Introduction
وكان الهدف العام لتطوير طريقة للخلية البذر والتخزين واختبار biochips الموائعية في جهاز الاستشعار البيولوجي ECIS. وكان الهدف من أجل تطوير هذا المستشعر لتلبية مواصفات الجيش الأمريكي لجهاز محمول الحقل الذي يمكن الكشف عن تلوث محتمل لامدادات مياه الشرب التي يستخدمها الجنود. وكانت متطلبات استشعار سمية أنه يمكن الكشف عن مجموعة واسعة من المركبات الصناعية السامة بسرعة (في غضون ساعة) في تركيزات ذات الصلة بصحة الإنسان، أن الجهاز سيكون الميدان المحمولة، كما أن المكونات البيولوجية لديهم العمر الافتراضي لل تسعة أشهر على الأقل. التبريد، ولكن ليس تجميد، من المكونات القابلة للتلف مقبول.
تاريخيا، كان الحقل المحمولة تقنيات اختبار الماء مع المكون البيولوجي لهم (مثل الأجسام المضادة، والإنزيمات، والأحماض النووية) تحليلها محددة 1-3. العيب إلى هذه الأنواع من أجهزة الاستشعار هو أنها سوف ONLذ كشف نوع واحد من المواد الكيميائية في وقت واحد. هناك حاجة إلى أجهزة استشعار متعددة إذا كان يشتبه في أن مادة كيميائية أكثر من موجود. إذا كان جهاز استشعار معين ليس في جعبته الاختبار، يمكن الملوثات الكيميائية في المياه تذهب بسهولة لم يتم كشفها.
أجهزة الاستشعار سمية على نطاق واسع، من ناحية أخرى، لديها القدرة على سد هذه الثغرة التكنولوجيا. لديك هذه عادة ما يكون عنصر الخلوي لهم 4-8. مزايا هذه الأجهزة سمية على نطاق واسع هي أنها يمكن الكشف عن وجود مجموعة واسعة من الملوثات الكيميائية، بما في ذلك الخلائط والمجهولة، في فترة قصيرة نسبيا من الزمن 5،9،10.
مفهوم استخدام قياس معاوقة من الطبقات الوحيدة الخلية كجهاز استشعار سمية الممكن، والذي يعرف أيضا باسم كهربائي خلية الركيزة مقاومة الاستشعار (ECIS)، وقد وصفت لأول مرة من قبل Giaever وKeese 11. على مدى العقدين الماضيين وقد تبين أن يكون مؤشرا حساسا من viab خلية ility والسمية الخلوية. أساسا، ما يتعرض له أحادي الطبقة الخلية التي انضمت إلى أقطاب كهربائية على biochips إلى التردد العالية والمنخفضة الجهد والتيار المتردد إشارة الحالية. أحادي الطبقة متموجة من الخلايا تعوق تدفق الإلكترونات. عندما يتم المساس سلامة أحادي الطبقة الخلية (مثل عندما يتم إدخال مادة كيميائية سامة)، وأجهزة الاستشعار ECIS يسجل تغييرا في معاوقة 11-14. ويوضح الشكل (1) مبدأ ECIS فيما يتعلق أحادي الطبقة خلية على بيوشيب .
الشكل 1:.. مبدأ ECIS توضيح لأحادي الطبقة خلية على بيوشيب مع مبسطة القارئ ECIS التخطيطي الكهربائية الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
> في البداية، كانت المصنفة خطوط الخلايا الثديية في biochips الموائعية، وكانت تستخدم في تكنولوجيا الاستشعار ECIS الموصوفة هنا 12. وكانت هذه الخلايا ليست عملية للاستخدام الميداني، ومع ذلك، لأنها تتطلب تغييرات وسائل الإعلام بشكل متكرر، وكان محدودة العمر الافتراضي، ومطلوب الاصطناعية CO 2 البيئة و37 درجة مئوية درجة حرارة الحضانة. تم اكتشاف أن خط الخلية متاحة تجاريا المشتقة من الخلايا الظهارية تراوت قوس قزح الخيشومية (RTgill W-1 الخلايا) يمكن اختبارها في درجة حرارة الغرفة في CO المحيطة 2، شكلت أحادي الطبقة متموجة في biochips، يمكن تخزينها في درجات حرارة المبرد، و كان استجابة سريعة (1 ساعة أو أقل) لمجموعة واسعة من المواد الكيميائية بتركيزات ذات الصلة بصحة الإنسان 12. تطبيقات الخلايا RTgill-W1 في علم السموم، وكذلك في البحوث الأساسية ويتم مراجعتها من قبل لي وآخرون. 15
طرق لزرع البذور وتخزينها واختبار biochips الموائعية تحتوي على ووصف الطبقات الوحيدة الخلايا RTgill-W1 على biochips الموائعية في جهاز الاستشعار البيولوجي ECIS هنا. وbiochips الموائعية يمكن تخزينها لمدة تصل إلى 9 أشهر في حالة مبردة ويمكن شحنها في حاوية التخزين البارد، لاختبار مياه الشرب supplies.The المرافق القراء ECIS، أو وحدات الاختبار، يتم شحنها بشكل منفصل. وbiochips من عنصرين لهم. طبقة البولي العلوي مع قناتين السوائل منفصلة، وطبقة الإلكترونية أقل يحتوي على أربعة منصات الكهربائي في قناة للاستشعار عن مقاومة. هناك 10 أقطاب العمل في وسادة. كل قطب كهربائي هو 250 ميكرون في القطر. وbiochips تجميعها لديهم اتصالات الذهب الكهربائي للحصول على قراءات مقاومة عند إدراجها في وحدة اختبار ECIS. سيكون على كل من القناتين على شكل U الموائعية المغلقة تعقد 2 مل من تعليق خلية RTgill-W1. ويبين الشكل 2 (أ) بيوشيب فلويديك في القارئ ECIS مع التكبير من خلايا متكدسة على القطب الاستشعار واحد.
= "jove_content" FO: المحافظة على together.within الصفحات = "1"> 
الشكل 2:.. بيوشيب فلويديك في ECIS قارئ معارض منطقة تضخيم أحادي الطبقة متموجة من الخلايا RTgill-W1 على القطب الاستشعار واحد الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Protocol
1. إعداد مواد الاختبار
ملاحظة: من أجل إعداد biochips للاختبار، تحتاج عدة قوارير متكدسة من خلايا RTgill-W1 لتكون جاهزة. تقدير جيد لعدد من قوارير المطلوب هو متموجة واحد T175 قارورة لمدة 16 biochips أن المصنف.
- نفذ الخطوات التالية في الدرجة الثانية مجلس الوزراء السلامة البيولوجية (biohood) باستخدام تقنية العقيم. استخدام الايثانول 70٪ لتطهير biohood وأية مواد وضعت في غطاء محرك السيارة.
- إعداد الركيزة فبرونيكتين لbiochips الموائعية من قبل ذوبان قارورة 1 ملغ من فبرونيكتين وتمييع في 100 مل من معقم L-15 وسائل الإعلام للتركيز 10 ميكروغرام / مل. تجميد في 40 مل قسامات في العقيمة 50 مل أنابيب البولي بروبلين المخروطية في -20 درجة مئوية. ذوبان الجليد في درجة حرارة الغرفة لعدة ساعات قبل بذر biochips. إذابة مرة واحدة، لا اعادة تجميد.
- إعداد وسائل الإعلام ثقافة الخلية بإضافة 50 مل من مصل بقري جنيني، 5 مل من 200 ملي من سوب L-ألانيل-L-الجلوتامينplement، و 5 مل من محلول البنسلين / الستربتومايسين (10،000 وحدة بنسلين / مل و 10000 ميكروغرام الستربتومايسين / مل) الأسهم إلى 500 مل من L-15 وسائل الإعلام. هذا وسوف تسفر عن 560 مل من وسائل الإعلام ثقافة الخلية التي تحتوي 9٪ مصل. بردت.
ملاحظة: ستكون هذه هي وسائل الإعلام ثقافة خلية كاملة المستخدمة في قوارير الثقافة وbiochips.
- مسحوق قوارير وسائل الإعلام
- إعداد قبل الموعد المحدد قارورة 0.1 درهم المفاجئة قبعة تحتوي على 60 ملغ ± 0.5٪ من مسحوق L-15ex باستخدام موزع مسحوق الآلي. تسمية قارورة مع التاريخ الذي تم الاستغناء المسحوق وقارورة في الثلاجة (بكميات من 50) في recloseable أكياس بولي المعدنى. تحتوي كل منها على ثلاثة 1 غرام هلام السيليكا حزم جفاف.
ملاحظة: قارورة L-15ex وسائل الاعلام مسحوق يمكن أن تكون وتخزينها لمدة تصل إلى 9 أشهر قبل الاختبار.
- إعداد قبل الموعد المحدد قارورة 0.1 درهم المفاجئة قبعة تحتوي على 60 ملغ ± 0.5٪ من مسحوق L-15ex باستخدام موزع مسحوق الآلي. تسمية قارورة مع التاريخ الذي تم الاستغناء المسحوق وقارورة في الثلاجة (بكميات من 50) في recloseable أكياس بولي المعدنى. تحتوي كل منها على ثلاثة 1 غرام هلام السيليكا حزم جفاف.
- جعل حل من 100 مل 20٪ التبييض عن طريق تمييع التبييض المنزلية مع الماء (DI) منزوع الأيونات. تقدير من شأنها أن تكون هناك حاجة إلى 5 مل من محلول التبييض لكل ثنائيochip.
- جعل المجالس بيوشيب الأنابيب عن طريق خفض 27 أقسام ملم من أنابيب حيويا autoclavable (2 أقسام لكل بيوشيب أن المصنف) وتناسب كلا طرفي الأنبوب مع التجهيزات LUER البولي زلة. وضع التجمعات أنابيب في حقيبة autoclavable والأوتوكلاف لمدة 8 دقائق عند 134 درجة مئوية. أيضا المقابس الأوتوكلاف بيوشيب (2 في بيوشيب) في كيس منفصل في نفس الإعدادات.
- الأوتوكلاف المياه DI لمدة 30 دقيقة at121 درجة مئوية.
ملاحظة: هذه المياه سيتم استخدامها لالشطف biochips بعد البذر. تقدير من شأنها أن تكون هناك حاجة إلى 10 مل لكل بيوشيب.
ملاحظة: الحجم الفعلي من كل قناة بيوشيب هو 2 مل، ولكن يتم شطف 5 مل من الماء المعقم من خلال كل قناة بعد إزالة محلول التبييض. - جعل المجالس حقن حقنة الأنابيب عن طريق خفض 27 أقسام ملم من أنابيب حيويا وربط الذكور التجهيزات زلة LUER لطرفي الأنبوب. وضع التجمعات الأنابيب في الحقيبة التعقيم ورقة الحرارة الختم والأوتوكلاف لمدة 8 دقائق في 134 و# 176؛ ج.
2. فلويديك الإجراءات بيوشيب البذر
ملاحظة: تنفيذ جميع الإجراءات حيث يتم التعامل مع biochips أو وسائل الإعلام في خزانة السلامة البيولوجية من الدرجة الثانية باستخدام تقنية العقيم.
- أربع وعشرين ساعة قبل البذر المقرر، وإزالة biochips من التعبئة والتغليف المصنعة في biohood ومكان في الحالات أداة بلاستيكية معقمة.
- تعقيم biochips باستخدام محلول التبييض 20٪ على النحو التالي
ملاحظة: من الناحية التاريخية، هذا الإجراء تبييض منعت نمو الفطريات في biochips أثناء التخزين على المدى الطويل في حال تعقيم البلازما من biochips به من قبل الشركة المصنعة لم يكن فعالا.- استخدام 20 مل محقنة معقمة مع أنابيب حقن حقنة المرفقة التجمع والعمل في biohood، وضخ 2 مل من محلول التبييض 20٪ في كل قناة من بيوشيب. السماح للbiochips على الجلوس لمدة 1 ساعة مع محلول التبييض.
- بعد ساعة واحدة، فراغ آسيا والمحيط الهادئغاضب على محلول التبييض من كل القنوات باستخدام الذكور التجمع زلة LUER العقيمة التي تعلق على أنابيب الشفط. استخدم إحدى الجمعيات بيوشيب أنابيب بمثابة استنزاف عند الشطف biochips.
- باستخدام العقيمة حقنة 20 مل تعلق على تجميع حقن حقنة معقمة، طرد كل قناة من الشريحة مع 5 مل من الماء المعقم، والسماح للالمياه الزائدة لاستنزاف في وعاء في biohood. ثم فراغ نضح قبالة المياه كما هو موضح فقط لتبييض ووضع biochips مرة أخرى في الحالات أداة بلاستيكية وترك في biohood حتى المصنف مع الخلايا في اليوم التالي.
- ستون دقيقة قبل بذر biochips، وضخ 2 مل من 10 ميكروغرام / مل حل فبرونيكتين في كل قناة من بيوشيب. مغادرة biochips في biohood لمدة 60 دقيقة، ثم فراغ نضح قبالة فبرونيكتين (كما هو موضح في الخطوة 2.2.3) قبل بذر بيوشيب مع الخلايا. ضع قسمين المجالس بيوشيب أنابيب معقمة (راجعالقسم 1.4) على موانئ biochips.
- يعرض للتريبسين متموجة واحد RTgill-W1 قارورة T175 لكل 16 biochips باستخدام الإجراءات المبينة في أمريكا مجموعة الثقافة نوع (آي تي سي سي) وصف المنتج ورقة 16.
- نضح عن وسائل الإعلام من القارورة متموجة (ق) من الخلايا.
- شطف طبقة الخلايا مع 15 مل من برنامج تلفزيوني ثم نضح قبالة.
- إضافة 6 مل من التربسين / EDTA إلى طبقة الخلايا في كل قارورة T175 وتسمح للخلايا يعرض للتريبسين ل~ 5 دقائق.
- إضافة 15 مل من اكتمال L-15 وسائل الإعلام ثقافة الخلية إلى كل قارورة لوقف trypsinization.
- الجمع بين الايقاف الخلية في وعاء القابل للتصرف العقيمة.
ملاحظة: حجم الحاويات يمكن أن تختلف 150-500 مل، تعتمد على عدد من biochips يجري المصنف. تقدير من شأنها أن تكون هناك حاجة إلى 5 مل من تعليق خلية في بيوشيب.
- إزالة ~ 1 مل من تعليق الخلية ومكان في أنبوب microcentrifuge لفرز الأصوات. باستخدام المجهر brightfield مع objecti 10Xلقد وعدادة الكريات، عد قسامة 10 ميكرولتر من الخلايا وحساب حجم الكامل L-15 وسائل الإعلام ثقافة الخلايا المطلوبة للوصول الى تعليق خلية من 2.5 × 10 5 خلية / مل.
ملاحظة: إذا كنت تستخدم لتعليق الخلية إلى البذور قوارير لمواصلة الثقافة، وهذا من شأنه أن يكون نقطة للقيام بذلك. ضبط تركيز تعليق خلية باستخدام الكامل L-15 وسائل الإعلام ثقافة الخلية. - استخدام معقم 20 مل syringeattached لمحقنة معقمة التجمع حقن الأنابيب (انظر القسم 1.6)، حقن 2.5 مل من تعليق خلية في ميناء الخارجي من كل قناة من بيوشيب (أي المنافذ التي لم يكن لديك أنابيب المرفقة)، السماح لبعض من تعليق خلية إضافية في التدفق من الأنبوب في حاوية النفايات في biohood.
ملاحظة: هذا سيضمن أن القناة بأكملها وأنابيب المرفقة سوف تكون كاملة من تعليق الخلية.- إنشاء حلقة مغلقة لكل قناة بيوشيب عن طريق إدراج نهاية خالية من خرطوم مع fitti LUERنانوغرام في الموانئ الخارجية لكل قناة.
- مسح أي وسيلة إعلامية الزائدة الخروج من الحلقات المغلقة مع منشفة ورقية مبللة الايثانول 70٪ ووضع biochips مرة أخرى في علبة بلاستيكية في 20 درجة مئوية الحاضنة. إعطاء كل بيوشيب عددا تحديد فريدة من نوعها.
- في أيام 4 و 7، وإزالة biochips من 20 درجة مئوية الحاضنة وتجديد وسائل الإعلام في كل من biochips مع كامل L-15 وسائل الإعلام ثقافة الخلية معايرتها درجة الحرارة. اتبع الإجراء نفسه كما في الخطوة 2.6 باستثناء استخدام فقط L-15 وسائل الإعلام ثقافة الخلية بدلا من ذلك (لا تعليق خلية). وضع biochips مرة أخرى في 20 درجة مئوية الحاضنة بعد التغذية اليوم 4.
- بعد الرضاعة يوم 7، إزالة والتخلص من خراطيم من الرقائق وإدراج المقابس هجرة تعقيمها في biochips.
- وضع biochips في مربع في 6 درجة مئوية الحاضنة حتى استخدامها للاختبار.
ملاحظة: يمكن تخزين البطاطا في درجات الحرارة المبردة لمدة تصل إلى 9 أشهر ولا تزال قابلة للحياة لاختبار طن القراء ECIS.
3. ECIS اختبار مع Biochips
- إعداد المواد الكيميائية الاختبار في حالة استخدام. (انظر برينان، وآخرون، 2012 (7) لإعداد المواد الكيميائية الاختبار).
- إزالة القارئ ECIS واللوازم اختبار من حالة حمل. إزالة بيوشيب استعداد من 6 ° C الحاضنة. وضع بيوشيب على منشفة ورقية. بدوره على القارئ ECIS.
- باستخدام 10 مل الحقن، والاستغناء عن 10 مل من الماء تحكم في المسمى 0.5 اوقية (الاونصة) جرة السيطرة البلاستيك واضحة و 10 مل من عينة الاختبار إلى المسمى 0.5 اوقية (الاونصة) من البلاستيك الشفاف اختبار جرة.
ملاحظة: 1) تأكد من إزالة الفقاعات لقياس دقيق. 2) المحاقن والجرار هي مرمزة. الأزرق للسيطرة والأحمر للاختبار. - إزالة اثنين من قارورة وسائل الاعلام مسحوق من أكياس رقائق. فتح أحد قارورة سائل الإعلام مسحوق (استخدام أداة متعددة الأغراض إذا لزم الأمر) وتصب محتويات قنينة واحدة في جرة بالماء السيطرة، واسقاط القارورة كلها إلىالحل كذلك. كرر هذا الإجراء مع جرة الاختبار. كاب ويهز الجرار للتأكد من أن مسحوق يذوب.
- ملء كل من اللون 10 مل المحاقن مع 9 مل إما التحكم (حقنة الزرقاء) أو حلول من قارورة كل اختبار (حقنة الحمراء). إزالة فقاعات الهواء من الحقن.
- إزالة المقابس من الموانئ بيوشيب وإرفاق هجرة.
- وضع بيوشيب في علبة من البلاستيك القابلة للإزالة في القارئ ECIS وإغلاق الغطاء.
- نعلق المحاقن شغل إلى الموانئ بيوشيب الخارجية ونعلق على المكبس حقنة.
- من الشاشة الرئيسية، حدد "NEXT" لبدء مرحلة ما قبل الاختبار.
ملاحظة: برنامج قارئ تحقق ممانعات. إذا ممانعات تقع ضمن النطاق المحدد من قبل المستخدم (عادة ما بين 1000 و 3000 أوم) وشاشة تسجيل "خرطوشة مرت" كما هو مبين في الشكل (3)، وإرشاد المستخدم لتحديد "التالي" ويقوم البرنامج انتقل إلى الخطوة 3.10). إذا كان ممانعات ليست ضمنمجموعة مجموعة بسبب بيوشيب خلل أو اتصال خاطئ من بيوشيب للقارئ (عادة بسبب اختلال الأقطاب)، ثم وشاشة تسجيل "فشل خرطوشة"، وسوف يكون لدى المستخدم الخيار إما إلى "إحباط" أو "التحقق" الاختبار.- حدد "إحباط" للعودة إلى الخطوة 3.9). حدد "التحقق" للشروع في خطوة 3.10) بعد حصوله على "مرت خرطوشة" رسالة واختيار "التالي".
ملاحظة: من الأفضل أن تأخذ من بيوشيب بها وذلك لتفقد عيوب أو تسرب إذا "فشل خرطوشة" لاستلام الرسالة قبل الشروع في بيوشيب الجديد بصريا.
- حدد "إحباط" للعودة إلى الخطوة 3.9). حدد "التحقق" للشروع في خطوة 3.10) بعد حصوله على "مرت خرطوشة" رسالة واختيار "التالي".
الرقم 3: ECIS القارئ لقطة شاشة لبيوشيب مع قراءات الممانعة المقبولة تظهر لقطة الشاشة قراءات مقاومة أولية في أوم لكل من شارك 4أقطاب ntrol (CE) و 4 أقطاب اختبار العينة (SE) داخل بيوشيب فلويديك. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
- عند المطالبة من قبل القارئ، أدخل معلومات العينة باستخدام لوحة مفاتيح لينة ثم حدد "قبول" عند الانتهاء.
ملاحظة: سوف يقوم البرنامج القارئ ECIS ختم تلقائيا كل مجموعة بيانات مع التاريخ والوقت وغيرها من المعلومات المدخلة من قبل المستخدم. مثل عدد بيوشيب، ونوع من المواد الكيميائية والتركيز. اثنين دقيقة من البيانات مقاومة سيتم جمعها من بيوشيب إدراج وسوف الموقت على الشاشة العد التنازلي الوقت. - بعد مرور دقيقة عند المطالبة من قبل الإرشادات التي تظهر على الشاشة التي تومض داخل مربع أحمر، وضرب "NEXT". عند المطالبة من قبل مربع أخضر وامض إلى "حقن عينات الآن"، وضخ مراقبة وسائل الإعلام اختبار من الحقن تعلق في وقت واحد في chann بيوشيبإلس. ترك الحقن في مكان على biochips عند الانتهاء.
سيتم جمع قيم المقاومة مرة واحدة في الدقيقة لمدة 60 دقيقة: مذكرة. إذا قرر برنامج قارئ ECIS أن القناة العلاج تختلف إحصائيا من قناة التحكم في أي لحظة بين 10 و 60 دقيقة بعد بدء الاختبار، ثم عرض على الشاشة سوف تشير إلى أن العينة "الملوثة". إذا كان العلاج لا تختلف كثيرا عن قناة التحكم، ثم الشاشة سيشير "لا تلوث الكشف" في نهاية تشغيل الاختبار. - سجل نتائج الاختبارات كما ملوثة أو غير ملوثة لكل عينة.
- في نهاية اختبار التشغيل، وإزالة والتخلص من بيوشيب. شطف والهواء الجاف الحقن، قارورة اختبار وعلبة من البلاستيك القابلة للإزالة الذي يضم بيوشيب أثناء الاختبارات.
ملاحظة: القارئ ECIS ديه 4 غيغابايت من التخزين على متن الطائرة للبرنامج التشغيلي، ونماذج التحكم والملفات اختبار ولدت من تشغيل الاختبار. وهذا يسمح للعديد من عشرملفات اختبار ousand ليتم تخزينها على القارئ. ويمكن استرجاع الملفات مع محرك القفزة USB ونقل إلى جهاز الكمبيوتر لمزيد من التحليل لأغراض البحث إذا رغبت في ذلك.
Representative Results
تكنولوجيا ECIS صفها في هذه الورقة خضعوا لاختبارات في وكالة حماية البيئة الأمريكية (وكالة حماية البيئة) الذي يرعاه تقنية اختبار وتقييم البرامج (TTEP). وقد تم اختيار ثلاثة عشر المواد الكيميائية لاختبار كممثلين للطائفة واسعة من المركبات الصناعية السامة والتي قد تكون الملوثات المحتملة لمياه الشرب. أثناء الاختبار، تم الكشف عن 9 من 13 من ECIS داخل ساعة على تركيزات ذات الصلة بصحة الإنسان 8. ويبين الجدول 1 نتائج هذا الاختبار الملوثات الشكل 4 هو ممثل عن ماهية "الملوثة" نتيجة ستبدو على الشاشة القارئ ECIS. بالنسبة للجزء الأكبر، وانخفضت ممانعات الخلوية لعينات ملوثة مقارنة بمجموعة التحكم. في بعض الأحيان، قد يسبب بعض المركبات زيادة في مقاومة.
لخص أيضا في الجدول 1 الشكل 5) لقطة الشاشة تمثيلية "لا تلوث اكتشاف".
الشكل 4: ECIS القارئ لقطة من "الملوثة" عينة المياه مثال على رسومات مقاومة تطبيع والنتائج من عينة المياه التي كانت ملوثة. خطوط زرقاء تمثل ممانعات تطبيع كل من أقطاب السيطرة؛ خطوط حمراء تمثل ممانعات تطبيع كل من الأقطاب الكهربائية اختبار العينة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 5: ECIS القارئ لقطة شاشة ل"لا تلوث اكتشاف" عينة المياه مثال على رسومات مقاومة تطبيع والنتائج من عينة المياه التي لم تكن ملوثة. خطوط زرقاء تمثل ممانعات تطبيع كل من أقطاب السيطرة؛ خطوط حمراء تمثل ممانعات تطبيع كل من الأقطاب الكهربائية اختبار العينة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| فئة | الملوث | تركيز اختبار (ملغم / لتر) 1 | الكشف عن ≤1 ساعة ن = 4/4 رقائق | |||
| مبيدات حشرية | الألديكارب | 0.17 | لا | |||
| أرسين جيم (الزرنيخ الصوديوم) | 4.5 | نعم فعلا | ||||
| أزيد (أزيد الصوديوم) | 46.7 | نعم فعلا | ||||
| Fenamiphos | 0.56 | لا | ||||
| الميثاميدوفوس | 1.4 | لا | ||||
| ميثيل البراثيون | 33.6 | نعم فعلا | ||||
| ترابل (كلوريد) | 4.6 | لا | ||||
| Pentachlorophenate (الصوديوم) | 71.9 | نعم فعلا | ||||
| المواد الكيميائية الصناعية | غاز الأمونيا | 924 | نعم فعلا | |||
| النحاس (النحاس الثاني سلفات) | 103 | نعم فعلا | ||||
| السيانيد (الصوديوم) | 3 "> 14نعم فعلا | |||||
| الزئبق (كلوريد) | 24.7 | نعم فعلا | ||||
| التولوين | 444 | نعم فعلا | ||||
| مياه نظيفة 2 | لا شيء | NA | لا | |||
| 1 تركيزات اختبارها هي نفسها كما في مخطوطة كتبها يدر، وآخرون. (2014). | ||||||
| تم تشغيل 2 40 عينة مياه نظيفة مع عدم وجود تلوث. | ||||||
الجدول 1: المواد الملوثة في عينات المياه التي كشفتها ECIS.
Discussion
تكنولوجيا ECIS أداء جيدا في إعداد مختبر وتمكنت من الكشف عن الملوثات المائية المحتملة في تركيزات ذات الصلة بصحة الإنسان. قابلية والتعبئة والتغليف والتكنولوجيا يجعلها تفضي إلى استخدام الميداني.
الخطوات الحاسمة في بروتوكول لنجاح هذه التكنولوجيا هي كما يلي: 1) الحفاظ على ظروف معقمة خلال الثقافة والبذر، وإطعام biochips، 2) حافظ على biochips المصنفة في ظروف المبردة لتصبح جاهزة للاختبار منذ الخلايا RTgill-W1 لن البقاء على قيد الحياة لفترة طويلة جدا مرة واحدة يتعرضون لدرجات حرارة تتجاوز 25 درجة مئوية، 3) تزن بدقة L-15ex في قارورة وسائل الاعلام مسحوق وقياس دقيق لعينات من المياه لتجنب إنتاج المغلوطة، والتي يمكن أن يكون ناجما عن تحول في الأسمولية من وسائل الإعلام بدلا من سمية عينة، 4) متابعة تعليمات المستخدم على الشاشة ECIS لتشغيل الاختبارات. يقوم البرنامج في القارئ تنبيه المستخدم إذا كان ثنائيochip غير مقبول لاختبار (بناء على قراءات مقاومة الأولية) عند إدخال بيوشيب لأول مرة في القارئ. إذا كانت مستويات مقاومة غير مقبولة للاختبار، فإن البرنامج لا تسمح للمستخدم المضي قدما في الاختبار حتى يتم استخدام بيوشيب الجديد. أسباب قراءات مقاومة غير مقبولة وعادة ما تكون نتيجة لاختلال طفيف من الأقطاب بيوشيب مع دبابيس القارئ ECIS أو تسرب السوائل على طول واحد من حواف الإلتصاق من بيوشيب.
هناك بعض القيود على هذه التكنولوجيا لأن استشعار ECIS فقط تم اختباره مع مياه الشرب وليس مع المياه السطحية. الخلايا RTgill-W1 التي هي على بيوشيب لا يمكن أن يتسامح مع تجميد أو درجات الحرارة كثيرا فوق 25 درجة مئوية لفترات طويلة من الزمن (فترة زمنية يمكن أن يكون من ساعات إلى أيام تعتمد على درجة الحرارة. وbiochips تعمل بشكل أفضل في درجة حرارة تتراوح من المبردة ل درجة حرارة الغرفة 7، وهي جاهزة للاستخدام الفوري، ولكن، والحق بعد أن صemoved من التخزين البارد. وتستخدم المحمولة حاويات التخزين الباردة حاليا من قبل أفراد الجيش في الميدان لإمدادات حساسة للحرارة. هذه الحاويات نفسها يمكن أن تستخدم لنقل بيوشيب المصنف.
حد آخر لهذه التقنية هو أنه على الرغم من أنه هو جهاز استشعار سمية اسع النطاق، فإنه لا تستجيب بشكل جيد، على كل حال، إلى مركبات تثبيط الكولين، مثل بعض المبيدات. ولسد هذه الفجوة في القدرات، تم تصميم جهاز استشعار ECIS لاستخدامها جنبا إلى جنب مع متوفرة تجاريا اختبار فحص المبيدات السريع عند اختبار عينات من المياه من أجل توفير المستخدم مع مجموعة واسعة من اختبار السمية. وهذه المجموعة هي فحص الأنزيمية السريع تهدف إلى الكشف عن الفوسفات العضوي والكرباماتية المبيدات في غضون 30 دقيقة.
أجهزة الاستشعار ECIS يكمل WQAS-PM (نوعية المياه تحليل النظام - الطب الوقائي) نظام اختبار المياه الحقل، الذي يستخدم حاليا من قبل موظفي الطب الوقائي العسكري للكشف أرسينجيم، والرصاص، أو السيانيد في عينة مياه الشرب. على الرغم من أن أجهزة الاستشعار ECIS لا تعرف ما هو ملوث، فإنه سيشير إذا كان بعض المعادن أو المركبات العضوية موجودة، مشيرا إلى أن المياه قد لا تكون صالحة للاستهلاك البشري. تتوفر نتائج الاختبار ECIS داخل ساعة. ويمكن بعد ذلك سيتم ارسال عينات المياه من لمزيد من التحليل لتحديد الملوثات إذا كان هناك نتيجة الاختبار إيجابية.
كما هو موضح أعلاه، تم تصميم القارئ ECIS أن تكون جزءا من النظام الذي يشمل مجموعة ACE الأنزيمية منفصلة من أجل تغطية واسعة للكشف عن الملوثات. يتم تعبئتها كل من هؤلاء القراء في قضية قوي للنقل المجال للاستخدام الميداني من قبل الجنود.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal bovine serum | Life Technologies, Inc. www.lifetechnologies.com | 16000-085 | Store @ -20 °C. Thaw @ room temperature before use. Ingredient for complete L-15 cell culture media (10%). |
| Fibronectin, bovine plasma | EMD Millipore Corp. www.emdmillipore.com | 341631-1 mg | Store @ -20 °C. Thaw @ room temperature before use. Mix with L-15 media for a concentration of 10 μg/ml and freeze @ -20 °C in aliquots. Use as substrate for biochips. |
| L-15 media without L-glutamine | Lonza www.lonzabioscience.com | 12-700F | Basal media for cell culture and feeding biochips. Store at 6 °C. |
| L-15ex powdered media with phenol red | US Biological www.usbio.net | L1501 | Media is weighed out in 60 mg aliquots in 0.1 dram vials and stored at 6 °C in foil pouches with dessicant packs. Nine month shelf-life. Mixed with 10 ml of water sample for testing in biochips. |
| PBS, w/o Ca2+ or Mg2+ | Lonza www.lonzabioscience.com | 17-516F | Store at room temperature. Used for rinsing media when trypsinizing cell culture flasks. |
| Trypsin, EDTA | Lonza www.lonzabioscience.com | CC-5012 | Store @ -20 °C. Thaw at room temperature and use to trypsinize cell culture flasks. |
| T175 culture flasks | Fisher Scientific www.fishersci.com |
12-565-30 | Used for culturing RTgill-W1 cells. |
| Bleach | Chlorox www.chlorox.com | Diluted to 20% with millique or distilled water for cleaning ECIS chips. Any household bleach is acceptable. | |
| 70% ethyl alcohol | For disinfecting biohood surfaces and any materials being placed in biohood. | ||
| Rainbow trout gill cells (RTgill-W1) | American Type Tissue Culture Collection www.atcc.org | CRL-2523 | Cells cultured and used for biosensor (seeding biochips). |
| GlutaMAX-1 Supplement, 200 mM | Lonza www.lonzabioscience.com | 35050-061 | Store at room temperature. Ingredient for complete L-15 cell culture media (1%). |
| Penn/Strep Stock 10K/10K | Lonza www.lonzabioscience.com | 17-602E | Store @ -20 °C. Thaw @ room temperature before use. Ingredient for complete L-15 cell culture media (1%). |
| Pharmed BPT tubing | U.S. Plastic Corp. www.usplastic.com | 57317 | Cut in 27 mm sections and autoclaved. Used for seeding biochips with cells and as a closed loop between media changes. |
| Polycarbonate luer fittings for Pharmed tubing assemblies | Value Plastics | MTLS210-9 | Secured to each end of cut Pharmed tubing for insertion into bichips. |
| 20 ml syringes, slip-tip | VWR Scientific us.vwr.com | BD302831 | Used for injection of cell suspension for seeding ECIS chips, as well as for feeding chips. |
| 0.1 dram snap-cap polypropylene microvials | Bottles Jars and Tubes, Inc. www.bottlesjarsandtubes.com | 30600 | Used to store 60 mg aliquots of L-15ex powdered media. |
| 60 mil Lexan fluidic ECIS biochips | Nanohmics, Inc. www.nanohmics.com | Custom-made by Nanohmics, Inc. RTgill-W1 cells will be injected into the biochips and seeded chips will be placed in ECIS reader for testing. | |
| Autoclavable Plastic Instrument Box 17 1/2" x 7 3/4" x 2 3/8" |
Medi-Dose EPS medidose.com | IB701 | Used to store the following; autoclaved plugs, biochips that have been cleaned, seeded biochips. |
| Paper heat-seal sterilization pouches, 7 ½” x 13” | CardinalHealth www.cardinalhealth.com | 90713 | Used for autoclaving tubing and fittings and plugs. |
| Quantos automated powder dispenser | Mettler Toledo www.mt.com | QB5 | Automated dispension of 60 mg aliquots of powdered L-15ex into 0.1 dram vials. |
| ECIS reader | Nanohmics, Inc. www.nanohmics.com | Custom-made by Nanohmics, Inc. Seeded biochip is inserted into the reader for conducting water toxicity testing. | |
| 3 x 5 metalized 2.5 mil polypropylene reclosable bags | Uline www.uline.com | S-16893 | Packaging and storage for both seeded biochips and powdered L-15ex media vials. |
| Leatherman squirt ps4 | Amazon www.Amazon.com | Used to open powdered media vials. | |
| 1 g silica gel desiccant packets | Uline www.uline.com | S-3902 | Put in polypropylene bags with L-15ex powdered media vials to prevent the powder from picking up moisture. |
| Sterile 250 or 500 ml Nalgene bottles | Fisher Scientific www.fishersci.com |
09-740-25C or E | Hold cell suspensions for seeding ECIS chips in biohood. |
| Plugs for biochips | Nanohmics, Inc. www.nanohmics.com | Custom-made by Nanohmics, Inc. Used to seal ports on biochips before storage at 6 °C. | |
| Drains for ECIS biochips | Nanohmics, Inc. www.nanohmics.com | Custom-made by Nanohmics, Inc. Placed on 2 inner ports on biochips prior to insertion in ECIS reader. Allows for excess media to drain from channels during test injections. | |
| Hemocytometer | Fisher Scientific www.fishersci.com |
S17040 | Needed for counting cells prior to adjusting cell suspension for injection into biochips. |
| Brightfield microscope w/ 10X objective | Leitz Labovert | Any brightfield microscope is acceptable. | |
| Class II biological safety cabinet | Any class II biological safety cabinet where cell culture can be performed under sterile conditions is acceptable. | ||
| Microcentrifuge tubes, 0.6 ml | Fisher Scientific www.fishersci.com |
02-681-311 | Holds 1 ml of cell suspension prior to counting cells. |
| Slip 10 cc red syringes | Procedure Products, Inc. www.procedureproducts.com | S/49S 30-R | Withdraws 9 ml of test water sample and used to inject sample into biochip. |
| Slip 10 cc blue syringes | Procedure Products, Inc. www.procedureproducts.com | S/49S 30-B | Withdraws 9 ml of control water sample and used to inject sample into biochip. |
| ½ oz. clear pet plastic jar w/ white ribbed lined caps | SKS Bottle & Packaging, Inc. www.sks-bottle.com | 0605-30 | Sample vials used for mixing L-15ex powder and 10 ml of water sample for testing. |
| 50 ml sterile conical polypropylene centrifuge tubes | Fisher Scientific www.fishersci.com | 12-565-269 | Used to hold 40 ml aliquots of 10 μg/ml fibronectin at -20 °C. |
| NIDS ACE Acetylcholinesterase Inhibitor Detection Test | ANP Technologies, Inc. www.anptinc.com |
ACE-400 | Sensor designed for the rapid detection of pesticides in drinking water |
References
- Pancrazio, J. J., Whelan, J. P., Borkholder, D. A., Ma, A., Stenger, D. A. Development and application of cell-based biosensors. Ann. Biomed. Eng. 27, 697-711 (1999).
- States, S., Scheuring, M., Kuchta, J., Newberry, J., Casson, L. Utility-based analytical methods to ensure public water supply security. J. Am. Water Works Assoc. 95, 103-115 (2003).
- Kelly, T., Baxter, W., McCauley, M., Koglin, E. Testing of Screening Technologies for Detection of Toxic Industrial Chemicals in All Hazards Receipt Facilities. EPA/600/R-08/034. , Washington, DC. 1-25 (2008).
- van der Schalie, W. H., James, R. R., Gargan, T. P. Selection of a battery of rapid toxicity sensors for drinking water evaluation. Biosens. Bioelectron. 22, 18-27 (2006).
- Iuga, A., Lerner, E., Shedd, T. R., van der Schalie, W. H. Rapid responses of a melanophore cell line to chemical contaminants in water. J. Appl. Toxicol. 29, 346-349 (2009).
- Curtis, T. M., et al. Suitability of invertebrate and vertebrate cells in a portable impedance-based toxicity sensor: temperature mediated impacts on long-term survival. Toxicol In Vitro. 27, 2016-2066 (2013).
- Brennan, L. M., Widder, M. W., Lee, L. E. J., van der Schalie, W. H. Long-term storage and impedence-based water toxicity testing capabilities of fluidic biochips seeded with RTgill-W1 cells. Toxicol In Vitro. 26, 736-745 (2012).
- Widder, M. W., Brennan, L. M., Hanft, E. A., Schrock, M. E., James, R. R., van der Schalie, W. H. Evaluation and refinement of a field-portable drinking water toxicity sensor and a fluidic biochip. J. Appl. Toxicol. , (2014).
- O'Shaughnessy, T. J., Gray, S. A., Pancrazio, J. J. Cultured neuronal networks as environmental biosensors. J. Appl.Toxicol. 24, 379-385 (2004).
- Eltzov, E., Marks, R. S. Whole-cell aquatic biosensors. Anal. Bioanal. Chem. 400, 895-913 (2011).
- Giaever, I., Keese, C. R. A morphological biosensor for mammalian cells. Nature. 366, 591-592 (1993).
- Curtis, T. M., et al. A portable cell-based impedance sensor for toxicity testing of drinking water. Lab on a Chip. 9, 2176-2183 (2009).
- Xiao, C., Luong, J. H. T. Assessment of cytotoxicity by emerging impedance spectroscopy. Toxicol. .Appl. Pharmacol. 206 (2), 102-112 (2005).
- Xing, J. Z., Zhu, L., Gabos, S., Xie, L. Microelectronic cell sensor assay for detection of cytotoxicity and prediction of acute toxicity. Toxicol. In Vitro. 20, 995-1004 (2006).
- Lee, L. E. J., Dayeh, V. R., Schirmer, K., Bols, N. C. Applications and potential uses of fish gill cell lines: examples with RTgill-W1. In Vitro Cell. Develop. Biol.- Animal. 45, 127-134 (2009).
- RT-gill-W1 (ATCC CRL-2523) Culture Method. American Type Culture Collection (ATCC). , Manassas, VA. Available from: https://www.atcc.org/ATCCAdvancedCatalogSearch/ProductDetails/tabid/452/Default.aspx? ATCCNum=CRL-2523&Template=cellBiology#aPropba73c (2015).
