Summary
Nous présentons une méthode pour isoler l'organe de Corti adulte que trois tours intactes cochléaires (APEX, milieu, et de la base). Nous démontrons également une procédure pour immunocoloration avec des anticorps marqués par fluorescence. Ensemble, ces techniques permettent l'étude des cellules ciliées, cellules de soutien, et d'autres types de cellules trouvées dans la cochlée.
Introduction
La cochlée en forme de spirale de l'oreille interne, contenue dans l'os temporal, abrite l'organe de Corti, la sensibilité auditive organe final chez les mammifères. La cochlée est tonotopically organisé et souvent divisé en apicale, un milieu et basale tours correspondant à différentes régions de fréquence avec détection de son à haute fréquence dans la base et la détection de basse fréquence dans l'apex 1. Les cellules ciliées, les cellules mécano de l'organe de Corti, courent tout le long de la cochlée, qui est d'environ 6 mm de long chez la souris 2,3. Ces cellules convertissent l'énergie mécanique des ondes sonores, qui sont transmis à travers le labyrinthe membraneux rempli de fluide, en des signaux neuronaux qui sont traitées par les structures auditives centrales. La technique décrite ici concerne un procédé pour la préparation de supports entiers de l'organe de Corti après calcification de la cochlée est complète (pour les échantillons allant de 1 semaine d'âge et l'âge adulte). Nous présentons également une méthode pour immunostaining le tout monté tissus cochléaire. Montures entières cochléaires sont cruciales pour la visualisation de toutes les cellules de cheveux et entourant les cellules de soutien dans leurs arrangements spatiaux naturelles et permettent l'analyse en trois dimensions avec l'utilisation de la microscopie confocale.
Drs. Hans Engstrom et Harlow Ades décrits à l'origine un ensemble de monter méthode de dissection cochléaire en 1966. Ils ont décrit une technique pour fixer rapidement et disséquer cochleae calcifiée immergée dans un liquide à partir d'une variété de mammifères, la préservation de courts segments intacts de l'organe de Corti pour analyse microscopique 4. La dissection, une cochlée de rat calcifiée non fixée a également été illustré dans une vidéo d'instruction 5. Drs. Barbara Bohne et Gary Harding à l'Université de Washington ont fait plusieurs modifications importantes à cette méthode. Dans leur version de la méthode de montage toute cochléaire, l'os temporal était adoucie, noyée dans le plastique, et cinq demi-tours ou dix quarts de tours étaient dissectionTed 6,7. Dr Charles Liberman et ses collègues de Eaton Peabody laboratoires, Massachusetts Eye and Ear Infirmary, modifiés cette technique afin que le plastique intégration n'a pas été nécessaire 8. Une modification supplémentaire de la technique a eu lieu dans le laboratoire du Dr Jian Zuo recherche de l'Hôpital pour enfants St. Jude 9-12 qui a informé la méthode de dissection présenté ici. On utilise une stratégie différente pour avoir accès à l'organe de Corti et que Bohne Liberman, ce qui permet l'isolement de toutes les apical, au milieu et à tour de rôle de base. Ainsi le tissu disséqué est plus grande et moins susceptibles d'être perdus ou endommagés pendant les processus de dissection ou immunocoloration. De plus, le procédé actuel facilite la mesure de la distance à partir de l'extrémité apicale ou basale crochet pour identifier une région de fréquence.
Bien que de nombreux laboratoires effectuent un marquage de tissu cochléaire, on ne sait pas où cette méthode est originaire. En conséquence, il existe plusieurs recettes pour bloquer Buffers et incubation des anticorps tampons qui peuvent affecter la performance des anticorps primaires individuels. Ici, nous présentons une méthode pour immunocoloration avec des anticorps marqués par fluorescence qui est applicable à des anticorps les plus couramment utilisés dans le domaine auditif.
La forme complexe de la cochlée, la structure délicate de l'organe de Corti, et enrobage osseuse constituent un défi pour l'analyse histologique et biochimique. Une variété de techniques sont actuellement utilisés dans le domaine de l'audition de surmonter ces caractéristiques difficiles et visualiser les cellules à l'intérieur de l'organe de Corti, chaque technique avec ses propres avantages et inconvénients. Le protocole présenté ici permet pour toute la dissection de montage de la cochlée de souris adulte et, avec une légère modification, peut potentiellement être utilisé pour examiner les structures critiques au sein de la cochlée d'une variété d'autres organismes modèles utilisés dans le domaine.
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Protocol
Déclaration éthique: procédures impliquant des sujets animaux ont été approuvés par l'Institutional Animal Care et l'utilisation Comité à l'École de médecine de l'Université Southern Illinois.
1. Extraction des temporelles Bones
- Identifier les os temporaux dans la base du crâne de la souris 13 et gratter les nerfs crâniens aide de pinces de modèle standard.
- Placez la pince de modèle standard à la pointe de la capsule otique et avec le pouce de la presse à main opposée sur le canal semi-circulaire postérieur pour déloger la cochlée encapsulé.
- Libérez la moitié inférieure de l'os temporal du crâne manuellement avec le pouce et l'index ou en utilisant 10,5 cm de ciseaux fins.
2. Post-temporelles fixer Bones
- Placer os temporal dans 2 ml contenant des tubes de microcentrifugation de 250 à 500 pi de paraformaldehyde à 4% (PFA) dilué dans 10 mM de tampon phosphate salin (PBS) de pH 7,4 et Incubmangé à RT pour les 2 - 20 heures.
NOTE: Aucune ouverture de la coiffe apicale ou l'injection de PFA dans la ronde ou fenêtre ovale est nécessaire. Recommander utilisant du méthanol libre, ultra-pure, la microscopie électronique (EM) de grade PFA qui peuvent être achetés à une concentration de 16% dans des flacons de verre. Une fois que le flacon est ouvert et dilué à 1: 4 dans du PBS, en faisant une solution à 4%, il peut être utilisé pour 2 semaines lors d'un stockage à 4 ° C (Certains anticorps nécessitent court fixation et d'autres peuvent tolérer O / N (O / N) de fixation).
3. détartrer temporelles Bones
- Après fixation, retirez PFA aide d'une pipette et le remplacer avec de l'acide 120 mM éthylènediaminetétraacétique (EDTA), un peu plus de 2 ml. Assurez-vous de remplir la totalité de microtube de 2 ml pour éviter les bulles d'air lorsque le tube est fermé.
- Si non détartrage immédiatement, replacez PFA avec PBS 10 mM pH 7,4 et stocker des échantillons à 4 o C.
NOTE: Après fixation, os temporaux peuvent être stockés pendant variabLe élève de temps avant la décalcification selon les antigènes en cours d'examen.
- Si non détartrage immédiatement, replacez PFA avec PBS 10 mM pH 7,4 et stocker des échantillons à 4 o C.
- Placer les tubes sur la fin-sur-end rotateurs et tournent à 4 min à température ambiante. Changer solution d'EDTA quotidiennement à l'aide d'une pipette. Durée de décalcification dépend de l'âge de l'échantillon et la préférence du scientifique faisant la dissection.
- Incuber os temporaux en EDTA utilisant les directives suivantes pour les durées d'incubation:
Pour les échantillons postnatale jour (P) 8 à P15: 2 - 4 h; Pour les échantillons P15 à P21: O / N; Pour les échantillons P21 à P30: 2 O / N; Pour les échantillons de plus de P30: 3 ou plus O / N.
Remarque: Les temps de décalcification sont soumis à la préférence des utilisateurs et peuvent être prolongés si nécessaire. Temps de décalcification peut être réduite par modification de la solution d'EDTA deux fois par jour, environ 8 heures d'intervalle. Certains laboratoires ajouter 1% de PFA à la solution d'EDTA un détartrage pendant plus de 3 jours pour éviter la contamination.
- Incuber os temporaux en EDTA utilisant les directives suivantes pour les durées d'incubation:
- Pour déterminer si l'échantillon est suffisamment détartrer, placez os temporaux ona silicium enduit d'élastomère plat de dissection et appuyez doucement forceps sur la cochlée forme d'escargot. Si le tissu est spongieuse, puis décalcification est terminée.
- Une fois décalcification est terminée, retirez EDTA aide d'une pipette et ajouter 500 -1 000 pi de PBS 10 mM pH 7,4. Conserver les échantillons à 4 ° C jusqu'au moment de disséquer.
4. Créer un élastomère de silicone revêtu Dish Dissection
- Mélanger la base et le durcisseur d'un kit d'encapsulation d'élastomère de silicone selon les instructions du fabricant et bien mélanger.
- Ajouter environ 2 - 3 cuillères à soupe de poudre de charbon jusqu'à ce que la solution est noir et bien mélanger.
REMARQUE: Encre liquide ou de charbon liquide ne se mélangent pas avec la solution et ne peuvent pas être utilisés. Kits élastomère d'encapsulation en silicone peuvent être achetés en noir, ce qui permet à l'étape 4.2 être omis. - Versez la solution dans 60 mm de verre ou des boîtes de Petri en plastique, suffisamment copieux pour recouvrir le fond. Si bubbles sont présents, gonflent avec de l'air à la surface. Laisser reposer au moins 24 heures à la température ambiante à définir.
REMARQUE: plats enduits d'élastomère de silicone peuvent être utilisés de façon répétée pendant des années. Cependant, ne pas utiliser l'éthanol pour le nettoyage, car cela provoquerait l'élastomère de silicone à se fissurer.
5. Mont entiers Dissection de la cochlée (pour P7 et anciens échantillons)
- Séparer le tour basal de tours moyen / apical
- Placez un os temporal adoucie dans un plat de dissection élastomère de silicone revêtu rempli aux deux tiers avec du PBS 10 mM pH 7,4 et utiliser un microscope de dissection stéréo pour les étapes suivantes.
- Tenir l'os temporal dans la région vestibulaire avec n ° 4 ou n ° 5 des pinces de bijoutier droite et en utilisant 5 mm Vannas-Tübingen ciseaux à ressort, couper l'excédent de tissu de la capsule otique sur les côtés et au-dessus de l'apex.
- Utilisation de 2,5 mm Vannas ciseaux à ressort, insérer une lame dans la fenêtre ovale et de faire plusieurs petites coupures le long de la spirale ligament / latéraleparoi de la tour basal.
- Utilisation de 5 mm Vannas-Tübingen ciseaux à ressort, insérer une lame dans la région il suffit de couper et placer l'autre lame à l'extérieur de l'os temporal, en dedans de la fenêtre ovale. Cette coupe sépare le tour basal de virages moyens et apical.
- Dissection complète du tour basal.
- Utilisation de 2,5 mm Vannas ciseaux à ressort, couper les fibres nerveuses du ganglion spiral qui se connectent à l'modiolus pour relâcher la tension dans la tour basal et couper en dessous de la tour basal de se séparer de organes vestibulaires.
- Utilisation de 2,5 mm Vannas ciseaux à ressort, faire une série de petites coupures pour supprimer le / paroi latérale spirale ligament du dessus et en dessous l'organe de Corti. Utilisez # 4 ou # 5 pince de bijoutier droite pour guider le tissu. Epingler les fibres nerveuses ganglionnaires spirale vers le plat de dissection d'enduit d'élastomère de silicone, mais ne tenez pas sur cette région que le tissu se déchire.
- Au cours des étapes précédentes, une partie de la Membran de Reissnere va souvent être retiré. Si tout reste encore, saisir la membrane de Reissner avec une pince de n ° 4 ou n ° 5 droite bijoutier et se détache de l'organe de Corti.
NOTE: La membrane de Corti est rarement visible et flotte généralement distance sans nécessiter une étape spécifique pour l'enlèvement. - Faire Enfin plusieurs coupes de réduire l'épaisseur des axones du ganglion spiral, pour faire le tour le plus plat possible et utiliser n ° 4 ou n ° 5 des pinces de bijoutier droit de transférer le tour basal disséqué, en saisissant les axones restants du ganglion spiral, à une plaque de 48 puits (ou lame de chambre) contenant ~ 500 pi de PBS 10 mM pH 7,4.
- Moyen séparée et tours apical
- Placez les deux-tiers restants de la cochlée, côté apical vers le bas.
- Utilisation de 2,5 mm Vannas ciseaux à ressort, insérer une lame dans les médias de Scala où le tour Moyen utilisé pour être connecté à la tour basal, et de faire plusieurs petites coupures le long de la paroi spirale ligament / latérale de ee spire médiane.
- Utilisation de 5 mm Vannas-Tübingen ciseaux à ressort, insérer une lame dans la région il suffit de couper avec le tour Moyen placé sur le dessus de la lame, et placer l'autre lame à l'extérieur du labyrinthe osseux, à un angle de la pointe apicale 90 o. Cela sépare le tour du milieu de la tour apicale.
- Dissection complète du tour milieu d'une manière similaire à la tour basal (voir les étapes 5.2.2 à 5.2.4).
- Dissection complète du tour apicale.
- Utilisation de 2,5 mm Vannas ciseaux à ressort, ouvrir le capuchon qui couvre le tour apicale. Dissection complète d'une manière similaire à la tour basal (voir les étapes 5.2.2 à 5.2.4).
NOTE: disséqué tours cochléaires peuvent être stockés dans PBS 10 mM pH 7,4 dans une plaque de 48 puits (ou lame de chambre) à 4 o C pendant plusieurs semaines avant immunocoloration. Cependant PBS s'évaporer et doit être réapprovisionné périodiquement et le stockage de plus de 2 - 3 semaines peut conduire à la croissance bactérienne ou fongique sur latissu qui peut diminuer la qualité de l'image. Nous recommandons un stockage à long terme des échantillons que os temporaux undissected.
- Utilisation de 2,5 mm Vannas ciseaux à ressort, ouvrir le capuchon qui couvre le tour apicale. Dissection complète d'une manière similaire à la tour basal (voir les étapes 5.2.2 à 5.2.4).
6. Immunocoloration avec par fluorescence Tagged Anticorps
- Après la dissection, stocker chaque tour cochléaire dans un puits séparé dans une plaque de 48 puits (ou lame de chambre), immergé dans ~ 500 pi de PBS 10 mM pH 7,4. Pour chacune des étapes suivantes de la tour cochléaire doit être immergé dans un liquide, non flottant au-dessus ou collé sur le côté du puits.
REMARQUE: Lors du retrait de liquide de chaque puits, il est facile de perdre les tours cochléaires ou sucer dans la pointe de la pipette. Modification de solutions avec une pointe de pipette 200 pi en utilisant un champ de dissection aidera à prévenir cela. - En utilisant une pipette, retirer PBS de chaque puits et le remplacer par ~ 200 - 300 pi par puits de bloquer / solution de perméabilisation (1% de Triton X-100, 1% de sérum albumine bovine (BSA), et 10% de sérum de chèvre normal (NGS) dilué dans 10 mM de PBS pH 7,4). Incuber 1 heure à température ambiante sur un rotateur 3D.
NOTE: Si un anticorps primaire utilisé a été faite dans un hôte de chèvre, puis un anticorps secondaire anti-chèvre sera nécessaire et NGS ne doit PAS être utilisé pour toutes les étapes. De sérum de cheval normal peut être utilisé comme un remplacement pour NGS. - Retirer la solution de blocage / de perméabilisation en utilisant une pipette et le remplacer par ~ 100 pi par puits de solution d'anticorps primaire (0,1% de Triton X-100, 1% de BSA, 5% de NGS et diluées dans du PBS 10 mM pH 7,4). Le facteur de dilution pour chaque anticorps primaire varie. Incuber O / N (minimum 14 heures) à 4 ° C sur un agitateur 3D.
NOTE: Si plus d'un anticorps primaire est utilisé, tous peuvent être combinés dans la même solution pour l'incubation, assurez-vous que chaque anticorps primaire a un hôte différent. - Retirer la solution d'anticorps primaire à l'aide d'une pipette et effectuer 3 lavages de PBS 10 mM pH 7,4 à ~ 500 ul par puits. Chaque lavage couve un minimum de 5 min à température ambiante sur un rotateur 3D.
- Retirer P dernièreBS laver avec une pipette et le remplacer avec ~ 100 pi par puits d'une solution d'anticorps secondaire (0,1% de Triton X-100, 1% de BSA, et 5% NGS dilué dans 10 mM PBS pH 7,4). Le facteur de dilution pour chaque étiqueté par fluorescence anticorps secondaire est habituellement de 1: 500 ou 1: 1000. Placez la plaque de 48 puits dans une boîte noire pour protéger fluorescence marqués Anticorps secondaires de la lumière. Incuber 2 - 3 heures à température ambiante sur un rotateur 3D.
REMARQUE: si plus d'un anticorps secondaire est nécessaire, ils peuvent être combinés dans la même solution pendant l'incubation. Assurez-vous qu'il n'y a pas de possibilité de contre-étiquetage (par ex., En utilisant chèvre anti-lapin et de poulet anti-chèvre Anticorps secondaires) - Retirer la solution d'anticorps secondaire à l'aide d'une pipette et effectuer 3 lavages de PBS 10 mM pH 7,4 à ~ 500 pi par puits. Incuber chaque lavage pendant au moins 5 min à température ambiante sur un agitateur 3D. Gardez plaque de 48 puits dans une boîte noire à l'abri de la lumière.
- Retirez dernier lavage PBS aide d'une pipette et le remplacer par ~ 100 pi par puits de HoecTVH 33342 (dilué 1: 2000 dans PBS 10 mM pH 7,4) pour marquer les noyaux. Incuber 15 - 20 min à température ambiante sur un rotateur 3D. Gardez plaque de 48 puits dans une boîte noire à l'abri de la lumière. Ne pas incuber plus de 20 minutes.
- Retirer solution Hoechst aide d'une pipette et effectuer 3 lavages de PBS 10 mM pH 7,4 à ~ 500 pi par puits. Incuber chaque lavage pendant au moins 5 min à température ambiante sur un agitateur 3D. Gardez plaque de 48 puits dans une boîte noire à l'abri de la lumière.
- Toutes les étapes peuvent être prolongés, sauf Hoechst incubation, de plusieurs heures si nécessaire. Pour interrompre la réaction à tout moment, simplement plonger échantillons dans ~ 500 ul de 10 mM PBS pH 7,4 et stocker la plaque 48 eh bien (ou chambre lame) à 4 o C jusqu'au moment de reprendre les heures de protocole ou 1 - 2 jours plus tard .
7. Mont Cochlear Active Diapositives
- Étiquette glisse avec des informations pertinentes sur l'échantillon et les anticorps utilisés.
- Pipette ~ 50 pi de milieu de montage sur chaque diapositive et soyez prudentpour éviter que des bulles. Centrifuger le tube contenant les milieux de montage pour éliminer les bulles.
- Utilisation # 4 ou pince de # 5 droite bijoutier, saisir les axones du ganglion spiral de transférer en douceur un tour cochléaire de la plaque de 48 puits à la diapositive et le lieu dans les milieux de montage. Montez un tour cochléaire par diapositive pour éviter exposition à la lumière et photoblanchiment pendant le processus d'imagerie.
- Utiliser un microscope de dissection stéréo pour assurer ce tour cochléaire soit pas plié, tordu, ou près d'une bulle d'air. Si l'une de ces situations se produit, les pinces d'utilisation n ° 4 ou n ° 5 droite bijoutier pour repositionner le tour cochléaire.
- Placez une extrémité d'une lamelle sur la lame et relâchez doucement pour laisser la chute de lamelle.
- Utilisez une dissection microscope stéréo pour garantir que le tour cochléaire soit pas plié, tordu, ou près d'une bulle d'air. Si l'une de ces situations se produit, déplacez doucement la lamelle d'avant en arrière pour repositionner le tour cochléaire.
- Placer les lamesdans un dossier de diapositives afin qu'ils reposent à plat. Laissez montage remède médias O / N à température ambiante (garder dans l'obscurité)
- Des lamelles de sceller avec vernis transparent de l'ongle et stocker à température ambiante ou à -20 ° C jusqu'à ce imagés. Les diapositives peuvent être stockées dans un dossier de diapositives ou boîte de diapositive.
REMARQUE: Les diapositives peuvent être stockées à long terme à -20 ° C ou -80 ° C et la fluorescence sera maintenu pendant plusieurs mois. - Glisse image en utilisant un microscope confocal à la longueur d'onde appropriée sur la base des anticorps secondaires utilisés durant la procédure d'immuno-coloration. Réglage de la luminosité et de contraste peuvent être effectuées en utilisant le logiciel d'imagerie fournie par le fournisseur confocale.
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Representative Results
Nous présentons une méthode pour isoler l'organe de Corti que trois tours intactes cochléaires (de sommet, milieu, et la base) à partir de tissu cochléaire qui est calcifiée, avec des étapes de dissection clés présentés dans la figure 1. Pendant la première semaine postnatale du développement, la calcification de la cochlée de souris est incomplète et une méthode de dissection plus simple peut être utilisé 13. En utilisant la méthode de dissection néonatale toute la montagne avec cochlée de P7 et les résultats des souris âgées dans les larmes et le déchiquetage de l'organe de Corti. Le / paroi latérale spirale ligament est maintenant plus fermement attaché et ne peut être décollée de l'épithélium sensoriel sans causer de dommages. Ainsi, le procédé de dissection "adulte" toute la montagne est nécessaire pour les échantillons de plus de P6. Nous présentons un exemple de la spire médiane d'une cochlée de souris P15 qui a été disséqué et immunocolorées avec cellules ciliées et des marqueurs de cellules de support (figure 2). Optiques sections transversales cun aussi être obtenus avec l'ensemble de la technique de montage (Figure 3).
Plusieurs problèmes peuvent se produire pendant toute la dissection de montage ou lors du montage du cochléaire tourne sur des lames. Au cours de la suppression de la / paroi latérale spirale ligament, il ya une fenêtre étroite entre la coupe trop ou pas assez. Coupures qui surviennent à côté de la dernière rangée de cellules ciliées externes peuvent causer les cellules ciliées dans cette dernière ligne pour monter à des angles variés (figure 4A). Coupures qui sont trop grands peuvent supprimer des sections de l'organe de Corti (figure 4B). Manipulation de l'échantillon avec une pince prend grand soin et souvent il ya des trous dans l'organe de Corti où forceps ont été égarés (figure 4C). Enfin lors du montage des tours cochléaires, l'organe de Corti peut plier qui obscurcit l'image (Figure 4D).
Figure 1. Étapes importantes pour toute la montagne Dissection de la "adulte" Souris cochlée. (A) après le protocole étape 5.1.4, le tour basal de la cochlée est séparée de tours moyen / apical, mais toujours attaché à la région vestibulaire. (B) Après le protocole étape 5.3.3, le tour du milieu est séparé de la tour apicale. (C) Exemple de la dissection complété d'un tour où le milieu / paroi latérale spirale ligament est retiré. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2. confocale Slice image du Moyen-Tournez isolé d'un P15 souris. Quatre 20x images sont superposées à reconstituer l'ensemble spire médiane. Les cellules ciliées sont marquées avec un anticorps de lapin anti-myosine VIIa anticorps primaire (1: 200 de dilution) en combinaison avec un anticorps d'âne anti-lapin conjugué à Alexa 488-secondaire (1: 1000 dilution) (magenta). Cellules de soutien sont marqués avec un anticorps de chèvre anti-Sox2 primaire (dilution 1: 500) combiné avec un âne anti-chèvre Alexa anticorps 568 conjugué secondaire (1: 1000 dilution) (vert). Hoechst (bleu) étiquettes tous les noyaux. L'image a été prise à l'aide d'un microscope confocal Zeiss LSM 700 avec 405, 488, et 555 longueurs d'onde. Barre d'échelle = 100 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. optique Croix-section du Moyen Tournez isolé à partir de 6 semaines vieille souris. (A) de tranche d'image confocale de l'ensemble de la préparation de montage (en bas) et de la section optique dans le plan XZ (en haut). (B) Augmentation agrandissement du panneau supérieur en (A), avec la ligne de mire enlevés. Les cellules ciliées sont marquées avec un anticorps de lapin anti-myosine VIIa anticorps primaire (1: 200 de dilution) en combinaison avec un anticorps d'âne anti-lapin conjugué à Alexa 647-secondaire (1: 1000 dilution) (magenta). Cellules de soutien sont marqués avec un anticorps de chèvre anti-Sox2 primaire (dilution 1: 500) combiné avec un âne anti-chèvre Alexa anticorps 568 conjugué secondaire (1: 1000 dilution) (vert). L'image a été prise à l'aide d'un microscope confocal Zeiss LSM 700 avec 405, 555, et 647 longueurs d'onde. Les barres d'échelle = 20 pm S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Figure 4. exemples de problèmes qui peuvent se produire pendant toute la montagne Dissection ou Lorsque Cochlear montage Active diapositives. (A) Sur le côté gauche de l'image, le tissu cochléaire a été coupé à côté de la dernière rangée de cellules ciliées externes causant un grand nombre de ces cellules à être montées à des angles variés. (B) Une partie de l'organe de Corti sur le côté gauche de l'image est coupée. (C) Il y a un trou poinçonné dans la région de cellules ciliées externes au milieu de la image. (D), L'organe de Corti est plié en plusieurs endroits. Les images ont été prises à partir 4 - 8 semaines vieux cochlée de souris. Les cellules ciliées sont marquées avec un anticorps de lapin anti-myosine VIIa anticorps primaire (dilution 1: 200) Alexa 488-conjugué anticorps secondaire combiné avec un anticorps de chèvre anti-lapin (1: 1000 dilution) ou un âne anti-lapin Alexa anticorps secondaire 488 conjugué (1: 1000 dilution) (magenta). En C cel externe de cheveuxls sont marquées avec un anticorps de chèvre anti-Prestin primaire (dilution 1: 200) en combinaison avec un anticorps d'âne anti-lapin conjugué à Alexa 568-secondaire (1: 1000 dilution) (vert). Les images ont été prises avec un Leica SP5 microscope confocal avec 405, 488, et 555 longueurs d'onde nm. Les barres d'échelle: AB = 20 pm; en CD = 40 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Il ya plusieurs étapes cruciales pour la réussite de toute la dissection de montage et immunologique. Cependant, avant l'une de ces méthodes sont exécutées, fixation appropriée du tissu cochléaire est nécessaire. Nous vous recommandons d'utiliser le méthanol libre, ultra-pure, de qualité EM PFA. PFA fait à partir de poudre peut avoir des traces de méthanol et un pH instable qui diminue la qualité de l'immunofluorescence. D'autres groupes ont également montré que les dissections similaires sont possibles en utilisant des fixateurs qui ne contiennent pas de formaldéhyde 14-16. La longueur de fixation est également importante et spécifique est un anticorps. Certains anticorps peuvent tolérer un O / N fixation, tandis que d'autres ne fonctionnent pas bien avec seulement 1 h en PFA (mais cela est rare). Sous-tissu fixe peut être problématique pour la méthode de dissection que le tissu se désagrège. Dans notre expérience, un 3 - 4 h fixation permet une fixation adéquate et ne pas interférer avec la majorité des anticorps primaires couramment utilisés dans le domaine de l'audition.
jove_content "> Il est également possible que l'EDTA peut interférer avec des anticorps primaires;. Ainsi, certains anticorps va bien travailler dans le tissu néonatale, mais pas dans P7 ou le tissu ancien qui était détartrer Après fixation, os temporaux peuvent être stockées pour des montants variables de temps avant décalcification selon les antigènes en cours d'examen. Certains antigènes exigent décalcification et la dissection dans les jours à quelques semaines après la fixation, tandis que d'autres peuvent être stockées pendant des années (soit avant ou après la décalcification) sans diminuer la qualité de l'immunocoloration. Nous recommandons échantillons stockage en os temporaux en raison du risque d'évaporation du support de stockage (PBS) à partir de la plaque de 48 puits et de contamination potentielle par des champignons ou des bactéries. Nous effectuons généralement toute la dissection de montage moins d'une semaine à l'avance pour l'immunocoloration.Une fois fixé et décalcifiée, toute la dissection de montage est réalisée avec l'os temporal immergé dans un liquide. Elimination de l'excès osseux et moustissu entourant le labyrinthe au début de la dissection aidera à l'enlèvement du / ligament paroi latérale en spirale à des stades ultérieurs en facilitant la manipulation du tissu et fournir une vision moins occultée de structures critiques. Lors de la réalisation des premières étapes, on peut utiliser une pince pour maintenir le tissu dans la région vestibulaire. Cependant, une fois les tours sont isolées, il est important d'éviter de placer la pince sur l'organe de Corti ou / paroi latérale spirale ligament. Au lieu de cela, garder les pinces fermées et épinglez les fibres nerveuses ganglionnaires spirale vers le plat de dissection d'élastomère de silicone enduite. Ne pas se tenir sur cette région que le tissu se déchire. En général, une fois que le tissu a été divisée en trois tours, de saisir et de manœuvres de traction peut entraîner des résultats imprévisibles, qui sont souvent préjudiciables à l'organe de Corti et devrait être évitée. Tissu provenant d'animaux plus jeunes (P7-P21) a tendance à être plus indulgent que le tissu provenant d'animaux âgés de plus de P21. En outre, les échantillons avec cochléaires cellules ciliées dAmage sont plus difficiles à disséquer. Si la souris a reçu l'exposition au bruit le tissu est particulièrement fragile. Indépendamment de l'état du tissu, la dissection nous présentons est techniquement exigeant et nécessite de nombreuses tentatives de pratique en matière de compétence.
Au cours de l'immunocoloration, il est important que chaque spire cochléaire est immergé dans un liquide, non flottant au-dessus ou collé sur le côté du puits. Ceci permet une pénétration plus complète de triton et les anticorps dans le tissu. Lors du retrait de liquide de chaque puits, il est facile de perdre le tour cochléaire ou le dresser dans la pointe de la pipette. Modification de solutions avec une pointe de pipette 200 pi en utilisant un champ de dissection aidera à prévenir cela. Lentement extraire le liquide et déplacer la pointe de la pipette si le tour cochléaire est trop près. Pipetteting également la solution des déchets dans un tube propre peut être une bonne stratégie que ce tube des déchets peut être recherché si un virage est accidentellement aspiré dans la pipette. Si le tour est coincé dans l'embout de pipette, til pointe peut être coupé ouverte avec une lame de rasoir, mais souvent l'organe de Corti sera endommagé si cela se produit.
Lorsque dépannage anticorps pour immunocoloration, des mesures supplémentaires telles que la recherche de l'antigène ou l'amélioration de signal peuvent être ajoutés. Il ya un faible pH et l'antigène de pH élevé réactifs démasquer qui peuvent être achetés. Si un anticorps ne fonctionne pas avec la méthode décrite ici, le premier changement de protocole est d'essayer une de ces méthodes de recherche d'antigène. Sinon, utilisez un amplificateur de signal. Il existe des solutions disponibles dans le commerce à utiliser des kits d'amplification avant immunocoloration, ou tyramide qui peuvent être utilisés pour amplifier le signal provenant de l'anticorps secondaire.
L'importance de la technique, nous présentons est la capacité de maintenir la structure tridimensionnelle de l'organe de Corti et de visualiser toutes les cellules à l'intérieur de l'organe. La longueur totale de la cochlée est séparé en trois spires tandis que d'autres techniques similaires, à savoir eméthodes e Bohne et Liberman, exigent division en 5 - 10 pièces 6-8, en augmentant le nombre d'échantillons à manœuvrer dans les processus de immunocoloration et d'imagerie. La dissection de la paroi latérale cochléaire qui a été développé par Cosgrove et Gratton exige un niveau de compétence similaire et est possible non fixée, tissu frais, ainsi que dans les tissus décalcifiés, mais l'organe de Corti est dépouillé et détruit dans le processus d'isolement de la paroi latérale 17. Un autre groupe a effectué des dissections similaires en tissus non fixée cochléaire, frais de trois semaine vieux rats où le / paroi latérale spirale ligament est saisi et dépouillé de l'organe de Corti, laissant l'organe intact. Toutefois, ce ne fut réalisé dans le virage 5 apicale. La méthode de pelage de la / paroi latérale spirale ligament loin de l'organe de Corti est de routine pour la dissection du tissu fixe dans une jeune souris (<P7) 13. Cependant, dans notre expérience avec des souris âgés de plus de P6, après la fixation d'und décalcification, cette manœuvre souvent des larmes l'organe de Corti de façon fiable. En outre, la procédure décrite ici permet d'isoler moyenne et basale tourne ainsi.
Cryosections et sections obtenus après la paraffine sont aussi couramment utilisés dans le domaine auditif. Ces méthodes permettent de visualiser d'autres structures telles que la strie vasculaire, la membrane de Reissner et de la membrane de Corti, mais chaque section permet que la visualisation d'une petite région de l'organe de Corti dans chaque tour cochléaire. Ainsi, pour étudier les événements qui se produisent dans un motif en mosaïque, tels que la perte de cellules ou de la division cellulaire, avec le procédé de sectionnement, 50 ou plus de diapositives doivent être colorées et imagées pour capturer toute la longueur de la cochlée. En revanche, l'ensemble du protocole de dissection de montage présente l'avantage de la préparation de l'ensemble organe de Corti en trois morceaux. En plus de l'avantage de préserver l'architecture de la longueur de l'organe de Corti, cette technique permet la collecte de données et de stockage simplifiée. Une des limites de l'ensemble de dissection de montage est qu'il détruit les structures environnant tel que le ligament en spirale, strie vasculaire, la membrane de Reissner, et membrane recouvrante. Une autre limitation réside dans la difficulté technique et longueur de temps pour un seul dissection. Cela est principalement dû à la nature fragile de l'organe de Corti et une petite marge d'erreur lors du retrait du / paroi latérale spirale ligament. Une fois maîtrisé, l'ensemble de la dissection de montage d'une cochlée peut être effectuée dans environ 20 - 30 min.
Bien que le protocole ci-dessus décrit toute une méthode de dissection de montage pour la souris adulte, nous l'espérons, d'appliquer cette technique à d'autres organismes modèles utilisés dans le domaine auditif. Notre laboratoire est en train de modifier cette technique pour la dissection de la cochlée de rat. Le plus grand cochlée du rat est enfermé dans une capsule otique plus épais qui est plus dense que la souris calcifié. Ainsi l'os temporal doit être excised avec de grands ciseaux. Avant la fixation et la décalcification avec de l'EDTA, la capsule otique doit être ouvert avec des ciseaux afin de permettre un meilleur accès au tissu cochléaire. Aussi le processus de décalcification est plus longue et peut prendre jusqu'à 3 semaines en fonction de l'âge de l'échantillon. Pour l'ensemble de la dissection de montage, la taille du labyrinthe osseux affecte la technique. L'augmentation de la taille de la cochlée de rat fournit une distance légèrement plus grand entre le mur / et organe de Corti latéral ligament spirale, offrant une plus grande marge d'erreur pour les coupes individuelles. Cependant, alors que le tissu plus large peut fournir plus de matériel à saisir pour la manipulation de l'échantillon, il faut aussi un plus grand nombre de coupes d'enlever toute la longueur de la / paroi latérale spirale ligament. Nous croyons que des modifications analogues pourraient être faites pour la dissection de la cochlée de chinchilla, gerbille, et cochon Guinée.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | can be purchased from other vendors |
| 10.5 cm fine scissors | Fine Science Tools | 14060-11 | can be purchased from other vendors |
| 2 ml microcentrifuge tubes | MidSci | AVSS2000 | can be purchased from other vendors |
| 16% formaldehyde, methanol free, ultra pure, EM grade | Polysciences | 18814 | TOXIC --wear gloves and cannot be disposed of in the sink. Can be purchased from other vendors. |
| PBS pH 7.4 | Sigma | P3813-10PAK | can be purchased from other vendors |
| EDTA | Fisher | BP118-500 | can be purchased from other vendors |
| end-over-end tube rotator | Fisher | 05-450-127 | can be purchased from other vendors |
| 60 mm petri dish | Fisher | 50-202-037 | can be purchased from other vendors |
| Dow Corning Sylgard 184 silicone encapsulant kit | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| activated charcoal | Fisher | AC134372500 | can be purchased from other vendors |
| stereo dissection microscope | Zeiss | Stemi 2000 | can be purchased from other vendors |
| Dumont #4 jeweler's forceps | Fine Science Tools | 11241-30 | |
| Dumont #5 jeweler's forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| 2.5 mm Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15001-08 | curved |
| 5 mm Vannas-Tubingen spring scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | straight |
| 48-well plates | Fisher | 08-772-52 | can be purchased from other vendors |
| 8-well chamber slides | Fisher | 1256518 | can be purchased from other vendors |
| Triton X-100 | Sigma | X100-500 | can be purchased from other vendors |
| BSA, fraction V | Fisher | BP1605 | can be purchased from other vendors |
| NGS | Vector labs | S-1000 | can be purchased from other vendors |
| NHS | Vector labs | S-2000 | can be purchased from other vendors |
| 3D rotator | Midsci | R3D-710 | can be purchased from other vendors |
| Western blot incubation box XL | Licor | 929-97401 | |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | can be purchased from other vendors |
| Prolong gold antifade mounting media | Life Technologies | P36930 | can be purchased from other vendors,but mounting medias vary in their ability to protect against photobleaching |
| Superfrost Plus Slides | Fisher | 12-550-15 | can be purchased from other vendors |
| coverslips 22 x 22 x 1 | Fisher | 12-548-B | can be purchased from other vendors |
| clear nail polish | Local drug store | can be purchased from other vendors | |
| cardboard slide folder | Fisher | 12-587-10 | can be purchased from other vendors |
| plastic slide box | Fisher | 03-448-10 | can be purchased from other vendors |
References
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- Ehret, G., Frankenreiter, M. Quantitattive analysis of cochlear structures in the house mouse in relation to mechanisms of acoustical information processing. J Comp Physiol. 122, 65-85 (1977).
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