نقدم طريقة لعزل الجهاز الكبار كورتي كما ثلاث لفات سليمة قوقعة (قمة، والمتوسطة، وقاعدة). علينا أيضا أن يبرهن على وجود إجراءات المناعية مع الأجسام المضادة الموسومة fluorescently. معا هذه التقنيات تتيح دراسة خلايا الشعر والخلايا الداعمة، وأنواع الخلايا الأخرى الموجودة في القوقعة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
جبل كله تشريح والمناعي من الكبار ماوس القوقعة
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يحتوي عضو كورتي ، الموجود في قوقعة الأذن الداخلية ، على خلايا شعر حسية ميكانيكية وخلايا داعمة محيطة منظمة في شكل حلزوني ولها تدرج توتوني للكشف عن الصوت. يبلغ طول قوقعة الفأر حوالي 6 مم وغالبا ما تنقسم إلى ثلاث لفات (قمة ووسط وقاعدة) للتحليل. للتحقيق في فقدان الخلايا أو انقسام الخلايا أو التعبير الجيني الفسيفسائي ، يكون التركيب الكامل للقوقعة أو التحضير السطحي مفيدا. تسمح طريقة التشريح هذه بتصور جميع الخلايا داخل عضو كورتي عند دمجها مع التلوين المناعي والفحص المجهري متحد البؤر لتصوير الخلايا على مستويات مختلفة في المحور z. يمكن أيضا الحصول على مقاطع عرضية بصرية متعددة من صور z-stack هذه. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام طريقة تشريح التثبيت بالكامل لمسح المجهر الإلكتروني ، على الرغم من الحاجة إلى طريقة تثبيت مختلفة. هنا ، نقدم طريقة لعزل عضو كورتي كثلاث منعطفات قوقعة صناعية سليمة (القمة والوسط والقاعدة). يمكن استخدام هذه الطريقة للفئران التي تتراوح من أسبوع واحد من العمر حتى مرحلة البلوغ وتختلف عن التقنية المستخدمة في عينات حديثي الولادة حيث يكون تكلس القوقعة غير مكتمل. يمكن استخدام نسخة معدلة قليلا لتشريح قوقعة الفئران. نعرض أيضا إجراء للتلوين المناعي بالأجسام المضادة الموسومة بالفلورسنت.
المقدمة
القوقعة على شكل حلزوني في الأذن الداخلية، الواردة في العظم الصدغي، ويوجد في جهاز كورتي، والسمعي الجهاز نهاية الحسي في الثدييات. ويتم تنظيم القوقعة tonotopically وتنقسم عادة إلى قمية، والمتوسطة، والقاعدية يتحول الموافق المناطق ترددية مختلفة مع الكشف عن الصوت عالية التردد في قاعدة وانخفاض الكشف عن التردد في قمة 1. خلايا الشعر، خلايا ميكانيكية حسية من جهاز كورتي، تشغيل طول القوقعة، وهو ما يقرب من 6 مم طويل في الفئران 2،3. هذه الخلايا بتحويل الطاقة الميكانيكية من الموجات الصوتية التي تنتقل عن طريق التيه الغشائي مملوءة بسائل، إلى إشارات العصبية التي تتم معالجتها من قبل هياكل السمعية المركزية. تقنية الموضحة هنا ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
بيان الأخلاق: إجراءات التي تجرى على الحيوانات قد وافقت عليها رعاية الحيوان واللجنة المؤسسية استخدم في جامعة جنوب إلينوي الطب.
1. استخراج الزمني العظام
- تحديد عظام الزمنية في قاعدة الجمجمة الماوس 13 وكشط بعيدا الأعصاب القحفية باستخدام ملقط نمط القياسية.
- وضع ملقط نمط القياسية في غيض من الكبسولة أذني ومع الإبهام من المعاكس جهة ضغط لأسفل على الخلفية القناة الهلالية لإزاحة القوقعة مغلفة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
نقدم طريقة لعزل جهاز كورتي كما ثلاث لفات سليمة قوقعة (قمة، والمتوسطة، وقاعدة) من الأنسجة القوقعة التي هي متكلسة، مع خطوات تشريح الرئيسية الواردة في الشكل 1. وخلال أول أسبوع بعد الولادة للتنمية، تكلس الماوس القوقعة غير مكتملة وطريقة تشريح أكثر بساطة يمكن استخدام 13. باستخدام جبل بأكمله طريقة تشريح حديثي الولادة مع القوقعة من P7 والنتائج الفئران الأكبر سنا في البكاء والتمزيق من جهاز كورتي. والآن يعلق دوامة.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
هناك العديد من الخطوات الهامة لنجاح كامل تشريح جبل والمناعية. ولكن قبل أن يتم إجراء أي من هذه الطرق، هناك حاجة إلى تثبيت السليم للأنسجة القوقعة. نوصي باستخدام الميثانول الحرة، نقي للغاية، EM الصف PFA. PFA مصنوعة من مسحوق يمكن أن يكون لها آثار الميثانول ودرجة الحموضة غير مستقرة مما يقلل من جودة المناعي. وقد أظهرت المجموعات الأخرى أيضا أن تشريح مماثلة ممكنة باستخدام المثبتات التي لا تحتوي على الفورمالديهايد 14-16. طول التثبيت هو أيضا مهم وغير محددة الأجسام المضادة. .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
تم دعم هذا العمل جزئيا بمنحة من مكتب البحوث البحرية (N000141310569). تم دعم معدات مرفق التصوير البحثي بكلية الطب بجامعة جنوب إلينوي من قبل المركز الوطني لموارد البحوث والصحة (S10RR027716).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| يمكن شراء ملقط نمط | أدوات العلوم | الدقيقة 11000-12 | من بائعين آخرين |
| مقص ناعم 10.5 سم | يمكن شراء أدوات العلوم | الدقيقة 14060-11 | من بائعين آخرين يمكن |
| أنابيب الطرد المركزي الدقيقة 2 مل | MidSci | AVSS2000 | من بائعين آخرين |
| 16٪ فورمالديهايد ، خالي من الميثانول ، نقي للغاية ، من الدرجة | الأولى Polysciences | 18814 | سام - ارتد قفازات ولا يمكن التخلص منها في الحوض. يمكن شراؤها من بائعين آخرين. |
| PBS الرقم الهيدروجيني 7.4 | شراء Sigma | P3813-10PAK | من بائعين آخرين يمكن |
| شراء EDTA | Fisher | BP118-500 | من بائعين آخرين يمكن |
| دوار الأنبوب النهائي | فيشر | 05-450-127 | من بائعين آخرين يمكن |
| طبق بتري 60 مم | يمكن شراء طبق بتري فيشر | 50-202-037 | من بائعين آخرين |
| مجموعة مغلفات سيليكون Dow Corning Sylgard 184 | Ellsworth المواد اللاصقة | 184 SIL ELAST KIT 0.5 كجم | |
| الفحم المنشط | شراء AC134372500 | فيشر | من بائعين آخرين يمكن |
| مجهر تشريح ستيريو | Zeiss | Stemi 2000 | من بائعين آخرين |
| Dumont # 4 ملقط المجوهرات | أدوات العلوم الدقيقة | 11241-30 | |
| Dumont # 5 ملقط صائغ | أدوات العلوم الدقيقة | 11251-20 | |
| 2.5 مم مقص زنبركي Vannas | أدوات العلوم الدقيقة | 15001-08 | منحني & nbsp ؛ |
| مقص زنبركي 5 مم Vannas-Tubingen | أدوات العلوم الدقيقة | 15003-08 | ألواح |
| مستقيمة 48 بئرا | يمكن شراء Fisher | 08-772-52 | من بائعين آخرين شرائح |
| غرفة 8 آبار | يمكن شراء 1256518 فيشر | من بائعين آخرين يمكن | |
| شراء Triton X-100 | Sigma | X100-500 | من بائعين آخرين |
| BSA ، الكسر الخامس | BP1605 | من بائعين آخرين يمكن | |
| مختبرات NGS | Vector | S-1000 | من بائعين آخرين يمكن |
| مختبرات | NHS | S-2000 | من بائعين آخرين يمكن |
| 3D Rotator | Midsci | R3D-710 | من بائعين آخرين صندوق |
| حضانة اللطخة الغربية XL | Licor | 929-97401 | |
| يمكن شراء Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | من بائعين آخرين |
| إطالة وسائل الإعلام المضادة للبهتان الذهبية | يمكن شراء Life Technologies | P36930 | من بائعين آخرين ، لكن وسائط التركيب تختلف في قدرتها على الحماية من التبييض الضوئي |
| يمكن شراء Superfrost Plus | Slides Fisher | 12-550-15 | البائعين الآخرين |
| 22 × 22 × 1 | فيشر | 12-548-B | يمكن شراؤها من بائعين آخرين طلاء |
| أظافر شفاف | الأدوية المحلي | من بائعين آخرين مجلد | |
| شرائح من الورق المقوى | يمكن شراء | فيشر 12-587-10 | من بائعين آخرين |
| صندوق شرائح بلاستيكي | يمكن شراء فيشر | 03-448-10 | من بائعين آخرين |
المراجع
- Robles, L., Ruggero, M. A. Mechanics of the mammalian cochlea. Physiol Rev. 81 (3), 1305-1352 (2001).
- Ehret, G., Frankenreiter, M. Quantitattive analysis of cochlear structures in the house mouse in relation to mechanisms of acoustical information process....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
