Summary
Wir präsentieren eine Methode, um die Erwachsenen Corti-Organ als drei intakte Cochlea-Windungen (Spitze, mittlere und Base) zu isolieren. Wir haben auch ein Verfahren zur Immunfärbung mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern nachzuweisen. Zusammen ermöglichen diese Verfahren die Untersuchung der Haarzellen, Stützzellen und anderen Zelltypen in der Cochlea vorhanden.
Introduction
Die spiralförmige Cochlea des Innenohres, innerhalb des Schläfenbeins enthalten, beherbergt das Corti-Organ, das auditive Sinnes Endorgan bei Säugetieren. Die Cochlea ist tonotopically organisiert und gewöhnlich in apikal, mittig geteilt, und basalen Windungen auf verschiedene Frequenzbereiche mit hochfrequenten Schallerkennung in der Basis und Niederfrequenzerkennung entsprechend der Spitze 1. Haarzellen, die mechanosensorischen Zellen des Corti-Organ, führen Sie die Länge der Cochlea, die etwa 6 mm lang bei Mäusen 2,3 ist. Diese Zellen wandeln die mechanische Energie der Schallwellen, die durch die mit Flüssigkeit gefüllte häutige Labyrinth übertragen werden, in neuronale Signale, die von zentralen auditorischen Strukturen verarbeitet werden. Die hier beschriebene Technik stellt ein Verfahren zur Herstellung von ganzen Bergen von Corti-Organ nach der Verkalkung der Cochlea abgeschlossen ist (für die Proben von einer Woche im Alter bis zum Erwachsenenalter). Wir präsentieren auch ein Verfahren zur immunostaining der ganzen montiert Cochlea-Gewebe. Cochlear Gesamtpräparate sind entscheidend für die Visualisierung der Haarzellen und Stützzellen umgibt in ihrer natürlichen räumlichen Anordnungen und ermöglichen eine Analyse in drei Dimensionen unter Verwendung der konfokalen Mikroskopie.
Drs. Hans Engström und Harlow Ades beschrieb ursprünglich eine ganze montieren Cochlea-Dissektion Verfahren im Jahr 1966. Sie detailliert eine Technik, um schnell zu fixieren und zu sezieren verkalkten cochleae in Flüssigkeit eingetaucht ist aus einer Vielzahl von Säugetieren, die Erhaltung intakter kurzen Segmenten des Corti-Organ für die mikroskopische Analyse 4. Die Präparation eines nicht fixierten, verkalkten Cochlea der Ratte hat sich auch in einem Lehr-Video 5 dargestellt. Drs. Barbara Bohne und Gary Harding an der Washington University, machte einige wichtige Veränderungen an dieser Methode. In ihrer Version der Cochlea ganze Berg-Methode, war das Schläfenbein entkalkt, in Kunststoff eingebettet und fünf Halbdrehungen oder zehn Viertel-Drehungen waren dissected 6,7. Dr. Charles Liberman und Kollegen an Eaton Peabody Laboratories, Massachusetts Eye and Ear Infirmary, modifiziert diese Technik so, daß Kunststoff-Einbettung nicht erforderlich 8. Weitere Modifikation der Technik traten bei Dr. Jian Zuo Labor in St. Jude-Kinderkrankenhaus 9-12, die die hier präsentierten Dissektion Verfahren informiert. Wir verwenden eine andere Strategie, um Zugriff auf das Corti-Organ als Bohne und Liberman, die Isolierung der kompletten apikalen, mittleren und basalen Umdrehungen ermöglicht zu gewinnen. Damit die sezierten Gewebe grßer und weniger wahrscheinlich, dass während der Dissektion oder Immunprozesse verloren gehen oder beschädigt werden. Darüber hinaus erleichtert die aktuelle Methode Messung des Abstandes von der apikalen Spitze oder basal Haken um einen Frequenzbereich zu ermitteln.
Obwohl viele Labors durchführen Immunfärbung von Cochlea-Gewebe, ist unklar, wo diese Methode entstand. Als Ergebnis gibt es verschiedene Rezepte zum Blockieren buffeRS und Antikörperinkubation Puffer, die die Leistung der einzelnen primären Antikörper beeinträchtigen kann. Hier stellen wir ein Verfahren zur Immunfärbung mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern, die für die am häufigsten verwendeten Antikörper im auditorischen Bereich ist.
Die komplexe Form der Cochlea, zarte Struktur des Corti-Organ, und knöchernen Umhüllung eine Herausforderung für die histologische und biochemische Analyse. Eine Vielzahl von Techniken sind derzeit in der mündlichen Verhandlung Feld verwendet, um diese schwierige Features zu überwinden und die Zellen zu visualisieren im Corti-Organ, jede Technik mit eigenen Vor- und Nachteile. Die hier vorgestellte Protokoll erlaubt ganze Berg Dissektion der erwachsenen Maus Cochlea und mit leichten Modifikation kann potentiell verwendet werden, um die kritischen Strukturen im cochleae aus einer Vielzahl von anderen auf dem Gebiet verwendet werden Modellorganismen untersuchen.
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Protocol
Ethics Statement: Verfahren, die Tier Themen wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee an der Southern Illinois University School of Medicine genehmigt.
1. Extraktion der Schläfenbeine
- Identifizieren Schläfenbeine in der Unterseite der Maus Schädel 13 und abkratzen die Hirnnerven mit Standardmuster Pinzette.
- Zeigen Standardmuster einer Pinzette an der Spitze der Ohrkapsel und mit dem Daumen der anderen Hand drücken Sie auf den hinteren Bogengangs, um den gekapselten Cochlea zu entfernen.
- Befreien Sie die untere Hälfte des Schläfenbeins aus dem Schädel von Hand mit dem Daumen und Zeigefinger oder mit Hilfe 10.5 cm feinen Schere.
2. Post-fix Schläfenbeine
- Platzieren temporale in 2 ml-Mikrozentrifugenröhrchen, die 250 bis 500 & mgr; l 4% Paraformaldehyd (PFA) in 10 mM phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) pH 7,4 und Incubaß bei RT für 2 - 20 h.
HINWEIS: Keine Öffnung der apikalen Kappe oder Injektion von PFA in die runden oder ovalen Fenster benötigt wird. Empfehlen die Verwendung von Methanol-freien, hochreine, Elektronenmikroskopie (EM) grade PFA, das bei einer 16% igen Konzentration in Glasfläschchen erworben werden kann. Sobald eine Ampulle geöffnet und 1: 4 verdünnt in PBS, so dass eine 4% ige Lösung, kann es bis zu 2 Wochen verwendet werden, wenn bei 4 o C gelagert (Einige Antikörper erfordern kurze Fixierung und andere können tolerieren O / N (O / N) Fixierung).
3. entkalken Schläfenbeine
- Nach der Fixierung zu entfernen PFA mit einer Pipette und ersetzen mit 120 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), etwas mehr als 2 ml. Stellen Sie sicher, die gesamte 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen zu verhindern, dass Luftblasen, wenn das Rohr geschlossen zu füllen.
- Wenn sie nicht sofort die Entkalkung, ersetzen PFA mit 10 mM PBS, pH 7,4, und Proben bei 4 o C
HINWEIS: Nach der Fixierung kann Schläfenbeine für variab gespeichert werdenle beträgt der Zeit, bis der Entkalkung in Abhängigkeit von der Antigene untersucht.
- Wenn sie nicht sofort die Entkalkung, ersetzen PFA mit 10 mM PBS, pH 7,4, und Proben bei 4 o C
- Die Röhrchen auf End-Over-End-Rotator und rotieren mit 4 Umdrehungen pro Minute bei RT. Ändern EDTA-Lösung täglich mit einer Pipette. Länge der Entkalkung ist abhängig vom Alter der Probe und der Präferenz des Wissenschaftlers dabei die Dissektion.
- Inkubieren Schläfenbeine in EDTA mit den folgenden Leitlinien für die Inkubationszeiten:
Für Proben postnatalen Tag (P) von 8 bis P15: 2-4 h; Für Proben, P15 bis P21: O / N; Für Proben, P21 bis P30: 2 O / N; Für Proben, die älter als P30: 3 oder mehr O / N.
HINWEIS: Entkalkung Zeiten können sich Nutzer Vorlieben und erweitert, wie gebraucht werden. Entkalkungszeit kann durch zweimaliges Ändern der EDTA-Lösung am Tag, etwa 8 Stunden auseinander reduziert werden. Einige Labors hinzufügen 1% PFA in die EDTA-Lösung, wenn die Entkalkung länger als 3 Tage, um eine Kontamination zu verhindern.
- Inkubieren Schläfenbeine in EDTA mit den folgenden Leitlinien für die Inkubationszeiten:
- Um festzustellen, ob die Probe ausreichend entkalkt, legen Schläfenbeine ona Silikonelastomer-beschichtet Dissektion Schüssel und drücken Sie vorsichtig Pinzette auf die schneckenförmige Cochlea. Wenn das Gewebe spongey ist, dann ist die Entkalkung komplett.
- Sobald Entkalkung beendet ist, entfernen EDTA mit einer Pipette und fügen 500 -1000 ul 10 mM PBS pH-Wert 7,4. Proben bei 4 ° C bis bereit zu sezieren.
4. Erstellen Sie Silikon-Kautschuk beschichtet Dissection Dish
- Kombinieren Sie die Basis und Härter aus einem Silikonelastomer Einkapselungsmaterial Kit nach den Anweisungen des Herstellers und gründlich mischen.
- In ca. 2 - 3 Esslöffel Pulver-Aktivkohle, bis die Lösung schwarz und gut mischen.
HINWEIS: Flüssigtinte oder Flüssigkohle wird nicht mit der Lösung zu mischen, und kann nicht verwendet werden. Siliconelastomer-Einkapselung Kits können in Schwarz erworben werden, so dass Schritt 4.2 entfallen. - Füllen Sie die Lösung in 60 mm Glas oder Kunststoff-Petrischalen, Füllung reicht zur Beschichtung der Unterseite. Wenn bubbles vorhanden sind, Blätterteig mit Luft auf der Oberfläche. Lassen Sie stehen mindestens 24 Stunden bei Raumtemperatur eingestellt.
HINWEIS: Silikon-Elastomer-beschichteten Schalen kann immer wieder für Jahre verwendet werden. Aber nicht mit Ethanol zur Reinigung, da sonst das Siliconelastomer zu knacken.
5. Ganze Berge Dissektion der Cochlea (für P7 und Ältere Proben)
- Trennen Sie die Basalwindung von Mitte / apikalen Windungen
- Legen Sie eine entkalkt Schläfenbein in einem Silikonelastomer-beschichtet Dissektion Teller füllte zwei Drittel mit 10 mM PBS, pH 7,4, und verwenden Sie ein Stereo-Dissektionsmikroskop für die folgenden Schritte.
- Halten Sie das Schläfenbein im vestibulären Bereich mit # 4 oder # 5 Pinzette gerade Juwelier- und mit 5 mm Vannas-Tübingen Frühjahr Schere, schneiden Sie überschüssiges Ohrkapsel Gewebe an den Seiten und über der Spitze.
- Verwendung von 2,5 mm Vannas Federschere, legen Sie ein Blatt in das ovale Fenster und stellen Sie mehrere kleine Schnitte entlang der Spiralligament / SeitenWand der basalen Windung.
- Unter Verwendung von 5 mm Vannas-Tübingen-Federschere, legen Sie ein Blatt in die Region nur schneiden und legen Sie die andere Klinge auf der Außenseite des Schläfenbeins, medial der ovalen Fenster. Dieser Schnitt trennt den Basalwindung von mittleren und apikalen Windungen.
- Komplette Dissektion der basalen Windung.
- Verwendung von 2,5 mm Vannas Frühjahr Schere, schnitt die Spiralgangliennervenfasern, die zu der Modiolus zu verbinden, um die Spannung in der basalen Windung freigeben und unter dem Basalwindung geschnitten, um vom Gleichgewichtsorgan zu trennen.
- Verwendung von 2,5 mm Vannas Federschere, stellen eine Reihe von kleinen Schnitten, um das Ligamentum spirale / Seitenwand von oben und unten Corti-Organ zu entfernen. Verwenden Sie # 4 oder # 5 Pinzette gerade Juwelier, um das Gewebe zu führen. Pin die Spiralgangliennervenfasern zu dem Silikonelastomer beschichtet Dissektion Gericht, aber nicht auf diesen Bereich zu halten, wenn das Gewebe zu zerreißen.
- Während der vorhergehenden Schritte, einige der Reissner membrane werden oft entfernt werden. Wenn einer nach wie vor, fassen Sie die Reissner-Membran mit einer Pinzette # 4 oder # 5 gerade Juwelier- und ziehen weg von Corti-Organ.
HINWEIS: Die Deckmembran ist selten sichtbar und in der Regel schwimmt weg, ohne einen bestimmten Schritt zur Entfernung erfordern. - Schließlich machen mehrere Schnitte, um die Dicke der Spiralganglien Axone zu reduzieren, um die wiederum so flach wie möglich herzustellen und zu verwenden # 4 oder # 5 Pinzette gerade Juwelier, um die seziert Basalwindung zu übertragen, durch Ergreifen Sie die verbleibenden Axone des Spiralganglions, um eine 48-Well-Platte (oder Kammerobjektträger), die ~ 500 ul 10 mM PBS pH-Wert 7,4.
- Separate mittleren und apikalen Windungen
- Die restlichen zwei Drittel der Cochlea, apikalen Seite nach unten.
- Verwendung von 2,5 mm Vannas Federschere, legen Sie ein Blatt in die Scala media, wo die Mitte wiederum verwendet, um die basalen Windung verbunden werden, und stellen Sie mehrere kleine Schnitte entlang der Spiralligament / Seitenwand the mittleren Reihe.
- Unter Verwendung von 5 mm Vannas-Tübingen-Federschere, legen Sie ein Blatt in der Region nur mit der Mitte wiederum auf der Oberseite des Blattes platziert geschnitten, und legen Sie die andere Klinge auf die außerhalb des knöchernen Labyrinth, in einem 90 o Winkel von der apikalen Spitze. Dies trennt den mittleren wiederum von der apikalen Umdrehung.
- Vollständige Präparation der Mitte wiederum in einer ähnlichen Weise zu der basalen Windung (siehe Schritte 5.2.2 bis 5.2.4).
- Komplette Dissektion der apikalen Umdrehung.
- Verwendung von 2,5 mm Vannas Federschere, öffnen Sie die Kappe, die den Scheitel wiederum deckt. Komplette Zerlegung in einer ähnlichen Weise zu der basalen Windung (siehe Schritte 5.2.2 bis 5.2.4).
HINWEIS: Dissected cochleären Windungen in 10 mM PBS, pH 7,4, in einer 48-Well-Platte (oder Kammerobjektträger) bei 4 ° C über mehrere Wochen vor der Immunfärbung gelagert werden. Jedoch PBS verdampft und muss periodisch aufgefüllt werden und die Lagerung von mehr als 2 - 3 Wochen in bakteriellen oder pilzlichen Wachstums auf dem ErgebnisGewebe, das die Qualität des Bildes zu verringern kann. Wir empfehlen, die Langzeitlagerung von Proben als unzerSchläfenBeine.
- Verwendung von 2,5 mm Vannas Federschere, öffnen Sie die Kappe, die den Scheitel wiederum deckt. Komplette Zerlegung in einer ähnlichen Weise zu der basalen Windung (siehe Schritte 5.2.2 bis 5.2.4).
6. Immunfärbung mit fluoreszenzmarkierten Antikörper
- Nach der Dissektion, speichern jede Cochlea wiederum in einer separaten Vertiefung in einer 48-Well-Platte (oder Kammerobjektträger), in ~ 500 ul 10 mM PBS, pH 7,4, eingetaucht. Für jeden der folgenden Schritte sollten die Windung der Cochlea in Flüssigkeit eingetaucht werden und nicht auf der Oberseite schwebend oder auf der Seite des Gut geklebt.
HINWEIS: Beim Entfernen von Flüssigkeit aus jeder Vertiefung, ist es leicht, die Cochlea-Windungen verlieren oder saugen sie auf in der Pipettenspitze. Ändern Lösungen mit 200 ul Pipettenspitze mit einer Dissektion Umfang wird dazu beitragen, dies zu verhindern. - Mit einer Pipette entfernen PBS aus jeder Vertiefung und ersetzen mit ~ 200 bis 300 & mgr; l pro Vertiefung blockiert / Permeabilisierung Lösung (1% Triton X-100, 1% Rinderserumalbumin (BSA) und 10% normalem Ziegenserum (NGS) in 10 mM PBS verdünnt pH 7,4). Inkubieren Sie 1 Stunde bei RT auf einem 3D-Rotator.
HINWEIS: Wenn ein primärer Antikörper verwendet wurde, bei einer Ziege Wirt gemacht, dann eine sekundäre anti-Ziegen-Antikörper benötigt werden und NGS sollten nicht für jeden der Schritte verwendet werden. Pferdenormalserum kann als Ersatz für NGS verwendet werden. - Entfernen Sie blockiert / Permeabilisierung Lösung mit einer Pipette und ersetzen mit ~ 100 ul pro Vertiefung von primären Antikörperlösung (0,1% Triton X-100, 1% BSA und 5% NGS in 10 mM PBS, pH 7,4, verdünnt). Der Verdünnungsfaktor für jeden primären Antikörper variiert. Inkubieren Sie O / N (mindestens 14 h) bei 4 ° C auf einem 3D-Rotator.
HINWEIS: Wenn mehr als eine primäre Antikörper verwendet wird, können alle in der gleichen Lösung für die Inkubation kombiniert werden, so stellen Sie sicher, dass jeder primären Antikörper hat einen anderen Host. - Entfernen primären Antikörperlösung mit einer Pipette und führen 3 Waschungen mit 10 mM PBS, pH 7,4, bei ~ 500 ul pro Vertiefung. Jeder Wasch brütet mindestens 5 min bei RT auf einem 3D-Rotator.
- Entfernen letzten PBS Wäsche mit einer Pipette und ersetzen mit ~ 100 ul pro Vertiefung von sekundären Antikörper-Lösung (0,1% Triton X-100, 1% BSA und 5% NGS in 10 mM PBS, pH 7,4, verdünnt). Der Verdünnungsfaktor für jedes fluoreszenzmarkierten sekundären Antikörpers ist in der Regel 1: 500 oder 1: 1000. Platzieren Sie 48-Well-Platte in einem schwarzen Kasten, um fluoreszenz schützen getaggt Sekundärantikörper von Licht. Inkubieren Sie 2 - 3 h bei RT auf einem 3D-Rotator.
HINWEIS: Wenn mehr als ein sekundärer Antikörper ist erforderlich, können sie in die gleiche Lösung für die Inkubation kombiniert werden. Stellen Sie sicher, es gibt keine Möglichkeit der grenzüber Kennzeichnung (z. B. unter Verwendung von Ziege-Anti-Kaninchen und Huhn anti-Ziege Sekundärantikörper) - Entfernen sekundären Antikörper-Lösung mit einer Pipette und führen 3 Waschungen mit 10 mM PBS, pH 7,4, bei ~ 500 ul pro Vertiefung. Inkubieren jeder Wäsche für mindestens 5 min bei RT auf einem 3D-Rotator. Halten Sie 48-Well-Platte in einem schwarzen Kasten, um vor Licht zu schützen.
- Entfernen letzten PBS waschen mit einer Pipette und ersetzen mit ~ 100 & mgr; l pro Vertiefung Hoechst 33342 (verdünnt 1: 2000 in 10 mM PBS pH-Wert 7,4), um Kerne zu beschriften. Inkubieren 15-20 min bei RT auf einem 3D-Rotator. Halten Sie 48-Well-Platte in einem schwarzen Kasten, um vor Licht zu schützen. Inkubieren Sie nicht länger als 20 min.
- Entfernen Hoechst-Lösung mit einer Pipette und führen 3 Waschungen mit 10 mM PBS, pH 7,4, bei ~ 500 ul pro Vertiefung. Inkubieren jeder Wäsche für mindestens 5 min bei RT auf einem 3D-Rotator. Halten Sie 48-Well-Platte in einem schwarzen Kasten, um vor Licht zu schützen.
- Alle Schritte können bei Bedarf erweitert werden, mit der Ausnahme, Hoechst Inkubation von mehreren Stunden. Um die Reaktion zu jedem Zeitpunkt unterbrechen, nur tauchen Proben in ~ 500 ul 10 mM PBS, pH 7,4, und speichern Sie die 48 -well Platte (oder Kammerobjektträger) bei 4 ° C bis bereit, um die Protokoll-Stunden oder 1 wieder aufzunehmen - 2 Tage später .
7. Montieren Cochlear Schaltet Slides
- Etikettenträger mit einschlägigen Informationen über die Probe und Antikörper verwendet.
- Pipette ~ 50 ul Eindeckmittel auf jeder Folie und darauf achten,um Blasen zu vermeiden. Zentrifugieren Sie die Röhrchen mit den Befestigungsmittel, um alle Luftblasen zu entfernen.
- Mit # 4 oder # 5 Pinzette gerade Juwelier, fassen die Axone des Spiralganglions, um sanft zu übertragen ein Cochlea wiederum von der 48-Well-Platte mit dem Schlitten und in die Montage Medien. Hängen Sie eine Cochlea wiederum pro Folie, um Belichtung und Photobleichen während des Abbildungsprozesses zu verhindern.
- Verwenden Sie ein Stereo Dissektionsmikroskop um sicherzustellen, dass Cochlea wiederum nicht gefaltet, verdreht, oder in der Nähe einer Luftblase. Wenn eine dieser Bedingungen auftreten, Pinzetten Verwendung # 4 oder # 5 gerade Juwelier, um die Cochlea wiederum neu zu positionieren.
- Platzieren Sie ein Ende eines Deckglas auf den Objektträger und sanft loslassen, um das Deckglas fallen lassen.
- Verwenden Sie ein Stereo Dissektionsmikroskop, um sicherzustellen, dass die Cochlea wiederum nicht gefaltet, verdreht, oder in der Nähe einer Luftblase. Wenn eine dieser Bedingungen zutrifft, sanft bewegen das Deckglas hin und her, um die Cochlea wiederum neu zu positionieren.
- Objektträgerin einer Dia-Ordner, so dass sie flach. Lassen Sie die Montage Medien Heilung O / N bei RT (halten in der Dunkelheit)
- Seal Deckgläser mit klarem Nagellack und lagern bei RT oder -20 ° C bis abgebildet. Dias können in einer Diashow Ordners oder Dias Box gespeichert werden.
HINWEIS: Die Objektträger können langfristig bei -20 ° C oder -80 ° C gelagert werden und die Fluoreszenz wird für mehrere Monate aufrechterhalten werden. - Bildobjektträger unter Verwendung eines konfokalen Mikroskops mit der entsprechenden Wellenlänge auf der Basis der Sekundärantikörper in der Immunfärbung verwendet. Helligkeit und Kontrast können unter Verwendung der Imaging-Software durch die konfokale Anbieter bereitgestellt werden.
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Representative Results
Wir präsentieren eine Methode, um das Corti-Organ als drei intakte Cochlea-Windungen (Spitze, mittlere und Basis) von Cochlea-Gewebe, das verkalkt ist, mit den wichtigsten Dissektion Schritte in Abbildung 1 dargestellt zu isolieren. Während der ersten postnatalen Woche der Entwicklung, Verkalkung der Maus Cochlea ist unvollständig und eine einfachere Dissektion Methode kann verwendet 13 werden. Verwenden des Neugeborenen ganze Berg Dissektion Methode mit Cochlea von P7 und älteren Mäusen zu Tränen und Zerkleinerung des Corti-Organ. Das Ligamentum spirale / Seitenwand ist nun fest angebracht und kann nicht weg von der Sinnesepithel abgezogen werden, ohne dass Schäden. So ist die "Erwachsenen" whole mount Dissektion Methode wird für Proben, die älter als P6 gebraucht. Wir stellen ein Beispiel der mittleren Windung eines P15-Maus Cochlea, die herausgeschnitten und mit Haarzelle und unterstützende Zellmarker (Abbildung 2) immungefärbt wurde. Optische Querschnitte cein auch mit der ganze Berg-Technik (Abbildung 3) erhalten werden.
Mehrere Probleme können während der ganze Berg Dissektion auftreten oder bei der Montage des Cochlea schaltet Rutschen. Während der Entfernung des Spiralbandes / Seitenwand befindet sich ein schmales Fenster zwischen Schneid zuviel oder nicht genug. Schnitte, die neben der letzten Zeile der äußeren Haarzellen auftreten können, die Haarzellen in dieser letzten Reihe zu veranlassen, in unterschiedlichen Winkeln (4A) zu montieren. Schnitte, die zu groß sind, können Abschnitte des Corti-Organ (4B) zu entfernen. Umgang mit der Probe mit einer Pinzette mit großer Sorgfalt und oft gibt es Löcher im Corti-Organ, wo Pinzette wurden verlegt (4C). Schließlich bei der Montage der Cochlea-Umdrehungen kann das Corti-Organ zu falten, die das Bild (Abbildung 4D) verdeckt.
Abbildung 1. Wichtige Schritte in der ganze Berg Dissektion der "Adult" Maus Cochlea. (A) Nach dem Protokoll Schritt 5.1.4 wird der basalen Windung der Cochlea von Mitte / apikalen Windungen getrennt, aber immer noch auf die vestibulären Bereich angebracht. (B) Nach dem Protokoll Schritt 5.3.3 wird die Mitte wiederum von der apikalen wiederum getrennt. (C) Beispiel für die fertige Präparation eines mittleren wiederum, wo das Ligamentum spirale / Seitenwand entfernt wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version zu sehen dieser Figur.
Abbildung 2. Die konfokale Scheibe Bild des MittelSchalten Isoliert von einer P15-Maus. Vier 20x Bilder werden überlagert, um die ganze Mitte wiederum rekonstruieren. (200 Verdünnung 1) kombiniert mit einem Esel-Anti-Kaninchen-Alexa 488-konjugierten Sekundärantikörper (1: 1000 Verdünnung) (magenta) Haarzellen werden mit einem Kaninchen-Anti-Myosin-VIIa primäre Antikörper markiert. (: 500 Verdünnung 1) in Kombination mit einem Esel anti-Ziege-Alexa 568-konjugierten Sekundärantikörper (1: 1000 Verdünnung) (grün) Stützzellen sind mit einem Ziege-Anti-Sox2 primären Antikörper markiert. Hoechst (blau) markiert alle Kerne. Das Bild wurde mit einem Zeiss LSM 700 konfokalen Mikroskop mit 405, 488 und 555 Wellenlängen gemacht. Maßstabsbalken = 100 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Optische Querschnitt des Mittel Drehen Sie Isolated von einem 6-Wochen alten Maus. (A) Die konfokale Schichtbild des gesamten Montagevorbereitung (unten) und optische Querschnitt in der XZ-Ebene (oben). (B) Höhere Vergrößerung der oberen Platte in (A), mit dem Fadenkreuz entfernt. (200 Verdünnung 1) kombiniert mit einem Esel-Anti-Kaninchen-Alexa647-konjugierten Sekundärantikörper (1: 1000 Verdünnung) (magenta) Haarzellen werden mit einem Kaninchen-Anti-Myosin-VIIa primäre Antikörper markiert. (: 500 Verdünnung 1) in Kombination mit einem Esel anti-Ziege-Alexa 568-konjugierten Sekundärantikörper (1: 1000 Verdünnung) (grün) Stützzellen sind mit einem Ziege-Anti-Sox2 primären Antikörper markiert. Das Bild wurde mit einem Zeiss LSM 700 konfokalen Mikroskop mit 405, 555 und 647 Wellenlängen gemacht. Maßstabsbalken = 20 & mgr; m Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Abbildung 4. Beispiele für Probleme, die während der ganze Berg Dissection auftreten können oder bei der Montage von Cochlear Schaltet Slides. (A) Auf der linken Seite des Bildes wurde die Cochlea-Gewebe neben der letzten Zeile der äußeren Haarzellen schneiden so dass viele der diese Zellen in unterschiedlichen Winkeln montiert werden. (b) ein Abschnitt des Corti-Organ an der linken Seite des Bildes abgeschnitten worden ist. (C) ist ein Loch in der äußeren Haarzellbereich in der Mitte der Stanz Bild. (D), ist das Corti-Organ an mehreren Stellen gefaltet. 8 Wochen alten Maus cochleae - Bilder wurden von 4 übernommen. Haarzellen werden mit einem Kaninchen-Anti-Myosin-VIIa primäre Antikörper markiert (1: 200-Verdünnung) in Kombination mit einem Ziege-anti-Kaninchen-Alexa 488-konjugierten Sekundärantikörper (1: 1000 Verdünnung) oder ein Esel-Anti-Kaninchen-Alexa 488-konjugierten Sekundärantikörper (1: 1000 Verdünnung) (magenta). In C äußeren Haar cel(: 200-Verdünnung 1) in Kombination mit einem Esel anti-Kaninchen-Alexa 568-konjugierten Sekundärantikörper (1: 1000 Verdünnung) (grün) ls sind mit Ziege-Anti-prestin primären Antikörper markiert. Die Bilder wurden mit einem Leica SP5 konfokalen Mikroskop mit 405, 488 und 555 nm Wellenlängen gemacht. Maßstabsbalken: in AB = 20 & mgr; m; in CD = 40 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Es gibt mehrere wichtige Schritte für eine erfolgreiche ganze Berg Präparation und Immunfärbung. Jedoch, bevor Sie eine dieser Methoden durchgeführt werden, ist die richtige Fixierung der Cochlea Gewebe benötigt. Wir empfehlen die Verwendung von Methanol-freien, hochreine, EM Grade PFA. PFA von Pulver kann Spuren von Methanol und einem instabilen pH-Wert, die Qualität der Immunfluoreszenz abnimmt. Andere Gruppen haben gezeigt, dass ähnliche Sektionen sind mit Hilfe Fixiermittel die Formaldehyd 14-16 enthalten. Die Länge der Fixierungs ist ebenfalls wichtig und ist spezifischer Antikörper. Einige Antikörper können eine O / N Fixierung zu tolerieren, während andere nicht gut mit nur 1 Stunde in PFA arbeiten (dies ist jedoch selten). Unter-fixiertem Gewebe problematisch für die Dissektion Methode sein kann, wenn das Gewebe auseinander fällt. Nach unserer Erfahrung ein 3-4 Std Fixierung bietet entsprechend fixiert und die nicht mit der Mehrheit der primären Antikörpern häufig in der mündlichen Verhandlung Feld verwendet stören.
jove_content "> Es ist auch möglich, dass EDTA kann mit primären Antikörpern stören;. so einige Antikörper werden auch bei der Neugeborenen-Gewebe in P7 oder älter Gewebe, entkalkt wurde Nach der Fixierung zu arbeiten, aber kann Schläfenbeine für variable Mengen an Zeit, bevor gespeichert werden Entkalkung je nach Antigene untersucht. Einige Antigene erfordern Entkalkung und Dissektion innerhalb von Tagen bis Wochen nach der Fixierung, während andere seit Jahren (entweder vor oder nach dem Entkalken) gespeichert werden, ohne die Qualität der Immunfärbung. Wir empfehlen Lagerung von Proben als Schläfenbeine wegen der Gefahr der Verdampfung von dem Speichermedium (PBS) von der Platte mit 48 Vertiefungen und möglichen Kontamination mit Pilzen oder Bakterien. Wir führen in der Regel die gesamte Halterung Präparation weniger als eine Woche vor der Immunfärbung.Einmal festgelegt und entkalkt wird der ganze Berg Dissektion mit dem Schläfenbein in Flüssigkeit eingetaucht durchgeführt. Entfernen überschüssiger Knochen und Weichdas Labyrinth umgebenden früh Dissektion Gewebe wird bei der Entfernung des Spiralbandes / Seitenwand in einem späteren Stadium durch die Erleichterung der Manipulation des Gewebes und ein weniger Sichtbehinderung des kritischen Strukturen zu unterstützen. Bei der Durchführung der ersten Schritte können Pinzetten verwendet, um das Gewebe in vestibulär halten. Doch sobald die Windungen getrennt sind, ist es wichtig zu vermeiden, dass einer Pinzette auf der Corti-Organ oder Ligamentum spirale / Seitenwand. Stattdessen halten die Zange geschlossen und stecken Sie die Spiralgangliennervenfasern in die Siliconelastomer-beschichtet Dissektion Gericht. Nicht auf diese Region zu halten, wie das Gewebe reißen. In der Regel einmal wurde das Gewebe in die drei Windungen aufgeteilt, Greifen und Ziehen Manöver kann zu unvorhersehbaren Ergebnissen, die oft schädlich für Corti-Organ und sollte vermieden werden verursachen. Gewebe von jüngeren Tieren (P7-P21) neigt dazu, mehr zu vergeben, als Gewebe von Tieren, die älter als P21. Darüber hinaus Cochlea-Proben mit Haarzelle dAmage sind schwieriger zu sezieren. Wenn die Maus erhielten Lärmbelastung das Gewebe ist besonders empfindlich. Unabhängig vom Zustand des Gewebes, ist die Dissektion präsentieren wir technisch anspruchsvoll und erfordert viele Versuche der Praxis für Kompetenz.
Bei Immunfärbung ist es wichtig, dass jede Windung der Cochlea in Flüssigkeit eingetaucht ist, nicht überschwimmende oder zu der Seite der Bohrung stecken. Dies erlaubt eine vollständige Durchdringung Triton und Antikörper in das Gewebe. Wenn Flüssigkeit aus jeder Vertiefung entfernt, ist es leicht, die Cochlea wiederum verlieren oder ziehen es in die Pipettenspitze. Ändern Lösungen mit 200 ul Pipettenspitze mit einer Dissektion Umfang wird dazu beitragen, dies zu verhindern. Langsam extrahieren Sie die Flüssigkeit und bewegen Sie die Pipettenspitze, wenn der Cochlea wiederum zu nahe kommt. Auch pipetteting Abfalllösung in ein sauberes Röhrchen kann eine gute Strategie sein, da diese Abfälle Rohr gesucht, wenn ein wiederum versehentlich bis in die Pipette gezogen werden. Wenn die wiederum in der Pipettenspitze, t steckener kippen kann offen mit einer Rasierklinge geschnitten werden, aber oft das Corti-Organ wird beschädigt, wenn dies der Fall ist.
Bei der Fehlersuche Antikörper zur Immunfärbung, können zusätzliche Schritte, wie beispielsweise Antigen-Retrieval oder Signalverstärkung zugesetzt werden. Es gibt niedrigen pH-Wert und hohen pH-Antigen Demaskierung Reagenzien, die gekauft werden können. Wenn ein Antikörper nicht mit dem hier beschriebenen Verfahren arbeiten, ist eine dieser Antigengewinnungsverfahren die erste Protokolländerung zu versuchen. Alternativ können Sie einen Signalverstärker. Es sind handelsübliche Lösungen vor der Immunofärbung oder Tyramid Amplifikation Kits, die verwendet werden können, um das Signal von dem sekundären Antikörper verstärken verwenden.
Die Bedeutung der Technik, die wir vorstellen, ist die Fähigkeit, um die dreidimensionale Struktur des Cortischen Organs zu erhalten und alle Zellen innerhalb des Organs zu visualisieren. Die gesamte Länge der Schnecke in nur drei Windungen getrennt werden, während andere ähnliche Techniken, nämlich the Bohne und Liberman Methoden erfordern Teilung in 5 - 10 Stück 6-8, Erhöhung der Anzahl der Proben, die in der Immunfärbung und Abbildungsprozesse zu manövrieren. Das Cochlea-Seitenwand Dissektion, die von Cosgrove und Gratton entwickelt wurde, erfordert ein ähnliches Maß an Geschick und ist in nicht fixierten, frischem Gewebe möglich ist, als auch in entkalkt Gewebe, aber das Corti-Organ ist weg in den Prozess der Isolierung der abgezogen und vernichtet Seitenwand 17. Eine andere Gruppe hat ähnliche Dissektionen in fixierten, frische Cochlea-Gewebe durchgeführt von drei Wochen alten Ratten, wo das Ligamentum spirale / Seitenwand ergriffen und weg von der Corti-Organ abgezogen, so dass die Orgel intakt. Allerdings war dies nur im apikalen wiederum 5 erreicht. Das Verfahren nach dem Abziehen des Spiralbandes / Seitenwand weg von der Corti-Organ ist Routine zur Dissektion festen Gewebe in einer jungen Maus (<P7) 13. Doch in unserer Erfahrung mit Mäusen älter als P6, nach der Fixierung eind Entkalkung, dieses Manöver oft zerreißt das Corti-Organ in einem unzuverlässigen Mode. Darüber hinaus ist das hier beschriebene Verfahren ermöglicht Isolierung von mittleren und basalen dreht sich auch.
Gefrierschnitte und Profile nach Paraffineinbettung erhalten werden häufig auch im auditorischen Bereich verwendet. Diese Methoden erlauben die Visualisierung anderer Strukturen wie der Stria vascularis, Reissner-Membran und Deckmembran, aber jeder Abschnitt erlaubt nur Visualisierung von einem kleinen Bereich des Corti-Organ in jeder Cochlea-Reihe. Somit auf Ereignisse, die in einem Mosaikmuster auftreten, wie Zellverlust oder Zellteilung, mit dem Schnittverfahren zu untersuchen, müssen 50 oder mehr zu färbenden Objekt und abgebildet werden, um über die gesamte Länge der Schnecke zu erfassen. Im Gegensatz dazu hat der ganze Berg Dissektion Protokoll den Vorteil, dass die Vorbereitung der gesamten Corti-Organ in nur drei Stück. Zusätzlich zum Vorteil der Erhaltung der Längs Architektur des Organes der Corti, dieses technique ermöglicht die vereinfachte Datenerhebung und -speicherung. Eine Einschränkung der gesamten Halterung Dissektion ist, dass er zerstört umgebenden Strukturen wie der Spiralbandes, Stria vascularis, Reissner-Membran und Tektorialmembran. Eine weitere Einschränkung ist die technische Schwierigkeit und die Länge der Zeit für eine einzelne Präparation. Dies ist vor allem auf die fragile Natur des Corti-Organ und kleine Spielraum für Fehler beim Entfernen des Ligamentum spirale / Seitenwand. 30 Minuten - einmal gemeistert, kann der ganze Berg Dissektion eines Cochlea in etwa 20 durchgeführt werden.
Während das obige Protokoll beschreibt eine ganze Berg Dissektion Methode zur erwachsenen Maus, hoffen wir, diese Technik auf andere im auditorischen Bereich verwendet Modellorganismen gelten. Unser Labor ist derzeit Änderung dieser Technik für die Präparation der Cochlea der Ratte. Der größere Cochlea der Ratte ist in einem dickeren Ohrkapsel, die dichter ist als die verkalkte Maus ummantelt. So ist die Schläfenbein muss eine E werdenmit großen Scheren xcised. Vor der Fixierung und Entkalkung mit EDTA sollte der Ohrkapsel mit einer Schere geöffnet werden, um einen besseren Zugang zu den cochleären Gewebe ermöglichen. Auch der Entkalkung ist länger und kann in Abhängigkeit vom Alter der Probe nehmen 3 Wochen. Für die gesamte Halterung Dissektion, die Größe des knöchernen Labyrinth wirkt sich auf die Technik. Die erhöhte Größe der Cochlea der Ratte stellt einen etwas größeren Abstand zwischen dem Ligamentum spirale / Seitenwand und Corti-Organ, die eine größere Fehlertoleranz für die einzelnen Schnitte. Jedoch während der größere Gewebe kann mehr Material für die Manipulation der Probe erfassen liefern, erfordert es, auch eine größere Anzahl von Schnitten, die gesamte Länge des Spiralbandes / Seitenwand zu entfernen. Wir glauben, dass analoge Modifikationen für die Präparation der Cochlea von Chinchilla, Hamster und Meerschweinchen gemacht werden könnten.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | can be purchased from other vendors |
| 10.5 cm fine scissors | Fine Science Tools | 14060-11 | can be purchased from other vendors |
| 2 ml microcentrifuge tubes | MidSci | AVSS2000 | can be purchased from other vendors |
| 16% formaldehyde, methanol free, ultra pure, EM grade | Polysciences | 18814 | TOXIC --wear gloves and cannot be disposed of in the sink. Can be purchased from other vendors. |
| PBS pH 7.4 | Sigma | P3813-10PAK | can be purchased from other vendors |
| EDTA | Fisher | BP118-500 | can be purchased from other vendors |
| end-over-end tube rotator | Fisher | 05-450-127 | can be purchased from other vendors |
| 60 mm petri dish | Fisher | 50-202-037 | can be purchased from other vendors |
| Dow Corning Sylgard 184 silicone encapsulant kit | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| activated charcoal | Fisher | AC134372500 | can be purchased from other vendors |
| stereo dissection microscope | Zeiss | Stemi 2000 | can be purchased from other vendors |
| Dumont #4 jeweler's forceps | Fine Science Tools | 11241-30 | |
| Dumont #5 jeweler's forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| 2.5 mm Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15001-08 | curved |
| 5 mm Vannas-Tubingen spring scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | straight |
| 48-well plates | Fisher | 08-772-52 | can be purchased from other vendors |
| 8-well chamber slides | Fisher | 1256518 | can be purchased from other vendors |
| Triton X-100 | Sigma | X100-500 | can be purchased from other vendors |
| BSA, fraction V | Fisher | BP1605 | can be purchased from other vendors |
| NGS | Vector labs | S-1000 | can be purchased from other vendors |
| NHS | Vector labs | S-2000 | can be purchased from other vendors |
| 3D rotator | Midsci | R3D-710 | can be purchased from other vendors |
| Western blot incubation box XL | Licor | 929-97401 | |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | can be purchased from other vendors |
| Prolong gold antifade mounting media | Life Technologies | P36930 | can be purchased from other vendors,but mounting medias vary in their ability to protect against photobleaching |
| Superfrost Plus Slides | Fisher | 12-550-15 | can be purchased from other vendors |
| coverslips 22 x 22 x 1 | Fisher | 12-548-B | can be purchased from other vendors |
| clear nail polish | Local drug store | can be purchased from other vendors | |
| cardboard slide folder | Fisher | 12-587-10 | can be purchased from other vendors |
| plastic slide box | Fisher | 03-448-10 | can be purchased from other vendors |
References
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- Ehret, G., Frankenreiter, M. Quantitattive analysis of cochlear structures in the house mouse in relation to mechanisms of acoustical information processing. J Comp Physiol. 122, 65-85 (1977).
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