Introduction
Transkriptionelle regulatoriske elementer er afgørende for spatio-temporale finjustering af genekspression under udvikling 1 og modifikation af disse elementer kan resultere i sygdom på grund af afvigende genekspression 2. Mange sygdom-associerede områder identificeret ved genom bred forening undersøgelser er i ikke-kodende områder og har træk af transkriptionelle forstærkere 3-4. Identificering enhancere og matche dem med de gener, de regulerer er kompliceret, da de ofte er placeret adskillige kilobaser væk fra generne, de regulerer og kan aktiveres i en vævsspecifik måde 5-6. Enhancer forudsigelser er almindeligt baseret på histon modifikation mærker, mediator-cohesin komplekser og binding af celletype-specifikke transkriptionsfaktorer 7-10. Validering af forudsagte enhancere er oftest sker gennem en vektor baseret assay, ved hvilken enhancer aktiverer ekspression af et reportergen 11-12. Disse data giver valuable information om de lovgivningsmæssige potentiale formodede forstærkersekvenser men afslører ikke deres opgaver i deres endogene genomiske kontekst eller identificere de gener, de regulerer. Genom redigering tjener som et effektivt redskab til at studere funktionen af transkriptionelle regulatoriske elementer i deres endogene kontekst ved tab af funktion analyse.
Nylige fremskridt i genom redigering, nemlig CRISPR / Cas9 genom redigering system, lette efterforskningen af genom-funktion. Den CRISPR / Cas9 systemet er let at bruge og kan tilpasses til mange biologiske systemer. Den Cas9 protein er målrettet til et specifikt sted i genomet af en vejledning RNA (gRNA) 13. Den SpCas9 / gRNA komplekset scanner genomet for sit mål genomiske sekvens, som skal være 5 'til en protospacer tilstødende motiv (PAM) sekvens, NGG 14-15. Baseparring af gRNA til dens mål, en 20 nukleotid (nt) sekvens komplementær til gRNA, aktiverer SpCas9 nukleaseaktivitet resulterer i en dobbele streng brud (DSB) 3 bp opstrøms for PAM-sekvensen. Specificitet opnås gennem fuldstændig baseparring i gRNA frø region, 6-12 nt siden af PAM; omvendt ikke stemmer overens 5 'af frø sædvanligvis tolereres 16-17. Den indførte DSB kan repareres enten af ikke-homolog ende sammenføjning (NHEJ) DNA-reparation eller homologi rettet reparation (HDR) mechanisms.NHEJ DNA-reparation skaber ofte insertion / deletion (indels) af et par bp på målstedet, der kan forstyrre den åbne læseramme (ORF) af et gen. For at generere større deletioner i genomet to gRNAs, som flankerer regionen af interesse, kan anvendes 18-19. Denne fremgangsmåde er særligt anvendelig for studiet af transkriptionelle enhancere grupperet i locus kontrol regioner eller super-enhancere, der er større end konventionelle forstærkere 9,18,20-22.
Monoallelisk sletninger er en værdifuld model til at studere cis -forordning af transskription. Den observerede Change i udskrift niveau efter monoallelisk sletning af en forstærker korrelerer til den rolle, som forstærker i genregulering uden de forstyrrende effekter, der kan opstå, når transkription af begge alleler påvirkes potentielt påvirke cellulære fitness. Evaluering reduceret ekspression er vanskeligt dog uden evnen til at skelne mellem den udgår af vildtype allelen. Endvidere genotypebestemmelse deletioner på hver allel uden evnen til at skelne mellem de to alleler er udfordrende, især for store deletioner af> 10 kb til 1 Mb 23, i hvilken det er vanskeligt at amplificere hele vildtype region ved PCR. Anvendelsen af F1 ES celler frembragt ved krydsning Mus musculus 129 med Mus castaneus tillader de to alleler, der skal differentieres ved allel-specifik PCR 18,24. Den hybride genomet i disse celler letter allel-specifik deletion screening og ekspressionsanalyse. I gennemsnit er der en SNP hver 125 bp mellem disse to genomer, Hvilket giver fleksibilitet i primer design for ekspression og genotypebestemmelse analyser. Tilstedeværelsen af én SNP kan påvirke primer smeltetemperatur (T m) og målrette specificitet i real-time kvantitativ PCR (qPCR) amplifikation tillader diskrimination af de to alleler 25. Endvidere et mismatch i 3'-enden af primeren i høj grad påvirker evnen af DNA-polymerase til at forlænge fra primer forhindrer amplifikation af det uønskede allel target 26. Beskrevet i det følgende protokol er anvendelsen af F1 ES celler til allelspecifikke enhancer deletioner af mere end 1 kb og efterfølgende ekspression analyse under anvendelse CRISPR / Cas9 genom redigering system (figur 1).
Figur 1. Enhancer sletning brug CRISPR / Cas9 at studere cis -regulation af genekspression. (A) F1 ES celler frembragt af en krydsning mellem Mus musculus 129 og Mus castaneus anvendes til at give mulighed for allel specifik deletion. (B) To guide RNA'er (gRNA) anvendes til at inducere et stort Cas9-medieret deletion af enhancerregionen. (C) Primersæt bruges til at identificere store mono- og bi-allele deletioner. De orange primere er de indvendige primere, de lilla primere er de udvendige primere og de grønne primere de gRNA flankerende primere. (D) Ændringer i genekspression overvåges ved hjælp af allel-specifik qPCR. RFU betegner relative fluorescensenheder. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Design og Konstruktion af gRNA
- For at slette transkriptionelle enhancerregioner bruge to gRNAs, en 5 'og en 3' af området af interesse. Brug musen UCSC genom browser spor genereret af Zhang laboratorium for at identificere unikke gRNA sekvenser (http://www.genome-engineering.org 15). Næste kontrollere disse gRNAs og deres tilstødende PAM for SNPs og indels bruger online værktøjer i Sanger Institute (www.sanger.ac.uk/sanger/Mouse_SnpViewer/rel-1211) 27-28. For at målrette begge alleler med samme effektivitet, undgå gRNA / PAM-sekvenser, der indeholder en SNP eller Indel.
- Mens valget af gRNA, kontrollere, om muligheden for at designe allel-specifikke primere til genotypebestemmelse sletningen. Se afsnit 5 for allel-specifikke primer design.
- Saml de to gRNA plasmider baseret på protokollen beskrevet i Mali et al. 2013 15. Indarbejd den valgte unikke 20 bp målsekvens into 61mer oligonukleotider som vist i tabel 7 (sekvenser er vist i 5 'til 3' orientering, og fed skrift baser er de 20 bp målsekvensen, der er omvendte komplementer af hinanden).
- Bland 10 pi 10 pM gRNA Primer_F og 10 pi 10 pM komplementær Primer_R i et rør.
- Anneale primerne ved at inkubere primerblanding ved 100 ° C i 5 minutter og derefter køle 1 ° C / sek til 25 ° C. Til dette trin, skal du bruge en PCR maskine eller placer røret i kogende vand og lad den køle af til stuetemperatur.
- Til den annealede primer mix, tilsæt den følgende reaktion blandes og inkuberes ved 72 ° C i 30 minutter for at forlænge hver primer: 18,5 pi vand, 10 pi 5x HF puffer, 1 pi 10 mM dNTP-blanding og 0,5 pi høj- fidelity DNA polymerase.
- Løb 10 pi målfragment på en 2% agarosegel for at bekræfte de 100 bp guide fragmenter er blevet produceret.
- Linearisere gRNA vektoren (en gave fra GeoRGE Kirke; Addgene plasmid # 41824) 15 med Afl II ved anvendelse af den følgende reaktion oprettet: 5 pi gRNA vektor backbone (2-4 ug), 5 pi 10 x buffer, 3 pi Afl II (20 enheder / pl) og 32 pi vand. Inkubér reaktionsblandingen i 3 timer ved 37 ° C.
- Kør fordøjede produkter på en 1% agarosegel og oprense DNA bånd svarende til de 3,5 kb lineariseret gRNA vektor ved anvendelse en gelekstraktionskit ved at følge producentens instruktioner.
- Opsæt Gibson assembly reaktioner 29-30 under anvendelse lineariseret gRNA vektor og målrette fragment fra trin 1.2.3 som følger: 1 pi lineær gRNA vektor (50 ng / pl), 1 pi målfragment, 10 pi 2x Gibson samling mastermix og 8 pi vand. Inkuber reaktioner ved 50 ° C i 60 minutter.
- Transformation af E. coli celler med Samlet gRNA Vector.
- Bland 1 pi af den samlede gRNA vektoren fra 1.2.7og 50 pi DH5a (E.coli-stamme) celler i et rør. Transformere DH5a celler ved varmechok metode ved at eksponere celler til 42 ° C i 45 sek.
- Snap chill rørene på is i 5 minutter; derefter tilsættes 400 pi SOC-medium og inkuberes ved 37 ° C i 45 minutter i en rysteinkubator.
- Spred 100 pi af DH5a-celler på en LB-kanamycin (50 ug / ml) plade til positiv selektion af transformerede celler og inkuberes O / N ved 37 ° C.
- Screening Positiv E.coli Kolonier for gRNA Indsæt.
- Vælg en kanamycinresistent koloni og resuspender i 3 ml LB indeholdende 50 ug / ml kanamycin. Gentag det samme for 6-8 kolonier og inkuberes alle rør ved 37 ° CO / N i en rysteinkubator.
- Uddrag plasmider fra O / N dyrkede kultur ved hjælp af plasmid mini prep kit ved at følge producentens manual.
- Forbered en EcoRl fordøjelse reaktion mix at kontrollere for gRNA sekvens inserti plasmidet. For hver prøve forberede reaktionsblandingen som følger: 2 pi enzym-buffer, 1 pi EcoRI, 15 pi vand. Alikvot reaktionsblandingen i 1,5 ml rør og tilsættes 2 pi plasmid. Inkuber rørene ved 37 ° C i 2 timer.
- Kør det fordøjede produkt på en 1,5% agarosegel.
Bemærk: Prøverne med indsatsen vil vise en 475 bp band størrelse, der er 100 bp højere end kloner uden skær.
Bemærkning: Alternativt kan de positive kloner screenes ved en koloni-PCR under anvendelse Sp6 (fremad) og T7 (revers) -primere (tabel 7), som binder til vektorsekvensen til opnåelse af en 642 bp størrelse fragment i nærvær af en gRNA insert. Den koloni-PCR tilgang er fordelagtigt, når der er en EcoR I restriktionssite i gRNA sekvensen.
- Bekræft Sekvensen af gRNA Indsæt ved DNA sekventering under anvendelse af T7 Primer.
2. Transfektion
Note:Elektroporation er en effektiv metode til transfektion af plasmider ind i ES-celler. Den her beskrevne metode bruger mikroperforator transfektion teknologi.
- Grow F1 ES-celler i en 10 cm gelatineovertrukket skål indeholdende 10 ml ES-celle medium (tabel 1) ved 37 ° C / 5% CO2. Når cellerne når 85% sammenflydning fjerne medierne og tilsættes 2 ml trypsin. Der inkuberes ved 37 ° C i CO2-inkubator i 5 minutter.
Bemærk: F1 ES celler blev opnået fra Barbara Panorering 24 og er tilgængelige på anmodning. - Neutralisere trypsin ved tilsætning af 10 ml spin-medier (tabel 2). Pipette flere gange for at løsne cellerne fuldstændigt.
- Indsamle alle cellerne i et 15 ml rør og centrifugering ved 300 xg i 5 min. Resuspender i 3 ml PBS og tælle cellerne under anvendelse af et hæmocytometer eller automatisk celletæller.
- Pelleter 1 x 10 6 ES-celler i et 1,5 ml rør ved centrifugering ved 300 xg i 5 minutter og resuspender i 100 pi R (resuspension) buffer som leveret af kittet fabrikanten.
- Tilsæt 5 pg hver af pCas9_GFP (en gave fra Kiran Musunuru; Addgene plasmid # 44.719) 31, 5 'og 3' gRNA plasmider til sletning af målområdet og bland forsigtigt med en pipette for at undgå indførelsen af bobler.
- Brug den elektroniske pipette spids at aspirere 100 ul af elektroporation mix, være omhyggelig med at undgå en boble i spidsen.
- Programmer volt, bredde og pulser for elektroporation. For F1 ES celler, bruge 1.400 V, 10 msek 3 impulser.
- Medens elektroporering kører observere spidsen at se eventuelle gnister i opløsningen. En gnist indikerer tilstedeværelsen af en luftboble og vil interferere med transfektion.
- Skubbe de transficerede ES-celler i en 10 cm gelatineovertrukket skål indeholdende 10 ml ES-celle medium (tabel 1) og inkuberes ved 37 ° C / 5% CO2.
3. FACS-sortering transficerede celler
- Efter 48 timer frigøre cellerne ved tilsætning af 2 ml trypsin og inkuberes ved 37 ° C i CO2-inkubator i 5 minutter.
- Neutraliser pladen ved tilsætning af 10 ml samling buffer (tabel 3). Opsamle cellerne i et 15 ml rør og centrifugering ved 300 xg i 5 min.
- Supernatanten fjernes, og cellerne resuspenderes i 1 ml sortering buffer (tabel 4). Tæl celler og fortyndet baseret på sortering platformen. Fortynd cellerne til 0,5-1 x 10 6 celler / ml for sortering i 15 ml rør og til sortering af individuelle celler direkte i 96-brønds plader, fortyndes cellerne til 2-5 x 10 6 celler / ml.
- Sorter Cas9-GFP + ES-celler under anvendelse af en FACS flowcytometer 32. Indsamle celler i bulk i rør med 2 ml gendannelsesmedie (tabel 5) og plade som beskrevet i 3.5 for koloni plukning, eller sortere individuelle celler direkte i gelatineovertrukne plader med 96 brønde indeholdende 100 pi ES-celle medium / brønd (
- Seed 1-1,5 x 10 4 GFP + ES-celler i en 10 cm gelatineovertrukket skål indeholdende 10 ml ES-celle medium (tabel 1). Plating ved denne lave densitet vil lette plukke individuelle ES-kolonier.
4. Kulturcenter Kloner for Genotypning, Expression Analyse og frysning Cell Stocks
- På dag 4-5 efter sortering score hver brønd af direkte sorteret plader med 96 brønde for tilstedeværelsen af ES-kolonier.
- Dissociere ES cellekolonier ved at fjerne mediet og tilsætte 30 pi trypsin. Der inkuberes ved 37 ° C i 5 min. Neutralisere trypsin ved at tilsætte 170 pi ES-celle medium (tabel 1), og pipette op og ned for komplet dissociation af kolonien i enkeltceller. Grow cellerne ved 37 ° C / 5% CO2, indtil de fleste brønde er over 70% sammenflydende (som regel 2-3 dage).
- Alternativt bryde individuelle ES-kolonier fra 10 cm skåle under anvendelseet omvendt mikroskop. Efter opsugning kolonien i pipettespidsen Følg trin 4.1.1 placere hver koloni i én brønd i en plade med 96 brønde, forbehandlet med gelatine og indeholdende 30 pi trypsin.
Bemærk: Kolonier kan sidde i trypsin ved RT, mens en hel række af kolonier er plukket. - Når alle kolonier er blevet samlet og dissocieret til medier vokser cellerne ved 37 ° C i CO2-inkubator indtil de fleste brønde er over 70% sammenflydende (som regel 2 dage).
- Når de 96-brønds plader er klar til opdeling, fjerne materialet, tilsættes 30 pi trypsin og inkuberes ved 37 ° C i 5 min. Neutralisere trypsin ved at tilsætte 180 pi ES-celle medium (tabel 1) til hver brønd og pipette op og ned for komplet dissociation i enkeltceller.
- Fra den resulterende 210 pi, frø 70 pi i tre gelatineovertrukne plader med 96 brønde, der hver indeholder 130 pi ES-celle medier / brønd (tabel 1). Brug disse plader til genotyping, ekspressionsanalyse og frysning celle lagre for hver klon som beskrevet nedenfor.
- Når genotype pladen når 70-85% sammenløb, behandle plade som beskrevet i afsnit 6 "Genotypebestemmelse sletning".
- Når udtrykket analyse pladen når 70-85% sammenløb, fjern medierne, forsegle pladen med forseglingstape og opbevares ved -80 ° C indtil de kloner er genotype.
Bemærk: ekspressionsanalyse pladen er nyttigt at analysere ændringer i genekspression på tidlige passager i klonerne. Genekspressionsanalyse fra 96-brønds plade er mulig, men da celle numre er lave anbefales en RNA Micro Extraction kit. - Fremstilling af 96-brønds plade Freeze Stock:
- Når pladen for frosne celle bestande (stock-1) når 70-85% konfluens, aspireres medierne, tilsættes 30 pi trypsin og inkuberes ved 37 ° C i 5 min.
- Neutralisere trypsin ved tilsætning af 100 pi ES-celle medium (tabel 1) to hver brønd og pipette op og ned for komplet dissociation i enkeltceller.
- Transfer 15 pi suspenderede celler fra hver brønd til to gelatineovertrukne plader med 96 brønde, som hver indeholder 185 pi ES-celle medium (tabel 1) og tillade at vokse ved 37 ° C / 5% CO2.
Bemærk: Dette er for lager-2 og -3 plader, som er ekstra back-up kloner i tilfælde genoplive cellerne fra lager-1 ikke er vellykket.
- I mellemtiden, til de 100 pi de resterende celler i 96-brønds plade (stock-1), der tilsættes 100 pi 2x frysemedium (tabel 6). Forsegl pladen med en forseglingstape og hurtigt vendes pladen 4-5 gange for korrekt blanding. Opbevar plade ved -80 ° C, indtil kloner genotype.
- Når bestanden-2 og stock-3 plader er klar til frysning aspirat medierne, tilsættes 30 pi trypsin og inkuberes ved 37 ° C i 5 min. Neutralisere trypsin ved at tilsætte 70 pi ES-celle medier (Tstand 1) til hver brønd og pipette op og ned for komplet dissociation i enkeltceller.
- Tilsæt 100 pi 2x indefrysning medier, forsegle pladen med forseglingstape og hurtigt vendes pladen 4-5 gange for korrekt blanding. Opbevar plade ved -80 ° C indtil disse plader er nødvendige.
5. Allel-specifikke primer design
- Design 4 sæt primere (fig 1C) for at screene kloner for den ønskede deletion: inside primere, uden primere og gRNA flankerende primere (for både 5'- og 3'gRNA målsteder) som beskrevet nedenfor.
- Hent den SNP sporet svarende til de 129 og Cast genotyper på http://labs.csb.utoronto.ca/mitchell/crispr.html. Den givne spor viser basesubstitutioner mellem 129 og Cast på koordinaterne i MM9 musen genom forsamling.
Bemærk: Linket på ovenstående hjemmeside vil omdirigere til UCSC genom browser og tilføje en brugerdefineret spor, der indeholder SNPs mellem 129 og Cast genomes. - Indtast koordinaterne i regionen, der skal slettes. Zoome ind på en region på ca. 500 bp i midten af den ønskede deletion indeholdende> 3 SNPs.
- Gå til at se> DNA i indstillingen, og klik få DNA til at hente målsekvensen i alle store bogstaver format.
- Opret to FASTA sekvenser; en til 129 og en for Cast ved basesubstitution på SNP position. Markere SNP'er med et lille.
- Gå til Primer3 plus (http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi/) og indsætte SNP erstattet 129 sekvens. Brug standardindstillingerne til at designe primere.
- At designe de indvendige allel-specifikke primere vælge Primer_List i opgaven drop menuen og klik Pick Primere. Vælg en fremadrettet eller revers primer, der har en SNP enten i 3'-enden eller inden for 4 baser fra 3'- og falder inden i området, der skal slettes.
Bemærk: Primere, der har en SNP ved 3'-enden display øget allel specificitet i qPCR. - For at vælge den anden primer tilbage til hovedsiden, skal du vælge Detection i drop menuen opgaven og indsæt den første primer sekvens i den relevante boks nederst på siden. I fanen Generelle indstillinger ændre indstillingen for produktet størrelse interval til 80-200 bp og klik Pick Primere. Valgte en primer sæt fra de anførte primerpar; disse vil være de 129 inde allelspecifikke primere.
- Gentag trin 5.1.5 til 5.1.7 til at designe primere til Cast allelen.
- Retur til UCSC genom browser og indtaste koordinaterne i regionen, der skal slettes. Gå til at se> DNA i indstillingen bar, under Sequence Retrieval Region Options tilføje 1000 bp opstrøms og nedstrøms klik få DNA til at hente målsekvensen.
- Marker gRNA målsekvensen i parentes. Gem hele denne sekvens, før du fortsætter.
- At designe de udvendige primere fjerne sekvensen mellem de to gRNA målsekvenser. Gentag trin 5.1.4-5.1.8 at designe ydersiden allelspecifik primers men ændre produktet størrelse 400-800 bp.
- Split sekvensen opnået i trin 5.1.10 i to sekvenser, hver med 500 bp 5 'og 3' af gRNA målsekvensen. Gentag trin 5.1.5 til 5.1.7 designe ikke-allelspecifikke primere til gRNA flankerende regioner, men ændre produktet størrelse 400-800 bp.
Bemærk: For ikke-allelspecifikke primere, enten 129 eller Cast sekvens kan anvendes og primere bør vælges, som ikke indeholder en SNP. Det er tilrådeligt at indstille et produkt størrelse på 400-800 bp for at designe udenfor og gRNA flankerende primere. Dette giver mulighed for opformering, selv hvis små indels er til stede.
- Hent den SNP sporet svarende til de 129 og Cast genotyper på http://labs.csb.utoronto.ca/mitchell/crispr.html. Den givne spor viser basesubstitutioner mellem 129 og Cast på koordinaterne i MM9 musen genom forsamling.
- Test de indvendige primere til allel specificitet ved qPCR hjælp ren 129 og Cast stammen genomisk DNA ved 2 ng / pl. Følg trin 6,2-6,4 at oprette qPCR reaktion.
Bemærk: Hvis 129-genotypen i målregionen er den samme som C57BL / 6J, DNA fra C57BL / 6J kan anvendes i stedet for 129-DNA. Allel-specifikke primere bør udvise mindst 5 cyklusserForskellen mellem Ct (tærskelcyklus) værdi for det korrekte vs. forkerte genotype. De udvendige primere kan afprøves for at sikre, at de amplificere sletning brug Cas9 / gRNA transficerede ES-celler, og F1 genomisk DNA som henholdsvis positive og negative kontroller. Allelen var specifikke eksterne primere kan testes, når monoallelisk kloner er blevet identificeret.
6. Genotypebestemmelse den Sletning
- Uddrag genomisk DNA fra genotypebestemmelse 96-brønds plade under anvendelse pladen fra trin 4.6, der genereres efter koloni ekspansion.
- Forbered genomisk DNA-ekstraktion mix: 89 pi vand, 10 pi 10x buffer og 1 pi udvinding reagens (leveret af producenten). Tilsæt 100 pi genomisk DNA-ekstraktion mix til hver brønd og forsegle pladen med en forseglingstape.
- Inkubér pladen ved 75 ° C i 5 minutter efterfulgt af 95 ° C i 5 min.
- Lad pladen afkøle ved inkubation på is i et par min end derefter centrifugeres kort for at bilægge enhver kondensering til bunden af brønden. Dette tjener som template-DNA plade til sletning screening.
- Opsætning af qPCR reaktioner i to eksemplarer for hver klon som følger: 5 pi 2x SYBR qPCR mix, forward og reverse primer (3 uM) hver en pi og 1 pi vand. Brug en multikanalpipette at tilføje 2 pi template-DNA, efterfulgt af 8 pi reaktionsblanding til hver brønd i en plade med 384 brønde.
- Forsegl pladen med forseglingstape og centrifugering ved 600 xg i 2 minutter for at blande indholdet. Placer 384 brønde array i realtid cyklusmaskinen.
- Program tidstro variator til en 2-trins PCR efterfulgt af smelte kurve analyse med detektion som følger: 1 cyklus ved 95 ° C i 10 minutter, 40 cykler ved 95 ° C i 15 s, 62 ° C i 30 sek med plade read og 95 ° C i 10 s, 65 ° C til 95 ° C med stigning på 5 ° C i 5 sek + plade læse.
Bemærk: Ud til primer design, qPCR miX og cyklusparametre også bidrage til primer specificitet. De i de materialer, der er beskrevet ovenfor parametre og reagenser oftere give allelspecifik forstærkning. - Analyse qPCR Resultater
- Tjek hver allel til forstærkning med indvendige allel-specifikke primere. Ingen amplifikation af en allel eller høj Ct værdi forskelle (> 5 cyklusser) mellem alleler tyder disse kloner bære en heterozygot deletion af allelen med høj / fraværende Ct-værdi. Ingen forstærkning af begge alleler tyder på, at de bærer en homozygot sletning.
- Tjek hver allel til forstærkning med eksterne allel-specifikke primere. Når målet deletion er større end 1 kb amplifikation med eksterne primere kun sker, når en deletion er til stede. En Ct værdi på 22-28 bekræfter sletningen. For mål sletninger mindre end 1 kb, bekræfter amplikonstørrelse ved elektroforese.
Bemærk: Hvis de udvendige primere viser kun moderat allel-specificitet (se FiguAd 2), kan amplikoner opnås med begge allele primersæt i monoallelisk kloner følge forbi mål amplifikation af de udvendige primere. I dette tilfælde en Ct-værdi forskel mellem de to alleler af mindst fem cyklusser skal bekræfte korrekte allel (lavere Ct-værdi) udgår baseret på resultaterne fra det indre primere. Hvis på målet versus forbi mål allel Ct forskellen er mindre end fem cykler designe nye allel specifikke eksterne primere. - I monoallelisk deletionskloner kontrollere for integriteten af den ikke-slettede allel ved hjælp af sekundær screening, gRNA flankerende primere.
Bemærk: indels af> 25 bp størrelse omkring gRNA målstedet kan identificeres ved at observere en ændring i smelten kurve i qPCR for 400-800 bp amplikoner. Alternativt kan de amplikoner fra gRNA flankerende primere sekventeres at detektere små indels af <25 bp.- Udfør qPCR med 2 sæt gRNA flankerende primere dvs, 5 'og 3' gRNA brugt til at frembringe CRISPR deletion. Ingen amplifikation med disse sæt primere indikerer indels større end qPCR ampliconen er til stede på gRNA målstedet på ikke-slettede allel af monoallelisk deletionskloner. Kassér kloner indeholdende disse store indels fra yderligere analyse som resultaterne kan være vanskelige at fortolke uden at kende omfanget af sletningen.
- Oprens amplikonnerne opnået udefra primer qPCR reaktion under anvendelse af en PCR rense kit efter producentens anvisninger.
- Bekræft sekvensen af den slettede allel ved DNA sekventering af det oprensede PCR-produkt fra det foregående trin. Brug qPCR amplifikationsprimere for frem og bak sekventering.
Bemærk: På dette stadie SNPs i amplikon fungere som en sekundær bekræftelse af genotypen af den slettede allel.
7. Analyse Expression med allelspecifikke primere
- Optø 96-brønds celle stock plspiste opbevaret ved -80 ° C (lager-1 fra trin 4.9) ved at placere den på en varm perle bad. Når mere end halvdelen af brøndene i pladen optøs, centrifugering ved 300 xg i 5 min.
- Forsigtigt, fjerne forseglingstapen og hurtigt overføre cellerne af ophævelsen positive brønde i gelatineovertrukne, 12-brønds plader indeholdende 1 ml ES-celle medium (tabel 1) og inkuberes ved 37 ° C / 5% CO2.
- Når pladen når 70-85% konfluens, passage af cellerne og opdele dem i tre brønde i en gelatine-coatet, 6-brønds plade, som hver indeholder 2 ml ES-celle medium (tabel 1). Brug to brønde for at forberede 2 hætteglas med frosne celler bestande for langtidsopbevaring i flydende nitrogen (beskrevet i trin 8) og det tredje godt for RNA-ekstraktion.
- Uddrag RNA under anvendelse af et RNA-ekstraktion kit.
- Konverter 100-500 ng af RNA til cDNA ved revers transskription (RT) af RNA under anvendelse af cDNA-syntese kit efter fabrikantens protokol. Medtag en RT negativ reaktion for hver RNA-prøve for at overvåge mængden af kontaminerende DNA i RNA-prøver.
- Fortynd cDNA før qPCR i et forhold på mellem 1: 2 og 1: 4; afhængigt af ekspressionsniveauet af målgenet i ES-celler.
- Indstil qPCR som beskrevet ovenfor, herunder F1 genomisk DNA som standardkurve (5 gange fortyndinger fra 250 til 0,08 ng / pl) for absolut kvantificering af transkriptniveauer. Sammenlign ekspressionen af hver allel af genet af interesse i hvert bekræftet udgår klon til en egnet kontrol gen, f.eks GAPDH (primere er anført i tabel 7).
Bemærk: Kontrol gen primere behøver ikke at være allelspecifik. Allelspecifik primer design er den samme for RT-qPCR primere som beskrevet for genotypebestemmelsesprimere med undtagelse af målregionen til amplifikation. Gensekvensen bør anvendes; hvis anvendelse af primere for en enkelt exon eller en exon-intron-grænsen (for at overvåge primære transkript) F1 genomisk DNA kan anvendes tilstandardkurven. For yderligere oplysninger om RT-qPCR henvises til Forlenza et al. 2012 33.
8. Freeze Stock Forberedelse til Langsigtet opbevaring af ES-celler
- Der tilsættes 300 pi trypsin til hver 6 brønde (fra trin 7.3) og inkuberes i 5 minutter ved 37 ° C. Tilsæt 2 ml spin-medier (tabel 2) for at neutralisere trypsin og pipette op og ned flere gange for at dissociere til enkeltceller.
- Overfør cellerne i et 15 ml rør og centrifugering ved 300 xg i 5 min.
- Aspirere supernatanten, og der tilsættes 500 pi ES-celle medium (tabel 1). Pipettere op og ned for at resuspendere cellerne.
- Overfør indholdet til en 1,5 ml kryohætteglas rør, og der tilsættes 500 pi 2x ES-celle frysning medier (tabel 3). Bland godt ved at vende røret og læg røret i en alkohol-fri celle frysning container. Placer denne celle frysning containere ved -80 ° C i mindst 12 timer før transferring til en flydende nitrogen lagertank.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollen beskrevet her anvender F1 ES celler for at studere cis -regulering af genekspression i monoallelisk enhancer slettede celler dannet ved anvendelse CRISPR / Cas9 genom redigering (figur 1). Den gRNA og allel-specifikke primer design til genotypebestemmelse og genekspression er de vigtigste faktorer i denne fremgangsmåde. Hver allel-specifikke primer sæt skal valideres af qPCR at bekræfte allel specificitet. Allel-specifikke primere, som amplificerer kun deres respektive genomiske DNA-mål er ideelle (figur 2). Ideelt disse primere har en SNP ved deres 3'-ende. Primere med mindre allel-specificitet kan anvendes, hvis de viser et minimum af en 5 Ct-værdi forskel i deres amplifikation af den korrekte vs. forkerte genotype 25. Primere, der bærer en SNP mere 5 'end 4 th base fra 3'-enden normalt udviser ikke allel specificitet og forstærke begge genotyper med samme effektivitet,afslører betydningen af SNP position i primeren 34. Derudover en purin / purin eller pyrimidin / pyrimidin substitution har vist sig at have en større virkning på T m forskel på to primere i forhold til en purin / pyrimidin substitution 25.
Primær screening af en 96-brønds plade af DNA isoleret fra ES-cellekloner udføres med allel-specifikke indvendige primere for at identificere kloner, der bærer en deletion på en eller begge alleler. Disse slettede kloner yderligere screenet med eksterne allel-specifikke primere at bekræfte hver sletning. Eksemplet her er fra en effektiv gRNA par, der resulterede i 46% af kloner, der bærer en sletning på 129, Cast, eller begge alleler (Figur 3). Sekundær screening er gjort for bekræftede monoallelisk deletionskloner at identificere indels omkring gRNA målområderne på den ikke-slettede allel som hyppigheden af Indel occurrrelser i gRNA målstedet er høj 23. Indels omkring gRNA ikke kan identificeres i den primære screening, da disse kloner viser ingen deletion med indvendige primere og amplificerer ikke med de udvendige primere (figur 4). Monoallelisk deletionskloner der giver amplifikation med begge sæt venstre og højre gRNA flankerende primere har deres andre allel stort set intakt, da de ikke indeholder en deletion større end 5 'eller 3' gRNA flankerende ampliconer. Sekventering af amplikoner fra gRNA flankerende primere vil identificere indels mindre end gRNA flankerende ampliconer, som måske ikke mærkbar i qPCR. De monoallelisk deletionskloner, der ikke giver forstærkning i begge regioner i den sekundære screening er ikke medtaget for yderligere genekspression analyse. Som gRNA målregioner er valgt uden for regionen mistænkes for at have forstærker funktion, indels mindre end gRNA flankerende amplikoner sandsynligvis ikke vil påvirke forstærker funktion og kloner conTaining disse kan indgå i yderligere analyse.
Hvis du vil begrænse en stor sletning til én allel en gRNA kan vælges som overlapper en SNP i frøet region eller PAM. Beskrevet her er et eksempel på en højeffektiv deletion (53%) på 129 allel grund af en SNP i PAM for 3'gRNA på Cast allel (figur 5). Denne deletion fjernede SCR, en nyligt beskrevet Sox2 enhancer i ES-celler 18,22. Selv indførelsen af den store deletion blev stærkt reduceret på Cast allelen blev tre kloner (1, 11, 75) identificeres med et stort deletion på Cast allel (figur 5). Af disse tre kloner to (1, 11) indeholdt 3'brudpunkter inden for 50 bp af 3'gRNA målregion. For tredje klon var vi ikke i stand til at identificere 3'knækpunkt og konkluderede, at sletningen var større end 11 kb 18. Deletioner med en eller begge afir brudpunkter placeret> 100 bp fra enten 5 'for 3'gRNA målregion er vanskelige at genotype, generelt udgør 15-30% af alle kloner, og forbliver ukarakteriserede i den primære screening angår sletning ikke er amplificeret med ydersiden primere.
Når kloner med monoallelisk deletion er blevet identificeret de analyseres for allelspecifik genekspression under anvendelse af absolut kvantificering ved revers transkription qPCR. Genekspression fra kloner, der bærer en monoallelisk deletion af kritiske Sox2 enhancer region, SCR, er vist her i forhold til ekspression i vildtype F1 ES celler (figur 6). Specifikt kloner, der bærer en deletion af enhancer region på 129 allelen viste et fald i 129 transkriptniveauer henviser kloner, der bærer en deletion på Cast allelen viste et fald i Cast transkriptniveauer. Den allelspecifik genekspression analyse afslørede thpå denne distale enhancer region, SCR, er en kritisk cis -regulator af Sox2 i ES-celler 18.
Figur 2. Test af allel-specificitet 129 og Cast allel-specifikke primere. (A) Forstærkning fra primere til 129 genotype. (B) Forstærkning fra primere til Cast genotype. I både A og B linierne vise amplifikationsprodukterne profiler for C57BL / 6 genomisk DNA, som har den samme genotype som 129 DNA ved disse specifikke SNPs; linjerne med åbne cirkler viser amplifikationsprodukterne profiler for Cast genomisk DNA. Amplifikation følge af primersæt med den mest allel-specificitet er vist i grøn (allelspecifik primer-1), et primersæt viser en 5 Ct forskel er vist i lilla (allelspecifik primer-2) og en primer sæt viser en minimal forskel i Ct værdi represented i rød (allelspecifik primer-3, primer detaljer i tabel 7). Den røde primer sæt ville ikke være passende for allel-specifik screening. RFU betegner relative fluorescensenheder. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Resultater opnået efter screening af et 96-brønds plade med allel-specifikke i og uden primere. (A) qPCR resultater fra skærmen med indvendige primere (Enh_del_IS_F1_129, Enh_del _IS_F1C, Enh_del _IS_R1) B) qPCR resultater fra skærmen med udenfor primere (Enh_del_OS_F1, Enh del_OS_R1_129, Enh_del_OS_F2C, Enh_del_OS_R3, primer detaljer i tabel 7). I begge grå søjler repræsenterer forstærkning fra Cast-specifikke primere og sorte søjler repræsenterer forstærkning fra 129-specifikke prim ter. Bemærk, at kun kloner med en deletion på en eller begge alleler screenes med de udvendige primere. Den relative forstærkning af hver allel blev beregnet under anvendelse af 2 -CT at tilnærme den initiale koncentration og efterfølgende udtrykker hver allel i procent af summen af de to alleler. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4. Kloner med et monoallelisk deletion screenes for at identificere store indels på gRNA målsteder. Primere der flankerer gRNA målregioner anvendes til at bekræfte, at den ikke-slettede allel er intakt. Kun monoallelisk kloner uden store indels på målet sites på de ikke-slettede allel anvendes i den efterfølgende udtryk analyse. tp_upload / 53.552 / 53552fig4large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Kloner opnået fra Sox2 SCR sletningen. Vist er de qPCR resultaterne fra en skærm med indvendige primere (pr111R, pr111F_129, pr111F_Cast, detaljer i tabel 7). Grå søjler repræsenterer forstærkning fra Cast-specifikke primere og sorte søjler repræsenterer forstærkning fra 129-specifikke primere. Bemærk, at deletionen er stærkt skæv mod 129 allel på grund af tilstedeværelsen af en SNP i PAM af 3'gRNA målregion på Cast allel. Den relative forstærkning af hver allel blev beregnet under anvendelse af 2 -CT at tilnærme den initiale koncentration og efterfølgende udtrykker hver allel i procent af summen af de to alleler. filer / ftp_upload / 53.552 / 53552fig5large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6. SCR sletning reducerer dramatisk udtryk for Sox2. Repræsentative resultater fra 129 eller Cast SCR slettede kloner. Røde bjælker repræsenterer ekspression af Sox2 Cast allel og blå bjælke repræsenterer amplifikation af Sox2 129 allel. Sletning af SCR på 129 allel reduceret ekspression af Sox2 (129), mens sletning af SCR på Cast allel reduceret ekspression af Sox2 (Cast). Data, der vises, er et gennemsnit af tre tekniske gentagelser, fejlsøjler ikke vist. Primere anvendt til Sox2 ekspressionsanalyse [Sox2_F, Sox2 (129) _R, Sox2 (Cast) _R] er anført i tabel 7.pload / 53.552 / 53552fig6large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
| Reagens | stamkoncentration | Bind | Endelig koncentration | ||||
| GlutaMAX | 200 mM | 6 ml | 2 mM | ||||
| 2-mercaptoethanol | 10 mM | 6 ml | 0,1 mM | ||||
| MEM Ikke-essentielle aminosyrer (NEAA) | 10 mM | 6 ml | 0,1 mM | ||||
| natriumpyruvat | 100 mM | 6 ml | 1 mM | ||||
| Penicillin / streptomycin | 10.000 enheder | 3 ml | 50 U / ml | ||||
| FBS | 90 ml | 15% | CHIR99021 * | 10 mM | 3 uM | ||
| PD0325901 * | 10 mM | 1 uM | |||||
| LIF * | 10 7 enheder / ml | 1.000 U / ml | |||||
| # For at forberede ES-celle medier, tilsæt de ovennævnte komponenter til 500 ml høj glucose DMEM. ES-celle medier bør ikke opbevares i mere end 4 uger, og med inhibitorer * ikke mere end 2 uger. | |||||||
Tabel 1. ES-celle medier.
| Reagens | stamkoncentration | Bind | Endelig koncentration |
| GlutaMAX | 200 mM | 5 ml | 2 mM |
| Penicillin / streptomycin | 10.000 enheder | 5 ml | 100 U / ml |
| FBS | 50 ml | 10% | |
| # For at forberede Spin medier, tilsæt de ovennævnte komponenter til 500 ml høj glucose DMEM. | |||
Tabel 2. Spin medier.
| Reagens | Endelig koncentration | Volumen (50 ml) |
| 1x PBS uden Ca / Mg 2+ | 42,0 ml | |
| BSA fraktion V (7,5%) | 15% (v / v) | 7,5 ml |
| 0,5 M EDTA > | 5 mM | 0,5 ml |
Tabel 3. Indsamling buffer.
| Reagens | Endelig koncentration | Volumen (50 ml) |
| 1x HBSS | 47.25 ml | |
| 1M HEPES | 25 mM | 1,25 ml |
| 0,5 M EDTA | 5 mM | 0,5 ml |
| BSA fraktion V (7,5%) | 1% (v / v) | 0,5 ml |
| FBS | 1% (v / v) | 0,5 ml |
Tabel 4. Sortering puffer.
måder ">Tabel 5. Recovery medier.
| ES-medier | 60% |
| FBS | 20% |
| DMSO | 20% |
Tabel 6. 2x frysemedium.
Tabel 7. Liste over primere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CRISPR / Cas9 medieret genom redigering teknologi giver en enkel, hurtig og billig metode til genom modifikation. Metoden beskrevet her for at generere og analysere monoallelisk forstærker sletning til funktionel forstærker karakterisering udnytter SNPs i F1 museceller. Fordelene ved denne type fremgangsmåde er: 1) monoallelisk enhancer deletioner ikke producerer forstyrrende effekter, som opstår, når et kritisk enhancer udgår fra begge alleler, dvs. en stor reduktion i protein-niveauer i det regulerede gen fører til celle letalitet eller ændret fænotype; 2) hvis frekvensen af monoallelisk deletion er lav opnå en homozygot deletion er mindre sandsynligt; dog med anvendelse af allel-specifikke primere i genekspression analyse kan man analysere kloner med en monoallelisk deletion; 3) anvendelse af fire sæt primere til screening monoallelisk deletioner tillader eliminering af kloner indeholdende partielle eller store deletioner, som beskæmme denedstrøms analyse.
Allelspecifik primer design er kritisk for genotypebestemmelse mono / biallele CRISPR deletioner og analysere virkningen på genekspression i en allel-specifik måde. Dette er lettere at opnå, når F1 anvendte celler indeholde mere hyppige SNPs, der tillader diskriminering af de to alleler. Her ES-celler genereret fra en Mus musculus anvendes 129 x Mus castaneus indlæg; imidlertid kunne andre celler anvendes, hvis SNPs mellem de to alleler tillader allelspecifik deletion screening og ekspressionsanalyse, og hvis der findes tilstrækkelige data til at forudsige aktive enhancerregioner målrettes i den valgte celletype. Derfor kan denne fremgangsmåde tilpasses enhver cellelinie hvor information om allele SNP'er er tilgængelig. En af begrænsningerne i protokollen er afhængigheden af SNPs på bestemte steder. Nogle målregioner bære færre SNPs som gør designe allel-specifikke eksterne primere, der forstærker en <800 bp fragment udfordrende. I sådanne tilfælde kan anvendes en PCR tilgang som et alternativ til qPCR screening giver mulighed for en større amplikon. Derudover kan der være SNP tilknyttede forskelle i fænotypen af F1 ES celler; at bekræfte funktionen af specifikke enhancere i yderligere genotyper homozygote deletioner kan udføres i standard ES linjer. Specificiteten af SpCas9 nuklease er et vigtigt spørgsmål, især i betragtning af potentielle anvendelser i kliniske tilgange. Undersøgelse SpCas9 specificitet har afsløret, at både 6-12 nt frø region af gRNA genkendelsessekvensen og den tilstødende PAM er vigtige for nukleaseaktivitet 13-14,17. Off målmutationer kan minimeres ved at sikre, at frøet region og tilstødende PAM er unikke i genomet er modificeret 14,16.
En monoallelisk sletning tilgang beskrives her kombineret med allel specifikt RNA-seq kan endeligt afsløre genet eller generne reguleres af en specifik enhancer 18. Disse eksperimenter er vigtige for forståelsen genom funktion som sletning af selv reporter-assay valideret forstærkere ikke altid påvirker genekspression 18. Endvidere kan enhancere ikke regulere den nærmeste genet i genomet eller kan regulere mere end et gen 1,20,35. Som et resultat, tab af funktion analyse er den mest informative metode til bestemmelse af funktionen af en enhancer region. Dette kan hurtigt opnås ved anvendelse CRISPR / Cas9-medieret monoallelisk deletion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har læst Jové politikker vedrørende interessekonflikter og har ingen konflikter til at videregive.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530S | high fidelity DNA polymerase used in gRNA assembly |
| Gibson Assembly Master Mix | NEB | E2611L | |
| gRNA_Cloning Vector | Addgene | 41824 | A target sequence is cloned into this vector to create the gRNA plasmid |
| pCas9_GFP | Addgene | 44719 | Codon-optimized SpCas9 and EGFP co-expression plasmid |
| AflII | NEB | R0520S | |
| EcoRI | NEB | R3101S | |
| Neon Transfection System 100 µL Kit | Life Technologies | MPK10096 | Microporator transfection technology |
| prepGEM | ZyGEM | PT10500 | genomic DNA extraction reagent |
| Nucleo Spin Gel & PCR Clean-up | Macherey-Nagel | 740609.5 | |
| High-Speed Plasmid Mini Kit | Geneaid | PD300 | |
| Maxi Plasmid Kit Endotoxin Free | Geneaid | PME25 | |
| SYBR select mix for CFX | Life Technologies | 4472942 | qPCR reagent |
| iScript cDNA synthesis kit | Bio-rad | 170-8891 | Reverse transcription reagent |
| 0.25% Trypsin with EDTA | Life Technologies | 25200072 | |
| PBS without Ca/Mg2+ | Sigma | D8537 | |
| 0.5 M EDTA | Bioshop | EDT111.500 | |
| HBSS | Life Technologies | 14175095 | |
| 1 M HEPES | Life Technologies | 13630080 | |
| BSA fraction V (7.5%) | Life Technologies | 15260037 | |
| Max Efficiency DH5α competent cells | Invitrogen | 18258012 | |
| FBS | ES cell qualified | FBS is subjected to a prior testing in mouse ES cells for pluripotency | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Glutamax | Invitrogen | 35050 | |
| DMEM | Life Technologies | 11960069 | |
| Pencillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140 | |
| Sodium pyruvate | Invitrogen | 11360 | |
| Non-essential aminoacid | Invitrogen | 11140 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| 96-well plate | Sarstedt | 83.3924 | |
| Sealing tape | Sarstedt | 95.1994 | |
| CoolCell LX | Biocision | BCS-405 | alcohol-free cell freezing container |
| CHIR99021 | Biovision | 1748-5 | Inhibitor for F1 ES cell culture |
| PD0325901 | Invivogen | inh-pd32 | Inhibitor for F1 ES cell culture |
| LIF | Chemicon | ESG1107 | Inhibitor for F1 ES cell culture |
References
- Sagai, T., Hosoya, M., Mizushina, Y., Tamura, M., Shiroishi, T. Elimination of a long-range cis-regulatory module causes complete loss of limb-specific Shh expression and truncation of the mouse limb. Development. 132 (4), 797-803 (2005).
- Kleinjan, D. A., Lettice, L. A. Long-range gene control and genetic disease. Adv Genet. 61, 339-388 (2008).
- Visel, A., Rubin, E. M., Pennacchio, L. A.
- Maurano, M. T., et al. Systematic localization of common disease-associated variation in regulatory DNA. Science. 337 (6099), 1190-1195 (2012).
- Heintzman, N. D., et al. Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression. Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).
- Shen, Y., et al. A map of the cis-regulatory sequences in the mouse genome. Nature. 488 (7409), 116-120 (2012).
- Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions. Science. 316 (5830), 1497-1502 (2007).
- Rhee, H. S., Pugh, B. F. Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution. Cell. 147 (6), 1408-1419 (2011).
- Whyte, W. A., et al. Master transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes. Cell. 153 (2), 307-319 (2013).
- Chen, C. Y., Morris, Q., Mitchell, J. A. Enhancer identification in mouse embryonic stem cells using integrative modeling of chromatin and genomic features. BMC Genomics. 13 (1), 152 (2012).
- Patwardhan, R. P., et al. Massively parallel functional dissection of mammalian enhancers in vivo. Nat Biotechnol. 30 (3), 265-270 (2012).
- Melnikov, A., et al. Systematic dissection and optimization of inducible enhancers in human cells using a massively parallel reporter assay. Nat Biotechnol. 30 (3), 271-277 (2012).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
- Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nat Biotechnol. 31 (9), 827-832 (2013).
- Cho, S. W., et al. Analysis of off-target effects of CRISPR/Cas-derived RNA-guided endonucleases and nickases. Genome Res. 24 (1), 132-141 (2014).
- Zhou, H. Y., et al. A Sox2 distal enhancer cluster regulates embryonic stem cell differentiation potential. Genes Dev. 28 (24), 2699-2711 (2014).
- Fujii, W., Kawasaki, K., Sugiura, K., Naito, K. Efficient generation of large-scale genome-modified mice using gRNA and CAS9 endonuclease. Nucleic Acids Res. 41 (20), e187 (2013).
- Tuan, D. Y., Solomon, W. B., London, I. M., Lee, D. P. An erythroid-specific, developmental-stage-independent enhancer far upstream of the human 'beta-like globin' genes. Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (8), 2554-2558 (1989).
- Amano, T., et al. Chromosomal dynamics at the Shh locus: limb bud-specific differential regulation of competence and active transcription. Dev Cell. 16 (1), 47-57 (2009).
- Li, Y., et al. CRISPR reveals a distal super-enhancer required for Sox2 expression in mouse embryonic stem cells. PLoS One. 9 (12), e114485 (2014).
- Canver, M. C., et al. Characterization of genomic deletion efficiency mediated by clustered regularly interspaced palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 nuclease system in mammalian cells. J Biol Chem. 289 (31), 21312-21324 (2014).
- Mlynarczyk-Evans, S., et al. X chromosomes alternate between two states prior to random X-inactivation. PLoS Biol. 4 (6), e159 (2006).
- Lefever, S., Pattyn, F., Hellemans, J., Vandesompele, J. Single-nucleotide polymorphisms and other mismatches reduce performance of quantitative PCR assays. Clin Chem. 59 (10), 1470-1480 (2013).
- Huang, M. M., Arnheim, N., Goodman, M. F. Extension of base mispairs by Taq DNA polymerase: implications for single nucleotide discrimination in PCR. Nucleic Acids Res. 20 (17), 4567-4573 (1992).
- Keane, T. M., et al. Mouse genomic variation and its effect on phenotypes and gene regulation. Nature. 477 (7364), 289-294 (2011).
- Yalcin, B., et al. Sequence-based characterization of structural variation in the mouse genome. Nature. 477 (7364), 326-329 (2011).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A., Venter, J. C., Merryman, C. Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome. Nat Methods. 7 (11), 901-903 (2010).
- Ding, Q., et al. Enhanced efficiency of human pluripotent stem cell genome editing through replacing TALENs with CRISPRs. Cell Stem Cell. 12 (4), 393-394 (2013).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). J Vis Exp. (41), (2010).
- Forlenza, M., Kaiser, T., Savelkoul, H. F., Wiegertjes, G. F. The use of real-time quantitative PCR for the analysis of cytokine mRNA levels. Methods Mol Biol. 820, 7-23 (2012).
- Wu, J. H., Hong, P. Y., Liu, W. T. Quantitative effects of position and type of single mismatch on single base primer extension. J Microbiol Methods. 77 (3), 267-275 (2009).
- Sanyal, A., Lajoie, B. R., Jain, G., Dekker, J. The long-range interaction landscape of gene promoters. Nature. 489 (7414), 109-113 (2012).
