Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

En studie av komplex Merkurius (II) med Dicysteinyl Tetrapeptider från elektrosprayjonisering masspektrometri

Published: January 8, 2016 doi: 10.3791/53536
Automatic Translation
1, 2
1Department of Chemistry and Biochemistry, University of North Carolina at Greensboro, 2Department of Chemistry, Winston-Salem State University

Protocol

Obs! Samråda med alla relevanta säkerhetsdatablad (SDB) före användning. Kvicksilverklorid är en giftig kemikalie. Personlig skyddsutrustning (handskar, skyddsglasögon och labbrock) måste användas vid överlämnandet den och alla tillhörande lösningar. Förfoga över lösningar i tydligt märkta kemiska avfallsflaskor avsedda för tungmetaller.

1. Framställning av 5 mM Avgasat ammoniumformiat-buffert, pH 7,5

  1. Lös 0,1576 g ammoniumformiat-buffert i 450 ml HPLC-kvalitet vatten. Justera pH av ovanstående lösning med en M myrsyra och 1 M ammoniumhydroxid till 7,5. Överför denna lösning till en 500 ml mätkolv och tillsätt HPLC-vatten till kalibreringslinjen för att göra en 5 mM ammoniumformiat-lösning.
  2. Avlufta den 5 mM ammoniumformiatbuffert under ett vakuumsystem för 10 min och spolades med argon. Upprepa två gånger och lagra lösning under argon. På dagen för användning, välja buffertlösningen genom ett 0,2 mikron filter before användning.

2. Framställning av kvicksilver (II) kloridlösningar

  1. Väg upp 0,2375 g kvicksilver (II) klorid. Lös den i 25 ml 5 mM ammoniumformiatbuffert för framställning av en 0,035 M kvicksilver (II) kloridlösning.
  2. Lägg 0,214 ml 0,035 M kvicksilver (II) kloridlösning till 9,785 ml 5 mM ammoniumformiatbuffert att skapa en 7,5 x 10 -4 M lösning. Filt 7,5 x 10 -4 M kvicksilver (II) lösning med argongas.

3. Framställning av CGGC stamlösning

  1. Lös 2,0 mg av dicysteinyl tetrapeptiden, CGGC, i 0,118 ml HPLC-kvalitet acetonitril och tillsätt sedan 1,0647 ml 5 mM ammoniumformiat, pH 7,5 buffert som har avgasats i argon för att ge en 5 mM CGGC stamlösning.
  2. Lägg 225 ul av 5 mM CGGC stamlösning till 1,275 ^ il 5 mM ammonium-bildning pH 7,5 buffert för att ge en 7,5 x 10 -4 M CGGC lösning.

4. Framställningav olika reaktions Blandningar av kvicksilver (II) och CGGC

  1. Framställning av 1: 0,5-förhållande av kvicksilver (II): CGGC lösning
    1. Placera 255 pl av 5 mM ammoniumformiat, pH 7,5-buffert i en 1,5 ml mikrocentrifugrör. Tillsätt 30 pl av 7,5 x 10 -4 M kvicksilver (II) kloridlösning i 1,5 ml mikrocentrifugrör med ammoniumformiatbuffert.
    2. Vortexa lösningen under 10 sek. Tillsätt sedan 15 pl av 7,5 x 10 -4 M CGGC lösning i 1,5 ml mikro. Vortexa lösningen under 10 sek. Låt lösningen stå under 10 min före injektion i masspektrometern.
  2. Framställning av 1: 1 förhållande av kvicksilver (II): CGGC lösning
    1. Placera 240 pl av 5 mM ammoniumformiat, pH 7,5-buffert i en 1,5 ml mikrocentrifugrör. Tillsätt 30 pl av 7,5 x 10 -4 M kvicksilver (II) kloridlösning i 1,5 ml mikrocentrifugrör med ammoniumformiatbuffert.
    2. Vortexa lösningen under 10 sek. Sedantill 30 pl 7,5 x 10 -4 M CGGC lösning i 1,5 ml mikrocentrifugrör. Upprepa på ett liknande sätt som beskrivs i avsnitt 4.1.
  3. Framställning av 1: 2 förhållande av kvicksilver (II): CGGC lösning
    1. Placera 210 pl av 5 mM ammoniumformiat, pH 7,5-buffert i en 1,5 ml mikrocentrifugrör. Tillsätt 30 pl av 7,5 x 10 -4 M kvicksilver (II) kloridlösning i 1,5 ml mikrocentrifugrör med ammoniumformiatbuffert.
    2. Vortexa lösningen under 10 sek. Tillsätt sedan 60 pl av 7,5 x 10 -4 M CGGC lösning i 1,5 ml mikrocentrifugrör. Upprepa på ett liknande sätt som beskrivs i avsnitt 4.1.

5. Framställning av CÖE stamlösning

  1. Lös 3,5 mg av dicysteinyl tetrapeptiden, CÖE, i 0,145 ml HPLC-kvalitet acetonitril för att lösa upp peptiden. Sedan till 13,067 ml 5 mM ammoniumformiat, pH 7,5-buffert som har avgasats i argon för framställning av 0,5 mM CÖE lösning.
  2. Vortexa lösningen tills all peptid är upplöst. Lägg 1,125 ml 0,5 mM CÖE lösning och 0,375 ml 5 mM ammoniumformiat, pH 7,5 buffert till en 1,5 ml mikrocentrifugröret för att ge en 7,5 x 10 -5 M CÖE lösning. Vortex tills blandad.

6. Beredning av olika reaktions Blandningar av kvicksilver (II) och CÖE Lösning

  1. Framställning av 1: 0,5-förhållande av kvicksilver (II): CÖE lösning
    1. Placera 255 pl av 5 mM ammoniumformiat, pH 7,5-buffert i en 1,5 ml mikrocentrifugrör. Tillsätt 30 pl av 7,5 x 10 -4 M kvicksilver (II) kloridlösning i 1,5 ml mikrocentrifugrör med ammoniumformiatbuffert.
    2. Vortexa lösningen under 10 sek. Tillsätt sedan 15 pl av 7,5 x 10 -4 M CÖE lösning i 1,5 ml mikrocentrifugrör. Upprepa på ett liknande sätt som beskrivs i avsnitt 4.1.
  2. Framställning av 1: 1 förhållande av kvicksilver (II): CÖE lösning
    1. Placera 24081; il av 5 mM ammoniumformiat, pH 7,5-buffert i en 1,5 ml mikrocentrifugrör. Tillsätt 30 pl av 7,5 x 10 -4 M kvicksilver (II) kloridlösning i 1,5 ml mikrocentrifugrör med ammoniumformiatbuffert.
    2. Vortexa lösningen under 10 sek. Tillsätt sedan 30 pl 7,5 x 10 -4 M CÖE lösning i 1,5 ml mikrocentrifugrör. Upprepa på ett liknande sätt som beskrivs i avsnitt 4.1.
  3. Framställning av 1: 2 förhållande av kvicksilver (II): CÖE lösning
    1. Placera 210 pl av 5 mM ammoniumformiat, pH 7,5-buffert i en 1,5 ml mikrocentrifugrör. Tillsätt 30 pl av 7,5 x 10 -4 M kvicksilver (II) kloridlösning i 1,5 ml mikrocentrifugrör med ammoniumformiatbuffert.
    2. Vortexa lösningen under 10 sek. Tillsätt sedan 60 pl av 7,5 x 10 -4 M CÖE lösning i 1,5 ml mikrocentrifugrör. Upprepa på ett liknande sätt som beskrivs i avsnitt 4.1.

7. Analyzing reaktionen Blandningar av kvicksilver (II) och CGGC Prover av Orbitrap ESI-masspektrometri

  1. Förbereda ESI masspektrometer 16
    1. Rita 100 pl kalibreringsstandarder i en glasspruta 500 l.
    2. Placera sprutan i sprutan vagga MS pumpen, fästa slangen, och injicera i massan spektrofotometer.
    3. Ställ in filnamnet för körningen genom att välja filikonen och skriva filnamnet.
    4. Välj förvärva uppgifter knappen i datainsamlingsmodulen och samla 150 skanningar.
    5. Analysera kromatogrammet för att kontrollera de kalibreringsstandarder genom att öppna databehandlingsmodulen av programvaran. Öppna modulen, gå till Arkiv-menyn och välj "öppna", och markera filen i dialogrutan. Verifiera att topparna i kromatogrammet korrelerar till massa och laddning förhållanden av standarderna.
    6. Rengör glasspruta 500 pl genom att utarbeta 500 il HPLC-kvalitet metanol och sedan fördela metanol i en bägare.
    7. Upprätta 500 pl av HPLC-kvalitet metanol i sprutan glaset och spola systemet enligt steg 7.1.2.
    8. Välj metod installationsmodulen av programvaran för att ställa in parametrar. Välj skannings -lägesmenyn och identifiera analysatorn som FTMS, och klicka sedan på "OK". Sedan genom att klicka på de olika ikonerna på realtids sidvisning spektrum, ställa in följande parametrar: Mantel Gasflödet: 10, Källtemperatur: 0, kapillär spänning: 37 V, Tube lins: 95 V, Spray spänning: 4.20 kV , Flödes 10,00 ul / min, Analyzer: FTMS, Antal skanningar: 150.
  2. Köra CGGC prover på ESI masspektrometer
    1. Kör 5 mM ammoniumformiat pH 7,5 buffert.
      1. Placera 500 il 5 mM ammoniumformiatbuffert i glasspruta 500 pl, placera den i sprutan vagga MS pumpen och fäst slangen.
      2. Kör buffert genom slangen för 1-2 minuter.
      3. Ställ in filnamnet för körningengenom att välja filikonen och skriva filnamnet.
      4. Välj förvärva uppgifter knappen i modulen och samla 150 skanningar.
      5. Klicka på knappen Kör för att stoppa samling efter 150 skanningar samlas.
      6. Öppna dataläsarmodulen och sedan gå till Arkiv-menyn och välj "öppna", och markera filen i dialogrutan. Verifiera att inga toppar vid 483, 683, 1163 och 1363 m / z är närvarande som liknar peptiden eller kvicksilver (II) -peptid komplex.
    2. Kör 1: 0,5 kvicksilver (II): CGGC förhållande lösning.
      1. Placera 250 pl 1: 0,5 kvicksilver (II): CGGC förhållande av provet in i sprutan.
      2. Placera sprutan i sprutan vagga MS pumpen, fästa slangar och prime apparaten.
      3. Välj ett filnamn för körningen genom att välja filikonen och skriva filnamnet.
      4. Tryck på knappen förvärvar data i datainsamlingsmodulen och samla 150 skannar och klicka på knappen Kör för att stoppa insamlingen.
      5. Öppna modulen, gå till Arkiv-menyn och välj "öppna", och markera filen i dialogrutan. Kontrollera att kromatogrammet innehåller toppar inklusive en för CGGC peptiden ensam.
      6. Skölj sprutan genom att aspirera med 500 pl ammoniumformiatbuffert och därefter dispensera ammoniumformiatbuffert i en bägare.
      7. Välj knappen avfall på MS och spola slangen tre gånger med 500 | il ammoniumformiatbuffert.
      8. Skölj sprutan genom att aspirera med 500 | il metanol och därefter dispensering av metanol i en bägare.
      9. Spola slangen en gång med 500 l metanol.
      10. Välj belastningsdetektor knappen på MS.
      11. Tillsätt 500 pl av ammoniumformiatbuffert till sprutan.
      12. Placera sprutan i sprutan vagga MS pumpen, fästa slangar och prime apparaten.
      13. Välj ett filnamn för bufferten drivs genom att välja filikonen och skriva filnamnet.
      14. Tryckden förvärva uppgifter knappen och samla 150 skannar och klicka sedan på knappen stop körning.
      15. Öppna dataläsarmodulen, gå till Arkiv-menyn och välj "öppna", och markera filen i dialogrutan. Kontrollera att kromatogrammet är ogiltig av toppar från föregående Hg: CGGC körning.
    3. Kör 1: 1 kvicksilver (II): CGGC förhållande lösning.
      1. Placera 250 pl 1: 1 kvicksilver (II): CGGC förhållande prov i sprutan.
      2. Upprepa på ett liknande sätt som beskrivits för steg 7.2.2.2 till 7.2.2.15.
    4. Kör 1: 2 kvicksilver (II): CGGC förhållande lösning
      1. Placera 250 pl 1: 2 kvicksilver (II): CGGC provkoncentration i sprutan.
      2. Upprepa på ett liknande sätt som beskrivits för steg 7.2.2.2 till 7.2.2.15.

8. Analysera reaktions Blandningar av kvicksilver och Central- och Östeuropa Prover från Orbitrap ESI masspektrometri

  1. Köra central- och östeuropeiska länderna prov på ESI masspektrometer
    1. Upprepa proceduren analys (steg 7,1 till 7,2) med användning av CÖE prover och reaktionsblandningar av kvicksilver (II) och CÖE vid olika stökiometriska förhållanden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En studie utfördes för att karakterisera den eventuella kvicksilverpeptidkomplexet komposition för två tetrapeptider, CGGC och CÖE (figur 1) med ESI-masspektrometri. Komplex av kvicksilver (II) med CGGC eller CÖE undersöktes genom reaktion av blandningarna av kvicksilver (II) och peptidlösningar vid tre olika molförhållanden: 1: 0,5, 1: 1, och en: 2 (kvicksilver (II): peptid) . Koncentrationen av kvicksilver (II) var 7,5 x 10 -6 M och peptidkoncentrationen varierade därefter.

Figur 1
Figur 1. Dicysteinyl peptidstrukturer. Kemiska strukturer av dicysteinyl tetrapeptiderna, CGGC och Central- och Östeuropa. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

ent "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Figur 2
Figur 2. ESI MS av kvicksilver (II) och CGGC Elektrosprayjonisering Orbitrap masspektra från en lösning innehållande 7,5 x 10 -6 M Hg 2+ i ammoniumformiat-buffert, pH 7,5 innehållande varierande Hg 2+:. CGGC stökiometriska förhållanden: (A ) 1: 0,5-förhållande, (B) en: 1-förhållande, och (C) en: 2-förhållande. Inläggningar visar kvicksilverisotopmönster de angivna kvicksilver-peptidkomplex. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3. ESI MS av kvicksilver (II) och CÖE. Elektrosprayjonisering Orbitrap masspektra frånen lösning innehållande 7,5 x 10 -6 M Hg 2+ i ammoniumformiat-buffert, pH 7,5 innehållande varierande Hg 2+: CÖE stökiometriska förhållanden: (A) en: 0,5-förhållande, (B) en: 1-förhållande, och (C) en : 2-förhållande. Inläggningar visar kvicksilverisotopmönster de angivna kvicksilver-peptidkomplex. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Elektrosprayjonisering Orbitrap mass kromatogram uppsamlades för kvicksilver (II) komplex med CGGC (figur 2) och CÖE (figur 3) vid olika kvicksilver (II) till peptid stökiometriska förhållanden (1: 0,5, 1: 1, och en: 2). De observerade kvicksilver peptid komplexa typer visar distinkta kvicksilver isotop toppar (sätter in), som används för att bestämma antalet kvicksilverjoner i komplexa samt antalet Deprotonations. Till exempel visar Figur 1b infälld kvicksilverisotop signatur i peptid-kvicksilver-addukt, som motsvarar de sju huvudsakliga naturligt förekommande isotoper av kvicksilver: 196 Hg (0,146%), 198 Hg (10,02%), 199 Hg (16,84%) , 200 Hg (23,13%), 201 Hg (13,22%), 202 Hg (29,80%), 204 Hg (6,85%), med procent naturliga förekomster som anges inom parentes. De två stora isotoper 200 Hg och 202 Hg visar en tydlig relativ intensitet förhållandet 2,3: 3. Följaktligen den mest intensiva isotop toppen av denna ett-kvicksilver isotop kluster utgör den monoisotopiska massan för addukten (m / z = 539). Det korrelerar med en två-koordinat komplex, som bildas genom deprotonering av två cysteinyl tioler för bildning av [(CGGC-2H + Hg) + H] addukt. Denna analys görs på följande sätt:

m / z-värde för [(CGGC-2H + Hg) + H] * är equal till (338-2 + 202 1) = 539.

Figur 1A infällda bilden visar kvicksilverisotop signatur i peptid-kvicksilver-addukt, vilket motsvarar en två-kvicksilverkomplex som beräknats med hjälp av ChemCal programmet för [(2CGGC-4H + 2HG) + H] (figur 4). Den teoretiska protone monoisotopisk massa motsvarar ett m / z-värde av 1077.061, som är den nionde isotop topp i det beräknade isotop klustret. Figur 1A infällda bilden visar en isotopisk topp motsvarande ett m / z-värde av 1077,1, som också är den nionde topp i den observerade isotop klustret. Därför kan addukten ursprung för isotop kluster tilldelas för [(2CGGC-4H + 2HG) + H] +.

Figur 4
Figur 4. Teoretiska isotop mönster för [(2CGGC-4H + 2HG) + H] + sup>. De teoretiska isotop mönster för [(2CGGC-4H + 2HG) + H] + beräknat med hjälp av ChemCal programmet. Pil indikerar monoisotopisk topp. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 5
Figur 5. katjoniserade addukter. Vissa katjoniserade natrium- och kalium addukter i samband med kvicksilver-peptid-komplex. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 5 visar några katjoniserat natrium- och kalium addukter i samband med kvicksilver peptid komplex som bildas av CGGC. Sodiated addukter är 22 massenheter större tHan motsvarande protonekvicksilver CGGC komplex, medan kalium addukter är 38 massenheter större. Den dominanta protonerad CGGC-dimer (m / z = 677) bildar också katjoniserade arter med natrium (m / z = 699) och kaliumjoner (m / z = 715). Detta bekräftar ytterligare bildandet av CGGC dimerer utan oxidation av cysteinyl tiolgrupperna att bilda disulfider, vilket skulle ha resulterat i en minskning av två massenheter för protone eller katjoniserade addukter.

Figur 6
Figur 6. Överlappande 1 och 2 laddningstillstånd. Överlappande toppar i samband med kvicksilver peptid joner [(CÖE-4H + 2HG) + H] + i +1 och +2 laddningstillstånd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

"Bild Figur 7. Teoretiska isotop mönster för [(CÖE-4H + 2HG) + H] +. De teoretiska isotop mönster för [(CÖE-4H + 2HG) + H] + beräknat med hjälp av ChemCal programmet. Pil indikerar monoisotopisk topp. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 6 visar överlappande toppar associerade med kvicksilver CÖE addukter i en och två laddning. Det visar isotop toppar som är förknippade med kvicksilver peptid joner [(CÖE-4H + 2HG) + H] + i en laddning och en m / z-värde på 883. Detta är i överensstämmelse med två kvicksilverkomplex som beräknats för [(CÖE-4H + 2HG) + H] * med hjälp av ChemCal programmet (fig 7). Den teoretiska proton monoisotopiskmassa motsvarar ett m / z-värde av 883,032.

Den ovan observerade [(CÖE-4H + 2HG) + H] + addukt med en monoisotopisk topp på 883,03 lappar med en annan addukt innehållande motsvarande toppar som visar ytterligare 0,5 massenheter. Med extremt hög upplösning uppnås av Orbitrap massinstrument spektrometri, kan det postuleras att dessa överlappande toppar motsvarar addukter med en laddning av 2. Följaktligen monoisotopisk massa av den överlapp komplex joniseras kan beräknas på följande sätt. Figur 8 visar att m / z skillnad mellan de isotop topparna är 0,5 och massan skillnaden mellan dem är en amu. Därför är laddningstillståndet 2. För att beräkna massan av kvicksilverpeptidkomplexet, är m / z för monoisotopisk toppen multiplicerat med laddningstillstånd, och subtraheras från massan av två protoner, vilket gjorde den komplexa jonen positivt laddad.

Beräkningar för två addukten:

m / z skillnaden mellan isotop toppar är 0,5

Mass skillnaden mellan isotop toppar är en amu (1 neutron)

z = en dela-med-0,5 = 2

m / z för proton monoisotopisk topp är (883,53 x 2) - 2 = 1765,06

Ovanstående m / z-värde för den protone monoisotopisk topp, [(2CEEC-8H + 4HG) + H] +, överensstämmer med det teoretiska värde som beräknats av ChemCal programmet 1765,056 (Figur 8).

Figur 8
Figur 8. Teoretisktisotop mönster för [(2CEEC-8H + 4HG) + H] +. De teoretiska isotop mönster för [(2CEEC-8H + 4HG) + H] + beräknade med hjälp av ChemCal programmet. Pil indikerar monoisotopisk topp. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Fördelen med att analysera kvicksilverpeptidkomplex med en ESI Orbitrap masspektrometer är att ansvara för varje jon kan lätt tilldelas enligt ovan. Peptider innehållande grundläggande aminoänden kan lätt stabilisera positiva laddningar. Vid användning av elektrosprayjonisering och en högupplösande mass-analysator såsom Orbitrap, laddningstillståndet för peptidjoner med mer än en laddning kan bestämmas lättare jämfört med den lägre upplösning iontrap massanalysatorn.

(Figur 3A och figur 6), som beskrivits ovan, analyserades också genom tandem MS. Det visade inte någon MS-MS fragmentering, vilket tydde på att de erhållna signalerna tillhör den förväntade föreningen som diskuterats ovan, och inte klustrade artefakter bildas vid högre koncentrationer av kvicksilver-to-peptid förhållanden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den hydrofoba dicysteinyl tetrapeptiden CGGC (C 10 H 18 N 4 O 5 S 2; molvikt = 338) (figur 1), bildar komplex med kvicksilver (II), såsom visas i fig 2 och tabell 1 Dessutom bildar den peptid dimerer och trimerer. inkrementellt som mängden av peptid ökningar i reaktionsblandningen. Såsom visas av m / z-värden för de associerade dimerer [(2M + H) + = 677] och trimerer [(3M + H) ^ = 1015], tiolgrupperna av CGGC inte oxiderar under bildning av disulfider under försöksbetingelserna . Bildningen av dessa associerade CGGC arter skulle kunna bero på hydrofobiciteten av denna tetrapeptid. CGGC bildar två typer av komplex med kvicksilver som motsvarar 1: 1 kvicksilver (II): peptid och 1: 2 kvicksilver (II) :( peptid) 2-komplex som tidigare rapporterats för dicysteinyl tripeptider 7. Men i närvaro av överskott av eller motsvarande kvicksilver (II), det också forms en 2: 2 [kvicksilver (II)] 2: (peptid) 2-komplexet.

Den karboxylerade dicysteinyl tetrapeptiden CÖE (C 16 H 26 N 4 O 9 S 2; molvikt = 482) (Figur 1) bildar komplex med kvicksilver (II), såsom visas i Figur 3 och Tabell 1 Det inte bildade CÖE dimerer lika lätt som. att observera för de mer hydrofoba CGGC. Jämförbar med CGGC, bildar den komplex med kvicksilver motsvarar en: ett kvicksilver (II): peptid och en: 2 kvicksilver (II) :( peptid) 2-komplex. Men med hjälp karboxylatgrupper, bildar den den 2: 2 [kvicksilver (II)] 2: (peptid) 2-komplexet lättare. Dessutom i överskott kvicksilver, bildar den den 2: 1 [kvicksilver (II)] 2: peptidkomplex och 4: 2 [kvicksilver (II)] 4: (peptid) 2 peptidkomplex, vilket inte observerades för CGGC.

Sammanfattningen av de observerade signalerna för komplexen fOrmed som m / z-värden visas i tabell 1.

Bord 1

Tabell 1. Sammanfattning av kvicksilverpeptidkomplex signaler. Kvicksilver-peptidkomplex signalerna i LTQ / Orbitrap MS kromatogram i ammoniumformiat-buffert, pH 7,5.

Vi har visat att reaktionen av kvicksilver (II) och två dicysteinyl tetrapeptider bildar komplex som är beroende av de inledande förhållandena av kvicksilver (II): peptid liksom närvaron av hjälpbindningsgrupper i dicysteinyl tetrapeptiden. Dessutom kan korrekt stökiometri av kvicksilver och peptid i komplexen bildas under specificerade elektrosprayjonisering villkor bestämmas genom att använda hög upplösning ESI masspektrometri baserad på tydliga kvicksilver isotopfördelningsmönster.

Vid omsättning av cysteinyl Peptides med kvicksilver (II), skall försiktighetsåtgärder vidtas för att förhindra oxidation av cysteinyl tiolgrupper att bilda disulfidbindningar. Inom den beskrivna protokollet, var buffertlösningar noggrant avgasades och förvarades under argon. Dessutom är alla reaktionsprover framställes omedelbart före analys med ESI-masspektrometri.

På grund av skillnader i löslighet mellan de två tetrapeptiderna, Central- och Östeuropa och CGGC ades olika koncentrationer användes för att framställa stamlösningar. Frys lager av CGGC peptid vättes med acetonitril och kunde enkelt upplöst följt av 5 mM ammoniumformiat-buffert, pH 7,5 för att framställa en 7,5 x 10 -4 M CGGC lösning. Central- och Östeuropa framställdes vid en lägre koncentration, 7,5 x 10 -5 M, före kvicksilver (II): peptidreaktionsblandningen steg på grund av dess lägre löslighet. Den optimala utspädningen för analys av kvicksilver (II) komplexen ansågs vara 10 -5 M på grund av lösligheten hos peptiden och för att medgeför att avlägsna rester i masspektrometer. I avtalet till de CGGC lösningar, central- och östeuropeiska rester följer slangen, vilket kräver enstaka slangar ersättning.

Betydelsen av att använda ESI masspektrometri för analys av kvicksilver peptidkomplexen ligger i dess mjuka jonisering av analyter. Detta underlättar analysen av molekylära joner med försumbar fragmentering. Som visas i detta arbete, kan den användas för att karakterisera stoichiometries av kvicksilver-peptidkomplex baserade på signaturkvicksilverisotopfördelningsmönster. Emellertid är nödvändig för analys med ESI-masspektrometri en flyktig buffertsystem. Detta kan begränsa dess praktiska användning för att identifiera analyter som kräver mindre flyktiga lösningsmedel eller buffertmedier för upplösning.

Som vi tidigare har nämnt 7,8 ger ESI masspektrometri ett känsligt analytiskt verktyg för en noggrann bestämning av stökiometrin av kvicksilver och Peptide i kvicksilver peptidkomplexen inom den angivna elektrosprayjonisering skick. Det är dock nödvändigt att använda ytterligare metoder (till exempel, 1H, 13C, 199 Hg NMR-spektroskopi, förlängt röntgenabsorption fin struktur, eller potentiometri 17-18) för att ge en mer noggrann bestämning av halten av komplex i lösning.

Vi har visat att ESI med en Orbitrap massanalysator kan användas för att analysera kvicksilverpeptidkomplex. Vi förväntar oss att denna teknik kan tillämpas mot analys av andra metalljoner och deras komplex med olika små föreningar. Det kommer att vara särskilt användbart för att analysera komplex bildade av andra metalljoner som kan finnas i olika isotopiska former.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

MN-S erkänner stöd från National Science Foundation, RUI bevilja CHE 1011859. Författarna erkänner tacksamt Triad masspektrometri Facility vid University of North Carolina i Greensboro för användning av Thermo Fisher Scientific LTQ Orbitrap XL masspektrometer. Författarna tackar Daniel Todd, Vincent Sica och Brandie Erhmann vid University of North Carolina i Greensboro för användbara förslag och kommentarer om detta arbete.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mercury(II) chloride Sigma-Aldrich 429724 Highly toxic
Ammonium formate Sigma-Aldrich 516961
Formic acid Sigma-Aldrich F0507
Ammonium hydroxide Fisher A512-P500
HPLC water Fisher W5-4
HPLC Acetonitrile Fisher BP2405-1
HPLC Methanol Fisher A452-4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Clifton, J. C. Mercury exposure and public health. Pediatr. Clin. N. Am. 54, 237-269 (2007).
  2. Andersen, O. Principles and Recent Developments in Chelation Treatment of Metal Intoxication. Chem. Rev. 99, 2683-2710 (1999).
  3. Aposhian, H. V., Maiorino, R. M., Gonzalez-Ramirez, D., Zuniga-Charles, M., Xu, Z., Hurlbut, J. M., Junco-Munoz, P., Dart, R. C., Aposhian, M. M. Mobilization of heavy metals by newer, therapeutically useful chelating agents. Toxicology. 97, 23-38 (1995).
  4. Flora, S. J. S., Pachauri, V. Chelation in Metal Intoxication. Int. J. Environ. Res. Public Health. 7, 2745-2788 (2010).
  5. Campbell, J. R., Clarkson, T. W., Omar, M. D. The therapeutic use of 2,3-dimercaptopropane-1-sulfonate in two cases of inorganic mercury poisoning. JAMA. 256, 3127-3130 (1986).
  6. Rooney, J. P. K. The role of thiols, dithiols, nutritional factors and interacting ligands in the toxicology of mercury. Toxicology. 234, 145-156 (2007).
  7. Lin, X., Brooks, J., Bronson, M., Ngu-Schwemlein, M. Evalution of the association of mercury (II) with some dicysteinyl tripeptides. Bioorg. Chem. 44, 8-18 (2012).
  8. Ngu-Schwemlein, M., Lin, X., Rudd, B., Bronson, M. Synthesis and ESI mass spectrometric analysis of the association of mercury(II) with multi-cysteinyl peptides. J. Inorg. Biochem. 133, 8-23 (2014).
  9. Winther, J. R., Thorpe, C. Quantification of thiols and disulfides. Biochimica et. Biophysica Acta. 1840, 838-846 (2014).
  10. D'Agstino, A., Colton, R., Traeger, J. C., Cantry, A. J. An Electrospray Mass Spectrometric Study of Organomercury (II) and Mercuric Interactions with Peptides Involving Cysteinyl Ligands. Eur. Mass Spectrom. , 273-285 (1990).
  11. Hofstadler, S. A., Sannes-Lowery, K. A. Applications of ESI-MS in drug discovery: interrogation of noncovalent complexes. Nature Reviews Drug Discovery. 5, 585-595 (2006).
  12. Rubino, F. M., Verduci, C., Giampiccolo, R., Pulvirenti, S., Brambilla, G., Columbi, A. Molecular Characterization of Homo- and Heterodimeric Mercury (II)-bis-thiolates of Some Biologically Relevant Thiols by Electrospray Ionization and Triple Quadruple Tandem Mass Spectrometry. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 15, 288-300 (2003).
  13. Krupp, E. M., Milne, B. F., Mestrot, A., Meharg, A. A., Feldmann, J. Investigation into mercury bound to biothiols: structural identification using ESI-ion-trap MS and introduction of a method for their HPLC separation with simultaneous detection by ICP-MS and and ESI-MS. Anal. Bioanal. Chem. 390, 1753-1764 (2008).
  14. Schaumlöffel, D., Tholey, A. Recent directions of electrospray mass spectrometry for elemental speciation analysis. Anal. Bioanal. Chem. 400, 1645-1652 (2011).
  15. Patiny, L., Borel, A. ChemCalc: a building block for tomorrow's chemical infrastructure. J. Chem. Inf. Model. 53, 1223-1228 (2013).
  16. Thermo Scientific. Xcaibur Versions 2.1.0-2.3.0 Data Acquisition and Processing User Guide. Revision E. United States. , Thermo Fisher Scientific Inc. (2012).
  17. Falcone, G., Foti, C., Gianguzza, A., Giuffrè, O., Napoli, A., Pettignano, A., Piazzese, D. Sequestering ability of some chelating agents towards methylmercury(II). Anal. Bioanal. Chem. 405 (2), 881-893 (2013).
  18. Mah, V., Jalilehvand, F. Glutathione Complex Formation with Mercury(II) in Aqueous Solution at Physiological pH. Chem. Res. Toxicol. 23, 1815-1823 (2010).

Tags

Kemi Mercury-peptidkomplex kvicksilver isotop toppar masspektrometri ESI MS cysteinyl-peptider
En studie av komplex Merkurius (II) med Dicysteinyl Tetrapeptider från elektrosprayjonisering masspektrometri
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mazlo, J., Ngu-Schwemlein, M. A… More

Mazlo, J., Ngu-Schwemlein, M. A Study of the Complexation of Mercury(II) with Dicysteinyl Tetrapeptides by Electrospray Ionization Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (107), e53536, doi:10.3791/53536 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter