Summary
We presenteren een methode om de volwassen orgaan van Corti isoleren drie intacte cochleaire windingen (apex, midden en base). We tonen ook een procedure voor immunokleuring met fluorescent gelabelde antilichamen. Samen technieken maken het bestuderen van haarcellen, steuncellen en andere celtypen in de cochlea.
Introduction
De spiraalvormige slakkenhuis van het binnenoor, vervat in de temporale, herbergt het orgaan van Corti, het auditieve sensorische eindorgaan bij zoogdieren. De cochlea is tonotopically georganiseerd en gewoonlijk verdeeld in apicale, midden en basale bochten overeenkomen met verschillende frequentiegebieden met hoogfrequent geluid detectie in de basis en laagfrequente detectie in de apex 1. Haarcellen, de mechanosensorische cellen van het orgaan van Corti, lopen de lengte van het slakkenhuis, dat is ongeveer 6 mm lang in muizen 2,3. Deze cellen zet de mechanische energie van geluidsgolven, die worden uitgezonden via de met vloeistof gevulde membraneuze labyrint, in neurale signalen die worden verwerkt door de centrale auditieve structuren. De hier beschreven techniek verschaft een werkwijze voor het bereiden whole mounts van het orgaan van Corti na verkalking van het slakkenhuis is voltooid (voor monsters die variëren van één week tot volwassenheid). Wij stellen ook een werkwijze voor het immunostaining de hele gemonteerd cochleaire weefsel. Cochleaire whole mounts zijn cruciaal voor visualisatie van haarcellen en omliggende steuncellen in hun natuurlijke ruimtelijke indelingen en maken voor analyse in drie dimensies door het gebruik van confocale microscopie.
Drs. Hans Engstrom en Harlow Ades oorspronkelijk beschreven geheel mount cochleair versnijdingsmethode in 1966. Zij gedetailleerd techniek snel oplossen en ontleden verkalkte cochleae ondergedompeld in vloeistof uit verschillende zoogdieren, behoud korte intacte segmenten van het orgaan van Corti voor microscopische analyse 4. De ontleding van een losgemaakte, verkalkte rat cochlea is ook geïllustreerd in een instructievideo 5. Drs. Barbara Bohne en Gary Harding aan de Washington University maakte een aantal belangrijke wijzigingen in deze methode. In hun versie van het cochleair hele berg methode, de temporale bot is ontkalkt, ingebed in kunststof, en vijf halve bochten of tien kwart-bochten waren dissected 6,7. Dr. Charles Liberman en collega's bij Eaton Peabody Laboratories, Massachusetts Eye en Ear Infirmary, bewerkt deze techniek, zodat plastic inbedding niet verplicht was 8. Verdere modificatie van de techniek zich heeft voorgedaan in het lab Dr Jian Zuo's in het St. Jude Children's Research Hospital 9-12 waarin de dissectie methode hier gepresenteerde geïnformeerd. We gebruiken een andere strategie om de toegang tot het orgaan van Corti dan Bohne en Liberman, die isolatie van volledige apicale, midden en basale bochten maakt krijgen. Zo is de ontleed weefsel is groter en minder waarschijnlijk worden verloren of beschadigd tijdens de dissectie of immunokleuring processen. Bovendien vergemakkelijkt de huidige methode van het meten van het apicale of basale uiteinde haak om een frequentiegebied te identificeren.
Hoewel veel labs voeren immunokleuring van cochleaire weefsel, het is onduidelijk waar deze methode is ontstaan. Dientengevolge zijn er diverse recepten voor het blokkeren buffers en antilichaam incubatie buffers die de prestaties van individuele primaire antilichamen kunnen beïnvloeden. Hier presenteren we een methode voor immunokleuring met fluorescent gelabelde antilichamen die toepassing meest gebruikte antilichamen in het auditieve veld.
De complexe vorm van de cochlea, delicate structuur van het orgaan van Corti, en benige omhulsel vormen een uitdaging voor histologische en biochemische analyse. Verschillende technieken worden momenteel in het gebied gehoor deze moeilijke functies overwinnen en visualiseren van de cellen in het orgaan van Corti, elke techniek met zijn eigen voor- en nadelen. De hier gepresenteerde protocol maakt ganse berg dissectie van de volwassen muis cochlea en met kleine wijziging, potentieel kan worden gebruikt om de kritische structuren binnen het cochleae onderzoeken vanuit verschillende andere modelorganismen gebruikt in het veld.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ethiek Verklaring: Procedure waarbij proefdieren zijn door de Institutional Animal Care en gebruik Comite aan de Southern Illinois University School of Medicine.
1. Winning van Temporal Bones
- Identificeren temporale botten in de onderkant van de muis schedel 13 en schraap de hersenzenuwen met behulp van standaard patroon tang.
- Plaats standaard patroon tang op het puntje van de otic capsule en met de duim van de andere hand drukt op de achterste halfronde kanaal naar de ingekapselde slakkenhuis verjagen.
- Bevrijd de onderste helft van de temporale bot van de schedel van de hand met de duim en wijsvinger of met behulp van 10,5 cm fijne schaar.
2. Post-fix Temporal Bones
- Plaats rotsbeenderen in 2 ml microcentrifuge buisjes die 250 - 500 pi 4% paraformaldehyde (PFA) verdund in 10 mM fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) pH 7,4 en incubaten bij kamertemperatuur gedurende 2 - 20 uur.
OPMERKING: nr opening van de apicale dop of injectie van PFA in de ronde of ovale venster nodig. Raden het gebruik van methanol vrij, ultra-zuivere, elektronenmicroscopie (EM) rang PFA die kunnen worden gekocht bij een concentratie van 16% in glazen flesjes. Zodra een injectieflacon geopend en verdund 1: 4 in PBS, waardoor een 4% oplossing, kan het worden gebruikt voor maximaal 2 weken indien bewaard bij 4 ° C (sommige antilichamen vereisen korte fixatie en anderen kunnen verdragen O / N (O / N) fixatie).
3. ontkalken Temporal Bones
- Na fixatie verwijdert PFA met een pipet en vervangen door 120 mM ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA), iets meer dan 2 ml. Zorg ervoor dat u de volledige 2 ml microcentrifugebuis om te voorkomen dat luchtbellen wanneer de buis wordt gesloten te vullen.
- Als het niet onmiddellijk ontkalken, vervang PFA met 10 mM PBS pH 7,4 en bewaar monsters bij 4 ° C.
NB: Na fixatie, kan temporale botten worden opgeslagen voor variable bedragen van tijd voordat ontkalking afhankelijk van de antigenen wordt onderzocht.
- Als het niet onmiddellijk ontkalken, vervang PFA met 10 mM PBS pH 7,4 en bewaar monsters bij 4 ° C.
- Plaats de buisjes op end-over-end rotator en draaien met 4 rpm bij kamertemperatuur. Verander EDTA-oplossing dagelijkse pipetteren. Lengte van de ontkalking is afhankelijk van de leeftijd van het monster en de voorkeur van de wetenschapper het doen van de dissectie.
- Incubate temporale botten in EDTA met de volgende richtlijnen voor de incubatietijd:
Voor monsters postnatale dag (P) 8 tot P15: 2-4 uur; Voor monsters P15 naar P21: O / N; Voor monsters P21 naar P30: 2 O / N; Voor monsters boven de P30: 3 of meer O / N.
OPMERKING: Ontkalken tijden zijn afhankelijk van de voorkeur van de gebruikers en kan zo nodig worden verlengd. Ontkalkingstijdstip kan worden verminderd door de EDTA-oplossing tweemaal per dag, ongeveer 8 uur apart. Sommige laboratoria voeg 1% PFA aan de EDTA-oplossing bij het ontkalken langer dan 3 dagen om besmetting te voorkomen.
- Incubate temporale botten in EDTA met de volgende richtlijnen voor de incubatietijd:
- Om te bepalen of het monster afdoende is ontkalkt, plaatst temporale botten ona silicium elastomeer-gecoate dissectie gerecht en druk voorzichtig op een tang op de slak-vormige slakkenhuis. Wanneer het weefsel spongey, dan ontkalking voltooid.
- Zodra ontkalking is voltooid, verwijdert EDTA met een pipet en voeg 500 -1000 pl 10 mM PBS pH 7,4. Store monsters bij 4 ° C tot klaar te ontleden.
4. Maak Silicone elastomeer gecoate Dissection Dish
- Combineer de basis en verharder van een siliconenelastomeer inkapselingsmiddel kit volgens de instructies van de fabrikant en meng.
- Voeg ongeveer 2 - 3 eetlepels poederkool tot de oplossing zwart en meng.
OPMERKING: Vloeibare inkt of houtskool niet mengen met de oplossing en kan niet worden gebruikt. Siliconenelastomeer inkapselingsmiddel kits kunnen worden gekocht in het zwart, waardoor stap 4.2 worden weggelaten. - Giet de oplossing in 60 mm glazen of plastic Petrischalen, vullen genoeg het bekleden van de bodem. Als bubbles aanwezig, bladerdeeg met lucht op het oppervlak. Laat staan ten minste 24 uur bij kamertemperatuur in te stellen.
OPMERKING: Silicone-elastomeer gecoate gerechten kunnen herhaaldelijk worden gebruikt voor jaren. Echter niet gebruiken ethanol reinigen, aangezien hierdoor het siliconenelastomeer te kraken.
5. Hele Mount Dissectie van het slakkenhuis (voor P7 en Oudere Samples)
- Scheid de basale beurt vanaf midden / apicale beurt
- Plaats een ontkalkt temporale bot in een siliconenelastomeer-gecoate dissectie schotel gevuld tweederde vol met 10 mM PBS pH 7,4 en het gebruik van een stereo-dissectie microscoop voor de volgende stappen.
- Houd de temporale bot in het evenwichtsorgaan regio met # 4 of # 5 tang recht juwelier en het gebruik van 5 mm Vannas-Tübingen lente schaar, weggesneden overtollige otic capsule weefsel langs de zijkanten en boven de apex.
- Met 2,5 mm Vannas lente schaar, steek een mes in het ovale venster en maak een aantal kleine sneetjes langs de spiraal ligament / lateralewand van de basale turn.
- Met behulp van 5 mm Vannas-Tübingen lente schaar, steek een mes in de regio gewoon knippen en plaats de overige mes op de buitenkant van de temporale bot, mediaal van het ovale venster. Dit gesneden scheidt de basale beurt uit midden en apicale bochten.
- Volledige dissectie van de basale beurt.
- Gebruik 2,5 mm Vannas spring schaar, knip de ganglion spirale zenuwvezels die aansluiten op de modiolus om de spanning in de basale beurt loslaten en onder de basale beurt gesneden scheiden van vestibulaire organen.
- Gebruik 2,5 mm Vannas spring schaar, maak een reeks kleine bezuinigingen op de spiraalvormige ligament / zijwand van zowel boven als onder het orgaan van Corti verwijderen. Gebruik # 4 of # 5 tang rechtstreeks juwelier om het weefsel te leiden. Speld de spiraal ganglion zenuwvezels naar de siliconen-elastomeer gecoate dissectie gerecht, maar niet in het bezit op dit gebied als het weefsel scheurt.
- Tijdens de vorige stappen, een aantal van Reissner's membrane zal vaak worden verwijderd. Als een nog steeds, het grijpen van de Reissner membraan met een pincet # 4 of # 5 recht juwelier en weg te trekken van het orgaan van Corti.
LET OP: De tectorial membraan is zelden zichtbaar en typisch zweeft weg zonder dat er een specifieke stap voor verwijdering. - Eindelijk meerdere sneden om de dikte van de ganglion spirale axonen te verminderen, uit het begin zo vlak mogelijk te maken en te gebruiken # 4 en # 5 tang rechte juwelier de ontleed basale turn overbrengen door grijpen de resterende axonen van de ganglion spirale aan een 48-well plaat (of kamer slide) met -500 pl 10 mM PBS pH 7,4.
- Aparte middelste en apicale bochten
- Leg de resterende tweederde van de cochlea, apicale naar beneden.
- Gebruik 2,5 mm Vannas spring schaar, steek een mes in de scala media waarin de middelste draai vroeger verbonden met de basale beurt en maak een aantal kleine sneden langs de spiraalvormige ligament / zijwand van the midden beurt.
- Met behulp van 5 mm Vannas-Tübingen spring schaar, steek een mes in het gebied knip de middelste draai bovenop het blad, en plaats het andere mes op de buiten de benige labyrint, een 90 o hoek vanaf het apicale uiteinde. Dit scheidt het midden beurt van de apicale beurt.
- Volledige ontleding van de middelste draai op dezelfde wijze als de basale bocht (zie stap 5.2.2 tot 5.2.4).
- Volledige dissectie van de apicale beurt.
- Met 2,5 mm Vannas lente schaar, open de kap die de apicale beurt bedekt. Compleet dissectie op soortgelijke wijze als de basale bocht (zie stap 5.2.2 tot 5.2.4).
OPMERKING: De ontlede cochleaire windingen kunnen worden opgeslagen in 10 mM PBS pH 7,4 in een 48-well plaat (of kamer slide) bij 4 ° C gedurende enkele weken voor immunokleuring. Echter PBS langer dan 2 verdampen en moet periodiek worden bijgevuld en opslag - 3 weken kan leiden tot bacteriële of schimmelgroei opweefsel dat de kwaliteit van het beeld kan verminderen. Wij adviseren langdurige opslag van de monsters als undissected temporale botten.
- Met 2,5 mm Vannas lente schaar, open de kap die de apicale beurt bedekt. Compleet dissectie op soortgelijke wijze als de basale bocht (zie stap 5.2.2 tot 5.2.4).
6. Immunokleuring met fluorescent Tagged Antilichamen
- Na dissectie, leg elk cochleaire beurt in een afzonderlijk putje in een 48-well plaat (of kamer slide), ondergedompeld in ~ 500 pi 10 mM PBS pH 7,4. Voor elk van de volgende stappen het cochleair weer moet worden ondergedompeld in vloeibare, niet zwevend boven of vast aan de zijkant van de put.
OPMERKING: Bij het verwijderen van vloeistof uit elk putje, is het gemakkelijk om het cochleair beurt te verliezen of suck it up in de pipetpunt. Veranderen van oplossingen met een 200 ul pipet met behulp van een dissectie scope zal helpen dit te voorkomen. - Pipetteer verwijdert PBS uit elk putje en vervangen door ~ 200 - 300 pl per putje van blokkerende / permeabilisatie oplossing (1% Triton X-100, 1% runderserumalbumine (BSA) en 10% normaal geit serum (NGS) verdund in 10 mM PBS pH 7,4). Incubeer 1 uur bij kamertemperatuur op een 3D-rotator.
LET OP: Als een primair antilichaam gebruikt werd gemaakt in een geit gastheer, dan is een secundaire anti-geit antilichaam zal nodig zijn en NGS mag NIET worden gebruikt voor een van de stappen. Paardennormaalserum kan worden gebruikt als vervanging voor NGS. - Verwijder geblokkeerde / permeabilisatie oplossing met een pipet en vervangen ~ 100 ul per putje primair antilichaam-oplossing (0,1% Triton X-100, 1% BSA en 5% NGS verdund in 10 mM PBS pH 7,4). De verdunningsfactor voor elke primaire antilichaam varieert. Incubeer O / N (minimaal 14 uur) bij 4 ° C op een rotator 3D.
OPMERKING: Indien meer dan één primaire antilichaam wordt gebruikt, ook gecombineerd in dezelfde oplossing incubatie zorg ervoor dat elke primaire antilichaam een andere host. - Verwijder primair antilichaam oplossing met een pipet en voer 3 wasbeurten van 10 mM PBS pH 7,4 bij ~ 500 ul per putje. Elke wasbeurt broedt een minimum van 5 min bij RT op een 3D-rotator.
- Verwijder laatste PBS wassen met een pipet vervangen ~ 100 ul per putje van secundair antilichaam-oplossing (0,1% Triton X-100, 1% BSA en 5% NGS verdund in 10 mM PBS pH 7,4). De verdunningsfactor voor elk fluorescent gelabeld secundair antilichaam is gewoonlijk 1: 500 of 1: 1000. Plaats 48-well plaat in een zwarte doos te beschermen fluorescent gelabeld secundaire antilichamen tegen licht. Incubeer 2 - 3 uur bij kamertemperatuur op een rotator 3D.
OPMERKING: Indien meer dan één secundaire antilichaam nodig, kunnen zij worden gecombineerd in dezelfde oplossing voor incubatie. Zorg ervoor dat er geen mogelijkheid van cross-labeling (bijv., Met behulp van geit anti-konijn en kip anti-geit secundaire antilichamen) - Verwijder secundair antilichaam oplossing met een pipet en voer 3 wasbeurten van 10 mM PBS pH 7,4 bij ~ 500 ul per putje. Incubeer elke wasbeurt gedurende ten minste 5 minuten bij kamertemperatuur op een rotator 3D. Houd 48-well plaat in een zwarte doos te beschermen tegen licht.
- Verwijder laatste PBS wassen met een pipet en te vervangen door ~ 100 ul per putje van Hoechst 33.342 (verdund 1: 2000 in 10 mM PBS pH 7,4) om kernen te labelen. Incubeer 15 - 20 min bij kamertemperatuur op een rotator 3D. Houd 48-well plaat in een zwarte doos te beschermen tegen licht. NIET broeden langer dan 20 min.
- Verwijder Hoechst oplossing met een pipet en voer 3 wasbeurten van 10 mM PBS pH 7,4 bij ~ 500 ul per putje. Incubeer elke wasbeurt gedurende ten minste 5 minuten bij kamertemperatuur op een rotator 3D. Houd 48-well plaat in een zwarte doos te beschermen tegen licht.
- Alle stappen kunnen worden verlengd, behalve Hoechst incubatie verschillende uren indien nodig. Om de reactie te onderbreken in elk stadium, net onderdompelen monsters in ~ 500 ul van 10 mM PBS pH 7,4 en opslaan van de 48 -goed plaat (of kamer slide) bij 4 ° C tot klaar om het protocol uur of 1 hervatten - 2 dagen later .
7. Mount Cochlear Schakelt Slides
- Etiket schuift met relevante informatie over het monster en antilichamen gebruikt.
- Pipet ~ 50 ul van de montage media op elke dia en wees voorzichtigom luchtbellen te voorkomen. Centrifugeer de buis met de montage media om eventuele luchtbellen te verwijderen.
- Met behulp van # 4 of tang # 5 recht juwelier, pakt u de axonen van de spiraal ganglion om voorzichtig te dragen een cochleair beurt van de 48-wells plaat aan de dia en plaats in de montage media. Mount een cochleair beurt per dia om blootstelling aan licht en fotobleken tijdens de beeldvorming proces te voorkomen.
- Gebruik een stereo dissectie microscoop om ervoor te zorgen dat cochleair beurt niet is gevouwen, verdraaid, of in de buurt van een luchtbel. Als een van deze situaties zich voordoet, pincet gebruiken # 4 of # 5 straight juwelier aan het cochleair beurt verplaatsen.
- Plaats een uiteinde van een dekglaasje op het objectglaasje en laten ontsnappen aan het dekglaasje laten vallen.
- Gebruik een stereo dissectie microscoop opdat het cochleair beurt niet gevouwen, verdraaid, of nabij een luchtbel. Als een van deze situaties zich voordoet, beweeg het dekglaasje heen en weer om het cochleair beurt verplaatsen.
- Plaats de glaasjesin een map dia zodat ze plat. Laat de montage media cure O / N bij RT (houden in het donker)
- Afdichting coverslips met duidelijke nagellak en bewaar bij kamertemperatuur of -20 ° C tot afgebeeld. Slides kunnen worden opgeslagen in een map dia of doos.
OPMERKING: Dia's kunnen worden opgeslagen op lange termijn bij -20 ° C of -80 ° C en fluorescentie zal worden gehandhaafd voor enkele maanden. - Afbeelding dia's met behulp van een confocale microscoop met de geschikte golflengte op basis van de secundaire antilichamen tijdens de immunokleuring procedure. Helderheid en contrast aanpassingen kunnen worden uitgevoerd via de beeldvormende software van de confocale verkoper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
We stellen een werkwijze voor het orgaan van Corti isoleren drie intacte cochleaire windingen (apex, midden en base) vanaf cochleaire weefsel dat verkalkt, met belangrijke dissectie stappen weergegeven in figuur 1. In de eerste postnatale week van ontwikkeling, verkalking van de muis cochlea onvolledig en een eenvoudigere versnijdingsmethode kan worden gebruikt 13. Met behulp van de neonatale hele berg versnijdingsmethode met slakkenhuis van P7 en ouder muizen leidt tot scheuren en versnipperen van het orgaan van Corti. De spiraalvormige ligament / zijwand nu steviger vast en kan niet van het sensorische epitheel worden afgepeld zonder schade. Dus de "volwassen" hele berg dissectie methode is nodig voor monsters ouder dan P6. We geven een voorbeeld van de middelste draai van een P15 muis cochlea die is uitgesneden en immunologisch gekleurd met haarcellen en ondersteunende celmarkers (figuur 2). Optische doorsneden ceen eveneens verkrijgbaar geheel mount techniek (figuur 3).
Verschillende problemen kunnen optreden tijdens het gehele mount dissectie of bij de montage van cochleaire wordt op objectglaasjes. Tijdens het verwijderen van het spiraalvormige ligament / zijwand is er een smal venster tussen snijden te veel of te weinig. Cuts dat naast de laatste rij buitenste haarcellen voorkomen kan de haarcellen in deze laatste rij veroorzaken te monteren in verschillende hoeken (Figuur 4A). Bezuinigingen die te groot zijn, kunnen delen van het orgaan van Corti (Figuur 4B) te verwijderen. Omgaan met het monster met een tang neemt grote zorg en vaak zijn er gaten in het orgaan van Corti, waar tang werden misplaatst (Figuur 4C). Tenslotte bij het monteren van het cochleair bochten, het orgaan van Corti kan vouwen die het beeld (figuur 4D) verduistert.
Figuur 1. Belangrijke stappen in de hele berg Dissection van de "Adult" Muis Cochlea. (A) Na protocol stap 5.1.4, is de basale begin van het slakkenhuis gescheiden van midden / apicale wendingen, maar nog steeds verbonden aan het evenwichtsorgaan regio. (B) Na het protocol stap 5.3.3, wordt de middelste beurt gescheiden van de apicale beurt. (C) Voorbeeld van de voltooide dissectie van een midden bocht waar de spiraal ligament / laterale wand wordt verwijderd. Klik hier om een grotere versie te bekijken van dit cijfer.
Figuur 2. Confocale Slice Afbeelding van het Midden-Draai geïsoleerd uit een P15 Muis. Vier 20x beelden worden gelegd om het gehele middelste beurt reconstrueren. Haarcellen gelabeld met een konijn anti-myosine VIIa primaire antilichaam (1: 200 verdunning) in combinatie met een ezel anti-konijn Alexa 488-geconjugeerd secundair antilichaam (1: 1000 verdunning) (magenta). Ondersteunende cellen gelabeld met een geit anti-Sox2 primaire antilichaam (1: 500 verdunning) in combinatie met een ezel anti-geit Alexa-568 geconjugeerd secundair antilichaam (1: 1000 verdunning) (groen). Hoechst (blauw) labels alle kernen. Het beeld werd genomen met behulp van een Zeiss LSM 700 confocale microscoop met 405, 488 en 555 golflengten. Schaal bar = 100 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Optische Cross-sectie van het Midden-Turn Geïsoleerde een 6-weken oude muis. (A) confocale stukje beeld van de hele berg voorbereiding (onder) en optische doorsnede in het XZ-vlak (boven). (B) Toegenomen vergroting van het bovenste paneel (A), met het vizier verwijderd. Haarcellen gelabeld met een konijn anti-myosine VIIa primaire antilichaam (1: 200 verdunning) in combinatie met een ezel anti-konijn Alexa 647-geconjugeerd secundair antilichaam (1: 1000 verdunning) (magenta). Ondersteunende cellen gelabeld met een geit anti-Sox2 primaire antilichaam (1: 500 verdunning) in combinatie met een ezel anti-geit Alexa-568 geconjugeerd secundair antilichaam (1: 1000 verdunning) (groen). Het beeld werd genomen met behulp van een Zeiss LSM 700 confocale microscoop met 405, 555 en 647 golflengten. Schaal bars = 20 pm Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
/files/ftp_upload/53561/53561fig4.jpg "/>
Figuur 4. Voorbeelden van problemen die kunnen optreden tijdens de hele berg Dissection of bij de montage van Cochlear Schakelt Slides. (A) Aan de linkerkant van het beeld, is het cochleair weefsel gesneden naast de laatste rij van de buitenste haarcellen waardoor veel van deze cellen bij verschillende hoeken te monteren. (B) Een gedeelte van het orgaan van Corti aan de linkerzijde van de afbeelding is afgesneden. (C) Er is een gat geslagen in de buitenste haarcel gebied in het midden van de afbeelding. (D), is het orgaan van Corti gevouwen op verschillende plaatsen. Beelden werden genomen 4-8 weken oude muis cochleae. Haarcellen gelabeld met een konijn anti-myosine VIIa primaire antilichaam (1: 200 verdunning) in combinatie met een geit anti-konijn Alexa 488-geconjugeerd secundair antilichaam (1: 1000 verdunning) of een ezel anti-konijn Alexa 488-geconjugeerde secundaire antilichaam (1: 1000 verdunning) (magenta). In C buitenste haren cells gelabeld met een geit anti-prestin primaire antilichaam (1: 200 verdunning) in combinatie met een ezel anti-konijn Alexa 568-geconjugeerd secundair antilichaam (1: 1000 verdunning) (groen). Beelden werden genomen met een Leica SP5 confocale microscoop met 405, 488 en 555 nm golflengte. Schaal bars: in AB = 20 urn; CD = 40 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Er zijn een aantal cruciale stappen voor een succesvolle ganse berg dissectie en immunokleuring. Echter voordat een van deze werkwijzen worden uitgevoerd, wordt goede fixatie van de cochleaire weefsel nodig. We raden het gebruik van methanol vrij, ultra-zuivere, EM leerjaar PFA. PFA uit poeder kan sporen van methanol en een instabiele pH die de kwaliteit van immunofluorescentie afneemt hebben. Andere groepen hebben ook aangetoond dat soortgelijke dissecties mogelijk met fixatieven die geen formaldehyde 14-16 bevatten. De lengte van fixatie is ook belangrijk en is specifiek antilichaam. Sommige antilichamen kunnen een O / N fixatie tolereren, terwijl anderen niet goed met slechts 1 uur in PFA (dit is echter zeldzaam). Under-gefixeerd weefsel kan problematisch zijn voor de dissectie methode als het weefsel uiteenvalt. In onze ervaring een 3 - 4 uur fixatie geeft voldoende fixatie en niet interfereert met de meeste primaire antilichamen gewoonlijk in het gebied gehoor.
jove_content "> Het is ook mogelijk dat EDTA kunnen interfereren met primaire antilichamen. waardoor een deel antilichamen goed in neonatale weefsel, maar niet in P7 of ouder weefsel dat was ontkalkt Na fixatie kan rotsbeenderen worden bewaard variabele hoeveelheden tijd voordat ontkalking afhankelijk van de antigenen onderzocht. Sommige antigenen vereisen ontkalking en dissectie binnen enkele dagen tot weken na fixatie, terwijl anderen kunnen worden bewaard jaren (vóór of na het ontkalken) zonder vermindering van de kwaliteit van de immunokleuring. Wij bevelen opslaan monsters rotsbeenderen vanwege het risico van verdamping van het opslagmedium (PBS) van de 48-well plaat en mogelijke verontreiniging met schimmels of bacteriën. We voeren meestal de hele berg ontleding minder dan een week vooraf immunokleuring.Zodra vaste en ontkalkt, is de hele berg dissectie uitgevoerd met de temporale bot ondergedompeld in vloeistof. Overtollige bot en zachte verwijderenweefsel rondom het labyrint begin van de dissectie zal helpen bij het verwijderen van het spiraalvormige ligament / zijwand in latere stadia van de manipulatie van het weefsel te vergemakkelijken en verschaffen minder verduisterde weergave kritische structuren. Bij het uitvoeren van de eerste stappen kunnen tang worden gebruikt om het weefsel in de vestibulaire regio houden. Maar zodra de windingen zijn geïsoleerd, is het belangrijk te vermijden dat forceps aan het orgaan van Corti of spiraalvormige ligament / zijwand. In plaats daarvan houdt de tang gesloten en speld de spiraal ganglion zenuwvezels van het siliconenelastomeer-gecoate dissectie schotel. Niet vasthouden aan deze regio als het weefsel scheurt. In het algemeen, wanneer het weefsel is verdeeld in drie beurten grijpen en trekken manoeuvres onvoorspelbare resultaten, die dikwijls schadelijk zijn voor het orgaan van Corti en moeten vermeden worden. Weefsel van jonge dieren (P7-P21) heeft de neiging meer vergevingsgezind dan weefsel van dieren ouder dan P21 te zijn. Bovendien monsters met cochleaire haarcellen dAmage zijn moeilijker te ontleden. Als de muis ontvangen geluidsbelasting het weefsel is bijzonder kwetsbaar. Ongeacht de toestand van het weefsel, de dissectie we presenteren is technisch veeleisend en vereist veel praktijk pogingen voor taalvaardigheid.
Tijdens immunokleuring, is het belangrijk dat elke cochleair beurt ondergedompeld in vloeibare, niet zwevend boven of vast aan de zijkant van de put. Hierdoor kunnen meer volledig van triton en antilichamen in het weefsel. Bij het verwijderen van vloeistof uit elk putje, is het gemakkelijk om het cochleair beurt verliezen of te tekenen tot in de pipetpunt. Veranderen van oplossingen met een 200 ul pipet met behulp van een dissectie scope zal helpen dit te voorkomen. Langzaam halen de vloeistof en zet de pipet tip als het cochleair beurt te dichtbij komt. Ook pipetteting oplossing afval in een schone buis kan een goede strategie als dit afval buis kan worden doorzocht indien een bocht per ongeluk in de pipet wordt getrokken. Als de beurt vast in de pipetpunt, thij tip kan worden opengesneden met een scheermesje, maar vaak is het orgaan van Corti zal worden beschadigd als dit gebeurt.
Wanneer-trouble shooting antilichamen voor immunokleuring, aanvullende stappen zoals antigen herstel of verbetering van het signaal kan worden toegevoegd. Er zijn lage pH en hoge pH-antigeen ontmaskering reagentia die kunnen worden gekocht. Indien een antilichaam niet met de hier beschreven werkwijze, het eerste protocol wijziging proberen één van deze antigen retrieval methoden. U kunt ook gebruik maken van een signaal versterker. Er zijn commercieel beschikbare oplossingen voorafgaand aan immunokleuring of tyramide versterking kits die kunnen worden gebruikt om het signaal van het secundaire antilichaam amplificeren gebruiken.
De betekenis van de techniek die we voorstellen is het vermogen om de driedimensionale structuur van het orgaan van Corti houden en om alle cellen te visualiseren binnen het orgaan. De gehele lengte van het slakkenhuis is verdeeld in drie beurten terwijl andere vergelijkbare technieken, namelijk the Bohne en Liberman methoden vereisen verdeling in 5 - 10 stuks 6-8, waardoor het aantal monsters te manoeuvreren in de immunokleuring en beeldvormingsprocessen. De cochleaire zijwand dissectie die is ontwikkeld door Cosgrove en Gratton vereist een vergelijkbaar niveau van vaardigheid en is mogelijk niet vastgelegde, vers weefsel, evenals in ontkalkte weefsel, maar het orgaan van Corti wordt verwijderd gestript en vernietigd in het proces van isoleren van het dwarswand 17. Een andere groep vergelijkbare dissecties uitgevoerd losgemaakt, vers cochleaire weefsel van drie weken oude ratten waarbij de spiraalvormige ligament / zijwand wordt gegrepen en van het orgaan van Corti gestript, waardoor het orgaan intact. Maar dit werd pas bereikt in de apicale beurt 5. De werkwijze van afpellen van het spiraalvormige ligament / zijwand van het orgaan van Corti is routine voor dissectie van vast weefsel in jonge muizen (<P7) 13. Echter, in onze ervaring met muizen ouder dan P6, na een fixatied ontkalking, deze manoeuvre tranen vaak het orgaan van Corti in een onbetrouwbare manier. Naast de hier beschreven procedure kunnen isoleren midden basale verandert ook.
Cryosecties en secties verkregen na inbedden in paraffine worden gewoonlijk ook gebruikt in het auditieve veld. Deze werkwijzen maken visualisatie van andere structuren, zoals de stria vascularis, Reissner membraan en tectorial membraan, maar elke sectie maakt visualisatie van slechts een klein gebied van het orgaan van Corti per cochleaire beurt. Zo gebeurtenissen die plaatsvinden in een mozaïekpatroon, zoals celverlies of celdeling, het snijden methode onderzoeken moet 50 of meer dia te worden gemerkt en afgebeeld op de gehele lengte van de cochlea te vangen. In tegenstelling, de ganse berg dissectie protocol heeft het voordeel van het bereiden van het gehele orgaan van Corti in drie stukken. Naast het voordeel van het behoud van de lengte architectuur van het orgaan van Corti, dit technique zorgt voor vereenvoudigde verzamelen en opslaan van gegevens. Een beperking van de hele berg dissectie is dat het vernietigt de omliggende structuren zoals de spiraal ligament, stria vascularis, Reissner membraan en tectorial membraan. Een andere beperking is het technisch moeilijk en duur van een dissectie. Dit is vooral te wijten aan de kwetsbaarheid van het orgaan van Corti en kleine marge voor fouten bij het verwijderen van de spiraal ligament / zijwand. Eenmaal geleid, kan het gehele onderstel ontleding van een slakkenhuis worden uitgevoerd in ongeveer 20 - 30 min.
Terwijl de bovenstaande protocol beschrijft een hele berg dissectie methode voor de volwassen muis, hopen we deze techniek toe te passen op andere model organismen gebruikt in de auditieve veld. Ons lab is momenteel het wijzigen van deze techniek voor de dissectie van het slakkenhuis rat. Hoe groter slakkenhuis van de rat is ingekapseld in een dikkere otic capsule die dichter is verkalkt dan de muis. Dus de temporale bot moet worden excised met grote schaar. Vóór fixatie en ontkalking met EDTA, moet de otic capsule geopend worden met een schaar een betere toegang tot het cochleair weefsel mogelijk te maken. Ook de ontkalking proces langer kan duren en 3 weken, afhankelijk van de leeftijd van het monster. Voor het volledig mount dissectie, de grootte van het benige labyrint beïnvloedt de techniek. De toegenomen omvang van de cochlea rat heeft een iets grotere afstand tussen de spiraalvormige ligament / zijwand en orgaan van Corti, die een grotere foutmarge voor moten. Hoewel de grotere weefsel meer materiaal te bevatten voor het manipuleren van het monster kan worden bepaald, het vereist ook een groter aantal sneden om de gehele lengte van de spiraalvormige ligament / zijwand verwijderen. Wij zijn van mening dat analoge wijzigingen kunnen worden gemaakt voor dissectie van het slakkenhuis van chinchilla, woestijnrat, en cavia.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | can be purchased from other vendors |
| 10.5 cm fine scissors | Fine Science Tools | 14060-11 | can be purchased from other vendors |
| 2 ml microcentrifuge tubes | MidSci | AVSS2000 | can be purchased from other vendors |
| 16% formaldehyde, methanol free, ultra pure, EM grade | Polysciences | 18814 | TOXIC --wear gloves and cannot be disposed of in the sink. Can be purchased from other vendors. |
| PBS pH 7.4 | Sigma | P3813-10PAK | can be purchased from other vendors |
| EDTA | Fisher | BP118-500 | can be purchased from other vendors |
| end-over-end tube rotator | Fisher | 05-450-127 | can be purchased from other vendors |
| 60 mm petri dish | Fisher | 50-202-037 | can be purchased from other vendors |
| Dow Corning Sylgard 184 silicone encapsulant kit | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| activated charcoal | Fisher | AC134372500 | can be purchased from other vendors |
| stereo dissection microscope | Zeiss | Stemi 2000 | can be purchased from other vendors |
| Dumont #4 jeweler's forceps | Fine Science Tools | 11241-30 | |
| Dumont #5 jeweler's forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| 2.5 mm Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15001-08 | curved |
| 5 mm Vannas-Tubingen spring scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | straight |
| 48-well plates | Fisher | 08-772-52 | can be purchased from other vendors |
| 8-well chamber slides | Fisher | 1256518 | can be purchased from other vendors |
| Triton X-100 | Sigma | X100-500 | can be purchased from other vendors |
| BSA, fraction V | Fisher | BP1605 | can be purchased from other vendors |
| NGS | Vector labs | S-1000 | can be purchased from other vendors |
| NHS | Vector labs | S-2000 | can be purchased from other vendors |
| 3D rotator | Midsci | R3D-710 | can be purchased from other vendors |
| Western blot incubation box XL | Licor | 929-97401 | |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | can be purchased from other vendors |
| Prolong gold antifade mounting media | Life Technologies | P36930 | can be purchased from other vendors,but mounting medias vary in their ability to protect against photobleaching |
| Superfrost Plus Slides | Fisher | 12-550-15 | can be purchased from other vendors |
| coverslips 22 x 22 x 1 | Fisher | 12-548-B | can be purchased from other vendors |
| clear nail polish | Local drug store | can be purchased from other vendors | |
| cardboard slide folder | Fisher | 12-587-10 | can be purchased from other vendors |
| plastic slide box | Fisher | 03-448-10 | can be purchased from other vendors |
References
- Robles, L., Ruggero, M. A.
- Ehret, G., Frankenreiter, M. Quantitattive analysis of cochlear structures in the house mouse in relation to mechanisms of acoustical information processing. J Comp Physiol. 122, 65-85 (1977).
- Ou, H. C., Bohne, B. A., Harding, G. W. Noise damage in the C57BL/CBA mouse cochlea. Hear Res. 145 (1-2), 111-122 (2000).
- Engstrom, H., Ades, H. W., Andersson, A. Structural pattern of the organ of Corti. A systematic mapping of sensory cells and neural elements. , Almqvist and Wiksell. (1966).
- Grant, L., Yi, E., Goutman, J. D., Glowatzki, E. Postsynaptic Recordings at Afferent Dendrites Contacting Cochlear Inner Hair Cells: Monitoring Multivesicular Release at a Ribbon Synapse. J Vis Exp. (48), e2442 (2011).
- Bohne, B. A., Harding, G. W. Processing and analyzing the mouse temporal bone to identify gross, cellular and subcellular pathology. Hear Res. 109 (1-2), 34-45 (1997).
- Bohne, B. A., Harding, G. W., Ou, H. C. Handbook of Mouse Auditory Research. Willott, J. , CRC Press. 171-187 (2001).
- Eaton-Peabody Laboratories. Video Tutorial for Cochlear Dissection. , Massachusetts Eye and Ear. Available from: http://www.masseyeandear.org/research/otolaryngology/investigators/laboratories/eaton-peabody-laboratories/epl-histology-resources/video-tutorial-for-cochlear-dissection/ (2015).
- Weber, T., et al. Rapid cell-cycle reentry and cell death after acute inactivation of the retinoblastoma gene product in postnatal cochlear hair cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (2), 781-785 (2008).
- Yu, Y., et al. In vivo proliferation of postmitotic cochlear supporting cells by acute ablation of the retinoblastoma protein in neonatal mice. J Neurosci. 30 (17), 5927-5936 (2010).
- Steigelman, K. A., et al. Polycystin-1 Is Required for Stereocilia Structure But Not for Mechanotransduction in Inner Ear Hair Cells. J Neurosci. 31 (34), 12241-12250 (2011).
- Liu, Z., et al. Age-dependent in vivo conversion of mouse cochlear pillar and Deiters' cells to immature hair cells by Atoh1 ectopic expression. J Neurosci. 32 (19), 6600-6610 (2012).
- Parker, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. Primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of Corti. J Vis Exp. (36), e1685 (2010).
- Burns, J. C., On, D., Baker, W., Collado, M. S., Corwin, J. T. Over half the hair cells in the mouse utricle first appear after birth, with significant numbers originating from early postnatal mitotic production in peripheral and striolar growth zones. J Assoc Res Otolaryngol. 13 (5), 609-627 (2012).
- Collado, M. S., et al. The postnatal accumulation of junctional E-cadherin is inversely correlated with the capacity for supporting cells to convert directly into sensory hair cells in mammalian balance organs. J Neurosci. 31 (33), 11855-11866 (2011).
- Meyers, J. R., Corwin, J. T. Shape change controls supporting cell proliferation in lesioned mammalian balance epithelium. J Neurosci. 27 (16), 4313-4325 (2007).
- Gratton, M. A., Rao, V. H., Meehan, D. T., Askew, C., Cosgrove, D. Matrix metalloproteinase dysregulation in the stria vascularis of mice with Alport syndrome: implications for capillary basement membrane pathology. Am J Pathol. 166 (5), 1465-1474 (2005).
