Summary
Мы представляем метод, чтобы изолировать взрослых орган Корти, как три неповрежденных кохлеарных поворотов (вершины, середины и основания). Мы также продемонстрировать процедуру иммуноокрашивания с флуоресцентно меченых антител. Вместе эти методы позволяют изучать волосковых клеток, поддерживающих клеток, и другие типы клеток, найденный в улитку.
Introduction
Спираль-образный улитка внутреннего уха, содержащиеся в височной кости, находится орган Корти, слуховой сенсорной конечного органа у млекопитающих. Улитки tonotopically организованы и обычно делится на апикальной, средней и базальной поворачивает соответствующие различным частотных областей с обнаружением звукового высокочастотного в основании и низкой частоты обнаружения в вершине 1. Клетки волос, механосенсорные клетки органа Корти, запустите длину улитки, который давно примерно 6 мм у мышей 2,3. Эти клетки преобразуют механическую энергию звуковых волн, которые передаются через заполненный жидкостью перепончатого лабиринта, в нервные сигналы, обработанные посредством центральных слуховых структур. Описанная методика здесь обеспечивает способ получения тотальных органа Корти после кальцификации улитки завершения (для образцов от одной недели возраста к взрослой жизни). Мы также представляем метод для immunostaоцен- ками в целом установлен кохлеарной ткани. Кохлеарные тотальных являются критическими для визуализации всех клеток и волос окружающие поддерживающие клетки в их естественной пространственным расположением и позволяют анализа в трех измерениях с использованием конфокальной микроскопии.
Доктора. Ханс Engstrom и Харлоу Адес первоначально описан целый монтировать кохлеарной метод вскрытия в 1966 году они подробно технику, чтобы быстро исправить и анализировать кальцинированная cochleae погруженный в жидкость из различных млекопитающих, сохраняя нетронутыми короткие сегменты органа Корти для микроскопического анализа 4. Рассечение незафиксированного, кальцинированная крысы улитки также были проиллюстрированы в качестве учебного видео 5. Доктора. Барбара Bohne и Гэри Хардинг в Университете Вашингтона сделал несколько важных изменений в этом методе. По их версии всей метода кохлеарной горе, временная кость декальцифицировали, встроенные в пластик, и пять полуоборотов или десять четверть-оборота были dissecТед 6,7. Доктор Чарльз Либерман и его коллеги Eaton Пибоди, Массачусетс Laboratories глаз и ухо лазарете, модифицированный эту технику так, что пластик вложение не требуется 8. Кроме того модификация техники произошел в лаборатории доктора Цзянь Цзо в исследовательского госпиталя Святого Иуды детей 9-12, которые сообщили метод вскрытия представленные здесь. Мы используем различные стратегии, чтобы получить доступ к органа Корти, чем Bohne и Либермана, который позволяет изоляцию полной верхушечные, середине и базальных поворотов. Таким образом, расчлененный ткани больше и менее вероятно, чтобы быть потеряны или повреждены во время вскрытия или иммуноокрашивания процессов. Кроме того, в настоящее время метод облегчает измерение расстояния от апикальной наконечником или базальной крюк, чтобы определить область частот.
Хотя многие лаборатории выполняют иммунное кохлеарной ткани, непонятно, где этот метод возник. В результате существуют различные рецепты для блокирования BuffeRS и антитела инкубации буферы, которые могут повлиять на производительность отдельных первичных антител. Здесь мы представляем один метод для иммуноокрашивания с флуоресцентно меченых антител, которые применяется к наиболее часто используемых антител в слуховой области.
Сложная форма улитки, нежная структура органа Корти, и костлявая обделки обеспечить вызов для гистологического и биохимического анализа. Разнообразие методов в настоящее время используется в области слуха преодолеть эти трудные функции и визуализировать клетки внутри органа Корти, каждого метода с собственными преимуществами и недостатками. Протокол, представленные здесь позволяет всей горе вскрытии улитки взрослых мышей, и с небольшим изменением, потенциально могут быть использованы для изучения критических структур внутри cochleae из различных других модельных организмов, используемых в этой области.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
О себе этика: Процедуры с участием животных предметы были одобрены Институциональные уходу и использованию животных комитета в университете Южного Иллинойса школа медицины.
1. Добыча височных костей
- Определить временные кости в основании черепа мыши 13 и соскрести черепных нервов, используя стандартную схему щипцы.
- Поместите стандартная схема щипцы на кончике слухового капсулы и большим пальцем противоположной руки надавите на задней полукружных каналов, чтобы сместить инкапсулированный улитку.
- Освободите нижнюю половину височной кости из черепа вручную с большим и указательным пальцем или с помощью 10,5 см тонкие ножницы.
2. После исправить височных костей
- Поместите височных костей в 2 мл микроцентрифужных пробирках, содержащих 250 - 500 мкл 4% параформальдегида (PFA), разбавленного в 10 мМ фосфатно-солевым буфером (PBS), рН 7,4, и incubели при КТ в течение 2 - 20 ч.
Примечание: Нет открытие апикальной крышкой или инъекции PFA в круглой или овальной окна не требуется. Рекомендуется использовать метанол бесплатно, ультра-чистое, электронная микроскопия (ЭМ) класса PFA, которые можно приобрести в концентрации 16% в стеклянных флаконах. После того, как флакон открыт и разводили 1: 4 в PBS, делая 4% раствор, его можно использовать в течение 2 недель при хранении при 4 ° С (Некоторые антитела требует короткого фиксации и другие могут переносить O / N (/ N) крепление).
3. ДЕКАЛЬЦ височных костей
- После фиксации удалите PFA с помощью пипетки и заменить 120 мм этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), чуть больше, чем 2 мл. Убедитесь, чтобы заполнить весь 2 мл микроцентрифужных трубку для предотвращения пузырьков воздуха, когда труба закрыта.
- Если не легкое, сразу замените PFA 10 мМ PBS, рН 7,4, и хранить образцы при температуре 4 ° С.
Примечание: После фиксации височных костей можно хранить в течение variabле составляет времени, прежде чем декальцинация в зависимости от антигенов рассматривается.
- Если не легкое, сразу замените PFA 10 мМ PBS, рН 7,4, и хранить образцы при температуре 4 ° С.
- Место трубки на конец над конец ротатора и вращать при 4 мин при комнатной температуре. Изменить ЭДТА в день с помощью пипетки. Длина декальцинации зависит от возраста образца и предпочтения ученого делает вскрытие.
- Выдержите височных костей в ЭДТА, используя следующие руководящие принципы для инкубационного периода:
Для образцов послеродовой день (P) 8 до P15: 2 - 4 ч; Для образцов P15 на P21: O / N; Для образцов P21 P30 на: 2 O / N; Для образцов старше P30: 3 или более O / N.
ПРИМЕЧАНИЕ: раз декальцинация подлежат предпочтения пользователей и может быть продлен в случае необходимости. Время Декальцификация может быть уменьшено путем изменения ЭДТА два раза в день, около 8 ч друг от друга. Некоторые лаборатории добавить 1% PFA в ЭДТА, когда легкое, более чем на 3 дня, чтобы предотвратить загрязнение.
- Выдержите височных костей в ЭДТА, используя следующие руководящие принципы для инкубационного периода:
- Чтобы определить, если образец адекватно декальцинированной, разместить височных костей она кремний эластомер покрытием рассечение блюдо и осторожно нажмите на щипцы улитки-формы улитки. Если ткань spongey, то декальцинации завершена.
- После завершения удаления накипи, удалить ЭДТА с помощью пипетки и добавить 500 -1000 мкл 10 мМ PBS, рН 7,4. Образцы хранят при температуре 4 ° С до готовности анализировать.
4. Создать силиконового эластомера покрытием Dissection блюдо
- Объедините основы и отвердителя из инкапсулянта комплект силиконового эластомера в соответствии с инструкциями изготовителя и тщательно перемешать.
- Добавить примерно 2 - 3 столовые ложки порошка древесного угля, пока раствор не черный и хорошо перемешать.
Примечание: жидкие чернила или жидкий уголь не будут смешиваться с раствором и не могут быть использованы. Силиконового эластомера инкапсулирующие наборы можно приобрести в черном, что позволяет шаг от 4,2 до быть опущены. - Залейте раствор в 60 мм стеклянных или пластиковых чашках Петри, достаточно заполнения, чтобы покрыть дно. Если буbbles присутствуют, слоеного воздухом на поверхности. Дайте постоять, по крайней мере 24 ч при комнатной температуре, чтобы установить.
ПРИМЕЧАНИЕ: силиконовый эластомер покрытием блюда можно использовать повторно в течение многих лет. Однако не следует использовать этанол для очистки, так как это приведет к тому, силиконовый эластомер взломать.
5. Всего горе Рассечение улитки (для Р7 и пожилых образцов)
- Отделите базальной поворот от средних оборотов / верхушечных
- Разместите один декальцинированной височной кости в силиконовый эластомер покрытием рассечение блюдо, заполнены на две трети с 10 мМ PBS, рН 7,4 и использовать стерео рассечение микроскоп для следующих шагов.
- Держите височной кости в вестибулярной области с # 4 или # 5 щипцы прямо ювелира и с использованием 5 мм Vannas-Тюбингене весенние ножницы, вырезать излишки ушной капсулы ткани по бокам и над вершиной.
- Использование 2,5 мм Vännäs весенние ножницы, вставьте одно лезвие в овальное окно и сделайте несколько небольшие порезы вдоль спиральных связки / боковаяСтенка базального оборота.
- Использование 5 мм Vannas-Тюбингене весенние ножницы, вставьте одно лезвие в область только вырезать и поместить другое лезвие на внешней височной кости, медиально к овального окна. Это сокращение отделяет базальной поворот от средних и апикальных оборотов.
- Полное рассечение базальной свою очередь.
- Использование 2,5 мм Vännäs весенние ножницы, вырезать спирального ганглия нервные волокна, которые подключаются к Modiolus чтобы снять напряжение в базисной свою очередь и сократить ниже базальной свою очередь отделить от вестибулярных органов.
- Использование 2,5 мм Vännäs весенние ножницы, сделать серию небольших разрезов, чтобы удалить спираль связок / боковую стенку от выше и ниже органа Корти. Используйте # 4 или # 5 щипцы прямо ювелира, чтобы направлять ткань. Pin спирального ганглия нервные волокна к силиконового эластомера покрытием рассечение блюдо, но не удержать этой области, как ткань будет рваться.
- Во время предыдущих этапов, некоторые из мембранных Рейснерае часто будет удалена. Если какой-либо до сих пор остается, понять мембраны Рейсснера щипцами # 4 или # 5 прямых ювелирных и оторваться от органа Корти.
ПРИМЕЧАНИЕ: покровная мембрана редко видно и, как правило уплывает, не требуя определенного шаг для удаления. - Наконец сделать несколько сокращений, чтобы уменьшить толщину спирального ганглия аксоны, чтобы сделать поворот как можно более плоскими и использовать # 4 или # 5 щипцы прямо ювелира перенести расчлененный базальной очередь, путем захвата оставшихся аксоны спирального ганглия, чтобы 48-луночный планшет (или камера слайд), содержащих ~ 500 мкл 10 мМ PBS, рН 7,4.
- Отдельная среднего и вершинные повороты
- Поместите оставшиеся две трети улитки, апикальной стороной вниз.
- Использование 2,5 мм Vännäs весенние ножницы, вставьте одно лезвие в Scala средах, где средний оборот используется для подключения к базальной свою очередь, и сделать несколько небольшие порезы вдоль спиральных связок / боковой стенки гое среднего очередь.
- Использование 5 мм Vannas-Тюбингене весенние ножницы, вставьте одно лезвие в область просто вырезать со средним свою очередь помещается в верхней части клинка, и поместите другое лезвие на внешней костного лабиринта, в 90 о углом апикальной наконечником. Это отделяет средний поворот от апикальной свою очередь.
- Полное рассечение средний опорный аналогичным способом к базовой свою очередь (см шаги 5.2.2 5.2.4).
- Полное рассечение апикальной свою очередь.
- Использование 2,5 мм Vännäs весенние ножницы, откройте крышку, закрывающую верхушечный поворот. Полное рассечение таким же образом к базальной свою очередь (см шаги 5.2.2 5.2.4).
Примечание: рассекали кохлеарные повороты могут быть сохранены в 10 мМ PBS, рН 7,4 в 48-луночный планшет (или камеры слайда) в 4 ° С в течение нескольких недель до иммунной окраски. Однако PBS будет испаряться, и нужно периодически пополняться и хранение более чем на 2 - 3 недель может привести к бактериальной или грибковой роста наткани, которые могут снизить качество изображения. Мы рекомендуем долгосрочное хранение образцов как undissected височных костей.
- Использование 2,5 мм Vännäs весенние ножницы, откройте крышку, закрывающую верхушечный поворот. Полное рассечение таким же образом к базальной свою очередь (см шаги 5.2.2 5.2.4).
6. Иммуноокрашивание с флуоресцентно меченых антител
- После вскрытия, хранить каждую кохлеарной поворот в отдельном колодце в 48-луночного планшета (или камеры), слайд погружен в ~ 500 мкл 10 мМ PBS, рН 7,4. Для каждого из следующих шагов улитки очередь должна быть погружена в жидкость, а не плавает на верхней или застряли в сторону скважины.
ПРИМЕЧАНИЕ: При удалении жидкости из каждой лунки, это легко потерять кохлеарные очереди или сосать его на кончике пипетки. Изменение решения с кончика пипетки 200 мкл, используя рассечение сферу поможет предотвратить это. - С помощью пипетки, удалить PBS из каждой лунки и заменить ~ 200 - 300 мкл на лунку блокирующего / пермеабилизации раствора (1% Тритон Х-100, 1% бычий сывороточный альбумин (БСА) и 10% нормальной козьей сыворотки (NGS) разбавляют в 10 мМ PBS рН 7.4). Выдержите 1 час при комнатной температуре на 3D ротатора.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если какой-либо первичное антитело используется было сделано в хозяине козьего, то вторичная анти-козел антитела будут необходимы и НГС не должны использоваться для какой-либо из этапов. Нормальный лошадиной сыворотки можно использовать в качестве замены для NGS. - Удалить блокирующий / проницаемости раствора с помощью пипетки и заменить ~ 100 мкл на лунку раствора антитела (первичного 0,1% Тритон Х-100, 1% BSA и 5% NGS разбавленные в 10 мМ PBS рН 7,4). Коэффициент разбавления для каждого первичного антитела меняется. Выдержите O / N (минимум 14 ч) при 4 ° С на 3D ротатора.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если используется более чем один основной антитела, все могут быть объединены в том же растворе для инкубации, просто убедитесь, что каждый первичный антитело имеет различное множество. - Удалить решение первичное антитело с помощью пипетки и выполнять 3 моет 10 мм PBS рН 7,4 при ~ 500 мкл на лунку. Каждая промывка высиживает минимум 5 мин при комнатной температуре на 3D ротатора.
- Удалить последний PBS мыть с помощью пипетки и заменить ~ 100 мкл на лунку раствора вторичного антитела (0,1% Тритон Х-100, 1% BSA и 5% NGS разбавленные в 10 мМ PBS рН 7,4). Коэффициент разбавления для каждой флуоресцентно помеченные вторичное антитело, как правило, 1: 500 или 1: 1,000. Поместите 48-луночный планшет в черный ящик, чтобы защитить флуоресцентно помеченные вторичных антител от света. Выдержите 2 - 3 ч при комнатной температуре на 3D ротатора.
Примечание: Если более одного вторичного антитела необходимо, они могут быть объединены в том же растворе для инкубации. Убедитесь, что нет возможности кросс-маркировки (например., Используя козий анти-кролик и курица анти-козел вторичные антитела) - Удалить раствор вторичного антитела с помощью пипетки и выполнять 3 промывок 10 мм PBS, рН 7,4 при ~ 500 мкл на лунку. Инкубируйте каждой промывки в течение как минимум 5 мин при комнатной температуре на 3D ротатора. Держите 48-луночного планшета в черном поле, чтобы защитить от света.
- Удалить последний PBS мыть с помощью пипетки и заменить ~ 100 мкл на лунку HoecHST 33342 (разбавленный 1: 2000 в 10 мМ PBS, рН 7,4), чтобы маркировать ядра. Инкубируют 15 - 20 мин при комнатной температуре на 3D ротатора. Держите 48-луночного планшета в черном поле, чтобы защитить от света. НЕ инкубировать дольше, чем 20 мин.
- Удалить решение Hoechst с помощью пипетки и выполнять 3 моет 10 мм PBS рН 7,4 при ~ 500 мкл на лунку. Инкубируйте каждой промывки в течение как минимум 5 мин при комнатной температуре на 3D ротатора. Держите 48-луночного планшета в черном поле, чтобы защитить от света.
- Все этапы могут быть расширены, за исключением того, Hoechst инкубации на несколько часов, если это необходимо. Чтобы приостановить реакцию на любой стадии, просто погрузите образцы в ~ 500 мкл 10 мМ PBS рН 7,4 и хранить 48 -ну пластину (или камеры) в слайд 4 ° С до готовности возобновить часов протокола или 1 - 2 дня позже ,
7. Установите Cochlear Включает Слайды
- Этикетка слайды с актуальной информацией о пробе и антител используется.
- Внесите ~ 50 мкл монтажных СМИ на каждом слайде и будьте осторожнычтобы предотвратить пузыри. Центрифуга пробирку, содержащую крепежные средства массовой информации, чтобы удалить любые пузырьки.
- Использование # 4 или # 5 щипцы прямо ювелира, понять аксоны спирального ганглия мягко передачи одного кохлеарного поворот от 48-луночного планшета с горкой и место в монтажных средств массовой информации. Смонтируйте один кохлеарной очередь на слайд, чтобы предотвратить попадания света и фотообесцвечивания в процессе визуализации.
- Используйте стерео микроскоп рассечение для того, чтобы кохлеарный очередь не сложена, не деформированы, или рядом с пузырьком воздуха. Если какой-либо из этих условий возникают, щипцы использование # 4 или # 5 прямых ювелир, чтобы переместить кохлеарной поворот.
- Поместите один конец покровное на слайде и осторожно освободить, чтобы покровное осенью.
- Использование стерео микроскопом рассечение для того, чтобы кохлеарный очередь не сложена, скручены или вблизи воздушного пузырька. Если какой-либо из этих условий возникают, осторожно двигаться покровное и обратно, чтобы переместить кохлеарной поворот.
- Место слайдыв папке слайд так, чтобы они лежали плоские. Давайте монтажа СМИ вылечить O / N в РТ (держать в темноте)
- Печать покровные с четким лака для ногтей и хранить при комнатной температуре или -20 ° С до тех пор, пока образ. Слайды могут быть сохранены в папке слайдов или слайд-коробки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Слайды можно хранить на долгий срок при -20 ° С или -80 ° С и флуоресценции будет поддерживаться в течение нескольких месяцев. - Слайды изображение, используя конфокальной микроскопии с соответствующей длиной волны на основе вторичных антител, используемых во время процедуры. Иммуноокрашивания Контрастности и яркости может быть выполнена с помощью программного обеспечения, обеспеченные конфокальной поставщика.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мы представляем метод, чтобы изолировать орган Корти, как три неповрежденных кохлеарных поворотов (вершины, середины и основания) с кохлеарной ткани, которая кальцинированная, с ключевых шагов рассечение, представленных на рисунке 1. Во время первой недели постнатального развития, кальцификации мыши улитка является неполным и более простой способ вскрытия может быть использован 13. Использование новорожденных весь метод монтирования рассечение с улитки из Р7 и старых мышей приводит слез и измельчения органа Корти. Спираль связки / боковая стенка теперь более прочно прикреплены и не могут быть очищены от сенсорного эпителия без повреждения. Таким образом, "взрослый" весь метод вскрытия монтирования необходим для образцов старше P6. Приведем пример среднего поворота Р15 мыши улитки, которая была расчлененного и иммунологически с ячейки волос и поддерживающих клеток маркеров (рисунок 2). Оптические поперечные сечения сбыть также получены со всей горе техники (рисунок 3).
Некоторые проблемы могут возникнуть в течение всего горе вскрытии или при монтаже Cochlear оказывается на слайдах. Во удаления спиральной связки / боковой стенки, существует узкое окно между режущими слишком много или мало. Разрезы, которые происходят рядом с последней строке наружных волосковых клеток может привести клетки волос в этой последней строке для установки на различных углах (фиг.4А). Порезы, которые слишком велики можете удалить разделы органа Корти (рис 4В). Обработка образца с пинцетом берет большую заботу и часто есть отверстия в органе Корти, где были напрасны щипцы (рис 4C). Наконец при монтаже кохлеарные очереди, орган Корти можно сложить затемняет изображение (рис 4D).
Рисунок 1. Важные шаги в горы всей рассечение "для взрослых" мыши улитки. (А) после протокола шаг 5.1.4, базальная оборот улитки отделяется от среднего / апикальных оборотов, но все еще прикреплены к вестибулярной области. (B) После протокол шаг 5.3.3, средний оборот отделена от вершинной свою очередь. (C) Пример заполненной вскрытии среднего очередь, где удаляется спираль связки / боковая стенка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию из этой фигуры.
Рисунок 2. конфокальной Slice изображение на БлижнемВключите Изолированные от P15 мыши. Четыре 20x изображения накладываются реконструировать весь средний оборот. Клетки волос помечены с кроличьими анти-миозина VIIa первичного антитела (1: 200 разведение) в сочетании с осла против кролика Alexa 488-конъюгированного второго антитела (1: 1000 разведение) (Magenta). Поддерживающие клетки метили козы против Sox2 первичного антитела (1: 500 разведение) в сочетании с осла против козьего Alexa 568-конъюгированного второго антитела (1: 1 000 разведение) (зеленый). Hoechst (синий) этикетки всех ядер. Изображение было принято с использованием Zeiss LSM 700 конфокальной микроскопии с 405, 488, 555 и длин волн. Масштаб бар = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. Оптический Сечение средний опорный Изолированные от 6-недельного возраста мыши. (А) конфокальной ломтик образ всего препарата горы (внизу) и оптического сечения в плоскости XZ (вверху). (Б) Увеличение увеличение верхней панели в (А), с прицелом удалены. Клетки волос помечены с кроличьими анти-миозина VIIa первичного антитела (1: 200 разведение) в сочетании с осла против кролика Alexa 647-конъюгированного второго антитела (1: 1000 разведение) (Magenta). Поддерживающие клетки метили козы против Sox2 первичного антитела (1: 500 разведение) в сочетании с осла против козьего Alexa 568-конъюгированного второго антитела (1: 1 000 разведение) (зеленый). Изображение было принято с использованием Zeiss LSM 700 конфокальной микроскопии с 405, 555, 647 и длин волн. Масштабные бары = 20 мкм Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
/files/ftp_upload/53561/53561fig4.jpg "/>
Рисунок 4. Примеры проблем, которые могут возникнуть во время полного горе Вскрытие или при монтаже Cochlear Включает Слайды. (А) С левой стороны изображения, кохлеарная ткань вырезать рядом с последней строке наружных волосковых клеток в результате чего многие из эти клетки должны быть установлены на различных углов. (B) часть органа Корти на левой стороне изображения была отрезана. (С) Существует дыра пробил в области внешней волосковых клеток в середине изображение. (D), Орган Корти складывается в нескольких местах. Изображения были взяты из 4 - 8 недель старой cochleae мыши. Клетки волос помечены с кроличьими анти-миозина VIIa первичного антитела (1: 200 разбавление) в сочетании с козьих антител против кроличьего Alexa 488-сопряженных вторичные антитела (1: 1,000 разведение) или осел анти-кроличий Alexa 488-сопряженных вторичные антитела (1: 1 000 разведение) (пурпурного). В C внешней волос челLs помечены с козьим анти-Prestin первичного антитела (1: 200 разведение) в сочетании с осла против кролика Alexa 568-конъюгированного второго антитела (1: 1,000 разведение) (зеленый). Изображения были приняты с использованием Leica SP5 конфокальной микроскопии с 405, 488 и 555 нм длины волн. Масштабные бары: в АБ = 20 мкм; в CD = 40 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Есть несколько важных шагов для успешного всей горе вскрытии и иммунной окраски. Однако прежде любой из этих методов выполняются, собственно фиксация улитки ткани необходим. Мы рекомендуем использовать метанол бесплатно, ультра-чистое, Е. М. класса PFA. PFA изготовлен из порошка может иметь следы метанола и нестабильной рН, что снижает качество иммунофлюоресценции. Другие группы также показали, что подобные вскрытия возможно при использовании фиксаторы, которые не содержат формальдегида 14-16. Длина фиксации также важно и антителом, специфичным. Некоторые антитела могут терпеть O / N фиксацию, в то время как другие не могут работать только с 1 ч в PFA (однако это редко). Под фиксированной ткани может быть проблематичным для метода вскрытия, как ткань разваливается. По нашему опыту 3 - 4 ч фиксации обеспечивает достаточную фиксацию и не мешает с большинством первичных антител, обычно используемых в области слуха.
jove_content "> Кроме того, возможно, что ЭДТА может помешать с первичными антителами;. Таким образом, некоторые антитела будет хорошо работать в неонатальном ткани, но не в Р7 или старшего ткани, который был декальцинированной после фиксации, височных костей можно хранить в течение различных количеств времени до декальцинация в зависимости от антигенов рассматривается. Некоторые антигены требуют декальцификацию и рассечение в течение нескольких дней до нескольких недель после фиксации, в то время как другие могут быть сохранены в течение многих лет (до или после декальцинации) без снижения качества иммунной окраски. Мы рекомендуем хранить образцы, как височных костей из-за риска испарения носителя (PBS) с 48-луночного планшета и возможной контаминации гриба или бактерий. Мы обычно выполняют вся гора рассечение меньше одной недели заранее иммунным.После того, как фиксированной и декальцифицировали, вся гора рассечение производится с височной кости, погруженной в жидкость. Удаление избыточной кости и мягкихтканей, окружающих лабиринт в начале вскрытия будет способствовать удалению спирального связки / боковой стенки на более поздних этапах, облегчая манипулирование ткани и обеспечивая более затененное вид критических структур. При выполнении первые шаги, щипцы могут быть использованы, чтобы держать ткань в вестибулярной области. Однако, как только повороты изолированы, важно, чтобы избежать размещения на щипцы органа Корти или спиральной связки / боковой стенки. Вместо этого, держать щипцы закрыты, и приколоть спирального ганглия нервные волокна к силиконового эластомера покрытием рассечение блюдо. Не удержать этом регионе, как ткань будет рваться. В общем, как только ткань была разделена на три очереди, схватив и потянув маневры могут привести к непредсказуемым результатам, которые часто разрушительны для органа Корти и его следует избегать. Ткань из молодых животных (Р7-P21) имеет тенденцию быть более снисходительными, чем ткани из животных старше P21. Кроме того, кохлеарные образцы с волосковых клеток DAmage труднее анализировать. Если мышь получила шумового воздействия ткань особенно хрупкой. Независимо от состояния ткани, рассечение мы представляем это технически сложная и требует много практики для попытки языком.
Во иммунное окрашивание, важно, что каждый кохлеарный поворот погружен в жидкость, не плавающим на поверхности или застряли в сторону скважины. Это позволяет более полно проникновение тритона и антител в ткани. При удалении жидкости из каждой лунки, это легко потерять кохлеарной поворот или нарисовать его на кончике пипетки. Изменение решения с кончика пипетки 200 мкл, используя рассечение сферу поможет предотвратить это. Медленно извлечь жидкость и переместить пипетки если кохлеарной очередь получает слишком близко. Также pipetteting отходов раствора в чистую пробирку может быть хорошая стратегия, как можно искать эти отходы труба, если поворот был случайно составлен в пипетку. Если очередь застрял в пипетки, тон выбил можно разрезать бритвой, но часто орган Корти будет поврежден, если это происходит.
При устранении неисправностей антител для иммунологического окрашивания, могут быть добавлены дополнительные этапы, такие как извлечение антигена или усиление сигнала. Есть с низким рН и высокой рН демаскацию антигена реагенты, которые могут быть приобретены. Если антитела не работают с методом, описанным здесь, первое изменение протокола попробовать один из этих методов извлечения антигена. Кроме того, использование сигнала усилителя. Существуют коммерчески доступные решения использовать до иммунной или tyramide комплекты амплификации, которые могут использоваться для усиления сигнала от вторичного антитела.
Значение техники мы приводим это способность поддерживать трехмерную структуру органа Корти и визуализировать все клетки внутри органа. По всей длине улитки разделяется на три оборота только тогда как другие подобные методы, а именно йе Bohne и Либерман методы требуют деление на 5 - 10 штук 6-8, увеличивая количество образцов для маневра в процессах иммуноокрашивания и обработки изображений. Улитки боковое рассечение стенки, которая была разработана Косгроув и Граттон требует аналогичного уровня мастерства и возможно в нефиксированной, свежей ткани, а также в декальцинированной ткани, но орган Корти раздели прочь и уничтожены в процессе изолируя боковая стенка 17. Другая группа выступала подобные разборы в нефиксированной, свежий кохлеарной ткани от трех недельных крыс, где спираль связки / боковая стенка захваченных и раздели от органа Корти, оставляя нетронутыми орган. Однако это было достигнуто только в апикальной свою очередь 5. Метод пилинга спираль связок / боковую стенку от органа Корти является обычным для рассечения тканей в фиксированном молодой мыши (<Р7) 13. Тем не менее, в нашем опыте с мышами старше P6, после фиксации апд декальцинация, этот маневр часто рвет орган Корти в ненадежной моды. Кроме того Описанная здесь процедура позволяет изоляция средней и базальной также поворачивается.
Криосрезах и секции, полученные после парафин, также широко используется в слуховое поле. Эти методы позволяют визуализировать других структур, таких как полоски vascularis, мембраны Рейсснера и текториальной мембраны, но каждая секция позволяет только визуализацию небольшого участка органа Корти в каждом кохлеарной свою очередь. Таким образом, чтобы исследовать события, которые происходят в мозаики, такие как потеря клеток или клеточного деления с методом секционирования, 50 или более слайдов должны быть окрашены и отображаемого захватить всю длину улитки. В отличие от этого, вся протокол вскрытия крепление имеет преимущество приготовления весь орган Корти всего три штуки. Кроме того в пользу сохранения продольное архитектуру органа Корти, эта TEChnique позволяет упрощенной сбора и хранения данных. Одно ограничение всей горе вскрытии в том, что она разрушает окружающие структуры, такие как спираль связки, полоски vascularis, мембраны Рейсснера и текториальной мембраны. Другим ограничением является техническая сложность и длительность времени, в течение одного вскрытия. Это в основном за счет хрупкости органа Корти и небольшим запасом на ошибку при удалении спирали связок / боковую стенку. После освоено, вся гора рассечение одной улитки могут быть выполнены в приблизительно 20 - 30 мин.
В то время как выше протокол описывает целый метод вскрытия монтирования для взрослой мыши, мы надеемся применить этот метод к другим модельных организмов, используемых в слуховой области. Наша лаборатория в настоящее время модификации этого метода для вскрытия крыс улитки. Чем больше улитки крысы заключен в толще ушной капсулы, который более плотно, чем кальцинированная мыши. Таким образом, временная кость должна быть электроннойxcised с большими ножницами. Перед фиксацией и декальцинации с ЭДТА, отические капсула должна быть открыта с ножницами, чтобы улучшить доступ к кохлеарной ткани. Также процесс удаления накипи больше и может занять до 3 недель в зависимости от возраста образца. За весь монтирования вскрытия, размер костного лабиринта влияет на технику. Увеличенный размер крысы улитки обеспечивает чуть больше расстояние между спиральной связки / боковой стенки и органа Корти, обеспечивая больший предел погрешности для отдельных разрезов. Тем не менее, в то время как больше, ткань может обеспечить больше материала захватить для манипулирования образца, она также требует большего количества сокращений, чтобы удалить всю длину спиральной связки / боковой стенки. Мы считаем, что аналогичные изменения могут быть сделаны для вскрытия улитки из шиншиллы, песчанки, и свинки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | can be purchased from other vendors |
| 10.5 cm fine scissors | Fine Science Tools | 14060-11 | can be purchased from other vendors |
| 2 ml microcentrifuge tubes | MidSci | AVSS2000 | can be purchased from other vendors |
| 16% formaldehyde, methanol free, ultra pure, EM grade | Polysciences | 18814 | TOXIC --wear gloves and cannot be disposed of in the sink. Can be purchased from other vendors. |
| PBS pH 7.4 | Sigma | P3813-10PAK | can be purchased from other vendors |
| EDTA | Fisher | BP118-500 | can be purchased from other vendors |
| end-over-end tube rotator | Fisher | 05-450-127 | can be purchased from other vendors |
| 60 mm petri dish | Fisher | 50-202-037 | can be purchased from other vendors |
| Dow Corning Sylgard 184 silicone encapsulant kit | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| activated charcoal | Fisher | AC134372500 | can be purchased from other vendors |
| stereo dissection microscope | Zeiss | Stemi 2000 | can be purchased from other vendors |
| Dumont #4 jeweler's forceps | Fine Science Tools | 11241-30 | |
| Dumont #5 jeweler's forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| 2.5 mm Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15001-08 | curved |
| 5 mm Vannas-Tubingen spring scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | straight |
| 48-well plates | Fisher | 08-772-52 | can be purchased from other vendors |
| 8-well chamber slides | Fisher | 1256518 | can be purchased from other vendors |
| Triton X-100 | Sigma | X100-500 | can be purchased from other vendors |
| BSA, fraction V | Fisher | BP1605 | can be purchased from other vendors |
| NGS | Vector labs | S-1000 | can be purchased from other vendors |
| NHS | Vector labs | S-2000 | can be purchased from other vendors |
| 3D rotator | Midsci | R3D-710 | can be purchased from other vendors |
| Western blot incubation box XL | Licor | 929-97401 | |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | can be purchased from other vendors |
| Prolong gold antifade mounting media | Life Technologies | P36930 | can be purchased from other vendors,but mounting medias vary in their ability to protect against photobleaching |
| Superfrost Plus Slides | Fisher | 12-550-15 | can be purchased from other vendors |
| coverslips 22 x 22 x 1 | Fisher | 12-548-B | can be purchased from other vendors |
| clear nail polish | Local drug store | can be purchased from other vendors | |
| cardboard slide folder | Fisher | 12-587-10 | can be purchased from other vendors |
| plastic slide box | Fisher | 03-448-10 | can be purchased from other vendors |
References
- Robles, L., Ruggero, M. A. Mechanics of the mammalian cochlea. Physiol Rev. 81 (3), 1305-1352 (2001).
- Ehret, G., Frankenreiter, M. Quantitattive analysis of cochlear structures in the house mouse in relation to mechanisms of acoustical information processing. J Comp Physiol. 122, 65-85 (1977).
- Ou, H. C., Bohne, B. A., Harding, G. W. Noise damage in the C57BL/CBA mouse cochlea. Hear Res. 145 (1-2), 111-122 (2000).
- Engstrom, H., Ades, H. W., Andersson, A. Structural pattern of the organ of Corti. A systematic mapping of sensory cells and neural elements. , Almqvist and Wiksell. (1966).
- Grant, L., Yi, E., Goutman, J. D., Glowatzki, E. Postsynaptic Recordings at Afferent Dendrites Contacting Cochlear Inner Hair Cells: Monitoring Multivesicular Release at a Ribbon Synapse. J Vis Exp. (48), e2442 (2011).
- Bohne, B. A., Harding, G. W. Processing and analyzing the mouse temporal bone to identify gross, cellular and subcellular pathology. Hear Res. 109 (1-2), 34-45 (1997).
- Bohne, B. A., Harding, G. W., Ou, H. C. Handbook of Mouse Auditory Research. Willott, J. , CRC Press. 171-187 (2001).
- Eaton-Peabody Laboratories. Video Tutorial for Cochlear Dissection. , Massachusetts Eye and Ear. Available from: http://www.masseyeandear.org/research/otolaryngology/investigators/laboratories/eaton-peabody-laboratories/epl-histology-resources/video-tutorial-for-cochlear-dissection/ (2015).
- Weber, T., et al. Rapid cell-cycle reentry and cell death after acute inactivation of the retinoblastoma gene product in postnatal cochlear hair cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (2), 781-785 (2008).
- Yu, Y., et al. In vivo proliferation of postmitotic cochlear supporting cells by acute ablation of the retinoblastoma protein in neonatal mice. J Neurosci. 30 (17), 5927-5936 (2010).
- Steigelman, K. A., et al. Polycystin-1 Is Required for Stereocilia Structure But Not for Mechanotransduction in Inner Ear Hair Cells. J Neurosci. 31 (34), 12241-12250 (2011).
- Liu, Z., et al. Age-dependent in vivo conversion of mouse cochlear pillar and Deiters' cells to immature hair cells by Atoh1 ectopic expression. J Neurosci. 32 (19), 6600-6610 (2012).
- Parker, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. Primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of Corti. J Vis Exp. (36), e1685 (2010).
- Burns, J. C., On, D., Baker, W., Collado, M. S., Corwin, J. T. Over half the hair cells in the mouse utricle first appear after birth, with significant numbers originating from early postnatal mitotic production in peripheral and striolar growth zones. J Assoc Res Otolaryngol. 13 (5), 609-627 (2012).
- Collado, M. S., et al. The postnatal accumulation of junctional E-cadherin is inversely correlated with the capacity for supporting cells to convert directly into sensory hair cells in mammalian balance organs. J Neurosci. 31 (33), 11855-11866 (2011).
- Meyers, J. R., Corwin, J. T. Shape change controls supporting cell proliferation in lesioned mammalian balance epithelium. J Neurosci. 27 (16), 4313-4325 (2007).
- Gratton, M. A., Rao, V. H., Meehan, D. T., Askew, C., Cosgrove, D. Matrix metalloproteinase dysregulation in the stria vascularis of mice with Alport syndrome: implications for capillary basement membrane pathology. Am J Pathol. 166 (5), 1465-1474 (2005).
