Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

יצירת CRISPR / Cas9 מתווכת Monoallelic מחיקות ללמוד לתפקד Enhancer בתאי עכבר גזע עובריים

Published: April 2, 2016 doi: 10.3791/53552
Automatic Translation
1, 1
1Department of Cell and Systems Biology, University of Toronto

Introduction

גורמי רגולטוריים תעתיק הם קריטיים עבור כוונון במרחב ובזמן קנס של ביטוי גנים במהלך התפתחות 1 ושינוי של אלמנטים אלו יכולים לגרום למחלות בשל ביטוי 2 גנים סוטים. אזורים רבים הקשורים מחלה שזוהו על ידי מחקרי עמותה רחבים הגנום נמצאים באזורים ללא קידוד ויש להם תכונות של משפרי תעתיק 3-4. זיהוי משפר והתאמתי עם הגנים שהם מווסתים מסובכים כפי שהם בדרך כלל ממוקמים כמה kilobases מן הגנים שהם מווסתים ועשויים להיות מופעלים באופן רקמות ספציפיות 5-6. תחזיות Enhancer מבוססים בדרך כלל על סימני שינוי היסטון, מתחמי-cohesin מתווך ומחייבת של שעתוק סוג תא ספציפי גורמי 7-10. אימות של משפר חזוי לרוב נעשתה באמצעות assay וקטוריות שבו משפרים מפעיל ביטוי של גן כתב 11-12. נתונים אלה מספקים נמידע aluable מהפוטנציאל רגולטוריות של רצפים משפרים משוערים אבל לא חושף את תפקידם בהקשר הגנומי אנדוגני שלהם או לזהות את הגנים שהם מווסתים. הגנום עריכה משמש ככלי רב עוצמה כדי לחקור את הפונקציה של גורמים רגולטוריים תעתיק בהקשר אנדוגני שלהם על ידי ניתוח הפסד של פונקציה.

התקדמות עריכת הגנום, כלומר מערכת עריכת הגנום CRISPR / Cas9, לסייע בחקירת פונקציה הגנום. מערכת CRISPR / Cas9 קלה לשימוש להתאמה למערכות ביולוגיות רבות. החלבון Cas9 הוא ממוקד לאתר מסוים בגנום ידי RNA מדריך (gRNA) 13. המתחם SpCas9 / gRNA סורק את הגנום רצף גנומי היעד שלה אשר חייב להיות 5 'כדי מוטיב הסמוך protospacer (PAM) רצף, NGG 14-15. זיווג מאגר של gRNA למטרתה, 20 נוקלאוטידים (NT) רצף משלים gRNA, יפעיל פעילות nuclease SpCas9 וכתוצאה מכך doublדואר גדיל Break (DSB) 3 נ"ב במעלה הזרם של רצף PAM. סגולי מושג באמצעות זיווג בסיס שלם באזור הזרע gRNA, 6-12 nt סמוך PAM; לעומת זאת, חוסר התאמה 5 'של הזרע בדרך כלל נסבלים 16-17. הציג DSB ניתן לתיקון או עד הסוף שאינו הומולוגי שהצטרף (NHEJ) תיקון דנ"א או תיקון מכוון הומולוגיה (HDR) תיקון דנ"א mechanisms.NHEJ יוצר לעתים קרובות כניסה / מחיקה (indels) של כמה נ"ב באתר היעד שיכול לשבש מסגרת הקריאה הפתוחה (ORF) של גן. כדי ליצור מחיקות גדולות בגנום שני gRNAs, אשר לאגף את האזור של עניין, ניתן להשתמש 18-19. גישה זו שימושית במיוחד עבור המחקר של משפרי תעתיק התקבצו לאזורים מלאי לוקוס או-משפרי סופר אשר שגודלם עולים על משפר קונבנציונלי 9,18,20-22.

מחיקות Monoallelic הם מודל ערך ללימוד -regulation cis של שעתוק. הנצפה צ'אנגדואר ברמת תמליל לאחר מחיקת monoallelic של משפר וקושר לתפקיד משפר כי ויסות גנים ללא תופעות הבלבול שעלול להתרחש כאשר שעתוק של שני אללים מושפע ההשפיע כושר הסלולר פוטנציאלי. הערכת ביטוי מופחת קשה אולם ללא היכולת להבחין בין נמחק מן אלל הסוג הבר. יתר על כן, genotyping מחיקות בכל אלל ללא היכולת להבחין בין שני אללים הוא מאתגר, במיוחד עבור מחיקות גדולות של> 10 kb עד 1 Mb 23 שבו קשה להגביר את האזור סוג בר כולו על ידי PCR. השימוש בתאי גזע עובריים F1 שנוצר על ידי מעבר Mus musculus 129 עם Mus castaneus מאפשר שני אללים כדי להיות מובחן על ידי אלל ספציפי PCR 18,24. הגנום ההיברידי בתאים אלו, מסייע הקרנה מחיקה ספציפית אלל וניתוח ביטוי. בממוצע יש SNP כל נ"ב 125 בין שני אלה הגנוםמתן, גמישות בעיצוב פריימר לביטוי גנוטיפ מנתח. הנוכחות של SNP אחד יכול להשפיע על טמפרטורת ההתכה פריימר (מ T), ולמקד סגוליות PCR כמותי בזמן אמת (qPCR) הגברה המאפשר אפליה של שני אללים 25. יתר על כן חוסר התאמה בתוך הסוף '3 ​​של פריימר משפיעה מאוד על היכולת של DNA פולימרז להאריך מן פריימר למנוע הגברה של יעד אלל הרצוי 26. כמתואר בפרוטוקול הבא הוא השימוש בתאי גזע עוברי F1 עבור מחיקות משפרות ספציפית אלל של יותר מ 1 kb וניתוח ביטוי שלאחר מכן באמצעות מערכת עריכת הגנום CRISPR / Cas9 (איור 1).

איור 1
איור 1. מחיקת Enhancer באמצעות CRISPR / Cas9 ללמוד ציס -regulation של ביטוי גנים. (א) בתאי גזע עובריים F1 שנוצר על ידי הכלאה בין Mus musculus 129 Mus castaneus משמשים כדי לאפשר למחיקה ספציפית אלל. (ב) שני RNAs המדריך (gRNA) משמש כדי לעורר מחיקת Cas9 בתיווך גדולה של האזור משפר. (ג) קובע פריימר ומשמשים לזיהוי מונו גדול ומחיקות דו-אללים. פריימרים הכתומים הם פריימרים בפנים, פריימרים הסגול הם פריימרים מחוץ ואת פריימרים הירוקים הם פריימרים איגוף gRNA. (ד) שינויים בביטוי הגנים מנוטרים באמצעות qPCR אלל ספציפי. RFU מציין יחידות קרינה יחסיות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. תכנון והקמת gRNA

  1. להסיר אזורים משפר תעתיק להשתמש בשני gRNAs, אחד 5 'ואחד 3' של האזור של עניין. השתמש מסלול דפדפן גנום העכבר UCSC שנוצר על ידי מעבדת ג'אנג לזהות רצפי gRNA ייחודיים (http://www.genome-engineering.org 15). הבא לבדוק gRNAs אלה PAM הסמוך אליהם עבור SNPs ו indels באמצעות כלים מקוונים הניתנים על ידי מכון סנגר (www.sanger.ac.uk/sanger/Mouse_SnpViewer/rel-1211) 27-28. כדי למקד הן אללים עם יעילות שווה, למנוע רצפי gRNA / PAM המכילים SNP או indel.
    1. בעת בחירת gRNA, לבדוק את הכדאיות של עיצוב פריימרים ספציפיים אלל עבור genotyping את המחיקה. ראה גם סעיף 5 עבור עיצוב פריימר אלל ספציפי.
  2. הרכב את שני פלסמידים gRNA מבוססים על הפרוטוקול המתואר מאלי et al. 2013 15. לשלב את int רצף 20 נ"ב היעד הייחודי שנבחרO את oligonucleotides 61mer כפי שמוצג בטבלה 7 (רצפים מוצגים 5 'ל 3' כיוון, ואת הבסיסים מודגשים הם רצף היעד 20 נ"ב כי הם משלים הפוכים זה מזה).
    1. מערבבים 10 μl של 10 מיקרומטר gRNA Primer_F ו -10 μl של 10 מיקרומטר משלימים Primer_R בתוך שפופרת.
    2. לחשל פריימרים על ידי דוגרי תמהיל פריימר ב 100 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ולאחר מכן לצנן 1 ° C / sec 25 ° C. לצעד זה, להשתמש במכונת PCR או במקום הצינור במים רותחים ולאפשר לו להתקרר RT.
    3. לתערובת פריימר annealed, מוסיפים את תערובת התגובה הבאה לדגור על 72 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כדי להאריך כל צבע יסוד: 18.5 μl של מים, 10 μl של חיץ 5x HF, 1 μl של 10 מ"מ dNTP לערבב 0.5 μl של גבוהה פולימראז נאמנות DNA.
    4. הפעל 10 μl של שבר היעד על ג'ל agarose 2% כדי לאשר את שברי מדריך 100 נ"ב הופקו.
    5. Linearize וקטור gRNA (מתנה George הכנסייה; Addgene פלסמיד # 41,824) 15 עם AFL השנייה באמצעות התגובה הבאה להגדיר: 5 μl של עמוד השדרה וקטור gRNA (2-4 מיקרוגרם), 5 μl של חיץ 10x, 3 μl של AFL השנייה (20 יחידות / μl) ו -32 μl של מים. דגירת תערובת התגובה במשך 3 שעות ב 37 מעלות צלזיוס.
    6. הפעל את המוצר מתעכל על ג'ל 1% agarose ולטהר את הלהקה DNA המתאים 3.5 kb לינארית וקטור gRNA באמצעות ערכת חילוץ ג'ל על פי ההוראות של היצרן.
    7. הגדרת התגובות הרכבה גיבסון 29-30 באמצעות וקטור gRNA לינארית ולכוון שבר משלב 1.2.3 כדלקמן: 1 μl של וקטור ליניארי gRNA (50 ng / μl), 1 μl של שבר היעד, 10 μl של תמהיל מאסטר הרכבה 2x גיבסון ו -8 μl של מים. דגירת תגובות על 50 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות.
  3. טרנספורמציה של תאים E.coli עם מורכבים gRNA וקטור.
    1. מערבבים 1 μl של וקטור gRNA המורכב מ 1.2.7ו 50 μl של DH5α (זן E.coli) תאים צינור. להפוך את תאי DH5α בשיטת הלם חום על ידי חשיפת התאים ל -42 מעלות צלזיוס למשך 45 שניות.
    2. צמד לצנן את הצינורות על קרח דק 5; ולאחר מכן להוסיף 400 μl של מדיום SOC ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 45 דקות בתוך חממה רועדת.
    3. מורחים 100 μl של תאים DH5α על LB-kanamycin (50 מיקרוגרם / מ"ל) צלחת סלקציה חיובית של תאים טרנספורמציה דגירה O / N ב 37 מעלות צלזיוס.
  4. הקרנת מושבות חיוביות E.coli עבור gRNA הכנס.
    1. פיק מושבה ו resuspend kanamycin עמיד ב 3 מ"ל LB המכיל 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​של kanamycin. חזור על אותו במשך 6-8 מושבות דגירה כל הצינורות ב 37 מעלות CO / N בתוך חממה רועדת.
    2. חלץ פלסמידים מתרבה מבוגר O / N באמצעות פלסמיד ערכת הכנת מיני על ידי ביצוע הוראות היצרן.
    3. הכן תערובת תגובת עיכול Ecor לי לבדוק כנס רצף gRNAפלסמיד. עבור כל דגימה, להכין את תערובת התגובה כדלקמן: 2 μl של חיץ האנזים, 1 μl של לי Ecor, 15 μl של מים. Aliquot את תערובת התגובה לתוך צינורות 1.5 מ"ל ולהוסיף 2 μl של פלסמיד. דגירת הצינורות ב 37 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות.
    4. הפעל את המוצר מתעכל על ג'ל 1.5% agarose.
      הערה: דגימות עם הכנס יציג גודל הלהקה 475 נ"ב כי הוא 100 נ"ב גבוה יותר מאשר שיבוטים ללא מוסיף.
      הערה: לחלופין, השיבוטים החיוביים יכולים להיות מוקרנים על ידי מושבה PCR באמצעות SP6 (קדימה) ו T7 (הפוך) פריימרים (לוח 7) אשר נקלטים על ידי רצף הווקטור לתת שבר גודל 642 נ"ב בנוכחות של gRNA הכנס. גישת מושבת PCR יש יתרון כאשר שיש אתר הגבלת Ecor שאני בתוך רצף gRNA.
  5. אשר את הרצף של gRNA הכנס ידי DNA רצף שימוש פריימר T7.

2. Transfection

הערה:Electroporation היא שיטה יעילה של transfecting פלסמידים לתוך בתאי גזע עובריים. השיטה המתוארת כאן משתמשת בטכנולוגית transfection microporator.

  1. לגדל תאים ES F1 בצלחת 10 ס"מ מצופה ג'לטין המכיל 10 מ"ל של התקשורת תא גזע עובריים (טבלה 1) על 37 מעלות צלזיוס / 5% CO 2. כאשר התאים מגיעים 85% confluency להסיר את המדיה ומוסיפים 2 מ"ל של טריפסין. לדגור על 37 מעלות צלזיוס CO 2 באינקובטור במשך 5 דקות.
    הערה: תאי F1 ES התקבלו ברברה Panning 24 והם זמינים על פי בקשה.
  2. לנטרל את טריפסין על ידי הוספת 10 מ"ל של התקשורת ספין (טבלה 2). פיפטה מספר פעמים כדי לנתק את התאים לחלוטין.
  3. לאסוף את כל התאים בתוך שפופרת 15 מ"ל ו ספין על XG 300 במשך 5 דקות. Resuspend ב 3 מיליליטר PBS ולספור את התאים באמצעות hemocytometer או נגד תא אוטומטי.
  4. גלולה 1 x 10 6 ES תאים צינור 1.5 מ"ל על ידי צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות ו resuspend ב 100 μl של R (resuspension) חיץ כפי שסופק על ידי יצרן הערכה.
  5. הוסף 5 מיקרוגרם כל אחת pCas9_GFP (מתנה קיראן Musunuru; Addgene פלסמיד # 44,719) 31, 5 'ו 3' פלסמידים gRNA למחיקה של אזור היעד ומערבבים בעדינות עם טפטפת, כדי למנוע את כניסתה של בועות.
  6. השתמש קצה פיפטה האלקטרוני לשאוב 100 μl של תמהיל electroporation, להיות זהיר, כדי למנוע בועת הקצה.
  7. תכנת את וולט, רוחב וקטניות עבור electroporation. עבור תאים F1 ES, השתמש 1,400 V, 10 msec 3 פולסים.
  8. בעוד electroporation פועל להתבונן הקצה לצפות לכל ניצוצות בתמיסה. ניצוץ מעיד על קיומו של בועת אוויר יפריע transfection.
  9. הוצא את בתאי גזע עובריים transfected לתוך צלחת 10 ס"מ מצופה ג'לטין המכיל 10 מ"ל ES תא התקשורת (טבלה 1) ו לדגור על 37 ° C / 5% CO 2.

3. FACS מיון תאים transfected

  1. לאחר 48 שעות, לנתק את התאים על ידי הוספת 2 מ"ל של טריפסין ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס CO 2 באינקובטור במשך 5 דקות.
  2. לנטרל את הצלחת על ידי הוספת 10 מ"ל של חיץ אוסף (לוח 3). אוספים את התאים בתוך שפופרת 15 מ"ל ו ספין על XG 300 במשך 5 דקות.
  3. בטל supernatant ו resuspend התאים 1 מ"ל של חיץ מיון (לוח 4). ספירת התאים לדלל המבוסס על פלטפורמת המיון. לדלל את התאים 0.5-1 x 10 6 תאים / מ"ל למיון ל -15 מ"ל צינורות למיון תאים בודדים ישירות לתוך צלחות 96-היטב, לדלל את התאים 2-5 x 10 6 תאים / מ"ל.
  4. מיין תאים Cas9-GFP + ES באמצעות זרימת FACS cytometer 32. איסוף תאים בתפזורת צינורות עם 2 מיליליטר תקשורת התאוששות (לוח 5) וצלחת כמתואר 3.5 לקטיף מושבה, או מעין תאים בודדים ישירות לתוך צלחות ג'לטין מצופה 96-היטב המכילות 100 μl תקשורת תא ES / טוב (
  5. זרע 1-1.5 x 10 4 GFP + ES תאים בצלחת 10 ס"מ מצופה ג'לטין המכיל 10 התקשורת תא מ"ל ES (טבלה 1). ציפוי בצפיפות נמוכה זה יקל לקטוף מושבות תאי ES פרט.

4. Culturing המשובטים עבור Genotyping, ניתוח ביטוי מניות תא הקפאה

  1. ביום 4-5 לאחר המיון, להבקיע היטב בכל 96-גם צלחות מסודרות ישירות לנוכחות של מושבות תאי ES.
    1. לנתק מושבות תאים ES על ידי הסרת התקשורת והוספת 30 μl של טריפסין. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. לנטרל את טריפסין על ידי הוספת 170 μl של התקשורת תא ES (טבלה 1), ו פיפטה למעלה ולמטה עבור ניתוק מוחלט של המושבה לתוך תאים בודדים. לגדל את התאים ב 37 ° C / 5% CO 2 עד שרוב בארות למעלה מ -70% ומחוברות (בדרך כלל 2-3 ימים).
  2. לחלופין לבחור מושבות תאי ES בודדות 10 מנות סנטימטר באמצעותמיקרוסקופ הפוכה. לאחר aspirating המושבה לתוך צעד מעקב פיפטה טיפ 4.1.1 הצבת כל מושבה אחד טוב של צלחת 96-היטב, pretreated עם ג'לטין המכיל 30 μl של טריפסין.
    הערה: מושבות יכולות לשבת טריפסין ב RT בעוד שורה שלמה אחת המושבות נקלטת.
  3. לאחר כל המושבות כבר הרים ו ניתקו לתוך תקשורת לגדל את התאים ב 37 מעלות צלזיוס CO 2 באינקובטור עד שרוב הבארות למעלה מ -70% ומחוברות (בדרך כלל 2 ימים).
  4. כאשר 96-גם הצלחות מוכנות עבור פיצול, להסיר את המדיה, להוסיף 30 μl של טריפסין ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. לנטרל את טריפסין על ידי הוספת 180 μl של התקשורת תא ES (טבלה 1) לכל היטב פיפטה ולמטה עבור ניתוק מוחלט לתוך תאים בודדים.
  5. מתוך 210 μl וכתוצאה מכך, זרע 70 μl לשלוש מצופה ג'לטין 96-גם צלחות שכל אחת מהן מכילה 130 μl של התקשורת תא ES / טוב (טבלה 1). להשתמש בצלחות אלה עבור GEnotyping, ניתוח ביטוי והקפאת מניות תא עבור כל שיבוט כמתואר להלן.
  6. כשהצליח גנוטיפ מגיע 70-85 מפגש%, לטפל הצלחת כמתואר בסעיף 6 "גנוטיפ את המחיקה".
  7. כשהצליח ניתוח הביטוי מגיע 70-85% מפגש, להסיר את המדיה, לאטום את הצלחת עם איטום קלטת ולאחסן ב -80 ° C עד השיבוטים כבר genotyped.
    הערה: צלחת ניתוח הביטוי שימושית לנתח שינויים בביטוי גנים ב הקטעים הראשונים של השיבוטים. ניתוח התבטאות גנים מהצלחת 96-היטב אפשרי אבל כמו מספרי התא נמוכים ערכת חילוץ מיקרו RNA מומלץ.
  8. הכנת מאגר להקפיא 96-היטב פלייט:
    1. כשהצליח למניות תא קפוא (מלאה-1) מגיע 70-85% מפגש, לשאוב את התקשורת, להוסיף 30 μl של טריפסין ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
    2. לנטרל את טריפסין על ידי הוספת 100 μl של תקשורת תא ES (טבלה 1) to כל טוב פיפטה מעלה ומטה עבור ניתוק מוחלט לתוך תאים בודדים.
    3. העברת 15 μl של תאים מושעה מכל טוב לשתי צלחות ג'לטין מצופה 96-היטב, כל 185 μl המכיל של התקשורת תא ES (טבלה 1) ולאפשר לגדול ב 37 ° C / 5% CO 2.
      הערה: אפשרות זו מיועדת מנייה-2 ו -3 צלחות שהן שיבוטי גיבוי נוספים במקרה החייאת התאים ממלאי-1 הוא לא מוצלחת.
  9. בינתיים, אל 100 μl של תאים הנותרים בצלחת 96-היטב (מלאה-1), להוסיף 100 μl של 2x הקפאת תקשורת (לוח 6). חותם את הצלחת עם סרט איטום ובמהירות להפוך את הצלחת 4-5 פעמים עבור ערבוב נאות. אחסן את הצלחת ב -80 מעלות צלזיוס עד שיבוטים הם genotyped.
  10. כאשר המנייה-2 ומלאים-3 הצלחות מוכנות להקפאה לשאוב התקשורת, להוסיף 30 μl של טריפסין ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. לנטרל את טריפסין על ידי הוספת 70 μl של תקשורת תא ES (Tמסוגל 1) לכל היטב פיפטה ולמטה עבור ניתוק מוחלט לתוך תאים בודדים.
  11. הוספת 100 μl של תקשורת הקפאת 2x, לאטום את הצלחת עם איטום קלטת ובמהירות להפוך את הצלחת 4-5 פעמים עבור ערבוב נאות. אחסן את הצלחת ב -80 מעלות צלזיוס עד הצלחות אלה נדרשים.

עיצוב 5. אלל ספציפי פריימר

  1. עיצוב 4 סטים של פריימרים (תרשים 1C) להקרין את שיבוטים למחיקה הרצוי: בתוך Primers, בחוץ, gRNA איגוף פריימרים (עבור 5 שני 'ו 3' gRNA היעד אתרים) כמפורט להלן.
    1. השג את המסלול SNP המתאים גנוטיפים 129 ו יצוקה ב http://labs.csb.utoronto.ca/mitchell/crispr.html. המסלול הנתון תערוכות החלפות בסיס בין 129 ו יצוק ב קואורדינטות באסיפת גנום עכבר mm9.
      הערה: הקישור באתר מעל יפנה אל דפדפן הגנום UCSC ולהוסיף מסלול מותאם אישית המכיל את SNPs בין 129 ו משתתף geמחוזות.
    2. הזן את הקואורדינטות של האזור למחיקה. זום על אזור של כ -500 נ"ב באמצע המחיקה הרצויה המכילה> 3 SNPs.
    3. הקלק על תצוגה> DNA בבר אפשרות ולחץ לקחת דנ"א להוריד רצף היעד בכל פורמט רישית.
    4. צור שני רצפים FASTA; אחד עבור 129 והאחד יצוק ידי החלפת בסיס במיקום SNP. סמן את SNPs ידי אותיות קטנות.
    5. עבור אל Primer3 פלוס (http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi/) ולהדביק את SNP להחליף 129 ברצף. השתמש בהגדרות ברירת המחדל לתכנן פריימרים.
    6. כדי לעצב את פריימרים בתוך ספציפי אלל לבחור Primer_List בתפריט ירידת משימה ולחץ הפיק פריימרים. בחר פריימר קדימה או אחורה כי יש SNP או ב 'בסוף או בתוך 4 בסיסים מן 3' 3 ונופל שבתחומי האזור למחיקה.
      הערה: Primers שיש להם SNP בתצוגת 3'end גדל סגולי אלל ב qPCR.
    7. כדי לבחור את החזר פריימר השני לדף הראשי, בחר איתור בתפריט ירידת המשימה ולהדביק את רצף פריימר הראשון בתיבה המתאימה בתחתית הדף. בלשונית ההגדרות הכלליות שנה את ההגדרה עבור טווח גודל מוצר 80-200 נ"ב ולחץ פיק פריימרים. בחר פריימר שתחילתו הזוגות פריימר המפורטים; אלה יהיו פריימרים אלל ספציפי בתוך 129.
    8. חזור על שלבים 5.1.5 5.1.7 לתכנן פריימרים עבור האלל יצוקה.
    9. חזור אל דפדפן הגנום UCSC והזן את הקואורדינטות-שיתוף של האזור למחיקה. הקלק על תצוגה> DNA בבר האפשרות, תחת אפשרויות אזור יחזור רצף להוסיף 1,000 נ"ב במורד זרם לחץ לקבל DNA להוריד רצף היעד.
    10. סמן את רצף יעד gRNA בסוגריים. שמור רצף כולו המעשה לפני שאתם ממשיכים.
    11. כדי לעצב את פריימרים מחוץ להסיר את הרצף בין רצפי יעד שני gRNA. חזור על שלב 5.1.4-5.1.8 לעצב את פריימר אלל ספציפי מחוץים אך לשנות את גודל המוצר 400-800 נ"ב.
    12. פיצול הרצף שהושג בשלב 5.1.10 לשני רצפים, כל אחד עם 500 נ"ב 5 'ו 3' של רצף יעד gRNA. חזור על שלבים 5.1.5 5.1.7 בעיצוב פריימרים ספציפיים שאינם אלל עבור אזורים gRNA איגוף אבל לשנות את גודל המוצר 400-800 נ"ב.
      הערה: פריימרים ספציפיים שאינם אלל, או 129 או רצף עופרת ניתן להשתמש צריך להבחר פריימרים שאינם מכילים SNP. מומלץ להגדיר גודל המוצר של 400-800 נקודות בסיס לעיצוב החוצה gRNA איגוף פריימרים. זה מאפשר הגברה גם אם indels הקטן נוכח.
  2. בדוק את פריימרים בתוך עבור סגוליות אלל ידי qPCR באמצעות DNA גנומי זן 129 ו יצוקה טהור 2 ng / μl. בצע צעד 6.2-6.4 להקים התגובה qPCR.
    הערה: אם הגנוטיפ 129 האזור זהה C57BL / 6J, דנ"א C57BL / 6J יכול לשמש במקום 129 DNA. פריימרים אלל ספציפי צריכים להציג לפחות 5 מחזוריםההפרש בין השווי CT (סף מחזור) על הנכונות לעומת הגנוטיפ שגוי. פריימרים מחוץ יכול להיבדק על מנת להבטיח שהם להגביר את המחיקה באמצעות Cas9 / gRNA transfected לתאי גזע עובריים, ו- DNA F1 גנומי בהתאמה כמו בקרות חיוביות ושליליות. אלל-הסגולי של פריימרים מחוץ ניתן לבדוק פעם שיבוטי monoallelic זוהו.

6. Genotyping את המחיקה

  1. חלץ הדנ"א הגנומי מהצלחת 96-היטב genotyping באמצעות צלחת משלב 4.6 שנוצר לאחר הרחבת המושבה.
    1. מכינים את תערובת מיצוי DNA גנומי: 89 μl של מים, 10 μl של 10x חיץ 1 μl של מגיב מיצוי (המסופקים על ידי היצרן). הוספת 100 μl של תערובת מיצוי DNA גנומי זה טוב לאטום את הצלחת עם סרט האיטום.
    2. דגירה את הצלחת על 75 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ואחריו 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
    3. אפשר הצליח להתקרר על ידי דוגר על קרח למשך דקות ספורותד אז צנטריפוגות בקצרה ליישוב מי עיבוי לתחתית הבאר. זה משמש את הצלחת ה- DNA תבנית להקרנה המחיקה.
  2. הגדר את התגובות qPCR בשני עותקים עבור כל שיבוט כדלקמן: 5 μl של תמהיל 2x SYBR qPCR, קדימה לאחור תחל (3 מיקרומטר) כל 1 μl ו 1 μl של מים. השתמש פיפטה רב להוסיף 2 μl של תבנית ה- DNA ואחריו 8 μl של תערובת התגובה היטב בכל צלחת 384 גם.
  3. חותם את הצלחת עם איטום קלטת ספין ב 600 XG למשך 2 דקות לערבב את תוכנו. מניחים את מערך צלחת 384 גם ב Cycler בזמן אמת.
  4. תכנית את Cycler בזמן האמת עבור PCR 2-צעד ואחריו ניתוח עקום להמס עם זיהוי כדלקמן: 1 מחזור ב 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, 40 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות, 62 ° C למשך 30 שניות עם קריאת צלחת ו -95 מעלות צלזיוס למשך 10 שניות, 65 ° C עד 95 ° C עם תוספת של 5 מעלות צלזיוס למשך 5 שניות + צלחת לקרוא.
    הערה: בנוסף פריימר העיצוב, qPCR מילx ופרמטרי מחזור גם לתרום פריימר סגולי. הפרמטרים שתוארו לעיל ריאגנטים המפורטים חומרים יותר להניב לעתים קרובות הגברת אלל ספציפית.
  5. ניתוח תוצאות qPCR
    1. בדוק כל אלל הגברה עם פריימרים אלל ספציפי בפנים. אין הגברה של אלל אחד או הבדלי ערך Ct גבוה (> 5 מחזורים) בין אללים מציעים שיבוטים אלה לשאת מחיקה הטרוזיגוטיים של האלל עם ערך Ct הגבוה / נעדרים. אין הגברה של שני אללים עולה כי הם נושאי מחיקה הומוזיגוטים.
    2. בדוק כל אלל הגברה עם פריימרים אלל ספציפי בחוץ. כאשר מחיקת היעד היא גדולה יותר מאשר הגברת 1 kb עם פריימרים מחוץ מתרחש רק כאשר מחיקה היא הווה. ערך ה- CT של 22-28 מאשר את המחיקה. לקבלת מחיקות היעד שלהן קטנה מ- 1 kb, לאשר את גודל amplicon ידי אלקטרופורזה.
      הערה: אם פריימרים מחוץ להראות אלל-סגוליות מתונה בלבד (ראה figuבתשובה לשאלה 2), ניתן לקבל amplicons עם שתי קבוצות פריימר אללים שיבוטי monoallelic עקב הגברת יעד הנחה של פריימרים בחוץ. במקרה זה בדל ערך Ct בין שני אללים של מחזורים חמישה לפחות אמור לאשר את אלל הנכון (ערך ה- CT נמוך) נמחק על בסיס התוצאות שהתקבלו פריימרים בפנים. אם על היעד לעומת הבדל Ct אלל יעד ההנחה הוא פחות מחמישה מחזורים לעצב אלל חדש פריימרים מחוץ ספציפי.
    3. שיבוטים מחיקים monoallelic לבדוק את תקינות האלל הלא שנמחק באמצעות ההקרנה משני, gRNA איגוף פריימרים.
      הערה: indels של> גודל 25 נ"ב סביב האתר היעד gRNA ניתן לזהות על ידי התבוננות שינוי בעקום להמיס את qPCR עבור 400-800 amplicons נ"ב. לחלופין, amplicons מן פריימרים איגוף gRNA יכול להיות רצף לזהות indels קטן של <25 נ"ב.
      1. בצע qPCR עם 2 סטים של פריימרים gRNA איגוף כלומר, 5 'ו 3' זRNA שבשימוש בתהליך יצירת מחיקת CRISPR. אין הגברה עם קבוצות אלה של פריימרים מציינת indels הגדול יותר amplicon qPCR נוכח באתר יעד gRNA על האלל הלא-deleted של שיבוטים מחיקים monoallelic. שיבוטי מחק המכילים indels הגדול אלה בניתוחים נוספים כמו התוצאות עשויים להיות קשים לפרש בלי לדעת את ההיקף המחיק.
  6. לטהר את amplicons המתקבל התגובה מחוץ פריימר qPCR באמצעות PCR לנקות ערכה ממלא את ההוראות של היצרן.
  7. אשר את הרצף של אלל נמחק על ידי ה- DNA רצף מוצר PCR מטוהר מהשלב הקודם. השתמש פריימרים הגברת qPCR עבור קדימה הפוך רצף.
    הערה: בשעה SNPs בשלב זה בתוך מעשה amplicon כאישור משני של הגנוטיפ של אלל נמחק.

7. ביטוי ניתוח עם פריימרים ספציפיים אלל

  1. הפשרת pl מניות תא 96-היטבאכול מאוחסן ב -80 ° C (מלאה-1 משלב 4.9) על ידי הצבתו על אמבט חרוז חם. כאשר יותר ממחצית הבארות בצלחת הם הפשירו, ספין ב XG 300 במשך 5 דקות.
  2. בזהירות, הסר את סרט האיטום ולהעביר את התאים במהירות מבארות חיובית המחיקה לתוך מצופה ג'לטין, צלחות 12-היטב המכיל 1 מ"ל של התקשורת תא גזע עובריים (טבלה 1) ו לדגור על 37 ° C / 5% CO 2.
  3. כשהצלחת מגיעה 70-85% המפגש, מעבר התאים ולפצל אותם לשלוש בארות צלחת ג'לטין מצופה, 6-היטב, שכל אחת מהן מכילה 2 מ"ל של התקשורת תא גזע עובריים (טבלה 1). השתמש שתי בארות להכין 2 בקבוקונים של מניות תא קפוא עבור אחסון לטווח ארוך בחנקן נוזלי (כמתואר בשלב 8) ואת הבאר השלישית להפקת RNA.
  4. חלץ RNA באמצעות ערכת חילוץ RNA.
  5. המרת 100-500 ננוגרם של רנ"א cDNA ידי בהעתקה הפוכה (RT) רנ"א באמצעות ערכת סינתזת cDNA בעקבות הפרוטוקול של היצרן. כלול n RTתגובת egative עבור כל דגימת RNA כדי לפקח על כמות זיהום DNA בדגימות RNA.
  6. לדלל את cDNA לפני qPCR על יחס של בין 1: 2 ו -1: 4; בהתאם לרמת הביטוי של גן היעד בתאי גזע עוברי.
  7. הגדר את qPCR כמתואר לעיל כולל DNA F1 גנומי כמו עקומת סטנדרט (5 דילולים לקפל 250-.08 ng / μl) כימות מוחלטת של רמות תמליל. השווה את הביטוי של כל אלל של הגן של הריבית בכל שיבוט נמחק אישר גן בקרה מתאימה, למשל GAPDH (פריימרים המפורטים בטבלה 7).
    הערה: פריימרים גן הבקרה לא צריך להיות אלל ספציפי. עיצוב פריימר אלל ספציפי זהה עבור פריימרים RT-qPCR כמתואר עבור פריימרים גנוטיפ למעט לאזור המיקוד של הגברה. רצף הגן אמור לשמש; אם באמצעות פריימרים עבור אקסון בודד או גבול אקסון-אינטרון (לפקח תמליל העיקרי) DNA F1 הגנומי יכול לשמשעקומת סטנדרט. לפרטים נוספים על RT-qPCR עיין לפורלנזה et al. 2012 33.

8. הכנת מאגר הקפאה עבור אחסון לטווח ארוך של בתאי גזע עובריים

  1. הוספת 300 μl של טריפסין לכל היטב 6 (משלב 7.3) ו דגירה במשך 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. הוסף 2 מ"ל של ספין תקשורתי (טבלה 2) כדי לנטרל טריפסין ו פיפטה מעלה ומטה מספר פעמים כדי לנתק לתוך תאים בודדים.
  2. העברת התאים לתוך צינור ספין 15 מ"ל ב 300 XG במשך 5 דקות.
  3. לשאוב supernatant ולהוסיף 500 μl של התקשורת תא ES (טבלה 1). פיפטה מעלה ומטה כדי resuspend התאים.
  4. מעביר את התוכן לצינור 1.5 מיליליטר cryovial ולהוסיף 500 μl של תקשורת הקפאת תא 2x ES (לוח 3). מערבבים היטב על ידי צינור היפוך ובמקום הצינור לתוך מיכל הקפאה תא נטול אלכוהול. מניחים את התא הזה הקפאת מכולות ב -80 מעלות צלזיוס למשך 12 שעות לפחות לפני transferring לתוך מיכל אחסון חנקן נוזלי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הפרוטוקול המתואר כאן משתמש בתאי F1 ES ללמוד -regulation cis של ביטוי גנים בתאים נמחקו משפרים monoallelic שנוצרו באמצעות CRISPR / עריכת הגנום Cas9 (איור 1). GRNA ועיצוב פריימר ספציפי אלל עבור genotyping ביטוי גנים הם גורמי המפתח בגישה זו. כל קבוצת פריימר אלל ספציפי חייבת להיות מאומתת על ידי qPCR כדי לאשר סגולי אלל. פריימרים אלל ספציפי כי להגביר רק יעד הדנ"א הגנומי שלהם הם אידיאליים (איור 2). באופן אידיאלי פריימרים האלה יש SNP ב -3 שלהם "בסופו של דבר. Primers עם אלל-סגולי פחות ניתן להשתמש אם הם מציגים מינימום של בדל ערך Ct 5 ההגברה שלהם של הפוליטיקלי לעומת הגנוטיפ השגוי 25. Primers שנושא SNP יותר 5 'מ לבסיס 4 th מן 3 "סוף בדרך כלל נכשל להפגין סגולי אלל ולהגביר גנוטיפים הוא באותה מידה של יעילות,חושף את החשיבות של העמדה SNP ב פריימר 34. בנוסף חילוף purine / purine או pyrimidine / פירימידין הוכח יש השפעה גדולה יותר על ההבדל T מ 'של שני פריימרים לעומת חילוף purine / פירימידין 25.

הקרנה ראשונית של צלחת 96-היטב של DNA שבודד שיבוטי תא ES מתנהלת עם פריימרים בתוך ספציפי אלל לזהות שיבוטים שנושאי מחיקה על אללים אחד או שניהם. שיבוטים נמחקו אלה מוקרנים נוספים עם פריימרים אלל ספציפי מחוץ לאשר כל מחיקה. הדוגמא שניתנה כאן היא מ- זוג gRNA יעיל שהסתיים ב -46% של שיבוטים נושאים מחיקה על 129, יצוק, או שניהם אללים (איור 3). הקרנה משני נעשתה עבור שיבוטים מחיקים monoallelic אשרו לזהות indels סביב אתרי יעד gRNA על האלל הלא שנמחק ואת תדירות occurr indelence באתר היעד gRNA הוא 23 גבוה. Indels ברחבי gRNA אינו ניתן לזיהוי ב ההקרנה הראשית, כמו שיבוטים אלה מראים מחיקים עם פריימרים בפנים ואל להגביר עם פריימרים בחוץ (איור 4). שיבוטים מחיקים Monoallelic שנותנים הגברה עם שני הקבוצות של שמאל וימין פריימרים איגוף gRNA יש אלל האחרים שלהם לא הוכתמו כפי שהם אינם מכילים מחיקה גדולות יותר 5 'או 3' amplicons איגוף gRNA. רצף amplicons מן פריימרים איגוף gRNA יזהה indels קטן יותר amplicons איגוף gRNA אשר לא יכול להיות מורגש בתוך qPCR. משובטי המחיקה monoallelic כי לא נותנים הגברה בשני אזורי ההקרנה המשנית אינם כלולים עבור ניתוח ביטוי גנים נוסף. כאזורים יעד gRNA נבחרים מחוץ לאזור חשד יש פונקציה משפרת, indels הקטן יותר amplicons איגוף gRNA אינו צפוי להשפיע על תפקוד משפר ומשכפל conניתן לכלול taining אלה לניתוח נוסף.

כדי להגביל את מחיקה גדולה אלל אחד gRNA יכול להיבחר אשר חופף SNP באזור הזרע או PAM. מתואר כאן הוא דוגמא של מחיקה יעילה גבוהה (53%) על 129 אלל עקב SNP ב- PAM עבור 3 'gRNA על האלל היצוק (איור 5). מחיקה זה הסירה את SCR, משפר ספציפי Sox2 תאר לאחרונה בתאי גזע עובריים 18,22. למרות כניסתה של המחיקה הגדולה הייתה פחותה בהרבה על האלל היצוק, שלושה שיבוטים (1, 11, 75) זוהו עם מחיקה גדולה על האלל היצוק (איור 5). מבין שלושת שיבוטים אלה שני (1, 11) הכיל 3 'נקודות מעבר בתוך 50 נ"ב של 3' באזור היעד gRNA. עבור שיבוט השלישי לא הצלחנו לזהות את 3 'נקודת פריצה והגיע למסקנה כי המחיקה היה גדול מ -11 kb 18. מחיקות עם אחד או שניהם שלנקודות מעבר ir הממוקמות> 100 נ"ב משני באזור היעד 5 'של 3' gRNA קשים גנוטיפ, חשבון בדרך כלל 15-30% של כל הכפילים, ולהישאר uncharacterized בהקרנה הראשונית המחיק לא מוגבר עם החוץ פריימרים.

לאחר שיבוטים עם המחיקה monoallelic זוהו הם מנותחים עבור ביטוי גנים ספציפיים אלל באמצעות כימות מוחלטת על ידי שעתוק לאחור qPCR. התבטאות גנים של שיבוטים נושאים מחיקת monoallelic האזור משפר Sox2 הקריטי, SCR, מוצגת כאן בהשוואת ביטוי בתאי wild-type F1 ES (איור 6). באופן ספציפי, שיבוטים נושאים מחיקה של האזור משפר על האלל 129 מציג ירידה ב 129 רמות תמליל ואילו שיבוטים נושאים מחיקה על האלל היצוק מציגים ירידה ברמות התמליל יצוק. ניתוח ביטוי הגנים ספציפי אלל חשף הב באזור משפר דיסטלי זה, SCR, הוא -regulator ציס קריטי של Sox2 בתאי גזע עובריים 18.

איור 2
איור 2. בדיקה הספציפית-אלל של 129 ו יצוק פריימרים אלל ספציפי. (א) הגברה מ פריימרים עבור גנוטיפ 129. (ב) הגברה מ פריימרים עבור גנוטיפ היצוקה. בשני A ו- B קו להציג את פרופילי הגברת הדנ"א הגנומי C57BL / 6 אשר יש גנוטיפ זהה כמו 129 הדנ"א SNPs הספציפי אלה; הקווים עם עיגול פתוח להציג את פרופילי הגברת הדנ"א הגנומי יצוק. ההגברה הנובעת פריימר משובץ אלל-הסגולי ביותר מוצגת בירוק (אלל ספציפי פריימר-1), סט פריימר מוצג הבדל 5 Ct מוצג סגול (פריימר 2 אלל ספציפי) ומערכת פריימר מוצגת הבדל מזערי ערך CT הוא represented באדום (פריימר 3 אלל ספציפי, פרטים פריימר בלוח 7). סט פריימר האדום לא יהיה מתאים להקרנה אלל ספציפית. RFU מציין יחידות קרינה יחסיות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
תוצאות איור 3. המתקבל לאחר ההקרנה צלחת 96-היטב עם אלל ספציפי בתוך ומחוץ פריימרים. (א) תוצאות qPCR מהמסך עם פריימרים בפנים (Enh_del_IS_F1_129, Enh_del _IS_F1C, Enh_del _IS_R1) B) תוצאות qPCR מהמסך עם בחוץ פריימרים (Enh_del_OS_F1, Enh del_OS_R1_129, Enh_del_OS_F2C, Enh_del_OS_R3, פרטים פריימר בלוח 7). בשנת פסים אפורים שניהם מייצגים הגברה מ פריימרים ספציפיים יציקה, פסים שחורים מייצגים הגברה מ 129 ספציפיים חסודה ERS. שימו לב שיבוטים רק עם מחיקה על אחד או שני אללים מוקרנים עם פריימרים בחוץ. ההגברה היחסית של כל אלל חושבה באמצעות 2 -CT כדי להיות קרובים ככל האפשר בריכוז ההתחלתי ובהמשך להביע כל אלל כאחוז מהסכום שני אללים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
המשובטים איור 4. עם מחיקת monoallelic מוקרנים לזהות indels הגדול באתרי יעד gRNA. Primers איגוף אזורי יעד gRNA משמש כדי לאשר כי אלל-deleted הלא הוא תם. רק שיבוטים monoallelic ללא indels גדול באתרי היעד על האלל הלא נמחק משמשים בניתוח ביטוי שלאחר מכן. "Target =" tp_upload / 53,552 / 53552fig4large.jpg _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
המשובטים איור 5. מתקבל מחיקת Sox2 SCR מוצג. הם תוצאות qPCR ממסך עם פריימרים בפנים (pr111R, pr111F_129, pr111F_Cast, פרטים בלוח 7). ברים גריי מייצגים הגברה מ פריימרים ספציפיים יציקה, פסים שחורים מייצגים הגברה מ פריימרים 129 ספציפיים. ראוי לציין, כי המחיקה היא מוטה בכבדות לעבר האלל 129 בשל נוכחותם של SNP ב- PAM של 3 באזור היעד 'gRNA על האלל היצוק. ההגברה היחסית של כל אלל חושבה באמצעות 2 -CT כדי להיות קרובים ככל האפשר בריכוז ההתחלתי ובהמשך להביע כל אלל כאחוז מהסכום שני אללים. קבצים / ftp_upload / 53,552 / 53552fig5large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 6
מחיקת איור 6. SCR מפחיתה באופן משמעותי את הביטוי של Sox2. תוצאות נציגה 129 או עופרת SCR נמחק שיבוטים. ברים אדומים מייצגים ביטוי של אלל Sox2 היציקה, הפס הכחולה מייצגת הגברה של אלל Sox2 129. מחיקה של SCR על ההתבטאות המופחתת 129 אלל של Sox2 (129) ואילו מחיקה של SCR על ההתבטאות המופחתת אלל היצוקה של Sox2 (משתתפות). הנתונים המוצגים הם ממוצעים של שלושה משכפל טכני, ברי שגיאה לא מוצגים. Primers המשמש ניתוח ביטוי Sox2 [Sox2_F, Sox2 (129) _R, Sox2 (משתתפות) _R] מפורטים בטבלה 7."Target =" pload / 53,552 / 53552fig6large.jpg _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

מֵגִיב ריכוז מניות כֶּרֶך ריכוז סופי
Glutamax 200 מ"מ 6 מ"ל 2 מ"מ
2-mercaptoethanol 10 מ"מ 6 מ"ל 0.1 מ"מ
aminoacids MEM שאינם חיוניים (NEAA) 10 מ"מ 6 מ"ל 0.1 מ"מ
נתרן פירובט 100 מ"מ 6 מ"ל 1 מ"מ
הפניצילין / סטרפטומיצין 10,000 יחידות 3 מ"ל 50 U / ml
FBS 90 מ"ל 15% CHIR99021 * 10 מ"מ 3 מיקרומטר
PD0325901 * 10 מ"מ 1 מיקרומטר
LIF * 10 7 יחידות / מ"ל 1000 U / ml
# כדי להכין תקשורת בתאי גזע עוברי, מוסיף את הרכיבים הנ"ל ל -500 מיליליטר של DMEM גלוקוז גבוה. התקשורת בתאי הגזע העוברית לא צריכה להיות מאוחסנת במשך יותר מ 4 שבועות עם מעכבים * לא יותר מ -2 שבועות.

תקשורת תא בטבלת 1. ES.

מֵגִיב ריכוז מניות כֶּרֶך ריכוז סופי
Glutamax 200 מ"מ 5 מ"ל 2 מ"מ
הפניצילין / סטרפטומיצין 10,000 יחידות 5 מ"ל 100 U / ml
FBS 50 מ"ל 10%
# להכין ספין תקשורתי, מוסיפים את הרכיבים הנ"ל ל -500 מ"ל של DMEM גלוקוז גבוהה.

תקשורת ספין טבלת 2..

מֵגִיב ריכוז סופי נפח (50 מ"ל)
1x PBS ללא Ca / Mg 2+ 42.0 מ"ל
V הפרקציה BSA (7.5%) 15% (v / v) 7.5 מ"ל
0.5 M EDTA > 5 מ"מ 0.5 מ"ל

לוח 3. חיץ אוסף.

מֵגִיב ריכוז סופי נפח (50 מ"ל)
1x HBSS 47.25 מ"ל
1M HEPES 25 מ"מ 1.25 מ"ל
0.5 M EDTA 5 מ"מ 0.5 מ"ל
V הפרקציה BSA (7.5%) 1% (v / v) 0.5 מ"ל
FBS 1% (v / v) 0.5 מ"ל

לוח 4. מיון חיץ.

דרכים "> מדיה בתאי גזע עובריים 60% FBS 40%

מדיית התאוששות לוח 5..

מדיה בתאי גזע עובריים 60%
FBS 20%
DMSO 20%

לוח 6: 2x תקשורת הקפאה.

לוח 7 א
7b טבלה
רשימה של פריימרים טבלה 7..

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

עריכת טכנולוגיה הגנום בתיווך CRISPR / Cas9 מספק שיטה פשוטה, מהירה וזולה עבור שינוי הגנום. השיטה המפורטת כאן כדי ליצור ולנתח מחיקה משפר monoallelic לאפיון משפר תפקודי מנצלת SNPs בתאי עכבר F1. היתרונות של סוג זה של גישה הם: 1) מחיקות משפרים monoallelic אינן מייצרות תופעות בלבול המתרחשות כאשר משפר קריטי נמחק אללים שניהם, כלומר, הפחתה גדולה רמות החלבון של הגן המוסדר המוביל לתא קטלני או שינה פנוטיפ; 2) האם התדירות של מחיקת monoallelic נמוכה קבלת מחיקה הומוזיגוטים היא פחות סביר; עם זאת, עם השימוש פריימרים ספציפי אלל בניתוח ביטוי גנים ניתן לנתח שיבוטים עם מחיקת monoallelic; 3) באמצעות ארבעה סטים של פריימרים להקרין מחיקות monoallelic מתיר חיסול שיבוטים המכילים מחיקות חלקיות או גדולות אשר לבלבלניתוח במורד הזרם.

עיצוב פריימר אלל ספציפי הוא קריטי עבור מונו גנוטיפ / מחיקות CRISPR biallelic וניתוח ההשפעה על ביטוי גנים באופן אלל ספציפי. זו מושגת בקלות רבה יותר כאשר תאי F1 בשימוש מכילים SNPs תכוף יותר המאפשר אפליה של שני אללים. הנה ES תאים המופקים Mus musculus 129 x Mus צלב castaneus משמשים; עם זאת, תאים אחרים יכולים לשמש אם SNPs בין שני אללים לאפשר ניתוח הקרנה וביטוי מחיקת אלל ספציפי, ואם מספיק נתונים קיימים כדי לחזות אזורים משפרים פעילים להיות ממוקדים בסוג התא הנבחר. לכן, שיטה זו ניתן להתאים לכל קו התא שבו מידע על אללים SNPs זמין. אחת המגבלות של הפרוטוקול הוא התלות SNPs במקומות ספציפיים. כמה אזורים היעד לשאת פחות SNPs מה שהופך את עיצוב פריימרים מחוץ ספציפית אלל כי להגביר <800 נ"ב וragment מאתגר. במקרים כאלה גישה PCR יכול לשמש כחלופה ההקרנה qPCR המאפשר amplicon גדול. בנוסף ייתכנו הבדלים הקשורים SNP ב הפנוטיפ של תאים F1 ES; כדי לאשר את הפונקציה של משפר ספציפי גנוטיפים נוסף ניתן לבצע מחיקות הומוזיגוטים בקווי ES סטנדרטיים. הספציפי של nuclease SpCas9 הוא נושא חשוב במיוחד בהתחשב יישומים פוטנציאליים גישות קליניות. חקירת סגוליות SpCas9 גילה כי הן באזור 6-12 NT זרע של רצף ההכרה gRNA ואת PAM הסמוך חשובים לפעילות nuclease 13-14,17. מוטציות יעד כבויות ניתן למזער על ידי ההבטחה כי אזור זרע PAM הסמוך ייחודיים בגנום להיות שונה 14,16.

גישת מחיקת monoallelic המתואר כאן בשילוב עם RNA-seq ספציפית אלל יכולה למפות לחשוף את הגן או גנים מוסדר על ידי דואר ספציפיnhancer 18. ניסויים אלה חשובים לתפקוד הגנום הבנה כמו מחיקה אפילו משפרי תוקף כתב-assay אינו תמיד להשפיע ביטוי גנים 18. יתר על כן, משפרים לא יכולים לווסת את הגן הקרוב בגנום או יכולים לווסת יותר מאחד גנים 1,20,35. כתוצאה מכך, ניתוח הפסד של פונקציה היא הגישה אינפורמטיבי ביותר לבדוק את רמת התפקוד של אזור משפר. זו יכולה להיות מושגת במהירות באמצעות CRISPR / המחיקה monoallelic בתיווך Cas9.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים קראו מדיניות של יופיטר על ניגוד העניינים ואין להם קונפליקטים לחשוף.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase NEB M0530S high fidelity DNA polymerase used in gRNA assembly
Gibson Assembly Master Mix NEB E2611L
gRNA_Cloning Vector Addgene 41824 A target sequence is cloned into this vector to create the gRNA plasmid
pCas9_GFP Addgene 44719 Codon-optimized SpCas9 and EGFP co-expression plasmid
AflII NEB R0520S
EcoRI NEB R3101S
Neon Transfection System 100 µL Kit Life Technologies MPK10096 Microporator transfection technology
prepGEM ZyGEM PT10500 genomic DNA extraction reagent
Nucleo Spin Gel & PCR Clean-up Macherey-Nagel 740609.5
High-Speed Plasmid Mini Kit Geneaid PD300
Maxi Plasmid Kit Endotoxin Free  Geneaid PME25
SYBR select mix for CFX Life Technologies 4472942 qPCR reagent
iScript cDNA synthesis kit Bio-rad 170-8891 Reverse transcription reagent
0.25% Trypsin with EDTA Life Technologies 25200072
PBS without Ca/Mg2+ Sigma D8537
0.5 M EDTA Bioshop EDT111.500
HBSS Life Technologies 14175095
1 M HEPES Life Technologies 13630080
BSA fraction V (7.5%) Life Technologies 15260037
Max Efficiency DH5α competent cells Invitrogen 18258012
FBS ES cell qualified FBS is subjected to a prior testing in mouse ES cells for pluripotency
DMSO Sigma D2650
Glutamax Invitrogen 35050
DMEM Life Technologies 11960069
Pencillin/Streptomycin Invitrogen 15140
Sodium pyruvate Invitrogen 11360
Non-essential aminoacid Invitrogen 11140
β-mercaptoethanol Sigma M7522
96-well plate Sarstedt 83.3924
Sealing tape Sarstedt 95.1994
CoolCell LX Biocision BCS-405 alcohol-free cell freezing container
CHIR99021 Biovision 1748-5 Inhibitor for F1 ES cell culture
PD0325901 Invivogen inh-pd32 Inhibitor for F1 ES cell culture
LIF Chemicon ESG1107 Inhibitor for F1 ES cell culture

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sagai, T., Hosoya, M., Mizushina, Y., Tamura, M., Shiroishi, T. Elimination of a long-range cis-regulatory module causes complete loss of limb-specific Shh expression and truncation of the mouse limb. Development. 132 (4), 797-803 (2005).
  2. Kleinjan, D. A., Lettice, L. A. Long-range gene control and genetic disease. Adv Genet. 61, 339-388 (2008).
  3. Visel, A., Rubin, E. M., Pennacchio, L. A. Genomic views of distant-acting enhancers. Nature. 461 (7261), 199-205 (2009).
  4. Maurano, M. T., et al. Systematic localization of common disease-associated variation in regulatory DNA. Science. 337 (6099), 1190-1195 (2012).
  5. Heintzman, N. D., et al. Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression. Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).
  6. Shen, Y., et al. A map of the cis-regulatory sequences in the mouse genome. Nature. 488 (7409), 116-120 (2012).
  7. Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions. Science. 316 (5830), 1497-1502 (2007).
  8. Rhee, H. S., Pugh, B. F. Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution. Cell. 147 (6), 1408-1419 (2011).
  9. Whyte, W. A., et al. Master transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes. Cell. 153 (2), 307-319 (2013).
  10. Chen, C. Y., Morris, Q., Mitchell, J. A. Enhancer identification in mouse embryonic stem cells using integrative modeling of chromatin and genomic features. BMC Genomics. 13 (1), 152 (2012).
  11. Patwardhan, R. P., et al. Massively parallel functional dissection of mammalian enhancers in vivo. Nat Biotechnol. 30 (3), 265-270 (2012).
  12. Melnikov, A., et al. Systematic dissection and optimization of inducible enhancers in human cells using a massively parallel reporter assay. Nat Biotechnol. 30 (3), 271-277 (2012).
  13. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  14. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  15. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
  16. Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nat Biotechnol. 31 (9), 827-832 (2013).
  17. Cho, S. W., et al. Analysis of off-target effects of CRISPR/Cas-derived RNA-guided endonucleases and nickases. Genome Res. 24 (1), 132-141 (2014).
  18. Zhou, H. Y., et al. A Sox2 distal enhancer cluster regulates embryonic stem cell differentiation potential. Genes Dev. 28 (24), 2699-2711 (2014).
  19. Fujii, W., Kawasaki, K., Sugiura, K., Naito, K. Efficient generation of large-scale genome-modified mice using gRNA and CAS9 endonuclease. Nucleic Acids Res. 41 (20), e187 (2013).
  20. Tuan, D. Y., Solomon, W. B., London, I. M., Lee, D. P. An erythroid-specific, developmental-stage-independent enhancer far upstream of the human 'beta-like globin' genes. Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (8), 2554-2558 (1989).
  21. Amano, T., et al. Chromosomal dynamics at the Shh locus: limb bud-specific differential regulation of competence and active transcription. Dev Cell. 16 (1), 47-57 (2009).
  22. Li, Y., et al. CRISPR reveals a distal super-enhancer required for Sox2 expression in mouse embryonic stem cells. PLoS One. 9 (12), e114485 (2014).
  23. Canver, M. C., et al. Characterization of genomic deletion efficiency mediated by clustered regularly interspaced palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 nuclease system in mammalian cells. J Biol Chem. 289 (31), 21312-21324 (2014).
  24. Mlynarczyk-Evans, S., et al. X chromosomes alternate between two states prior to random X-inactivation. PLoS Biol. 4 (6), e159 (2006).
  25. Lefever, S., Pattyn, F., Hellemans, J., Vandesompele, J. Single-nucleotide polymorphisms and other mismatches reduce performance of quantitative PCR assays. Clin Chem. 59 (10), 1470-1480 (2013).
  26. Huang, M. M., Arnheim, N., Goodman, M. F. Extension of base mispairs by Taq DNA polymerase: implications for single nucleotide discrimination in PCR. Nucleic Acids Res. 20 (17), 4567-4573 (1992).
  27. Keane, T. M., et al. Mouse genomic variation and its effect on phenotypes and gene regulation. Nature. 477 (7364), 289-294 (2011).
  28. Yalcin, B., et al. Sequence-based characterization of structural variation in the mouse genome. Nature. 477 (7364), 326-329 (2011).
  29. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  30. Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A., Venter, J. C., Merryman, C. Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome. Nat Methods. 7 (11), 901-903 (2010).
  31. Ding, Q., et al. Enhanced efficiency of human pluripotent stem cell genome editing through replacing TALENs with CRISPRs. Cell Stem Cell. 12 (4), 393-394 (2013).
  32. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). J Vis Exp. (41), (2010).
  33. Forlenza, M., Kaiser, T., Savelkoul, H. F., Wiegertjes, G. F. The use of real-time quantitative PCR for the analysis of cytokine mRNA levels. Methods Mol Biol. 820, 7-23 (2012).
  34. Wu, J. H., Hong, P. Y., Liu, W. T. Quantitative effects of position and type of single mismatch on single base primer extension. J Microbiol Methods. 77 (3), 267-275 (2009).
  35. Sanyal, A., Lajoie, B. R., Jain, G., Dekker, J. The long-range interaction landscape of gene promoters. Nature. 489 (7414), 109-113 (2012).

Tags

ביולוגיה התפתחותית גיליון 110 Enhancer CRISPR / Cas9 עריכת הגנום המחיקה monoallelic פולימורפיזם נוקלאוטיד בודד תאי גזע עובריים real-time PCR כמותי שעתוק ביטוי גנים
יצירת CRISPR / Cas9 מתווכת Monoallelic מחיקות ללמוד לתפקד Enhancer בתאי עכבר גזע עובריים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Moorthy, S. D., Mitchell, J. A.… More

Moorthy, S. D., Mitchell, J. A. Generating CRISPR/Cas9 Mediated Monoallelic Deletions to Study Enhancer Function in Mouse Embryonic Stem Cells. J. Vis. Exp. (110), e53552, doi:10.3791/53552 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter