתכנית Chemcal. החץ מצביע על שיא monoisotopic. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
איור 5. adducts Cationized. חלק adducts נתרן ואשלגן cationized קשורים למתחמי הכספית-פפטיד. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5 מראה כמה adducts נתרן ואשלגן cationized קשורים למתחמי הכספית-פפטיד שהוקמו על ידי CGGC. adducts Sodiated הם לא 22 יחידות מסה גדולות יותרהאן מקביל מתחמי הכספית-CGGC protonated, ואילו adducts אשלגן הן 38 יחידות מסה גדולות יותר. דימר הדומיננטי protonated CGGC (m / z = 677) גם יוצר מין cationized עם נתרן (m / z = 699) ויוני אשלגן (m / z = 715). זו מאשרת נוספת ההיווצרות של הדימרים CGGC ללא החמצון של קבוצות תיאול ציסטנילים כדי ליצור disulfides, שהיה גורם לירידה של שתי יחידות מסה לadducts protonated או cationized.

איור 6
מדינות איור 6. החופף +1 ו+2 תשלום. פסגות חופפות הקשורים יוני כספית-פפטיד [(CEEC-4H + 2Hg) + H] + ב+1 ו+2 המדינות אחראית. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של נתון זה.

"איור 7. דפוסי איזוטופים תיאורטי איור ל[ (CEEC-4H + 2Hg) + H] +. דפוסי איזוטופים התיאורטי ל[ (CEEC-4H + 2Hg) + H] + כפי שמחושבים על ידי שימוש בתכנית Chemcal. החץ מצביע על שיא monoisotopic. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 6 מציגים חופף פסגות הקשורים adducts כספית-CEEC בתשלום +1 ו+2. זה מראה פסגות איזוטופים הקשורים ליוני כספית-פפטיד [(CEEC-4H + 2Hg) + H] + בתשלום +1 וערך מ '/ z של 883. זה בהסכם עם מורכב שתי כספית כפי שמחושב ל [(CEEC-4H + 2Hg) + H] + על ידי שימוש בתכנית Chemcal (איור 7). Monoisotopic protonated התיאורטי מסה מתאימה לערך מ '/ z של 883.032.

נצפה מעל [(CEEC-4H + 2Hg) + H] + adduct עם שיא של 883.03 monoisotopic חופף עם adduct אחר המכיל פסגות המתאימות מראה 0.5 יחידות מסה נוספות. עם הרזולוציה גבוהה במיוחד שהושגה על ידי מכשיר ספקטרומטר מסת orbitrap, ניתן הניח אותו כי פסגות חופפות אלה מתאימות לadducts עם תשלום של +2. בהתאם לכך, מסת monoisotopic של חופף מורכב שמיונן יכול להיות מחושב כדלקמן. איור 8 מראה כי ההבדל מ '/ z בין פסגות איזוטופים הוא 0.5 ואת ההבדל ביניהם הוא מסת האמו 1. לכן, המדינה אחראית היא +2. כדי לחשב את המסה של מתחם הכספית-פפטיד, מ '/ z לשיא monoisotopic מוכפל במדינה אחראית, ונוכו מהמסה של שני פרוטונים, מה שהפך את היון המורכב הטעון חיובי.

o: לשמור-together.within עמודים = "1"> חישובים לadduct +2:

הבדל מ '/ z בין פסגות איזוטופים הוא 0.5

הבדל בין מסת פסגות איזוטופים הוא האמו 1 (ניטרונים 1)

z = 1 פער של 0.5 = 2

מ '/ z לשיא monoisotopic protonated הוא (883.53 x 2) - 2 = 1,765.06

הערך מ '/ z מעל לשיא monoisotopic protonated, [(2CEEC-8H + 4Hg) + H] +, עולה בקנה אחד עם הערך התיאורטי כפי שמחושבים על ידי תכנית Chemcal כ1,765.056 (איור 8).

איור 8
איור 8. תיאורטי דפוסי איזוטופים ל[ (2CEEC-8H + 4Hg) + H] +. דפוסי איזוטופים התיאורטי ל[ (2CEEC-8H + 4Hg) + H] + כפי שמחושבים על ידי שימוש בתכנית Chemcal. החץ מצביע על שיא monoisotopic. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

היתרון של ניתוח מתחמי כספית-פפטיד עם ספקטרומטר מסת orbitrap ESI הוא שאחראי על כל יון ניתן להקצות בקלות כפי שמוצג לעיל. פפטידים המכילים אמינו-סופית בסיסית יכולים בקלות לייצב מטענים חיוביים. בעת שימוש ביינון electrospray ומנתח המוני ברזולוציה גבוהה כגון orbitrap, המדינה אחראית על יוני פפטיד עם יותר מ +1 תשלום ניתן לקבוע בהשוואה יותר בקלות לרזולוציה נמוכה יותר iontrap מנתח המוני.

= "1"> פסגות החופפות הקשורים adducts כספית-CEEC (איור 3 א ואיור 6), כפי שתואר לעיל, גם נותחו על ידי טנדם MS. זה לא הראה שום פיצול MS-MS, אשר הצביע על כך שהאותות שהתקבלו שייכים למתחם הצפוי כפי שפורטו לעיל, ואינם התקבצו חפצים נוצרו בריכוזים גבוהים יותר של יחסים כספית לפפטיד.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Tetrapeptide dicysteinyl הידרופובי CGGC (10 C H 18 N O 4 5 S 2; MW = 338) (איור 1), יוצר קומפלקסים עם כספית (II) כפי שמוצג באיור 2 ולוח 1 בנוסף, הוא יוצר הדימרים פפטיד וtrimers. בהדרגה בסכום של עליות פפטיד בתערובת התגובה. כפי שניתן לראות על ידי ערכי m / z של הדימרים הקשורים [(2M + H) + = 677] וtrimers [(3M + H) + = 1,015], קבוצות תיאול של CGGC לא לחמצן כדי ליצור disulfides תחת תנאי הניסוי . ההיווצרות של מיני CGGC הקשורים אלה יכול להיות בגלל הידרופוביות של tetrapeptide זה. CGGC יוצר שני סוגים של מתחמים עם כספית המתאימה 1: 1 כספית (II): פפטיד ו1: 2 כספית (II) :( פפטיד) 2 מתחמים כפי שדווח בעבר לtripeptides dicysteinyl 7. עם זאת, בנוכחות עודפת או שווה ערך כספית (II), זה גם FOrms 2: 2 [כספית (II)] 2: 2 מורכב (פפטיד).

Tetrapeptide dicysteinyl carboxylated CEEC (C 16 H 26 N 4 O 9 S 2; MW = 482) (איור 1) מתחמי טופס עם כספית (II) כפי שמוצג באיור 3 ולוח 1 זה לא יוצר הדימרים CEEC אותה קלות ש. שלהתבונן לCGGC הידרופובי יותר. דומה לCGGC, הוא יוצר קומפלקסים עם הכספית המתאימה 1: 1 כספית (II): פפטיד ו1: 2 כספית (II) :( פפטיד) 2 מתחמים. עם זאת, עם קבוצות carboxylate עזר, הוא יוצר 2: 2 [הכספית (II)] 2: 2 מורכב יותר בקלות (פפטיד). יתר על כן, בכספית עודפת, הוא יוצר 2: [הכספית (II)] 1 2: פפטיד מורכב ו4: 2 [הכספית (II)] 4: מורכב פפטיד (פפטיד) 2, שלא נצפו לCGGC.

הסיכום של האותות נצפו עבור המתחמים Formed כערכי m / z מוצגים בטבלה 1.

שולחן 1

טבלה 1. סיכום של אותות מתחמי כספית-פפטיד. אותות מתחמי מרקורי-פפטיד בchromatograms LTQ / Orbitrap MS במאגר formate אמוניום, pH 7.5.

אנחנו הוכחנו כי התגובה של כספית (II) ושתי tetrapeptides dicysteinyl יצירת קומפלקסים שתלויים ביחסים הראשוניים של כספית (II): פפטיד, כמו גם הנוכחות של קבוצות מחייבות עזר בtetrapeptide dicysteinyl. יתר על כן, stoichiometry מדויק של כספית ופפטיד במתחמי נוצרו בתנאי יינון electrospray צוינו ניתן לקבוע על ידי שימוש ברזולוציה גבוהה ספקטרומטר מסת ESI מבוסס על דפוסי הפצה איזוטופי כספית נפרד.

בתגובת pept ציסטניליםאידו עם כספית (II), יש לנקוט באמצעי זהירות כדי למנוע החמצון של קבוצות תיאול ציסטנילים ליצור קשרי דיסולפיד. בתוך הפרוטוקול המתואר, פתרונות החיץ היו degassed בקפידה ומאוחסנים בארגון. בנוסף, כל דגימות התגובה מוכנות מייד לפני הניתוח על ידי ספקטרומטריית מסת ESI.

בשל הבדלים במסיסות בין שני tetrapeptides, CEEC וCGGC, ריכוזים שונים המשמשים להכנת פתרונות המניות. מניית המקפיא של פפטיד CGGC הייתה רטובה עם אצטוניטריל וקלות מומס ואחריו חיץ formate אמוניום 5 מ"מ, pH 7.5 לייצר פתרון x 10 -4 M CGGC 7.5. CEEC הוכן בריכוז נמוך, 7.5 x 10 -5 M, לפני הכספית (II): צעדי תערובת תגובת פפטיד בגלל המסיסות הנמוכה שלה. הדילול האופטימלי לניתוח כספית מתחמים (II) נחשב להיות 10 -5 M בגלל המסיסות של פפטיד ולאפשרלהסרת שאריות בספקטרומטר המסה. בחוזה לפתרונות CGGC, שאריות CEEC לדבוק בצינורות, שמחייב החלפת צינורות מזדמנת.

המשמעות של שימוש בספקטרומטר מסת ESI לניתוח מתחמי כספית-פפטיד טמון ביינון הרך של analytes. זה מקל על הניתוח של יונים מולקולריים עם פיצול זניח. כפי שניתן לראות בעבודה זו, ניתן להשתמש בו כדי לאפיין את stoichiometries של מתחמי כספית-פפטיד המבוססים על דפוסי הפצה איזוטופי כספית חתימה. עם זאת, מערכת חיץ נדיפים היא הכרחית לניתוח על ידי ספקטרומטריית מסת ESI. זה עשוי להגביל את השימוש המעשי שלה לזיהוי analytes שדורש ממסים פחות תנודתי או תקשורת חציצה לפירוק.

כפי שהזכרנו קודם לכן 7,8, ספקטרוסקופיית מסות ESI מספקת כלי ניתוח רגישים לקביעה מדויקת של ההרכב של כספית וpeptIDE במתחמי הכספית-פפטיד בתנאי יינון electrospray שצוין. עם זאת, יש צורך להשתמש בשיטות נוספות (לדוגמא, H 1, 13 C, ספקטרוסקופיה 199 Hg NMR, מבנה רנטגן הוארך קליטה בסדר, או potentiometry 17-18) כדי לספק קביעה מדויקת יותר של התוכן של מתחמים ב פִּתָרוֹן.

הראינו כי ESI עם מנתח המוני orbitrap ניתן להשתמש כדי לנתח מתחמי כספית-פפטיד. אנו צופים כי טכניקה זו יכולה להיות מיושמת כלפי הניתוח של יונים של מתכות אחרות והמתחמים שלהם עם תרכובות קטנות שונות. זה יהיה שימושי במיוחד לניתוח מתחמים שהוקמו על ידי יונים של מתכות אחרות שיכול להתקיים בצורות שונות איזוטופים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

MN-S מודה תמיכה מהקרן הלאומית למדע, רוי להעניק מל"ג 1011859. המחברים תודה להכיר מתקן שלישיית ספקטרומטריית מסה באוניברסיטת צפון קרוליינה בגרינסבורו לשימוש בספקטרומטר המסה תרמו פישר סיינטיפיק LTQ Orbitrap XL. המחברים מודים דניאל טוד, וינסנט סיקה, וBrandie Erhmann באוניברסיטת צפון קרוליינה בגרינסבורו להצעות מועילות והערות לגבי עבודה זו.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mercury(II) chloride Sigma-Aldrich 429724 Highly toxic
Ammonium formate Sigma-Aldrich 516961
Formic acid Sigma-Aldrich F0507
Ammonium hydroxide Fisher A512-P500
HPLC water Fisher W5-4
HPLC Acetonitrile Fisher BP2405-1
HPLC Methanol Fisher A452-4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Clifton, J. C. Mercury exposure and public health. Pediatr. Clin. N. Am. 54, 237-269 (2007).
  2. Andersen, O. Principles and Recent Developments in Chelation Treatment of Metal Intoxication. Chem. Rev. 99, 2683-2710 (1999).
  3. Aposhian, H. V., Maiorino, R. M., Gonzalez-Ramirez, D., Zuniga-Charles, M., Xu, Z., Hurlbut, J. M., Junco-Munoz, P., Dart, R. C., Aposhian, M. M. Mobilization of heavy metals by newer, therapeutically useful chelating agents. Toxicology. 97, 23-38 (1995).
  4. Flora, S. J. S., Pachauri, V. Chelation in Metal Intoxication. Int. J. Environ. Res. Public Health. 7, 2745-2788 (2010).
  5. Campbell, J. R., Clarkson, T. W., Omar, M. D. The therapeutic use of 2,3-dimercaptopropane-1-sulfonate in two cases of inorganic mercury poisoning. JAMA. 256, 3127-3130 (1986).
  6. Rooney, J. P. K. The role of thiols, dithiols, nutritional factors and interacting ligands in the toxicology of mercury. Toxicology. 234, 145-156 (2007).
  7. Lin, X., Brooks, J., Bronson, M., Ngu-Schwemlein, M. Evalution of the association of mercury (II) with some dicysteinyl tripeptides. Bioorg. Chem. 44, 8-18 (2012).
  8. Ngu-Schwemlein, M., Lin, X., Rudd, B., Bronson, M. Synthesis and ESI mass spectrometric analysis of the association of mercury(II) with multi-cysteinyl peptides. J. Inorg. Biochem. 133, 8-23 (2014).
  9. Winther, J. R., Thorpe, C. Quantification of thiols and disulfides. Biochimica et. Biophysica Acta. 1840, 838-846 (2014).
  10. D'Agstino, A., Colton, R., Traeger, J. C., Cantry, A. J. An Electrospray Mass Spectrometric Study of Organomercury (II) and Mercuric Interactions with Peptides Involving Cysteinyl Ligands. Eur. Mass Spectrom. , 273-285 (1990).
  11. Hofstadler, S. A., Sannes-Lowery, K. A. Applications of ESI-MS in drug discovery: interrogation of noncovalent complexes. Nature Reviews Drug Discovery. 5, 585-595 (2006).
  12. Rubino, F. M., Verduci, C., Giampiccolo, R., Pulvirenti, S., Brambilla, G., Columbi, A. Molecular Characterization of Homo- and Heterodimeric Mercury (II)-bis-thiolates of Some Biologically Relevant Thiols by Electrospray Ionization and Triple Quadruple Tandem Mass Spectrometry. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 15, 288-300 (2003).
  13. Krupp, E. M., Milne, B. F., Mestrot, A., Meharg, A. A., Feldmann, J. Investigation into mercury bound to biothiols: structural identification using ESI-ion-trap MS and introduction of a method for their HPLC separation with simultaneous detection by ICP-MS and and ESI-MS. Anal. Bioanal. Chem. 390, 1753-1764 (2008).
  14. Schaumlöffel, D., Tholey, A. Recent directions of electrospray mass spectrometry for elemental speciation analysis. Anal. Bioanal. Chem. 400, 1645-1652 (2011).
  15. Patiny, L., Borel, A. ChemCalc: a building block for tomorrow's chemical infrastructure. J. Chem. Inf. Model. 53, 1223-1228 (2013).
  16. Thermo Scientific. Xcaibur Versions 2.1.0-2.3.0 Data Acquisition and Processing User Guide. Revision E. United States. , Thermo Fisher Scientific Inc. (2012).
  17. Falcone, G., Foti, C., Gianguzza, A., Giuffrè, O., Napoli, A., Pettignano, A., Piazzese, D. Sequestering ability of some chelating agents towards methylmercury(II). Anal. Bioanal. Chem. 405 (2), 881-893 (2013).
  18. Mah, V., Jalilehvand, F. Glutathione Complex Formation with Mercury(II) in Aqueous Solution at Physiological pH. Chem. Res. Toxicol. 23, 1815-1823 (2010).

Tags

כימיה גיליון 107 מתחמי מרקורי-פפטיד פסגות איזוטופי כספית ספקטרוסקופיית מסות ESI MS פפטידים ציסטנילים
חקר complexation של מרקורי (II) עם Dicysteinyl Tetrapeptides ידי Ionization electrospray ספקטרומטריית המסה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mazlo, J., Ngu-Schwemlein, M. A… More

Mazlo, J., Ngu-Schwemlein, M. A Study of the Complexation of Mercury(II) with Dicysteinyl Tetrapeptides by Electrospray Ionization Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (107), e53536, doi:10.3791/53536 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter