Protocol
Nota: Si prega di consultare tutte le schede di sicurezza pertinenti (MSDS) prima dell'uso. Cloruro di mercurio è una sostanza chimica tossica. Dispositivi di protezione individuale (guanti, occhiali di sicurezza, e camice) devono essere indossati al momento della consegna e tutte le soluzioni collegate. Smaltire le soluzioni in bottiglie rifiuti chimici chiaramente etichettati designate per i metalli pesanti.
1. Preparazione di 5 mm degassificato ammonio formiato tampone, pH 7,5
- Sciogliere 0,1576 g di buffer di formiato di ammonio in 450 ml di acqua per HPLC. Regolare il pH della soluzione sopra con 1 M di acido formico e 1 M di idrossido di ammonio a 7,5. Trasferire questa soluzione in un matraccio tarato da 500 ml e aggiungere acqua HPLC per la retta di calibrazione per ottenere una soluzione di ammonio formiato 5 mM.
- Degassare il 5 mM tampone formiato di ammonio sotto un sistema di aspirazione per 10 minuti e spurgo con argon. Ripetere due volte e la soluzione di negozio sotto argon. Il giorno di utilizzo, filtrare la soluzione tampone attraverso un filtro da 0,2 micron before l'uso.
2. Preparazione di mercurio (II) Chloride Soluzioni
- Pesare 0,2375 g di mercurio (II) cloruro. Sciogliere in 25 ml di 5 mM tampone formiato di ammonio per produrre una soluzione di cloruro di 0,035 M di mercurio (II).
- Aggiungere 0,214 ml di soluzione 0,035 M di mercurio (II) cloruro di 9.785 ml di 5 mM tampone formiato di ammonio per creare una soluzione 7,5 x 10 -4 M. Ricoprire la soluzione con gas argon 7.5 x 10 -4 M mercurio (II).
3. Preparazione del CGGC Stock Solution
- Sciogliere 2,0 mg di tetrapeptide dicysteinyl, CGGC, in 0,118 ml di acetonitrile grado HPLC e quindi aggiungere 1,0647 ml di 5 formiato di ammonio mM, pH 7,5 tampone che è stato degasata in argon per ottenere una soluzione madre 5 CGGC mm.
- Aggiungere 225 ml di soluzione madre 5 CGGC mM a 1.275 ml di 5 mM formazione ammonio pH 7,5 tampone per dare una soluzione 7,5 x 10 -4 M CGGC.
4. Preparazionedi varie miscele di reazione di mercurio (II) e CGGC
- Preparazione 1: 0,5 rapporto di mercurio (II): soluzione CGGC
- Mettere 255 ml di formiato di ammonio 5 mM, pH 7,5 tampone in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. Aggiungere 30 ml di soluzione di mercurio (II) cloruro 7,5 x10 -4 M nel tubo 1,5 ml microcentrifuga con il buffer formiato di ammonio.
- Vortex la soluzione per 10 secondi. Quindi aggiungere 15 ml di 7,5 x 10 -4 soluzione M CGGC nella microcentrifuga 1,5 ml. Vortex la soluzione per 10 secondi. Lasciare riposare la soluzione per 10 minuti prima dell'iniezione nello spettrometro di massa.
- Preparazione di rapporto 1: 1 di mercurio (II): soluzione CGGC
- Mettere 240 ml di formiato di ammonio 5 mM, pH 7,5 tampone in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. Aggiungere 30 ml di soluzione di mercurio (II) cloruro 7,5 x10 -4 M nel tubo 1,5 ml microcentrifuga con il buffer formiato di ammonio.
- Vortex la soluzione per 10 secondi. Poiaggiungere 30 ml di 7,5 x 10 -4 soluzione M CGGC nel tubo 1,5 ml microcentrifuga. Ripetere in un modo simile come descritto nella sezione 4.1.
- Preparazione di rapporto 1: 2 di mercurio (II): soluzione CGGC
- Mettere 210 ml di formiato di ammonio 5 mM, pH 7,5 tampone in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. Aggiungere 30 ml di soluzione di mercurio (II) cloruro 7,5 x10 -4 M nel tubo 1,5 ml microcentrifuga con il buffer formiato di ammonio.
- Vortex la soluzione per 10 secondi. Quindi aggiungere 60 ml di 7,5 x 10 -4 soluzione M CGGC nel tubo 1,5 ml microcentrifuga. Ripetere in un modo simile come descritto nella sezione 4.1.
5. Preparazione di PECO Stock Solution
- Sciogliere 3,5 mg di tetrapeptide dicysteinyl, PECO, in 0,145 ml di acetonitrile grado HPLC per sciogliere il peptide. Poi aggiungere 13.067 ml di 5 mM formiato di ammonio, pH 7,5 tampone che è stata degasata in argon per produrre 0,5 mSoluzione M PECO.
- Agitare la soluzione fino a quando tutti peptide è disciolto. Aggiungere 1,125 ml di soluzione 0,5 mM PECO e 0,375 ml di 5 mM formiato di ammonio, pH 7,5 tampone in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml per ottenere una soluzione 7,5 x 10 -5 M PECO. Vortex fino misti.
6. Preparazione di varie miscele di reazione di mercurio (II) e soluzione PECO
- Preparazione 1: 0,5 rapporto di mercurio (II): soluzione PECO
- Mettere 255 ml di formiato di ammonio 5 mM, pH 7,5 tampone in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. Aggiungere 30 ml di soluzione di mercurio (II) cloruro 7,5 x10 -4 M nel tubo 1,5 ml microcentrifuga con il buffer formiato di ammonio.
- Vortex la soluzione per 10 secondi. Quindi aggiungere 15 ml di 7,5 x 10 -4 soluzione M PECO nel tubo 1,5 ml microcentrifuga. Ripetere in un modo simile come descritto nella sezione 4.1.
- Preparazione di rapporto 1: 1 di mercurio (II): soluzione PECO
- Mettere 24081; l di formiato di ammonio 5 mM, pH 7,5 tampone in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. Aggiungere 30 ml di soluzione di mercurio (II) cloruro 7,5 x10 -4 M nel tubo 1,5 ml microcentrifuga con il buffer formiato di ammonio.
- Vortex la soluzione per 10 secondi. Quindi aggiungere 30 ml di 7,5 x 10 -4 soluzione M PECO nel tubo 1,5 ml microcentrifuga. Ripetere in un modo simile come descritto nella sezione 4.1.
- Preparazione di rapporto 1: 2 di mercurio (II): soluzione PECO
- Mettere 210 ml di formiato di ammonio 5 mM, pH 7,5 tampone in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. Aggiungere 30 ml di soluzione di mercurio (II) cloruro 7,5 x10 -4 M nel tubo 1,5 ml microcentrifuga con il buffer formiato di ammonio.
- Vortex la soluzione per 10 secondi. Quindi aggiungere 60 ml di 7,5 x 10 -4 soluzione M PECO nel tubo 1,5 ml microcentrifuga. Ripetere in un modo simile come descritto nella sezione 4.1.
7. Analyzing le miscele di reazione di Mercurio (II) e CGGC campioni da Orbitrap ESI Spettrometria di Massa
- Preparazione del spettrometro di massa ESI 16
- Disegnare 100 ml di standard di calibrazione in una siringa di vetro da 500 ml.
- Posizionare la siringa nella culla della siringa della pompa MS, collegare il tubo, e iniettare lo spettrofotometro di massa.
- Impostare il nome del file per la corsa selezionando l'icona del file e digitando il nome del file.
- Selezionare il pulsante dei dati acquisiscono, nel modulo di acquisizione dati e raccogliere 150 scansioni.
- Analizzare il cromatogramma per verificare gli standard di calibrazione aprendo modulo di elaborazione di dati del software. Aprire il modulo, andare al menu File e selezionare "aperto", e selezionare il file nella finestra di dialogo. Verificare che i picchi nel cromatogramma sono correlati alla massa di addebitare i rapporti degli standard.
- Pulire la siringa di vetro da 500 ml, elaborando 500 microlitri HPLC metanolo e poi dispensare il metanolo in un becher.
- Elaborare 500 ml di metanolo per HPLC nella siringa di vetro e lavare il sistema di cui al punto 7.1.2.
- Selezionare il modulo di impostazione metodo di software per impostare i parametri. Scegliere il menu della modalità di scansione e identificare l'analizzatore come FTMS, e quindi fare clic su "OK". Poi cliccando sulle varie icone nella pagina vista spettro in tempo reale, impostare i seguenti parametri: Guaina portata del gas: 10, temperatura Fonte: 0, tensione capillare: 37 V, lente del tubo: 95 V, tensione Spray: 4.20 kV , Portata 10.00 ml / min, Analyzer: FTMS, Numero di scansioni: 150.
- Esecuzione di campioni CGGC su ESI spettrometro di massa
- Eseguire il formiato di ammonio pH 7,5 tampone 5 mm.
- Mettere 500 ml di 5 mM tampone formiato di ammonio nella siringa di vetro da 500 ml, metterlo nella culla della siringa della pompa MS, e collegare il tubo.
- Eseguire tampone attraverso il tubo per 1-2 min.
- Impostare il nome del file per la corsaselezionando l'icona del file e digitando il nome del file.
- Selezionare il pulsante dei dati acquisiscono nel modulo e raccogliere 150 scansioni.
- Fare clic sul pulsante di esecuzione per interrompere la raccolta dopo 150 scansioni vengono raccolti.
- Aprire il modulo del browser di dati, quindi andare al menu File e selezionare "aperto", e selezionare il file nella finestra di dialogo. Verificare che non picchi a 483, 683, 1.163 e 1.363 m / z sono presenti che assomigliano il peptide o il mercurio (II) -peptide.
- Eseguire il 1: 0,5 mercurio (II): soluzione rapporto CGGC.
- Mettere 250 ml di 1: 0,5 mercurio (II): rapporto CGGC del campione nella siringa.
- Posizionare la siringa nella culla della siringa della pompa MS, collegare il tubo, e il primo l'apparato.
- Selezionare un nome di file per la corsa selezionando l'icona del file e digitando il nome del file.
- Premere il pulsante di dati acquisiscono, nel modulo di acquisizione dati e di raccogliere 150 scansioni e fare clic sul pulsante di esecuzione per fermare la raccolta.
- Aprire il modulo, andare al menu File e selezionare "aperto", e selezionare il file nella finestra di dialogo. Verificare che il cromatogramma contiene picchi compreso quello per il peptide CGGC sola.
- Lavare la siringa aspirando con 500 microlitri di buffer formiato di ammonio e quindi l'erogazione del buffer formiato di ammonio in un becher.
- Selezionare il pulsante rifiuti MS e lavare la tubazione tre volte con 500 microlitri di buffer formiato di ammonio.
- Lavare la siringa aspirando con 500 microlitri di metanolo e quindi l'erogazione del metanolo in un becher.
- Lavare l'unica volta tubazione da 500 microlitri metanolo.
- Selezionare il pulsante rilevatore carico sui SM.
- Aggiungere 500 microlitri di tampone formiato di ammonio alla siringa.
- Posizionare la siringa nella culla della siringa della pompa MS, collegare il tubo, e il primo l'apparato.
- Selezionare un nome di file per il buffer gestito selezionando l'icona del file e digitando il nome del file.
- stampail pulsante di dati acquisire e raccogliere 150 scansioni e quindi fare clic sul pulsante di esecuzione di arresto.
- Aprire il modulo del browser di dati, andare al menu File e selezionare "aperto", e selezionare il file nella finestra di dialogo. Verificare che il cromatogramma è privo di picchi del precedente Hg: corsa CGGC.
- Eseguire il 1: 1 di mercurio (II): soluzione rapporto CGGC.
- Mettere 250 ml di 1: 1 di mercurio (II): rapporto CGGC campione nella siringa.
- Ripetere in un modo simile a quello descritto per passaggi 7.2.2.2 a 7.2.2.15.
- Eseguire il 1: 2 di mercurio (II): Soluzione rapporto CGGC
- Mettere 250 ml di 1: 2 di mercurio (II): CGGC campione concentrazione nella siringa.
- Ripetere in un modo simile a quello descritto per passaggi 7.2.2.2 a 7.2.2.15.
- Eseguire il formiato di ammonio pH 7,5 tampone 5 mm.
8. Analizzando le miscele di reazione di Mercurio e Campioni PECO di Orbitrap ESI Spettrometria di Massa
- Esecuzione di campioni PECO su ESI spettrometro di massa
- Ripetere la procedura di analisi (passaggi 7,1-7,2) utilizzando campioni PECO e miscele di reazione di mercurio (II) e PECO a vari rapporti stechiometrici.
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Representative Results
Uno studio è stato effettuato per caratterizzare l'eventuale mercurio peptide complessa composizione per due tetrapeptidi, CGGC e PECO (Figura 1) mediante spettrometria di massa ESI. Complessi di mercurio (II) con CGGC o PECO sono stati studiati facendo reagire le miscele di mercurio (II) e soluzioni di peptidi a tre differenti rapporti molari: 1: 0.5, 1: 1 e 1: 2 (mercurio (II): peptide) . La concentrazione di mercurio (II) era 7,5 x 10 -6 M e la concentrazione del peptide varia di conseguenza.
Figura 1. strutture peptidiche. Dicysteinyl strutture chimiche delle tetrapeptidi dicysteinyl, CGGC e PECO. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. ESI MS di mercurio (II) e CGGC ionizzazione elettrospray Orbitrap massa spettri da una soluzione contenente 7,5 x 10 -6 M Hg 2+ in tampone formiato di ammonio, pH 7.5 contenente diversi Hg 2+:. Rapporti stechiometrici CGGC: (A ) 1: 0,5 rapporto, (B) 1: 1, e (C) rapporto 1: 2. Riquadri mostrano i modelli isotopiche mercurio dei complessi peptide mercurio indicate. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. ESI MS di mercurio (II) e PECO. Elettrospray ionizzazione Orbitrap spettri di massa dauna soluzione contenente 7,5 x 10 -6 M Hg 2+ in tampone formiato di ammonio, pH 7.5 contenente diversi Hg 2+: rapporti stechiometrici PECO: (A) 1: 0,5 rapporto, (B) 1: 1, e (C) 1 : 2 Rapporto. Riquadri mostrano i modelli isotopiche mercurio dei complessi peptide mercurio indicate. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Elettrospray cromatogrammi di massa a ionizzazione Orbitrap stati raccolti per mercurio (II) complessazione con CGGC (Figura 2) e PECO (Figura 3) a vari mercurio (II) per peptide rapporti stechiometrici (1: 0.5, 1: 1, e 1: 2). I tipi complessi mercurio-peptide osservati mostrano distinti picchi isotopici mercurio (inserti), che vengono utilizzati per determinare il numero di ioni di mercurio nel complesso così come il numero di Deprotonations. Ad esempio, la Figura 1b inserto mostra la firma isotopica mercurio nel addotto peptide mercurio, che corrisponde ai sette principali isotopi presenti in natura di mercurio: 196 Hg (0,146%), 198 Hg (10,02%), 199 Hg (16.84%) , 200 Hg (23.13%), 201 Hg (13,22%), 202 Hg (29.80%), 204 Hg (6,85%), con percentuali abbondanze naturali indicate tra parentesi. I due principali isotopi 200 e 202 Hg Hg mostrano una distinta rapporto di intensità relativa di 2.3: 3. Pertanto il picco più intenso isotopica di questo isotopo grappolo uno mercurio costituisce la massa monoisotopica per l'addotto (m / z = 539). Si correla con due coordinate complessa, che è formata dalla deprotonazione di due tioli cisteinil per formare il [(CGGC-2H + Hg) + H] + addotto. Tale analisi viene effettuata come segue:
valore m / z per [(CGGC-2H + Hg) + H] + è equal di (338-2 + 202 + 1) = 539.
Figura 1A inserto mostra mercurio firma isotopica nel addotto peptide-mercurio, che corrisponde ad un complesso di due mercurio calcolato utilizzando il programma per ChemCal [(2CGGC-4H + 2HG) + H] + (Figura 4). La massa teorica protonata monoisotopico corrisponde ad un valore m / z di 1.077,061, che è il nono picco isotopica del cluster isotopica calcolato. Figura 1A inserto mostra un picco isotopica corrispondente ad un valore di m / z di 1077,1, che è anche il nono picco nel cluster isotopica osservata. Pertanto, l'addotto origine per questo cluster isotopica può essere assegnato per [(2CGGC-4H + 2HG) + H] +.
Figura 4. modelli isotopici teoriche per [(2CGGC-4H + 2HG) + H] + sup>. I modelli teorici isotopici per [(2CGGC-4H + 2HG) + H] + calcolato utilizzando il programma ChemCal. La freccia indica picco monoisotopico. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5. addotti cationizzata. Alcuni addotti sodio e potassio cationizzati associati ai complessi mercurio-peptide. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5 mostra alcune sodio e potassio addotti cationizzato associati ai complessi mercurio-peptide formate da CGGC. Addotti Sodiated sono 22 unità di massa più grande than la corrispondente protonati complessi mercurio-CGGC, mentre le addotti potassio sono 38 unità di massa più grandi. Il dimero protonated CGGC dominante (m / z = 677) costituisce anche specie cationizzati con sodio (m / z = 699) e ioni potassio (m / z = 715). Questo conferma ulteriormente la formazione di dimeri CGGC senza l'ossidazione dei gruppi tiolici cisteinil per formare disolfuri, che avrebbe comportato una riduzione di due unità di massa per addotti protonati o cationizzati.
Figura 6. Sovrapposizione +1 e +2 carica Stati. Picchi che si sovrappongono associate a ioni di mercurio-peptide [(PECO-4H + 2HG) + H] + nelle +1 e +2 stati di carica. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 7. modelli isotopici teoriche per [(PECO-4H + 2HG) + H] +. I modelli teorici isotopici per [(PECO-4H + 2HG) + H] + come calcolati utilizzando il programma ChemCal. La freccia indica picco monoisotopico. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
La figura 6 mostra picchi associati con addotti mercurio PECO in carica +1 e +2 sovrapposti. Esso mostra picchi isotopici che sono associati con ioni di mercurio-peptide [(PECO-4H + 2HG) + H] + nella carica +1 e un valore m / z 883. Questo è in accordo con un complesso di due mercurio calcolato per [(PECO-4H + 2HG) + H] + utilizzando il programma ChemCal (Figura 7). Il monoisotopico teorica protonatomassa corrisponde ad un valore di m / z di 883,032.
Quanto sopra osservato [(PECO-4H + 2HG) + H] + addotto con un picco di 883,03 monoisotopico sovrappone con un altro addotto contenente corrispondenti picchi che mostrano un ulteriore 0,5 unità di massa. Con l'elevatissima risoluzione ottenuta dallo strumento spettrometria di massa Orbitrap, si può ipotizzare che questi picchi sovrapposti corrispondono ad addotti con una carica di +2. Di conseguenza, la massa monoisotopica della sovrapposizione complesso essere ionizzato può essere calcolata come segue. La Figura 8 mostra che la differenza m / z tra i picchi isotopici è 0,5 e la differenza di massa tra loro è 1 amu. Pertanto, lo stato di carica è +2. Per calcolare la massa del complesso mercurio peptide, la m / z per il picco monoisotopico viene moltiplicato per lo stato di carica, e sottratto dalla massa dei due protoni, che ha reso il complesso ione positivo.
I calcoli per il 2 addotto:
differenza m / z tra i picchi isotopici è 0.5
Differenza di massa tra i picchi isotopici è 1 uma (1 neutrone)
z = 1 dividere per 0,5 = 2
m / z per il picco monoisotopico protonato è (883,53 x 2) - 2 = 1.765,06
Il valore m / z sopra per il picco monoisotopico protonata, [(2CEEC-8H + 4HG) + H] +, è coerente con il valore teorico calcolato dal programma ChemCal come 1.765,056 (Figura 8).
Figura 8. Teoricamodelli isotopiche per [(2CEEC-8H + 4HG) + H] +. I modelli teorici isotopici per [(2CEEC-8H + 4HG) + H] +, calcolata utilizzando il programma ChemCal. La freccia indica picco monoisotopico. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Il vantaggio di analizzare complessi mercurio-peptide con un ESI Orbitrap spettrometro di massa è che la carica di ogni ione può essere facilmente assegnato come mostrato sopra. Peptidi contenenti base amino-terminale possono facilmente stabilizzare cariche positive. Quando si utilizza la ionizzazione elettrospray e un analizzatore di massa ad alta risoluzione come il Orbitrap, lo stato di carica degli ioni peptidici con più del 1 carica può essere determinata più facilmente rispetto alla risoluzione inferiore iontrap analizzatore di massa.
(Figura 3A e figura 6), come descritto sopra, sono stati analizzati mediante tandem MS. Esso non ha mostrato alcuna frammentazione MS-MS, che indicano che i segnali ottenuti appartenenti al composto atteso come discusso sopra, e non sono raggruppati artefatti formate a concentrazioni più elevate di rapporti mercurio-to-peptide.
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Discussion
Il dicysteinyl tetrapeptide idrofoba CGGC (C 10 H 18 N 4 O 5 S 2; PM = 338) (Figura 1), forma complessi con mercurio (II) come mostrato in Figura 2 e Tabella 1 Inoltre, forma dimeri peptidici e trimeri. incrementale come aumenta la quantità di peptide nella miscela di reazione. Come mostrato dai valori m / z dei dimeri associati [(2M + H) + = 677] e trimeri [(3M + H) + = 1.015], i gruppi tiolici di CGGC ha si ossida a formare disolfuri nelle condizioni sperimentali . La formazione di queste specie CGGC associati potrebbe essere dovuto alla idrofobicità del tetrapeptide. CGGC forma due tipi di complessi con mercurio corrispondenti a 1: 1 di mercurio (II): peptide e 1: 2 di mercurio (II) :( peptide) 2 complessi come precedentemente riportato per tripeptide dicysteinyl 7. Tuttavia, in presenza di un eccesso di mercurio o equivalente (II), ma anche forms 2: 2 [mercurio (II)] 2: (peptide) 2 complesso.
Il dicysteinyl tetrapeptide carbossilato PECO (C 16 H 26 N 4 O 9 S 2; PM = 482) (Figura 1) formano complessi con mercurio (II) come mostrato nella figura 3 e nella tabella 1 Non ha formare dimeri PECO prontamente come. che osservare per i più idrofobico CGGC. Paragonabile a CGGC, forma complessi con mercurio corrispondente a 1: 1 di mercurio (II): peptide e 1: 2 di mercurio (II) :( peptide) 2 complessi. Tuttavia, con i gruppi carbossilato ausiliari, forma il 2: 2 [mercurio (II)] 2: (peptide) complesso 2 più facilmente. Inoltre, in eccesso di mercurio, forma il 2: 1 [mercurio (II)] 2: peptide complesso e il 4: 2 [mercurio (II)] 4: (peptide) 2 complesso peptide, che non sono stati osservati per CGGC.
La sintesi dei segnali osservati per i complessi fORMED come valori m / z sono riportati in Tabella 1.
Tabella 1. Sintesi di complessi segnali di mercurio-peptide. Mercurio-peptide segnali complessi nei cromatogrammi LTQ / Orbitrap MS in tampone formiato di ammonio, pH 7.5.
Abbiamo dimostrato che la reazione di mercurio (II) e due tetrapeptidi dicysteinyl formano complessi che dipendono dai rapporti iniziali di mercurio (II): peptide, nonché la presenza di gruppi di legame ausiliari nel tetrapeptide dicysteinyl. Inoltre, stechiometria accurata di mercurio e peptide nei complessi in caso d'Elettrospray specificato può essere determinato utilizzando alta risoluzione ESI spettrometria di massa sulla base di mercurio distinte distribuzioni isotopica.
Nel reagire cisteinil PEPTidi con mercurio (II), le precauzioni devono essere prese per prevenire l'ossidazione dei gruppi cisteinil tiolici per formare legami disolfuro. All'interno del protocollo descritto, le soluzioni tampone sono stati accuratamente degasata e conservati sotto argon. Inoltre, tutti i campioni di reazione vengono preparate immediatamente prima dell'analisi mediante spettrometria di massa ESI.
A causa delle differenze nei solubilità tra i due tetrapeptidi, PECO e CGGC, diverse concentrazioni sono stati utilizzati per preparare le soluzioni madre. Il congelatore magazzino di CGGC peptide viene bagnata con acetonitrile ed è stato dissolto facilmente seguita da 5 mM tampone formiato di ammonio, pH 7,5 per produrre una soluzione 7,5 x 10 -4 M CGGC. Il PECO è stata preparata ad una concentrazione inferiore, 7,5 x 10 -5 M, prima del mercurio (II): peptide passi miscela di reazione a causa della sua solubilità inferiore. La diluizione ottimale per l'analisi del mercurio (II) è stato ritenuto 10 -5 M a causa della solubilità del peptide e consentireper la rimozione di residui nello spettrometro di massa. Nel contratto per le soluzioni CGGC, residui PECO aderiscono al tubo, che richiede la sostituzione tubo occasionale.
L'importanza di usare spettrometria di massa ESI per l'analisi di complessi mercurio-peptide risiede nella sua morbida ionizzazione degli analiti. Questo facilita l'analisi di ioni molecolari con frammentazione trascurabili. Come mostrato in questo lavoro, può essere utilizzato per caratterizzare le stechiometrie di complessi mercurio-peptide basata sulla firma mercurio modelli di distribuzione isotopica. Tuttavia, un sistema tampone volatile è necessario per l'analisi mediante spettrometria di massa ESI. Ciò può limitare il suo uso pratico per identificare analiti che richiedono solventi meno volatili o supporti di buffer di scioglimento.
Come abbiamo accennato in precedenza 7,8, spettrometria di massa ESI fornisce uno strumento analitico sensibile per una determinazione accurata della stechiometria di mercurio e PEPTide nei complessi mercurio-peptide sotto la condizione Elettrospray specificato. Tuttavia, è necessario usare metodi aggiuntivi (ad esempio, 1 H, 13 C, spettroscopia NMR 199 Hg, esteso a raggi X struttura fine di assorbimento, o potenziometria 17-18) per fornire una determinazione più accurata del contenuto di complessi in soluzione.
Abbiamo dimostrato che ESI con un analizzatore di massa Orbitrap può essere utilizzato per analizzare i complessi mercurio-peptide. Ci aspettiamo che questa tecnica può essere applicata verso l'analisi di altri ioni metallici e loro complessi con varie piccole composti. Sarà particolarmente utile per analizzare complessi formati da altri ioni metallici che possono esistere in varie forme isotopiche.
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Acknowledgments
MN-S riconosce il sostegno della National Science Foundation, RUI concedere CHE 1011859. Gli autori ringraziano lo strumento Triade Spettrometria di Massa presso la University of North Carolina a Greensboro per l'uso del spettrometro di massa Thermo Fisher Scientific LTQ Orbitrap XL. Gli autori ringraziano Daniel Todd, Vincenzo Sica, e Brandie Erhmann presso la University of North Carolina a Greensboro per utili suggerimenti e commenti questo lavoro.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mercury(II) chloride | Sigma-Aldrich | 429724 | Highly toxic |
| Ammonium formate | Sigma-Aldrich | 516961 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich | F0507 | |
| Ammonium hydroxide | Fisher | A512-P500 | |
| HPLC water | Fisher | W5-4 | |
| HPLC Acetonitrile | Fisher | BP2405-1 | |
| HPLC Methanol | Fisher | A452-4 |
References
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