Introduction
Det övergripande målet var att utveckla en metod för cellsådd, lagring och testning av fluid biochip i ECIS biosensor. Målet för utvecklingen av denna biosensor var att träffa amerikanska armén specifikationer för ett fält bärbar enhet som kan upptäcka eventuell förorening av dricksvattentäkter som används av soldater. Kraven på toxicitet sensorn var att det kunde upptäcka ett brett spektrum av giftiga industri föreningar snabbt (inom en timme) i koncentrationer som är relevanta för människors hälsa, att anordningen är fält portabel och biologiska komponenter skulle ha en hållbarhetstid minst nio månader. Kylning, men inte frysa, av färsk komponenter var acceptabelt.
Historiskt sett har fält bärbara vatten testning av teknik med en biologisk komponent till dem (såsom antikroppar, enzymer, eller nukleinsyror) varit analytspecifik 1-3. Nackdelen med dessa typer av biosensorer är att de kommer only detektera en typ av kemikalie i taget. Flera sensorer behövs om man misstänker att fler än en kemikalie är närvarande. Om en specifik sensor är inte i testrepertoaren kan kemiska föroreningar i vattnet lätt gå oupptäckt.
Breda toxicitets sensorer, å andra sidan, har potential att fylla denna tekniska klyftan. Dessa har oftast en cellulär komponent till dem 4-8. Fördelarna med breda toxicitets biosensorer är att de kan detektera närvaron av ett brett spektrum av kemiska föroreningar, inklusive blandningar och okända, i en relativt kort tid 5,9,10.
Konceptet att använda mätning av elektrisk impedans av cellmonoskikt som en möjlig toxicitet sensor, som också är känd som elektrisk cell-substrat impedans avkänning (ECIS), beskrevs först av Giaever och Keese 11. Under de senaste två decennierna har det visat sig vara en känslig indikator på cell VIABbilitet och cytotoxicitet. I grund och botten, är cellmonoskiktet som vidhäftar till elektroderna på de biochips utsätts för hög frekvens och låg spänning och strömstyrka växelströmsignal. Den sammanflytande monoskikt av celler hindrar flödet av elektroner. När integriteten hos cellmonoskiktet äventyras (såsom när en giftig kemikalie införs), registrerar ECIS sensorn en förändring i den elektriska impedansen 11-14. Figur 1 illustrerar principen för ECIS i förhållande till cellmonoskiktet på biochip .
Figur 1:.. Principen om ECIS Illustration av en cell monolager på en biochip med förenklad ECIS läsare elektriskt schema Klicka här för att se en större version av denna siffra.
12. Dessa celler var inte praktiskt för fältbruk, men eftersom de kräver täta medier förändringar, hade en begränsad hållbarhetstid, och krävde en artificiell CO2 miljö och en 37 ° C inkubationstemperatur. Det upptäcktes att en kommersiellt tillgänglig cellinje härledd från regnbågsforell gäl epitelceller (RTgill W-1-celler) skulle kunna testas vid rumstemperatur vid omgivande CO2, bildade ett sammanhängande monoskikt i biochips, kunde lagras vid nedkylda temperaturer, och hade en snabb respons (en timme eller mindre) till ett brett spektrum av kemikalier vid koncentrationer som är relevanta för människors hälsa 12. Tillämpningar av RTgill-W1 celler i toxikologi, liksom i grundforskning, granskas av Lee et al. 15
Metoder för sådd, lagring och testning av fluid biochips innehållandemonolager av RTgill-W1 celler på fluid biochips i ett ECIS biosensor beskrivs här. Fluidic biochips kan lagras i upp till 9 månader i ett kylt tillstånd och kan levereras i en kall lagringsbehållare, för att testa dricksvatten supplies.The medföljande ECIS läsare, eller testenheter, levereras separat. De biochips har två komponenter till dem; ett övre polykarbonatskikt med två separata fluidkanaler och ett nedre elektroniska skiktet som innehåller fyra elektroderna per kanal för impedans avkänning. Det finns 10 arbetselektroder per block; varje elektrod är 250 | j, m i diameter. De monterade biochips har guldelektrodanslutningar för att förvärva impedans avläsningar när de sätts i ECIS testenheten. Var och en av de två inneslutna fluid U-formade kanaler kommer att hålla 2 ml av RTgill-W1 cellsuspension. Figur 2 visar en fluid biochip i ECIS läsaren med en förstoring av ett sammanflytande celler på ett enda avkännande elektrod.
Figur 2:.. Fluidic Biochip i ECIS Reader förstorade området visar en sammanhängande monolager av RTgill-W1 celler på en enda avkänningselektrod Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Protocol
1. Framställning av testmaterial
OBS: För att förbereda biochips för testning, flera konfluenta kolvar med RTgill-W1 celler måste vara redo. En god uppskattning av antalet flaskor som behövs är en sammanhängande T175 kolv för 16 biochips att seedas.
- Utför följande steg i en klass II biologiskt säkerhetsskåp (biohood) med aseptisk teknik. Använd 70% etanol för desinficering av biohood och eventuella material som placeras i huven.
- Förbereda fibronektin substrat för fluidic biochip genom att tina en 1 mg injektionsflaska med fibronektin och utspädning i 100 ml sterila L-15 media för en koncentration av 10 pg / ml. Frysa i 40 ml alikvoter i sterila 50 ml koniska polypropylenrör vid -20 ° C. Tina vid rumstemperatur flera timmar före sådd biochips. När tinats, inte frysas.
- Förbereda cellkulturmedia genom tillsats av 50 ml av fetalt bovint serum, 5 ml av 200 mM en L-alanyl-L-glutamin supkomplement, och 5 ml av en penicillin / streptomycin-lösning (10.000 enheter penicillin / ml och 10000 ug streptomycin / ml) lager till 500 ml av L-15 media. Detta kommer att ge 560 ml av cellodlingsmedia innehållande 9% serum. Kyla.
Obs: Detta kommer att vara den kompletta cellodlingsmedier som används för odlingskolvar och biochips.
- Pulveriserade Media Ampuller
- Förbereda i förväg 0,1 dram snap-cap flaskor innehållande 60 mg ± 0,5% av L-15ex pulver med hjälp av en automatiserad pulverdispensern. Märk flaskorna med det datum pulvret fördelades och kylskåp flaskor (i mängder på 50) i återförslutbara metalliserade poly påsar; var och en innehållande tre 1 g kiselgel uttorknings förpackningar.
Anmärkning: L-15ex pulveriserade medier flaskor kan göras och lagras i upp till 9 månader i förväg för testning.
- Förbereda i förväg 0,1 dram snap-cap flaskor innehållande 60 mg ± 0,5% av L-15ex pulver med hjälp av en automatiserad pulverdispensern. Märk flaskorna med det datum pulvret fördelades och kylskåp flaskor (i mängder på 50) i återförslutbara metalliserade poly påsar; var och en innehållande tre 1 g kiselgel uttorknings förpackningar.
- Gör en lösning av 100 ml 20% blekmedel genom att späda hushållsblekmedel med avjoniserat (DI) vatten. Uppskattar att 5 ml blekmedelslösning kommer att behövas för varje biochip.
- Gör biochip slangar heter genom att skära 27 mm sektioner av autoklaverbar biokompatibelt rör (2 sektioner för varje biochip att seedas) och montera båda ändarna av röret med polykarbonat slip Luer beslag. Placera slangaggregat i en autoklaverbar påse och autoklav under 8 minuter vid 134 ° C. Även autoklav biochip pluggar (2 per biochip) i en separat påse på samma inställningar.
- Autoklav DI-vatten under 30 min at121 ° C.
Obs: Detta vatten kommer att användas för att skölja biochips efter sådd. Uppskattar att 10 ml kommer att behövas för varje biochip.
Obs: Den faktiska volymen för varje biochip kanal 2 ml, men 5 ml sterilt vatten sköljs genom varje kanal efter avlägsnande av blekmedel lösning. - Gör injektionsspruta slangar heter genom att skära 27 mm sektioner av biokompatibelt rör och fästa manliga slip Luer beslag på båda ändarna av slangen. Placera slangaggregat i en pappersvärmeförseglings sterilisering påse och autoklav under 8 minuter vid 134 &# 176; C.
2. Fluidic Biochip Seeding Procedure
Obs: Utför alla förfaranden där biochips eller media hanteras i en klass II biologiskt säkerhetsskåp med aseptisk teknik.
- Tjugofyra timmar före planerad sådd, avlägsna biochips Tillverkarens förpackningar i biohood och plats i steriliserade plast instrument fall.
- Sterilisera biochips med användning av en 20% blekmedelslösning enligt följande
Notera: Historiskt har detta blekningsförfarande förhindras svamptillväxt i biochips under långtidslagring i händelse av att den plasmasterilisering av biochips gjorda av tillverkaren inte var effektiv.- Med hjälp av en 20 ml steril spruta med en injektionsspruta slang montering fäst och arbetar i biohood, injicera 2 ml blekmedelslösning 20% i varje kanal av biochip. Låt biochips att sitta i en timme med blekmedel lösning.
- Efter en timme, vakuum aspilsken blekmedelslösningen från båda kanalerna med hjälp av en steril manliga slip Luer enheten ansluten till vakuumsugslangen. Använd någon av biochip slangenheterna som ett avlopp när skölja biochips.
- Med hjälp av en steril 20 ml spruta kopplad till en steril injektionsspruta enhet, spola varje kanal av chipet med 5 ml sterilt vatten, vilket gör att överflödigt vatten kan rinna in i en behållare i biohood. Därefter vakuum aspirera av vattnet som just beskrivits för blekmedel och placera biochips tillbaka i plastinstrumentlådor och lämna i biohood tills ympas med celler följande dag.
- Sextio minuter före ympning av biochips, injicera 2 ml av 10 pg / ml fibronektin lösning i varje kanal hos biochip. Lämna de biochips i biohood under 60 minuter, och sedan vakuum aspirera bort fibronektin (såsom beskrivs i steg 2.2.3) innan sådd av biochip med celler. Placera två sektioner av de sterila biochip slangaggregat (seavsnitt 1.4) på hamnar i de biochips.
- Trypsinize ett sammanflytande RTgill-W1 T175 kolv för varje 16 biochips med användning av förfaranden som beskrivs i American Type Culture Collection (ATCC) produktbladet 16.
- Sug bort media från konfluenta kolven (s) av celler.
- Skölj cellskiktet med 15 ml PBS och sedan aspirera av.
- Tillsätt 6 ml trypsin / EDTA till cellskiktet i varje T175 kolv och låta cellerna att trypsinize för ~ 5 min.
- Tillsätt 15 ml av komplett L-15 cellkulturmedia till varje kolv för att stoppa trypsinisering.
- Kombinera de cellsuspensioner i en steril engångsbehållare.
Obs: Container storlek kan variera från 150-500 ml, beroende på antalet biochips som ympades. Uppskattar att 5 ml cellsuspensionen kommer att behövas per biochip.
- Ta bort ~ 1 ml av cellsuspensionen och placera i ett mikrocentrifugrör för räkning. Med hjälp av en ljusfältsmikroskop med en 10X objective och en hemocytometer, räkna en 10 | il alikvot av cellerna och beräkna volym komplett L-15 cellkulturmedia som behövs för att uppnå en cellsuspension av 2,5 x 10 5 celler / ml.
Obs: Om du använder cellsuspensionen för att ympa kolvar för att fortsätta odlingen, skulle detta vara den punkt att göra det. Justera cellsuspensionskoncentrationen med hjälp av fullständig L-15 cellodlingsmedier. - Med användning av en steril 20 ml syringeattached till en steril injektionsspruta rörenheten (se avsnitt 1.6), injicera 2,5 ml av cellsuspensionen in i den yttre porten på varje kanal i biochip (dvs., de portar som inte har slangen fäst), att tillåta en del av den extra cellsuspensionen att flöda ut av slangen i en avfallsbehållare i biohood.
Obs: Detta kommer att säkerställa att hela kanalen och fäst slangen kommer att vara full av cellsuspensionen.- Skapa en sluten slinga för varje biochip kanal genom att föra in den fria änden av slangen med luer fitting in i de yttre portar för varje kanal.
- Torka alla överflödigt material bort av slutna slingor med en pappershandduk fuktad med 70% etanol och placera biochips tillbaka i plastlådan i en 20 ° C inkubator. Ge varje biochip ett unikt identifieringsnummer.
- På dagarna 4 och 7, ta bort biochips från 20 ° C inkubator och fylla på media i alla biochips med temperaturen jämvikt komplett L-15 cellodlingsmedier. Följ samma procedur som i steg 2,6, förutom användning bara L-15 cellodlingsmedier i stället (ingen cell suspension). Placera biochips tillbaka i 20 ° C inkubator efter dag fyra utfodring.
- Efter dag 7 utfodring, ta bort och kassera slangarna från chips och sätta in autoklavedräneringspluggarna i biochips.
- Placera biochips i en låda i en 6 ° C inkubator tills de användes för att testa.
Obs: Flisen kan lagras vid frystemperaturer för upp till 9 månader och är fortfarande lönsamt för testning in ECIS läsare.
3. ECIS Test med Biochips
- Framställa test kemikalier om du använder. (Se Brennan et al., 2012 7 för framställning av testkemikalier).
- Ta ECIS läsare och testmaterial från väskan. Ta ett förberett biochip från 6 ° C inkubator. Placera biochip på en pappershandduk. Slå på ECIS läsaren.
- Med användning av 10 ml sprutor, fördela 10 ml vattenkontroll i ett märkt 0,5 ounce klar plast styr burk och 10 ml av testprovet i ett märkt 0,5 ounce klar plast provburk.
Obs: 1) Var noga med att ta bort bubblor för en noggrann mätning. 2) Sprutorna och burkar är färgkodade; blå för kontroll och röd för test. - Ta bort de två pulver media flaskor från foliepåsar. Öppna en av pulvermedieflaskor (användning universalverktyget om det behövs) och häll hela innehållet i en flaska i burken med kontroll vatten, tappa hela flaskan ilösning samt. Upprepa denna procedur med testburken. Locket och skaka burkarna för att säkerställa att pulvret är upplöst.
- Fyll vardera av de färgade 10 ml sprutor med 9 ml av antingen kontroll (blå spruta) eller test (röd spruta) lösningar från respektive flaskor. Avlägsna luftbubblor från sprutor.
- Ta bort pluggarna från biochip hamnar fästa avloppet.
- Placera biochip i den löstagbara plastbricka i ECIS läsaren och stäng locket.
- Fäst fyllda sprutor till de yttre biochip hamnar fästa sprutkolven.
- Från huvudskärmen, välj "NEXT" för att inleda förtest.
Obs: Reader kommer att kontrollera impedanser. Om impedansen är inom räckhåll in av användaren (vanligen mellan 1000 och 3000 ohm) skärmen kommer att registrera "patron Godkänd" som visas i figur 3, och instruera användaren att välja "Nästa" och programmet kommer att gå vidare till steg 3,10). Om impedanserna inte är inomdet inställda området på grund av en defekt biochip eller felaktig anslutning av biochip till läsaren (oftast på grund av en förskjutning av elektroderna), då skärmen kommer att registrera "patron Failed" och användaren kommer att ha möjlighet att antingen "Abort" eller "Verifiera" testet.- Välj "Avbryt" för att gå tillbaka till steg 3,9). Välj "Bekräfta" för att fortsätta till steg 3,10) efter att ha fått ett meddelande "patron Godkänd" och välja "Next".
Obs: Det är bäst att ta biochip ut och inspektera det för fel eller läckande om en "patron Failed" meddelande tas emot innan du fortsätter med en ny biochip.
- Välj "Avbryt" för att gå tillbaka till steg 3,9). Välj "Bekräfta" för att fortsätta till steg 3,10) efter att ha fått ett meddelande "patron Godkänd" och välja "Next".
Figur 3:. ECIS Reader Skärmdump av en Biochip med godtagbar impedans Avläsning Skärmbilden visar initiala impedans avläsningar i ohm för vart och ett av fyra control elektroder (CE) och 4 testprovelektroder (SE) inom fluidic biochip. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
- När du uppmanas av läsaren, anger prov information med hjälp av en mjuk tangentbord och välj sedan "Acceptera" när du är klar.
Obs! ECIS läsarprogram kommer automatiskt stämpla varje dataset med datum, tid och annan information som anges av användaren; såsom biochip nummer och typ av kemisk och koncentration. Två minuter av impedans data kommer att samlas in från den insatta biochip och en timer på skärmen nedräkning tid. - Efter två minuter när du får instruktioner på skärmen som blinkar i en röd ruta, klicka på "Next". När du uppmanas av en blinkande gröna rutan för att "injicera prover nu", injicera kontroll och testmedia från de bifogade sprutorna samtidigt i biochip kanaliels. Lämna sprutorna på plats på biochips när du är klar.
Anmärkning: impedansvärden kommer att samlas in en gång per minut under 60 min. Om ECIS läsarprogrammet bestämmer att behandlingen kanalen är statistiskt skiljer sig från kontrollkanalen vid någon punkt mellan 10 och 60 minuter efter provningens början då displayen på skärmen indikerar att provet "Förorenad". Om behandlingen skiljer sig inte från kontrollkanalen, då skärmen visar "Ingen Förorening upptäckt" i slutet av testkörningen. - Spela testresultat som förorenat eller inte förorenats för varje prov.
- Vid slutet av testkörningen, ta bort och kasta biochip. Skölj och lufttorka sprutorna, testflaskor och flyttbara plastbricka som inhyste biochip under testerna.
Obs! ECIS läsaren har 4 GB inbyggt lagringsutrymme för den operativa programvaran, styrmodeller och testfiler som genereras från att köra ett test. Detta gör det möjligt för flera thousand testfiler som skall lagras på läsaren. Filer kan hämtas med en USB hoppa enhet och överföras till en dator för vidare analys för forskningsändamål om så önskas.
Representative Results
ECIS teknik som beskrivs i detta dokument gick att testa på US Environmental Protection Agency (USEPA) -sponsored Technology Test och utvärderingsprogram (TTEP). Tretton kemikalier valdes för att testa som representanter för ett brett spektrum av giftiga industri föreningar som kan vara möjliga föroreningar av dricksvattnet. Under testning, 9 av 13 upptäcktes av ECIS inom en timme vid koncentrationer som är relevanta för människors hälsa 8. Tabell 1 visar resultaten av denna förorening testning. Figur 4 är representativa för vad en "Förorenad" resultat skulle se ut på ECIS läsarens fönster. För det mesta, minskade cellulära impedanser för förorenade prover jämfört med kontroller. Ibland kan vissa föreningar orsaka en ökning av impedansen.
Även sammanfattade i tabell 1 figur 5) för en representativ skärmbild av "ingen förorening upptäckt".
Figur 4: ECIS Reader Skärmdump av en "Förorenad" vattenprov Ett exempel på normaliserade impedans grafik och resultat från ett vattenprov som var förorenat.. Blå linjer representerar normaliserade impedanserna hos var och en av styrelektroderna; röda linjer representerar normaliserade impedans av varje testprovelektroderna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: ECIS Reader Skärmdump av en "ingen förorening upptäckt" vattenprov Ett exempel på normaliserade impedans grafik och resultat från ett vattenprov som inte var förorenad.. Blå linjer representerar normaliserade impedanserna hos var och en av styrelektroderna; röda linjer representerar normaliserade impedans av varje testprovelektroderna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Kategori | kontaminant | Testade koncentrationen (mg / L) 1 | Detekteras ≤1 timme n = 4/4 chips | |||
| pesticider | aldikarb | 0,17 | Nej | |||
| arsen ic (natriumarsenit) | 4,5 | ja | ||||
| Azid (natriumazid) | 46,7 | ja | ||||
| fenamifos | 0,56 | Nej | ||||
| metamidofos | 1,4 | Nej | ||||
| metylparation | 33,6 | ja | ||||
| Paraquat (diklorid) | 4,6 | Nej | ||||
| Pentachlorophenate (natrium) | 71,9 | ja | ||||
| Industrial Chemicals | Ammoniak | 924 | ja | |||
| Koppar (koppar II-sulfat) | 103 | ja | ||||
| Cyanid (natrium) | 3 "> 14ja | |||||
| Kvicksilver (klorid) | 24,7 | ja | ||||
| toluen | 444 | ja | ||||
| Clean Water 2 | ingen | NA | Nej | |||
| 1 Koncentrationer som testades är desamma som i manuskriptet av Widder, et al. (2014). | ||||||
| 2 40 rent vatten prover kördes utan kontaminering. | ||||||
Tabell 1: Föroreningar i vattenprover som upptäckts av ECIS.
Discussion
ECIS tekniken utvecklades väl i laboratoriemiljö och kunde upptäcka eventuella vattenföroreningar vid koncentrationer som är relevanta för människors hälsa. Portabilitet och förpackning av tekniken gör det främjar fältanvändning.
Kritiska steg i protokollet för framgången av tekniken är följande: 1) Bibehåll aseptiska förhållanden under odling, sådd, och utfodring av biochips, 2) Håll sådda biochips i kylda förhållanden tills redo för att testa eftersom RTgill-W1 celler kommer inte att överleva mycket länge när de utsätts för temperaturer över 25 ° C, 3) väg noggrant L-15ex i pulvermedieflaskor och noggrant mäta vattenproven för att undvika att producera falska positiva, som kan orsakas av en förändring i osmolalitet media snarare än prov toxicitet, 4) Följ användarinstruktioner på ECIS skärmen för att köra testerna. Mjukvaran i läsaren kommer att varna användaren om en biochip är oacceptabelt för testning (baserat på initiala impedans avläsningar) när biochip är först in i läsaren. Om impedansen nivåerna är oacceptabla för att testa, kommer programmet inte tillåter användaren att gå vidare med att testa tills en ny biochip används. Orsaker till oacceptabla impedans avläsningar är oftast på grund av en liten förskjutning av biochip elektroderna med ECIS läsare stift eller vätskeläckage utmed en av limning kanterna av biochip.
Det finns några gränser för denna teknik på grund av ECIS sensorn endast testats med dricksvatten och inte med ytvatten. De RTgill-W1 celler som finns på biochip kan inte tolerera frysning eller temperaturer mycket över 25 ° C under längre tidsperioder (tidsram kan vara från timmar till dagar beroende på temperaturen. De biochips fungerar bäst i ett temperaturområde från kyld till rumstemperatur 7. De är redo för omedelbar användning, dock rätt efter att removed från kylförvaring. Bärbara kalla förvaringsbehållare för närvarande används av armén personal i fält för temperaturkänsliga leveranser. Samma behållare kan användas för seedade biochip transport.
En annan gräns för denna teknik är att även om det är en toxicitet sensor bredbands, inte svarar bra, om alls, till kolinesteras-hämmande föreningar, såsom vissa bekämpningsmedel. För att fylla denna resursbristen är ECIS sensorn utformad för att användas tillsammans med en kommersiellt tillgänglig snabb bekämpningsmedel testanalysen vid provning vattenprov för att förse användaren med ett bredare spektrum av toxicitetstester. Satsen är en snabb enzymatisk analys utformad för att detektera fosfororganiska och karbamat bekämpningsmedel inom 30 minuter.
ECIS sensor kompletterar wqas-PM (Water Quality Analysis System - Förebyggande medicin) fält vatten testsystem, som för närvarande används av militär preventiv medicin personal för att upptäcka, arsenic, bly, eller cyanid i ett dricksvattenprov. Även om ECIS sensorn inte kommer att identifiera vad det främmande ämnet är, kommer det att ange om vissa metaller eller organiska föreningar är närvarande, vilket tyder på att vattnet inte kan vara lämpliga för mänsklig konsumtion. De ECIS Testresultaten finns inom en timme. Vattenproven kan sedan skickas ut för vidare analys för identifiering av det främmande ämnet, om det finns ett positivt testresultat.
Som beskrivits ovan, är ECIS läsaren utformad för att vara en del av ett system som innefattar en separat enzymatisk ACE kit för att täcka ett brett spektrum av förorenings upptäckt. Båda dessa läsare förpackas i en kraftig väska för transport fält för fältbruk av soldater.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal bovine serum | Life Technologies, Inc. www.lifetechnologies.com | 16000-085 | Store @ -20 °C. Thaw @ room temperature before use. Ingredient for complete L-15 cell culture media (10%). |
| Fibronectin, bovine plasma | EMD Millipore Corp. www.emdmillipore.com | 341631-1 mg | Store @ -20 °C. Thaw @ room temperature before use. Mix with L-15 media for a concentration of 10 μg/ml and freeze @ -20 °C in aliquots. Use as substrate for biochips. |
| L-15 media without L-glutamine | Lonza www.lonzabioscience.com | 12-700F | Basal media for cell culture and feeding biochips. Store at 6 °C. |
| L-15ex powdered media with phenol red | US Biological www.usbio.net | L1501 | Media is weighed out in 60 mg aliquots in 0.1 dram vials and stored at 6 °C in foil pouches with dessicant packs. Nine month shelf-life. Mixed with 10 ml of water sample for testing in biochips. |
| PBS, w/o Ca2+ or Mg2+ | Lonza www.lonzabioscience.com | 17-516F | Store at room temperature. Used for rinsing media when trypsinizing cell culture flasks. |
| Trypsin, EDTA | Lonza www.lonzabioscience.com | CC-5012 | Store @ -20 °C. Thaw at room temperature and use to trypsinize cell culture flasks. |
| T175 culture flasks | Fisher Scientific www.fishersci.com |
12-565-30 | Used for culturing RTgill-W1 cells. |
| Bleach | Chlorox www.chlorox.com | Diluted to 20% with millique or distilled water for cleaning ECIS chips. Any household bleach is acceptable. | |
| 70% ethyl alcohol | For disinfecting biohood surfaces and any materials being placed in biohood. | ||
| Rainbow trout gill cells (RTgill-W1) | American Type Tissue Culture Collection www.atcc.org | CRL-2523 | Cells cultured and used for biosensor (seeding biochips). |
| GlutaMAX-1 Supplement, 200 mM | Lonza www.lonzabioscience.com | 35050-061 | Store at room temperature. Ingredient for complete L-15 cell culture media (1%). |
| Penn/Strep Stock 10K/10K | Lonza www.lonzabioscience.com | 17-602E | Store @ -20 °C. Thaw @ room temperature before use. Ingredient for complete L-15 cell culture media (1%). |
| Pharmed BPT tubing | U.S. Plastic Corp. www.usplastic.com | 57317 | Cut in 27 mm sections and autoclaved. Used for seeding biochips with cells and as a closed loop between media changes. |
| Polycarbonate luer fittings for Pharmed tubing assemblies | Value Plastics | MTLS210-9 | Secured to each end of cut Pharmed tubing for insertion into bichips. |
| 20 ml syringes, slip-tip | VWR Scientific us.vwr.com | BD302831 | Used for injection of cell suspension for seeding ECIS chips, as well as for feeding chips. |
| 0.1 dram snap-cap polypropylene microvials | Bottles Jars and Tubes, Inc. www.bottlesjarsandtubes.com | 30600 | Used to store 60 mg aliquots of L-15ex powdered media. |
| 60 mil Lexan fluidic ECIS biochips | Nanohmics, Inc. www.nanohmics.com | Custom-made by Nanohmics, Inc. RTgill-W1 cells will be injected into the biochips and seeded chips will be placed in ECIS reader for testing. | |
| Autoclavable Plastic Instrument Box 17 1/2" x 7 3/4" x 2 3/8" |
Medi-Dose EPS medidose.com | IB701 | Used to store the following; autoclaved plugs, biochips that have been cleaned, seeded biochips. |
| Paper heat-seal sterilization pouches, 7 ½” x 13” | CardinalHealth www.cardinalhealth.com | 90713 | Used for autoclaving tubing and fittings and plugs. |
| Quantos automated powder dispenser | Mettler Toledo www.mt.com | QB5 | Automated dispension of 60 mg aliquots of powdered L-15ex into 0.1 dram vials. |
| ECIS reader | Nanohmics, Inc. www.nanohmics.com | Custom-made by Nanohmics, Inc. Seeded biochip is inserted into the reader for conducting water toxicity testing. | |
| 3 x 5 metalized 2.5 mil polypropylene reclosable bags | Uline www.uline.com | S-16893 | Packaging and storage for both seeded biochips and powdered L-15ex media vials. |
| Leatherman squirt ps4 | Amazon www.Amazon.com | Used to open powdered media vials. | |
| 1 g silica gel desiccant packets | Uline www.uline.com | S-3902 | Put in polypropylene bags with L-15ex powdered media vials to prevent the powder from picking up moisture. |
| Sterile 250 or 500 ml Nalgene bottles | Fisher Scientific www.fishersci.com |
09-740-25C or E | Hold cell suspensions for seeding ECIS chips in biohood. |
| Plugs for biochips | Nanohmics, Inc. www.nanohmics.com | Custom-made by Nanohmics, Inc. Used to seal ports on biochips before storage at 6 °C. | |
| Drains for ECIS biochips | Nanohmics, Inc. www.nanohmics.com | Custom-made by Nanohmics, Inc. Placed on 2 inner ports on biochips prior to insertion in ECIS reader. Allows for excess media to drain from channels during test injections. | |
| Hemocytometer | Fisher Scientific www.fishersci.com |
S17040 | Needed for counting cells prior to adjusting cell suspension for injection into biochips. |
| Brightfield microscope w/ 10X objective | Leitz Labovert | Any brightfield microscope is acceptable. | |
| Class II biological safety cabinet | Any class II biological safety cabinet where cell culture can be performed under sterile conditions is acceptable. | ||
| Microcentrifuge tubes, 0.6 ml | Fisher Scientific www.fishersci.com |
02-681-311 | Holds 1 ml of cell suspension prior to counting cells. |
| Slip 10 cc red syringes | Procedure Products, Inc. www.procedureproducts.com | S/49S 30-R | Withdraws 9 ml of test water sample and used to inject sample into biochip. |
| Slip 10 cc blue syringes | Procedure Products, Inc. www.procedureproducts.com | S/49S 30-B | Withdraws 9 ml of control water sample and used to inject sample into biochip. |
| ½ oz. clear pet plastic jar w/ white ribbed lined caps | SKS Bottle & Packaging, Inc. www.sks-bottle.com | 0605-30 | Sample vials used for mixing L-15ex powder and 10 ml of water sample for testing. |
| 50 ml sterile conical polypropylene centrifuge tubes | Fisher Scientific www.fishersci.com | 12-565-269 | Used to hold 40 ml aliquots of 10 μg/ml fibronectin at -20 °C. |
| NIDS ACE Acetylcholinesterase Inhibitor Detection Test | ANP Technologies, Inc. www.anptinc.com |
ACE-400 | Sensor designed for the rapid detection of pesticides in drinking water |
References
- Pancrazio, J. J., Whelan, J. P., Borkholder, D. A., Ma, A., Stenger, D. A. Development and application of cell-based biosensors. Ann. Biomed. Eng. 27, 697-711 (1999).
- States, S., Scheuring, M., Kuchta, J., Newberry, J., Casson, L. Utility-based analytical methods to ensure public water supply security. J. Am. Water Works Assoc. 95, 103-115 (2003).
- Kelly, T., Baxter, W., McCauley, M., Koglin, E. Testing of Screening Technologies for Detection of Toxic Industrial Chemicals in All Hazards Receipt Facilities. EPA/600/R-08/034. , Washington, DC. 1-25 (2008).
- van der Schalie, W. H., James, R. R., Gargan, T. P. Selection of a battery of rapid toxicity sensors for drinking water evaluation. Biosens. Bioelectron. 22, 18-27 (2006).
- Iuga, A., Lerner, E., Shedd, T. R., van der Schalie, W. H. Rapid responses of a melanophore cell line to chemical contaminants in water. J. Appl. Toxicol. 29, 346-349 (2009).
- Curtis, T. M., et al. Suitability of invertebrate and vertebrate cells in a portable impedance-based toxicity sensor: temperature mediated impacts on long-term survival. Toxicol In Vitro. 27, 2016-2066 (2013).
- Brennan, L. M., Widder, M. W., Lee, L. E. J., van der Schalie, W. H. Long-term storage and impedence-based water toxicity testing capabilities of fluidic biochips seeded with RTgill-W1 cells. Toxicol In Vitro. 26, 736-745 (2012).
- Widder, M. W., Brennan, L. M., Hanft, E. A., Schrock, M. E., James, R. R., van der Schalie, W. H. Evaluation and refinement of a field-portable drinking water toxicity sensor and a fluidic biochip. J. Appl. Toxicol. , (2014).
- O'Shaughnessy, T. J., Gray, S. A., Pancrazio, J. J. Cultured neuronal networks as environmental biosensors. J. Appl.Toxicol. 24, 379-385 (2004).
- Eltzov, E., Marks, R. S. Whole-cell aquatic biosensors. Anal. Bioanal. Chem. 400, 895-913 (2011).
- Giaever, I., Keese, C. R. A morphological biosensor for mammalian cells. Nature. 366, 591-592 (1993).
- Curtis, T. M., et al. A portable cell-based impedance sensor for toxicity testing of drinking water. Lab on a Chip. 9, 2176-2183 (2009).
- Xiao, C., Luong, J. H. T. Assessment of cytotoxicity by emerging impedance spectroscopy. Toxicol. .Appl. Pharmacol. 206 (2), 102-112 (2005).
- Xing, J. Z., Zhu, L., Gabos, S., Xie, L. Microelectronic cell sensor assay for detection of cytotoxicity and prediction of acute toxicity. Toxicol. In Vitro. 20, 995-1004 (2006).
- Lee, L. E. J., Dayeh, V. R., Schirmer, K., Bols, N. C. Applications and potential uses of fish gill cell lines: examples with RTgill-W1. In Vitro Cell. Develop. Biol.- Animal. 45, 127-134 (2009).
- RT-gill-W1 (ATCC CRL-2523) Culture Method. American Type Culture Collection (ATCC). , Manassas, VA. Available from: https://www.atcc.org/ATCCAdvancedCatalogSearch/ProductDetails/tabid/452/Default.aspx? ATCCNum=CRL-2523&Template=cellBiology#aPropba73c (2015).
