Summary
نقدم طريقة لعزل الجهاز الكبار كورتي كما ثلاث لفات سليمة قوقعة (قمة، والمتوسطة، وقاعدة). علينا أيضا أن يبرهن على وجود إجراءات المناعية مع الأجسام المضادة الموسومة fluorescently. معا هذه التقنيات تتيح دراسة خلايا الشعر والخلايا الداعمة، وأنواع الخلايا الأخرى الموجودة في القوقعة.
Introduction
القوقعة على شكل حلزوني في الأذن الداخلية، الواردة في العظم الصدغي، ويوجد في جهاز كورتي، والسمعي الجهاز نهاية الحسي في الثدييات. ويتم تنظيم القوقعة tonotopically وتنقسم عادة إلى قمية، والمتوسطة، والقاعدية يتحول الموافق المناطق ترددية مختلفة مع الكشف عن الصوت عالية التردد في قاعدة وانخفاض الكشف عن التردد في قمة 1. خلايا الشعر، خلايا ميكانيكية حسية من جهاز كورتي، تشغيل طول القوقعة، وهو ما يقرب من 6 مم طويل في الفئران 2،3. هذه الخلايا بتحويل الطاقة الميكانيكية من الموجات الصوتية التي تنتقل عن طريق التيه الغشائي مملوءة بسائل، إلى إشارات العصبية التي تتم معالجتها من قبل هياكل السمعية المركزية. تقنية الموضحة هنا يوفر طريقة لتحضير يتصاعد كاملة من جهاز كورتي بعد تكلس القوقعة كاملة (للعينات تتراوح بين أسبوع واحد من العمر إلى سن البلوغ). كما نقدم طريقة لimmunostaining كلها محمولة على الأنسجة القوقعة. يتصاعد كلها قوقعة حاسمة لرؤية جميع خلايا الشعر والخلايا المحيطة دعم في الترتيبات المكانية الطبيعية وتسمح للتحليل في ثلاثة أبعاد باستخدام المجهر متحد البؤر.
د. هانز انجستروم وهارلو عدس وصف في الأصل كله جبل طريقة تشريح قوقعة الأذن في عام 1966. وهي المفصل تقنية لإصلاح سريع وتشريح قوقعة متكلسة المغمورة في السائل من مجموعة متنوعة من الثدييات، والحفاظ على شرائح سليمة قصيرة من جهاز كورتي عن التحليل المجهري 4. كما تم توضيح وتشريح لغير المثبتة، متكلسة القوقعة الفئران في شريط فيديو تعليمي 5. د. قدمت باربرا Bohne وغاري هاردينغ في جامعة واشنطن عدة تعديلات هامة لهذا الأسلوب. في النسخة الخاصة من طريقة جبل كامل القوقعة، وكان العظم الصدغي decalcified، جزءا لا يتجزأ من البلاستيك، وكانت خمس نصف المنعطفات أو عشرة ربع يتحول dissecتيد 6،7. الدكتور تشارلز ليبرمان وزملاؤه في مختبرات بيبودي إيتون، ماساتشوستس العين والأذن المستوصف، تعديل هذه التقنية لذلك لم يكن مطلوبا أن التضمين البلاستيك 8. حدث مزيد من التعديل للتقنية في مختبر الدكتور جيان تسوه في مستشفى سانت جود للاطفال البحوث 12/09 الذي أبلغ طريقة تشريح المقدمة هنا. نحن نستخدم استراتيجية مختلفة للوصول إلى جهاز كورتي من Bohne وليبرمان، والذي يسمح عزل قمي كاملة، والمتوسطة، والمنعطفات القاعدية. وهكذا فإن تشريح الأنسجة أكبر وأقل عرضة للالمفقودة أو التالفة أثناء عمليات تشريح أو المناعية. وبالإضافة إلى ذلك، فإن الطريقة الحالية يسهل قياس المسافة من طرف القمي أو ربط القاعدية لتعريف المنطقة التردد.
على الرغم من أن العديد من المعامل أداء المناعية للأنسجة القوقعة، فمن غير الواضح أين نشأت هذه الطريقة. ونتيجة لذلك هناك وصفات مختلفة لمنع العازلهالتمرير ومخازن الأجسام المضادة الحضانة التي قد تؤثر على أداء الأجسام المضادة الأولية الفردية. هنا، نقدم طريقة واحدة لالمناعية مع الأجسام المضادة الموسومة fluorescently التي تنطبق على الأجسام المضادة الأكثر استخداما في مجال السمعي.
شكل معقد من القوقعة، هيكل الدقيق للجهاز كورتي، وتغطية عظمي توفر تحديا للتحليل النسيجي والبيوكيميائية. وتستخدم مجموعة متنوعة من التقنيات حاليا في مجال السمع للتغلب على هذه الميزات صعبة وتصور الخلايا داخل جهاز كورتي، كل أسلوب مع مزاياه وعيوبه. بروتوكول المعروضة هنا يسمح لكامل تشريح جبل القوقعة الماوس الكبار و، مع تعديل طفيف، يمكن أن يحتمل أن تستخدم لدراسة الهياكل الحيوية داخل قوقعة من مجموعة متنوعة من الكائنات النموذج الأخرى المستخدمة في هذا المجال.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
بيان الأخلاق: إجراءات التي تجرى على الحيوانات قد وافقت عليها رعاية الحيوان واللجنة المؤسسية استخدم في جامعة جنوب إلينوي الطب.
1. استخراج الزمني العظام
- تحديد عظام الزمنية في قاعدة الجمجمة الماوس 13 وكشط بعيدا الأعصاب القحفية باستخدام ملقط نمط القياسية.
- وضع ملقط نمط القياسية في غيض من الكبسولة أذني ومع الإبهام من المعاكس جهة ضغط لأسفل على الخلفية القناة الهلالية لإزاحة القوقعة مغلفة.
- تحرير النصف السفلي من العظم الصدغي من الجمجمة يدويا مع الإبهام والسبابة أو باستخدام 10.5 سم مقص غرامة.
2. بعد إصلاح الزمني العظام
- وضع العظام الزمنية إلى 2 مل أنابيب microcentrifuge تحتوي على 250-500 ميكرولتر بارافورمالدهيد 4٪ (PFA) المخفف في الفوسفات 10 ملي المالحة (PBS) ودرجة الحموضة 7.4 وincubيأكلون في RT ل2-20 ساعة.
ملاحظة: لا حاجة لفتح الغطاء القمي أو حقن PFA الى الدور أو النافذة البيضوية. نوصي باستخدام الميثانول الحرة، فائقة نقية، المجهر الإلكتروني (EM) الصف PFA التي يمكن شراؤها عند تركيز 16٪ في قوارير زجاجية. بمجرد فتح القارورة والمخفف 1: 4 في برنامج تلفزيوني، مما يجعل حل 4٪، ويمكن استخدامها لمدة تصل إلى 2 أسابيع عند تخزينها في 4 درجة مئوية (بعض الأجسام المضادة تتطلب تثبيت القصير وغيرها يمكن أن يتسامح مع O / N (O / N) التثبيت).
3. يزيل الكلس الزمني العظام
- بعد التثبيت، وإزالة PFA باستخدام ماصة واستبدالها مع 120 ملم ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الخل (EDTA)، ما يزيد قليلا عن 2 مل. تأكد من ملء كامل 2 مل أنبوب microcentrifuge لمنع فقاعات الهواء عند إغلاق الأنبوب.
- إن لم يكن مزيل للكلس على الفور، استبدال PFA مع 10 ملي PBS الرقم الهيدروجيني 7.4 وتخزين العينات عند 4 درجة مئوية.
ملاحظة: بعد التثبيت، والعظام الزمنية يمكن تخزينها لvariabلو يرقى وقت قبل زوال الكلس اعتمادا على مولدات المضادات يجري بحثها.
- إن لم يكن مزيل للكلس على الفور، استبدال PFA مع 10 ملي PBS الرقم الهيدروجيني 7.4 وتخزين العينات عند 4 درجة مئوية.
- مكان الأنابيب في نهاية الإفراط في نهاية المدورة وتناوب على 4 دورة في الدقيقة في RT. تغيير الحل EDTA يوميا باستخدام ماصة. طول زوال الكلس يعتمد على عمر العينة وتفضيل للعالم القيام تشريح.
- احتضان العظام الزمنية في EDTA باستخدام المبادئ التوجيهية التالية لمرات الحضانة:
للحصول على عينات يوم بعد الولادة (P) 8 إلى P15: 2-4 ساعة. للحصول على عينات P15 P21 إلى: O / N؛ للحصول على عينات P21 P30 ل: 2 O / N؛ للحصول على عينات قديمة من P30: 3 أو أكثر O / N.
ملاحظة: مرات زوال الكلس تخضع لتفضيل المستخدمين ويمكن تمديدها حسب الحاجة. الوقت زوال الكلس يمكن الحد من تغيير الحل EDTA مرتين في اليوم، حوالي 8 ساعة على حدة. بعض المعامل إضافة 1٪ PFA إلى حل EDTA عندما مزيل للكلس لمدة أطول من 3 أيام لمنع التلوث.
- احتضان العظام الزمنية في EDTA باستخدام المبادئ التوجيهية التالية لمرات الحضانة:
- لتحديد ما إذا كان decalcified العينة بشكل كاف، ضع العظام الزمنية سالمغلفة المطاط الصناعي غ السيليكون طبق تشريح واضغط بلطف ملقط على القوقعة على شكل الحلزون. إذا كانت الأنسجة spongey، ثم زوال الكلس كاملة.
- مرة واحدة زوال الكلس اكتمال إزالة EDTA باستخدام ماصة وإضافة 500 -1000 ميكرولتر من 10 ملي PBS الرقم الهيدروجيني 7.4. مخزن العينات في 4 درجة مئوية حتى جاهزة للتشريح.
4. إنشاء سيليكون المرنة المغلفة طبق تشريح
- الجمع بين القاعدة وعلاج وكيل لencapsulant عدة سيليكون المطاط الصناعي وفقا لتعليمات الشركة الصانعة وتخلط جيدا.
- إضافة حوالي 2-3 ملاعق من مسحوق الفحم حتى حل والأسود وتخلط جيدا.
ملاحظة: الحبر السائل أو الفحم السائل لا يختلط مع الحل والتي لا يمكن استخدامها. سيليكون المطاط الصناعي مجموعات encapsulant يمكن شراؤها في الأسود، مما يسمح خطوة 4.2 إلى أن يتم حذف. - صب الحل في 60 ملم الزجاج أو البلاستيك أطباق بتري، وملء ما يكفي لمعطف أسفل. إذا بوbbles موجودة، نفخة مع الهواء على السطح. اسمحوا الوقوف لا يقل عن 24 ساعة على RT لتعيين.
ملاحظة: أطباق المغلفة المطاط الصناعي سيليكون يمكن استخدامها مرارا وتكرارا لسنوات. ولكن لا تستخدم الإيثانول لتنظيف، وهذا سوف يسبب الاستومر سيليكون للقضاء.
5. الجامع جبل تشريح القوقعة (لP7 وعينات أقدم)
- فصل بدوره القاعدية من المنعطفات المتوسطة / قمي
- مكان واحد العظم الصدغي decalcified في طبق تشريح المغلفة المطاط الصناعي سيليكون شغل ثلثي كامل مع 10 ملم PBS الرقم الهيدروجيني 7.4 واستخدام المجهر تشريح ستيريو للخطوات التالية.
- عقد العظم الصدغي في المنطقة الدهليزي مع # 4 أو 5 # ملقط صائغ التوالي وباستخدام 5 ملم مقص الربيع Vannas-توبنجن، وقطع بعيدا الزائدة الأنسجة كبسولة أذني على طول الجانبين وفوق قمة.
- باستخدام 2.5 ملم مقص الربيع Vannas، إدراج شفرة واحدة في إطار بيضاوي وجعل العديد من الجروح الصغيرة على طول دوامة الرباط / جانبيجدار بدوره القاعدية.
- استخدام 5 مم Vannas-توبنجن مقص الربيع، إدراج شفرة واحدة في المنطقة مجرد قطع ووضع شفرة أخرى على خارج العظم الصدغي، وسطي إلى إطار بيضاوي. هذا الخفض يفصل بدوره القاعدية من المنعطفات المتوسطة وقمي.
- تشريح كامل للبدوره القاعدية.
- باستخدام 2.5 ملم مقص الربيع Vannas، وقطع الألياف العصبية دوامة العقدة التي تتصل عماد القوقعة للافراج عن التوتر في المقابل القاعدية وقطع تحت بدوره القاعدية لفصل من أجهزة الدهليزي.
- باستخدام 2.5 ملم مقص الربيع Vannas، وجعل سلسلة من الجروح الصغيرة لإزالة دوامة الرباط / الجدار الجانبي من كل من فوق وتحت جهاز كورتي. استخدام رقم 4 أو 5 # ملقط صائغ التوالي لتوجيه الأنسجة. دبوس الألياف العصبية دوامة العقدة للسيليكون المغلفة المطاط الصناعي طبق تشريح، ولكن لا نحتفظ في هذه المنطقة مثل الأنسجة والمسيل للدموع.
- خلال الخطوات السابقة، بعض MEMBRAN رايسنروغالبا ما يتم إزالتها ه. إن وجدت لا يزال، فهم غشاء رايسنر مع ملقط # 4 أو 5 # الجواهري على التوالي، وسحب بعيدا عن جهاز كورتي.
ملاحظة: الغشاء السقفي نادرا ما المرئي ويطفو عادة بعيدا دون الحاجة إلى خطوة محددة لإزالة. - وأخيرا إجراء عدة تخفيضات للحد من سمك المحاور دوامة العقدة، لجعل بدوره شقة قدر الإمكان واستخدام رقم 4 أو # 5 ملقط صائغ التوالي لنقل بدوره القاعدية تشريح، من خلال استيعاب المحاور المتبقية من العقدة الحلزونية، ل لوحة 48-جيدا (أو غرفة الشرائح) التي تحتوي على ~ 500 ميكرولتر من 10 ملي PBS الرقم الهيدروجيني 7.4.
- وسط منفصل والمنعطفات قمي
- وضع ما تبقى من ثلثي القوقعة، الجانب قمي أسفل.
- باستخدام 2.5 ملم مقص الربيع Vannas، إدراج شفرة واحدة في وسائل الإعلام سكالا حيث منعطف الأوسط تستخدم ليكون متصلا بدوره القاعدية، وجعل العديد من الجروح الصغيرة على طول دوامة الرباط / الجدار الجانبي من الالبريد بدوره الأوسط.
- استخدام 5 مم Vannas-توبنجن مقص الربيع، إدراج شفرة واحدة في المنطقة مجرد قطع مع مطلع المتوسطة وضعت على رأس النصل، ووضع شفرة أخرى في الخارج المتاهة عظمي، في 90 س زاوية من طرف القمي. هذا يفصل بدوره المتوسطة من مطلع القمي.
- تشريح كامل للبدوره المتوسطة بطريقة مشابهة للبدوره القاعدية (انظر الخطوات 5.2.2 إلى 5.2.4).
- تشريح كامل للبدوره القمي.
- باستخدام 2.5 ملم مقص الربيع Vannas، فتح الغطاء الذي يغطي بدوره القمي. تشريح كامل بطريقة مشابهة للبدوره القاعدية (انظر الخطوات 5.2.2 إلى 5.2.4).
ويمكن تخزين تشريح يتحول القوقعة في 10 ملي PBS الرقم الهيدروجيني 7.4 في لوحة 48-جيدا (أو غرفة الشرائح) في 4 درجة مئوية لعدة أسابيع قبل المناعية: ملاحظة. ومع ذلك PBS سوف تتبخر ويحتاج إلى تجديد دوري وتخزين أطول من 2-3 أسابيع يمكن أن يؤدي إلى نمو البكتيريا أو الفطريات علىالأنسجة التي يمكن أن تقلل من جودة الصورة. نوصي التخزين على المدى الطويل من العينات وundissected العظام الزمنية.
- باستخدام 2.5 ملم مقص الربيع Vannas، فتح الغطاء الذي يغطي بدوره القمي. تشريح كامل بطريقة مشابهة للبدوره القاعدية (انظر الخطوات 5.2.2 إلى 5.2.4).
6. المناعية مع الموسومة fluorescently الأجسام المضادة
- بعد التشريح، وتخزين كل بدوره القوقعة في بئر مستقل في لوحة 48-جيدا (أو غرفة الشريحة)، غارقة في ~ 500 ميكرولتر من 10 ملي PBS الرقم الهيدروجيني 7.4. لكل من الخطوات التالية يجب أن يغطس في المقابل القوقعة في السائل، لا تطفو على أعلى أو تمسك إلى جانب البئر.
ملاحظة: عند إزالة السائل من كل جانب، فمن السهل أن تفقد يتحول قوقعة أو تمتص منه في الطرف ماصة. سوف تغير حلول مع ماصة 200 ميكرولتر باستخدام نطاق تشريح تساعد على منع ذلك. - باستخدام ماصة، وإزالة PBS من كل بئر واستبدالها مع ~ 200-300 ميكرولتر لكل بئر من عرقلة / حل permeabilization (1٪ تريتون X-100، 1٪ ألبومين المصل البقري (BSA)، و 10٪ مصل الماعز العادي (خ ع) مخففة في 10 ملي PBS صH 7.4). احتضان 1 ساعة عند RT على محور دوار 3D.
ملاحظة: إذا تم إجراء أي الأجسام المضادة الأولية المستخدمة في مجموعة الماعز، وبعد ذلك سوف تكون هناك حاجة إلى الأجسام المضادة لمكافحة الماعز الثانوي وNGS يجب أن لا تستخدم لأي من الخطوات. طبيعي مصل الحصان يمكن استخدامها كبديل للNGS. - إزالة حجب / حل permeabilization باستخدام ماصة واستبدالها مع ~ 100 ميكرولتر لكل بئر من حل الأجسام المضادة الأولية (0.1٪ تريتون X-100، 1٪ BSA، و 5٪ NGS مخففة في 10 ملي PBS درجة الحموضة 7.4). عامل تخفيف لكل الأجسام المضادة الأولية يختلف. احتضان O / N (الحد الأدنى 14 ساعة) عند 4 درجة مئوية على محور دوار 3D.
ملاحظة: إذا تم استخدام الأجسام المضادة الأولية أكثر من واحد، كل يمكن دمجها في نفس الحل للحضانة، فقط للتأكد من أن كل الأجسام المضادة الأولية لديها مجموعة مختلفة. - إزالة حل الأجسام المضادة الأولية باستخدام ماصة وتنفيذ 3 يغسل من 10 ملي PBS الرقم الهيدروجيني 7.4 في ~ 500 ميكرولتر لكل بئر. كل غسل الحضن لا تقل عن 5 دقائق على RT على محور دوار 3D.
- إزالة P مشاركةBS غسل باستخدام ماصة واستبدالها مع ~ 100 ميكرولتر لكل بئر من حل الضد الثانوية (0.1٪ تريتون X-100، 1٪ BSA، و 5٪ NGS مخففة في 10 ملي PBS درجة الحموضة 7.4). عامل تخفيف لكل الموسومة fluorescently الضد الثانوية عادة 1: 500 أو 1: 1000. وضع لوحة 48-جيدا في مربع أسود لحماية الموسومة fluorescently الأجسام المضادة الثانوية من الضوء. احتضان 2-3 ساعة على RT على محور دوار 3D.
ملاحظة: إذا كانت هناك حاجة الأجسام المضادة الثانوية أكثر من واحد، فإنها يمكن أن تكون مجتمعة في نفس الحل للحضانة. تأكد من عدم وجود إمكانية عبر وضع العلامات (على سبيل المثال، وذلك باستخدام الماعز المضادة للأرنب والدجاج مكافحة الماعز الأجسام المضادة الثانوية) - إزالة حل الأجسام المضادة الثانوية باستخدام ماصة وتنفيذ 3 يغسل من 10 ملي PBS الرقم الهيدروجيني 7.4 في ~ 500 ميكرولتر لكل بئر. احتضان كل غسل مدة لا تقل عن 5 دقائق على RT على محور دوار 3D. إبقاء لوحة 48-جيدا في الصندوق الأسود للحماية من الضوء.
- إزالة الماضي غسل PBS باستخدام ماصة واستبدالها مع ~ 100 ميكرولتر لكل بئر من HoecHST 33342 (المخفف 1: 2000 في 10 ملي PBS درجة الحموضة 7.4) لتسمية النوى. احتضان 15-20 دقيقة في RT على محور دوار 3D. إبقاء لوحة 48-جيدا في الصندوق الأسود للحماية من الضوء. لا NOT احتضان أطول من 20 دقيقة.
- إزالة حل هويشت باستخدام ماصة وتنفيذ 3 يغسل من 10 ملي PBS الرقم الهيدروجيني 7.4 في ~ 500 ميكرولتر لكل بئر. احتضان كل غسل مدة لا تقل عن 5 دقائق على RT على محور دوار 3D. إبقاء لوحة 48-جيدا في الصندوق الأسود للحماية من الضوء.
- جميع الخطوات التي يمكن مدها إلا هويشت الحضانة، لعدة ساعات إذا لزم الأمر. لإيقاف التفاعل في أي مرحلة، فقط غمر العينات في ~ 500 من المجاهدين 10MM PBS pH7.4 وتخزين لوحة 48 -well (أو الشرائح غرفة) في 4 درجة مئوية لتصبح جاهزة لاستئناف ساعات بروتوكول أو 1-2 أيام في وقت لاحق .
7. جبل القوقعة يضيء الشرائح
- التسمية الشرائح مع المعلومات ذات الصلة حول العينة والأجسام المضادة المستخدمة.
- ماصة ~ 50 ميكرولتر من وسائل الاعلام المتزايدة على كل شريحة وتوخي الحذرلمنع الفقاعات. أجهزة الطرد المركزي الأنبوب الذي يحتوي على وسائل الاعلام متزايدة لإزالة أي فقاعات.
- باستخدام # 4 أو ملقط # 5 الجواهري على التوالي، وفهم محاور من العقدة الحلزونية لنقل بلطف بدوره قوقعة واحدة من لوحة 48-جيدا إلى الشريحة ومكان في وسائل الإعلام في تصاعد مستمر. جبل احد بدوره قوقعة لكل شريحة لمنع التعرض للضوء وphotobleaching من خلال عملية التصوير.
- استخدام مجهر تشريح ستيريو لضمان بدوره قوقعة لا مطوية، الملتوية، أو بالقرب من فقاعة الهواء. إذا كان أي من هذه الشروط تحدث، ملقط استخدام رقم 4 أو 5 # صائغ الثابت لإعادة وضع بدوره القوقعة.
- وضع واحدة من نهاية ساترة على الشريحة وإطلاق سراح بلطف لتسقطوا ساترة.
- استخدام مجهر تشريح ستيريو لضمان بدوره قوقعة لا مطوية، الملتوية، أو بالقرب من فقاعة الهواء. إذا كان أي من هذه الشروط تحدث، تحرك بلطف ساترة ذهابا وإيابا لإعادة بدوره القوقعة.
- مكان الشرائحفي مجلد الشريحة بحيث وضع مسطح. السماح تصاعد علاج وسائل الإعلام O / N في RT (نضع في الظلام)
- ختم coverslips مع طلاء الأظافر واضح وتخزينها في RT أو -20 س C حتى تصوير. ويمكن تخزين الشرائح في مجلد الشريحة أو الشرائح مربع.
ملاحظة: يمكن تخزين الشرائح على المدى الطويل عند -20 درجة مئوية أو -80 س C ومضان أن يستمر لعدة أشهر. - شرائح الصور باستخدام المجهر متحد البؤر مع الطول الموجي المناسب استنادا إلى الأجسام المضادة الثانوية استخدامها أثناء إجراء المناعية. لا يمكن أن يؤديها السطوع والتباين التعديلات باستخدام برامج التصوير التي تقدمها بائع متحد البؤر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
نقدم طريقة لعزل جهاز كورتي كما ثلاث لفات سليمة قوقعة (قمة، والمتوسطة، وقاعدة) من الأنسجة القوقعة التي هي متكلسة، مع خطوات تشريح الرئيسية الواردة في الشكل 1. وخلال أول أسبوع بعد الولادة للتنمية، تكلس الماوس القوقعة غير مكتملة وطريقة تشريح أكثر بساطة يمكن استخدام 13. باستخدام جبل بأكمله طريقة تشريح حديثي الولادة مع القوقعة من P7 والنتائج الفئران الأكبر سنا في البكاء والتمزيق من جهاز كورتي. والآن يعلق دوامة الرباط / الجدار الجانبي أكثر رسوخا ولا يمكن مقشر بعيدا عن الظهارة الحسية دون التسبب في اضرار. وبالتالي هناك حاجة إلى "الكبار" جبل بأكمله طريقة تشريح للنماذج القديمة من P6. نقدم مثالا للبدوره المتوسطة من القوقعة الماوس P15 التي تم تشريح وimmunostained مع خلية الشعر ودعم علامات الخلية (الشكل 2). عبر المقاطع البصرية ج وأيضا يمكن الحصول عليها مع تقنية جبل بأكمله (الشكل 3).
يمكن أن تحدث عدة مشاكل أثناء جبل تشريح كامل أو عند تركيب قوقعة يتحول على الشرائح. أثناء إزالة دوامة الرباط / الجدار الجانبي، وهناك نافذة ضيقة بين قطع أكثر من اللازم أو لا يكفي. التخفيضات التي تحدث بجانب الصف الأخير من خلايا الشعر الخارجي قد يسبب خلايا الشعر في هذا الصف الأخير إلى جبل في زوايا مختلفة (الشكل 4A). يمكن أن التخفيضات التي تكون كبيرة جدا إزالة أجزاء من جهاز كورتي (الشكل 4B). التعامل مع العينة مع ملقط يأخذ عناية كبيرة، وغالبا ما توجد ثقوب في جهاز كورتي حيث تم في غير محله ملقط (الشكل 4C). وأخيرا عندما تصاعد يتحول القوقعة، جهاز كورتي يمكن طيها الذي يحجب الصورة (الشكل 4D).
-together.within صفحة = "1">
الشكل 1. خطوات هامة في صحيح الجامع جبل تشريح "الكبار" ماوس القوقعة. (A) بعد بروتوكول خطوة 5.1.4، يتم فصل بدوره القاعدية من القوقعة من المنعطفات المتوسطة / قمي، ومع ذلك لا تزال تعلق على المنطقة الدهليزي. (B) بعد بروتوكول خطوة 5.3.3، يتم فصل بدوره المتوسطة من مطلع القمي. (C) مثال لتشريح الانتهاء من منعطفا المتوسطة حيث يتم إزالة دوامة الرباط / الجدار الجانبي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. متحد البؤر شريحة صورة الشرقتحويل معزولة من P15 ماوس. ومضافين أربعة 20x والصور لإعادة بناء بدوره الأوسط كله. وصفت خلايا الشعر مع أرنب المضادة للميوسين السابع-الأجسام المضادة الأولية (1: 200 تمييع) جنبا إلى جنب مع حمار المضادة للأرنب اليكسا الضد 488 مترافق الثانوية (1: 1000 تمييع) (قرمزي). وصفت الخلايا المساندة مع الماعز الأجسام المضادة الأولية لمكافحة Sox2 (1: 500 تمييع) جنبا إلى جنب مع حمار المضادة للماعز اليكسا الضد 568 مترافق الثانوية (1: 1000 تمييع) (الخضراء). هويشت (الأزرق) تصف كل نواة. واتخذت صورة باستخدام مجهر متحد البؤر زايس LSM 700 مع 405، 488، و 555 الأطوال الموجية. على نطاق وبار = 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. البصرية مقطع عرضي من الشرق بدوره معزولة من ماوس قديم 6 أسابيع. (A) صورة شريحة متحد البؤر من إعداد كامل جبل (القاع) والبصري المقطع العرضي في الطائرة XZ (أعلى). (ب) زيادة التكبير من أعلى لوحة في (A)، مع مرمى إزالتها. وصفت خلايا الشعر مع أرنب المضادة للميوسين السابع-الأجسام المضادة الأولية (1: 200 تمييع) جنبا إلى جنب مع حمار المضادة للأرنب اليكسا الضد 647 مترافق الثانوية (1: 1000 تمييع) (قرمزي). وصفت الخلايا المساندة مع الماعز الأجسام المضادة الأولية لمكافحة Sox2 (1: 500 تمييع) جنبا إلى جنب مع حمار المضادة للماعز اليكسا الضد 568 مترافق الثانوية (1: 1000 تمييع) (الخضراء). واتخذت صورة باستخدام مجهر متحد البؤر زايس LSM 700 مع 405، 555، 647 وموجات. الحانات النطاق = 20 ميكرومتر الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
/files/ftp_upload/53561/53561fig4.jpg "/>
الشكل 4. أمثلة من المشاكل التي يمكن أن تحدث أثناء الجامع جبل تشريح أو عند تركيب القوقعة يضيء الشرائح. (A) على الجانب الأيسر من الصورة، وقطع النسيج قوقعة بجانب الصف الأخير من خلايا الشعر الخارجي مما تسبب في العديد من هذه الخلايا لتركيبها في زوايا متنوعة. (B) تم قطع قسم من جهاز كورتي على الجانب الأيسر من الصورة خارج. (C) هناك حفرة لكمات في المنطقة خلية الشعر الخارجي في منتصف صورة (D)، ومطوية جهاز كورتي في عدة أماكن. وقد أخذت صور 4-8 الأسبوع القوقعة الماوس القديمة. وصفت خلايا الشعر مع أرنب المضادة للميوسين السابع-الأجسام المضادة الأولية (1: 200 تمييع) جنبا إلى جنب مع الماعز المضادة للأرنب اليكسا 488 مترافق الضد الثانوية (1: 1000 تمييع) أو حمار المضادة للأرنب اليكسا 488 مترافق الضد الثانوية (1: 1000 تمييع) (قرمزي). في C سل الشعر الخارجيوصفت ليرة سورية مع الماعز الأجسام المضادة الأولية لمكافحة prestin (1: 200 تمييع) جنبا إلى جنب مع حمار المضادة للأرنب اليكسا الضد 568 مترافق الثانوية (1: 1000 تمييع) (الخضراء). واتخذت صورة باستخدام ايكا SP5 المجهر مبائر مع 405، 488، و 555 موجات نانومتر. أشرطة النطاق: في AB = 20 ميكرون. في CD = 40 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هناك العديد من الخطوات الهامة لنجاح كامل تشريح جبل والمناعية. ولكن قبل أن يتم إجراء أي من هذه الطرق، هناك حاجة إلى تثبيت السليم للأنسجة القوقعة. نوصي باستخدام الميثانول الحرة، نقي للغاية، EM الصف PFA. PFA مصنوعة من مسحوق يمكن أن يكون لها آثار الميثانول ودرجة الحموضة غير مستقرة مما يقلل من جودة المناعي. وقد أظهرت المجموعات الأخرى أيضا أن تشريح مماثلة ممكنة باستخدام المثبتات التي لا تحتوي على الفورمالديهايد 14-16. طول التثبيت هو أيضا مهم وغير محددة الأجسام المضادة. يمكن لبعض الأجسام المضادة يتسامح مع أي O / N التثبيت، والبعض الآخر لا تعمل بشكل جيد مع ساعة فقط 1 في PFA (ولكن هذا أمر نادر الحدوث). وكيل ثابتة الأنسجة يمكن أن يكون مشكلة للأسلوب تشريح كما تقع الأنسجة عن بعضها البعض. في تجربتنا 3 - يوفر ساعة التثبيت 4 التثبيت الكافي ولا تتداخل مع غالبية الأجسام المضادة الأولية التي يشيع استخدامها في مجال السمع.
jove_content "> ومن الممكن أيضا أن EDTA يمكن أن تتداخل مع الأجسام المضادة الأولية؛ وبالتالي بعض الأجسام المضادة سوف تعمل بشكل جيد في أنسجة الأطفال حديثي الولادة، ولكن ليس في P7 أو الأنسجة القديمة التي تم decalcified بعد التثبيت، والعظام الزمنية يمكن تخزينها لكميات متفاوتة من الزمن قبل زوال الكلس اعتمادا على المستضدات قيد النظر، وتتطلب بعض المستضدات زوال الكلس وتشريح خلال أيام إلى أسابيع بعد التثبيت، بينما قد تكون مخزنة الآخرين لسنوات (إما قبل أو بعد زوال الكلس)، دون التقليل من جودة المناعية. ونحن نوصي عينات تخزين كما العظام الزمنية نظرا لخطر تبخر وسائط التخزين (PBS) من لوحة 48-جيدا وتلوث محتمل مع الفطريات أو البكتيريا. ونحن أداء عادة جبل تشريح كامل أقل من أسبوع واحد مقدما لالمناعية.مرة واحدة ثابتة وdecalcified، يتم تنفيذ جبل تشريح كامل مع العظم الصدغي المغمورة في السائل. إزالة العظم الزائد وناعمةوالأنسجة المحيطة بها المتاهة في وقت مبكر من تشريح تساعد في إزالة دوامة الرباط / الجدار الجانبي في مراحل لاحقة من خلال تسهيل التلاعب في الأنسجة وتقديم وجهة نظر أقل حجب هياكل الحرجة. عند تنفيذ الخطوات القليلة الأولى، ملقط يمكن استخدامها لعقد النسيج في المنطقة الدهليزي. ولكن مرة واحدة يتم عزل المنعطفات، فمن المهم تجنب وضع ملقط على جهاز كورتي أو الرباط اللولبي / الجدار الجانبي. بدلا من ذلك، تبقي مغلقة ملقط ويعلقون الألياف العصبية دوامة العقدة إلى الطبق تشريح المغلفة المطاط الصناعي من السيليكون. لا تمسك بهذه المنطقة مثل الأنسجة والمسيل للدموع. بشكل عام، مرة واحدة وقد تم تقسيم الأنسجة في المنعطفات الثلاثة، واستيعاب، ويمكن أن المناورات سحب تسبب نتائج غير متوقعة، والتي غالبا ما تضر جهاز كورتي ويجب تجنبها. من أنسجة الحيوانات الأصغر سنا (P7-P21) تميل إلى أن تكون أكثر تسامحا من الأنسجة من الحيوانات القديمة من P21. وبالإضافة إلى ذلك، وعينات من قوقعة مع خلية الشعر دamage هي أكثر صعوبة لتشريح. لو حصل الماوس التعرض للضوضاء الأنسجة هشة للغاية. بغض النظر عن حالة الأنسجة، وتشريح نقدم يتطلب تقنية عالية ويتطلب الكثير من المحاولات الممارسة لإتقان.
خلال المناعية، فمن المهم أن كل بدوره القوقعة والمغمورة في السائل، لا تطفو على أعلى أو تمسك إلى جانب البئر. وهذا يسمح اختراق أكثر اكتمالا من تريتون والأجسام المضادة في الأنسجة. عند إزالة السائل من كل جانب، فمن السهل أن تفقد بدوره القوقعة أو استدراجه حتى في تلميح ماصة. سوف تغير حلول مع ماصة 200 ميكرولتر باستخدام نطاق تشريح تساعد على منع ذلك. استخراج ببطء السائل ونقل معلومات سرية ماصة إذا كان بدوره القوقعة يحصل قريبة جدا. يمكن pipetteting أيضا حل النفايات في أنبوب نظيفة تكون الإستراتيجية الجيدة لأن هذا الأنبوب النفايات يمكن البحث في حالة تعادل بدوره يصل بطريق الخطأ في ماصة. إذا عالق بدوره في ماصة، رانه تلميح يمكن قطع مفتوحة مع شفرة حلاقة، ولكن في كثير من الأحيان جهاز كورتي سوف تتضرر إذا حدث هذا.
عندما، يمكن إضافة خطوات إضافية مثل استرجاع مستضد أو تعزيز إشارة الأجسام المضادة للالمناعية التصوير المتاعب. هناك انخفاض الرقم الهيدروجيني ودرجة الحموضة العالية مستضد الكواشف فضح التي يمكن شراؤها. إذا لم يعمل الجسم المضاد مع الطريقة الموصوفة هنا، فإن التغيير البروتوكول الأول في محاولة واحدة من هذه الطرق استرجاع مستضد. بدلا من ذلك، استخدام اشارة المحسن. هناك الحلول المتاحة تجاريا لاستخدام مجموعات التضخيم قبل المناعية، أو tyramide التي يمكن استخدامها لتضخيم إشارة من الأجسام المضادة الثانوية.
أهمية تقنية نقدم هي القدرة على الحفاظ على هيكل ثلاثي الأبعاد للجهاز كورتي وتصور كل الخلايا داخل الجهاز. ويفصل على طول القوقعة في المنعطفات ثلاثة فقط، بينما تقنيات أخرى مماثلة، وهي عشرالبريد Bohne وليبرمان الطرق، تتطلب التقسيم إلى 5-10 قطعة 6-8، وزيادة عدد العينات للمناورة في العمليات المناعية والتصوير. في قوقعة الجانبي تشريح الجدار الذي تم تطويره من قبل كوسجروف وجراتون يتطلب مستوى مماثل من المهارة وممكن في غير المثبتة أنسجة طرية، وكذلك في الأنسجة decalcified، ولكن يتم تجريد جهاز كورتي بعيدا ودمرت في عملية عزل الجدار الجانبي 17. تم تنفيذ مجموعة أخرى مماثلة في تشريح غير المثبتة، والنسيج قوقعة جديدة من ثلاثة أسابيع الفئران القديمة حيث يتم اغتنامها دوامة الرباط / الجدار الجانبي وجردهم من جهاز كورتي، وترك الجهاز سليمة. ولكن هذا لم يتحقق إلا في مطلع القمي 5. طريقة تقشير دوامة الرباط / الجدار الجانبي بعيدا عن جهاز كورتي هو روتيني لتشريح الأنسجة ثابتة في الماوس الشباب (<P7) (13). ومع ذلك، في تجربتنا مع الفئران الأكبر سنا من P6، بعد تثبيت لد زوال الكلس، هذه المناورة في كثير من الأحيان الدموع جهاز كورتي بطريقة غير موثوق بها. وبالإضافة إلى ذلك الإجراء الموضح هنا يسمح عزل المتوسطة والقاعدية تتحول كذلك.
كما تستخدم Cryosections والأقسام التي تم الحصول عليها بعد تضمين البارافين عادة في مجال السمعي. هذه الأساليب تسمح التصور الهياكل الأخرى مثل عائي السطر، غشاء رايسنر، والغشاء السقفي، بعد كل مقطع يسمح فقط التصور من منطقة صغيرة من جهاز كورتي في كل منعطف القوقعة. وبالتالي لتحقيق الأحداث التي تحدث في نمط الفسيفساء، مثل فقدان الخلية أو انقسام الخلايا، مع أسلوب باجتزاء، تحتاج 50 أو أكثر الشرائح لتكون ملطخة وتصوير لالتقاط طول القوقعة. في المقابل، وكلها بروتوكول تشريح جبل لديه ميزة إعداد الجهاز بأكمله كورتي في ثلاث قطع فقط. بالإضافة إلى الاستفادة من الحفاظ على العمارة بالطول من جهاز كورتي، وهذا تكhnique يسمح لجمع بيانات مبسطة والتخزين. القيد واحد من جبل تشريح كله هو أنه يدمر الهياكل المحيطة مثل الرباط دوامة، السطر الوعائي، غشاء رايسنر، والغشاء السقفي. الحد الآخر هو صعوبة التقنية وطول الفترة الزمنية لتشريح واحد. هذا يرجع في معظمه إلى الطبيعة الهشة للجهاز كورتي وهامش صغير للخطأ عند إزالة دوامة الرباط / الجدار الجانبي. مرة واحدة يتقن، وتشريح جبل كامل من القوقعة واحد لا يمكن أن يؤديها في حوالي 20-30 دقيقة.
بينما يصف البروتوكول المذكور على جبل بأكمله طريقة تشريح للماوس الكبار، ونأمل أن تطبيق هذه التقنية لنموذج الكائنات الأخرى المستخدمة في مجال السمعي. لدينا مختبر يتم تعديل حاليا هذه التقنية لتشريح القوقعة الفئران. هو المغطى القوقعة أكبر من الفئران في كبسولة أذني سمكا ومتكلسة أكثر كثافة من الماوس. وبالتالي يجب أن ê في العظم الصدغيxcised مع مقص كبير. قبل التثبيت وزوال الكلس مع EDTA، يجب فتح الكبسولة أذني مع مقص لتأمين وصول أفضل إلى الأنسجة القوقعة. أيضا عملية إزالة الكلس أطول، ويمكن أن يستغرق 3 أسابيع اعتمادا على عمر من العينة. للجبل تشريح كامل، وحجم المتاهة العظمية يؤثر على التقنية. زيادة حجم القوقعة الفئران يوفر مسافة أكبر قليلا بين دوامة الرباط / الجدار الجانبي وجهاز كورتي، وتوفير هامش أكبر من الخطأ لخفض الفردية. ومع ذلك، في حين أن الأنسجة أكبر قد توفر المزيد من المواد إلى فهم للتلاعب من العينة، كما أنه يتطلب عددا أكبر من التخفيضات لإزالة طول دوامة الرباط / الجدار الجانبي. ونحن نعتقد أن تعديلات مماثلة يمكن أن تكون لتشريح القوقعة من شينشيلا، يربوع، وخنزير غينيا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | can be purchased from other vendors |
| 10.5 cm fine scissors | Fine Science Tools | 14060-11 | can be purchased from other vendors |
| 2 ml microcentrifuge tubes | MidSci | AVSS2000 | can be purchased from other vendors |
| 16% formaldehyde, methanol free, ultra pure, EM grade | Polysciences | 18814 | TOXIC --wear gloves and cannot be disposed of in the sink. Can be purchased from other vendors. |
| PBS pH 7.4 | Sigma | P3813-10PAK | can be purchased from other vendors |
| EDTA | Fisher | BP118-500 | can be purchased from other vendors |
| end-over-end tube rotator | Fisher | 05-450-127 | can be purchased from other vendors |
| 60 mm petri dish | Fisher | 50-202-037 | can be purchased from other vendors |
| Dow Corning Sylgard 184 silicone encapsulant kit | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| activated charcoal | Fisher | AC134372500 | can be purchased from other vendors |
| stereo dissection microscope | Zeiss | Stemi 2000 | can be purchased from other vendors |
| Dumont #4 jeweler's forceps | Fine Science Tools | 11241-30 | |
| Dumont #5 jeweler's forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| 2.5 mm Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15001-08 | curved |
| 5 mm Vannas-Tubingen spring scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | straight |
| 48-well plates | Fisher | 08-772-52 | can be purchased from other vendors |
| 8-well chamber slides | Fisher | 1256518 | can be purchased from other vendors |
| Triton X-100 | Sigma | X100-500 | can be purchased from other vendors |
| BSA, fraction V | Fisher | BP1605 | can be purchased from other vendors |
| NGS | Vector labs | S-1000 | can be purchased from other vendors |
| NHS | Vector labs | S-2000 | can be purchased from other vendors |
| 3D rotator | Midsci | R3D-710 | can be purchased from other vendors |
| Western blot incubation box XL | Licor | 929-97401 | |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | can be purchased from other vendors |
| Prolong gold antifade mounting media | Life Technologies | P36930 | can be purchased from other vendors,but mounting medias vary in their ability to protect against photobleaching |
| Superfrost Plus Slides | Fisher | 12-550-15 | can be purchased from other vendors |
| coverslips 22 x 22 x 1 | Fisher | 12-548-B | can be purchased from other vendors |
| clear nail polish | Local drug store | can be purchased from other vendors | |
| cardboard slide folder | Fisher | 12-587-10 | can be purchased from other vendors |
| plastic slide box | Fisher | 03-448-10 | can be purchased from other vendors |
References
- Robles, L., Ruggero, M. A.
- Ehret, G., Frankenreiter, M. Quantitattive analysis of cochlear structures in the house mouse in relation to mechanisms of acoustical information processing. J Comp Physiol. 122, 65-85 (1977).
- Ou, H. C., Bohne, B. A., Harding, G. W. Noise damage in the C57BL/CBA mouse cochlea. Hear Res. 145 (1-2), 111-122 (2000).
- Engstrom, H., Ades, H. W., Andersson, A. Structural pattern of the organ of Corti. A systematic mapping of sensory cells and neural elements. , Almqvist and Wiksell. (1966).
- Grant, L., Yi, E., Goutman, J. D., Glowatzki, E. Postsynaptic Recordings at Afferent Dendrites Contacting Cochlear Inner Hair Cells: Monitoring Multivesicular Release at a Ribbon Synapse. J Vis Exp. (48), e2442 (2011).
- Bohne, B. A., Harding, G. W. Processing and analyzing the mouse temporal bone to identify gross, cellular and subcellular pathology. Hear Res. 109 (1-2), 34-45 (1997).
- Bohne, B. A., Harding, G. W., Ou, H. C. Handbook of Mouse Auditory Research. Willott, J. , CRC Press. 171-187 (2001).
- Eaton-Peabody Laboratories. Video Tutorial for Cochlear Dissection. , Massachusetts Eye and Ear. Available from: http://www.masseyeandear.org/research/otolaryngology/investigators/laboratories/eaton-peabody-laboratories/epl-histology-resources/video-tutorial-for-cochlear-dissection/ (2015).
- Weber, T., et al. Rapid cell-cycle reentry and cell death after acute inactivation of the retinoblastoma gene product in postnatal cochlear hair cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (2), 781-785 (2008).
- Yu, Y., et al. In vivo proliferation of postmitotic cochlear supporting cells by acute ablation of the retinoblastoma protein in neonatal mice. J Neurosci. 30 (17), 5927-5936 (2010).
- Steigelman, K. A., et al. Polycystin-1 Is Required for Stereocilia Structure But Not for Mechanotransduction in Inner Ear Hair Cells. J Neurosci. 31 (34), 12241-12250 (2011).
- Liu, Z., et al. Age-dependent in vivo conversion of mouse cochlear pillar and Deiters' cells to immature hair cells by Atoh1 ectopic expression. J Neurosci. 32 (19), 6600-6610 (2012).
- Parker, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. Primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of Corti. J Vis Exp. (36), e1685 (2010).
- Burns, J. C., On, D., Baker, W., Collado, M. S., Corwin, J. T. Over half the hair cells in the mouse utricle first appear after birth, with significant numbers originating from early postnatal mitotic production in peripheral and striolar growth zones. J Assoc Res Otolaryngol. 13 (5), 609-627 (2012).
- Collado, M. S., et al. The postnatal accumulation of junctional E-cadherin is inversely correlated with the capacity for supporting cells to convert directly into sensory hair cells in mammalian balance organs. J Neurosci. 31 (33), 11855-11866 (2011).
- Meyers, J. R., Corwin, J. T. Shape change controls supporting cell proliferation in lesioned mammalian balance epithelium. J Neurosci. 27 (16), 4313-4325 (2007).
- Gratton, M. A., Rao, V. H., Meehan, D. T., Askew, C., Cosgrove, D. Matrix metalloproteinase dysregulation in the stria vascularis of mice with Alport syndrome: implications for capillary basement membrane pathology. Am J Pathol. 166 (5), 1465-1474 (2005).
