Summary
Vi presentiamo un metodo per isolare l'organo del Corti adulta come tre turni intatte cocleari (apice, il medio e basso). Abbiamo anche dimostrare una procedura per immunocolorazione con anticorpi con tag fluorescenza. Insieme, queste tecniche consentono lo studio di cellule ciliate, cellule di supporto, e altri tipi di cellule trovato nella coclea.
Introduction
La coclea a forma di spirale dell'orecchio interno, contenuto all'interno l'osso temporale, ospita l'organo del Corti, l'organo sensoriale uditivo fine nei mammiferi. La coclea è tonotopically organizzato e comunemente suddivisa in apicale, centrale e basale giri corrispondente alle regioni di frequenze diverse con rilevamento del suono ad alta frequenza nella base e il rilevamento a bassa frequenza nel vertice 1. Le cellule cigliate, le cellule meccanosensoriali dell'organo di Corti, eseguire la lunghezza della coclea, della lunghezza di circa 6 mm in topi 2,3. Queste cellule convertono l'energia meccanica delle onde sonore, che sono trasmessi attraverso il labirinto membranoso pieno di liquido, in segnali neurali che vengono elaborati dalle strutture uditive centrali. La tecnica qui descritta fornisce un metodo per preparare supporti interi dell'organo di Corti dopo calcificazione della coclea è completa (per i campioni che vanno da una settimana di vita adulta). Vi presentiamo anche un metodo per immunostavorazio il tutto montato tessuti cocleare. Supporti interi cocleari sono cruciali per la visualizzazione di tutte le cellule dei capelli e circostante cellule di sostegno nei loro arrangiamenti spaziali naturali e consentire l'analisi in tre dimensioni con l'uso della microscopia confocale.
Drs. Hans Engstrom e Harlow Ades originariamente descritto un intero metodo di montaggio dissezione cocleare nel 1966. Hanno dettagliato una tecnica per fissare rapidamente e sezionare coclee calcificata immersi in un liquido da una varietà di mammiferi, preservando brevi segmenti intatti dell'organo del Corti per l'analisi microscopica 4. La dissezione di un unfixed, calcificata ratto coclea è stato illustrato in un video didattico 5. Drs. Barbara Bohne e Gary Harding alla Washington University fatto diverse modifiche importanti a questo metodo. Nella loro versione del metodo cocleare tutto il monte, l'osso temporale era decalcificata, incorporato nella plastica, e cinque semi-spire o dieci quarti di giri erano dissezioneted 6,7. Dr. Charles Liberman e colleghi Eaton Peabody Laboratories, Massachusetts Eye e Ear Infirmary, modificato questa tecnica in modo che embedding plastica non è stato richiesto 8. Ulteriore modifica della tecnica si è verificato nel laboratorio del Dr. Jian Zuo in Ospedale dei Bambini St. Jude 9-12, che ha informato il metodo di dissezione presentato qui. Usiamo una strategia diversa per accedere al dell'organo del Corti di Bohne e Liberman, che permette l'isolamento di apicale completo, medio, e si gira basali. Così il tessuto sezionato è più grande e meno probabilità di essere perso o danneggiato durante i processi di dissezione e di immunoistochimica. Inoltre, l'attuale metodo facilita misura della distanza dalla punta apicale o gancio basale per identificare una regione di frequenza.
Anche se molti laboratori svolgono immunocolorazione del tessuto cocleare, non è chiaro in cui questo metodo ha avuto origine. Di conseguenza ci sono varie ricette per il blocco buffers e buffer di incubazione anticorpo che possono influenzare le prestazioni di anticorpi primari individuali. Qui, presentiamo un metodo per immunocolorazione con anticorpi targhette fluorescenza che è applicabile agli anticorpi più comunemente usati nel campo uditivo.
La forma complessa della coclea, delicata struttura dell'organo del Corti, e encasement ossuto forniscono una sfida per l'analisi istologica e biochimica. Una varietà di tecniche sono attualmente utilizzati nel campo dell'udito di superare queste caratteristiche difficili e visualizzare le cellule all'interno dell'organo di Corti, ogni tecnica con i suoi vantaggi e svantaggi. Il protocollo presentato qui permette per tutta la dissezione monte della coclea topo adulto e, con leggera modifica, può potenzialmente essere utilizzato per esaminare le strutture critiche all'interno del coclee da una varietà di altri organismi modello utilizzato in campo.
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Protocol
Etica Dichiarazione: procedure che coinvolgono soggetti animali sono stati approvati dalla cura degli animali istituzionale e del Comitato uso alla Southern Illinois University School of Medicine.
1. Estrazione di temporali Ossa
- Identificare ossa temporali nella base del cranio del mouse 13 e raschiare via nervi cranici con pinze modello standard.
- Posizionare forcipe modello standard con la punta della capsula otica e con il pollice della mano opposta stampa verso il basso sul canale semicircolare posteriore per rimuovere la coclea incapsulato.
- Liberare la metà inferiore dell'osso temporale dal cranio manualmente con il pollice e l'indice o utilizzando 10,5 cm forbici sottili.
2. Post-fix temporali Ossa
- Mettere ossa temporali in 2 ml microprovette contenenti 250-500 microlitri 4% paraformaldeide (PFA) diluito in 10 mM tampone fosfato (PBS) pH 7.4 e incubmangiato a temperatura ambiente per 2-20 ore.
NOTA: Non è necessaria l'apertura della calotta apicale o iniezione di PFA nella rotonda o finestra ovale. Consiglia di utilizzare metanolo gratuito, ultra-pura, microscopia elettronica (EM) di grado PFA che può essere acquistato ad una concentrazione del 16% in flaconcini di vetro. Una volta che una fiala viene aperto e diluito 1: 4 in PBS, facendo una soluzione al 4%, può essere utilizzato per un massimo di 2 settimane se conservato a 4 ° C (Alcuni anticorpi richiedono breve fissazione e altri possono tollerare O / N (O / N) fissazione).
3. decalcify temporali Ossa
- Dopo la fissazione, rimuovere PFA con una pipetta e sostituirlo con 120 mm di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), poco più di 2 ml. Assicurati di riempire l'intera 2 ml provetta per evitare bolle d'aria quando il tubo è chiuso.
- In caso contrario decalcificazione immediatamente, sostituire PFA con PBS 10 mM pH 7.4 e conservare i campioni a 4 ° C
NOTA: Dopo la fissazione, ossa temporali possono essere conservati per variabLe quantità di tempo prima di decalcificazione seconda delle antigeni esaminata.
- In caso contrario decalcificazione immediatamente, sostituire PFA con PBS 10 mM pH 7.4 e conservare i campioni a 4 ° C
- Porre le provette su end-over-end dei rotatori e ruotano a 4 rpm a temperatura ambiente. Cambiare soluzione EDTA quotidiano con una pipetta. Lunghezza della decalcificazione dipende dall'età del campione e la preferenza del scienziato fare la dissezione.
- Incubare ossa temporali in EDTA utilizzando le seguenti linee guida per i tempi di incubazione:
Per i campioni postnatale giorno (P) 8 a P15: 2-4 ore; Per i campioni di P15 P21: O / N; Per i campioni di P21 P30: 2 O / N; Per i campioni di età superiore a P30: 3 o più O / N.
NOTA: i tempi di decalcificazione sono soggetti alle preferenze degli utenti e possono essere estesi a seconda delle necessità. Decalcificazione tempo può essere ridotto cambiando la soluzione di EDTA due volte al giorno, circa 8 ore a parte. Alcuni laboratori aggiungi 1% PFA alla soluzione EDTA quando decalcificazione per più di 3 giorni di tempo per evitare la contaminazione.
- Incubare ossa temporali in EDTA utilizzando le seguenti linee guida per i tempi di incubazione:
- Per determinare se il campione è adeguatamente decalcificata, posizionare ossa temporali ona silicone elastomero rivestito piatto dissezione e premere delicatamente pinze sulla coclea a forma di chiocciola. Se il tessuto è spongey, allora decalcificazione è completa.
- Una volta che la decalcificazione, rimuovere EDTA con una pipetta e aggiungere 500 ml di -1.000 10 mM PBS pH 7,4. Conservare i campioni a 4 ° C fino al momento di sezionare.
4. Creare silicone elastomero rivestite Dish Dissection
- Unire la base e il catalizzatore di un kit incapsulante elastomero siliconico in base alle istruzioni del produttore e mescolare accuratamente.
- Aggiungere circa 2-3 cucchiai di polvere di carbone fino a quando la soluzione è di colore nero e mescolare bene.
NOTA: l'inchiostro liquido o carbone liquido non si mescolano con la soluzione e non possono essere utilizzati. Kit elastomero incapsulante silicone possono essere acquistati in nero, permettendo passo 4.2 a essere omesso. - Versare la soluzione in 60 mm di vetro o scatole Petri in plastica, riempimento sufficiente a rivestire il fondo. Se bubbles sono presenti, sfoglia con l'aria sulla superficie. Lasciate riposare almeno 24 ore a temperatura ambiente per impostare.
NOTA: piatti elastomero silicone può essere utilizzato più volte per anni. Tuttavia non utilizzare l'etanolo per la pulizia, in modo da causare il elastomero siliconico di crack.
5. intero monte dissezione della coclea (per P7 e campioni più vecchi)
- Separare il giro basale da curve medio / apicali
- Posizionare un osso temporale decalcificata in un piatto dissezione elastomero siliconico rivestite riempita per due terzi con 10 mM PBS pH 7.4 e utilizzare un microscopio dissezione stereo per i seguenti passaggi.
- Tenere l'osso temporale nella regione vestibolare con # 4 o # 5 pinze gioiellerie dritto e con 5 mm di forbici a molla Vannas-Tubinga, tagliare l'eccesso di tessuto capsula otica lungo i lati e sopra l'apice.
- Utilizzando 2,5 mm Vännäs forbici a molla, inserire una lama nella finestra ovale e fare diversi piccoli tagli lungo la spirale legamento / lateraleparete del giro basale.
- Utilizzando 5 mm forbici primavera Vannas-Tubinga, inserire una lama nella regione appena tagliato e posizionare l'altra lama sulla parte esterna dell'osso temporale, mediale alla finestra ovale. Questo taglio separa il giro basale da curve medio e apicale.
- Dissezione completa del giro basale.
- Utilizzando 2,5 mm Vännäs forbici primavera, tagliare le fibre nervose spirale gangliari che si connettono al modiolus per allentare la tensione nel giro basale e tagliare sotto il giro basale a separarsi da organi vestibolari.
- Utilizzando 2,5 mm Vännäs forbici a molla, effettuare una serie di piccoli tagli per rimuovere il / parete laterale spirale legamento da sopra e sotto l'organo di Corti. Utilizzare # 4 o # 5 pinze gioielliere dritto per guidare il tessuto. Pin le fibre nervose spirale gangliari al rivestito-elastomero piatto dissezione di silicone, ma non tenere su questa regione come il tessuto si strappa.
- Durante le fasi precedenti, alcuni dei Membran di Reissnere sarà spesso rimosso. Se qualcuno rimane ancora, afferrare la membrana della Reissner con una pinza # 4 o # 5 gioiellerie dritto e tirare via dal organo del Corti.
NOTA: La membrana tectorial è raramente visibile e in genere galleggia via senza la necessità di una fase specifica per la rimozione. - Infine fare diversi tagli per ridurre lo spessore degli assoni spirale gangliari, per far girare il più piatto possibile e utilizzare # 4 o 5 # pinze gioielliere dritto per trasferire il giro basale sezionato, afferrando le rimanenti assoni del ganglio a spirale, a una piastra 48 pozzetti (o una diapositiva da camera) contenente ~ 500 ml di 10 mM PBS pH 7,4.
- Mezzo separata e curve apicali
- Posizionare i restanti due terzi della coclea, parte apicale verso il basso.
- Utilizzando 2,5 mm Vännäs forbici a molla, inserire una lama nei media Scala, dove il turno di mezzo utilizzato per essere collegato al giro basale, e fare diversi piccoli tagli lungo il / parete laterale spirale legamento di the turno centrale.
- Utilizzando 5 mm forbici primavera Vannas-Tübingen, inserire una lama nella regione appena tagliato con il blocco di supporto centrale posto sulla parte superiore della lama, e posizionare l'altra lama sul lato esterno del labirinto osseo, a un angolo di punta apicale 90 o. Questo separa la svolta mezzo dalla svolta apicale.
- Dissezione completa del blocco di supporto centrale in modo simile al giro basale (vedi i punti 5.2.2 a 5.2.4).
- Dissezione completa del turno apicale.
- Utilizzando 2,5 mm Vännäs forbici a molla, aprire il tappo che copre il turno apicale. Dissezione completa in un modo simile al giro basale (vedere i passi 5.2.2 a 5.2.4).
NOTA: dissecato giri cocleari possono essere memorizzati in 10 mM PBS pH 7,4 in una piastra a 48 pozzetti (o camera di scorrimento) a 4 ° C per diverse settimane prima immunocolorazione. Tuttavia PBS evapora e deve essere rifornito periodicamente e stoccaggio più di 2 - 3 settimane può provocare la crescita batterica o fungina sultessuto che può diminuire la qualità dell'immagine. Si consiglia di conservazione a lungo termine di campioni come ossa temporali undissected.
- Utilizzando 2,5 mm Vännäs forbici a molla, aprire il tappo che copre il turno apicale. Dissezione completa in un modo simile al giro basale (vedere i passi 5.2.2 a 5.2.4).
6. Immunostaining con fluorescenza Tagged Anticorpi
- Dopo la dissezione, memorizzare ogni turno cocleare in un pozzo separata in una piastra da 48 pozzetti (o una diapositiva da camera), immerso in ~ 500 ml di 10 mM PBS pH 7,4. Per ciascuna delle seguenti fasi del turno cocleare deve essere immerso in un liquido, non galleggia sulla parte superiore o attaccato al lato del bene.
NOTA: Quando si rimuove liquido da ciascun pozzetto, è facile perdere i giri cocleari o aspirare nella punta della pipetta. Modifica soluzioni con una punta della pipetta 200 microlitri utilizzando un ambito dissezione aiuterà a prevenire questo. - Usando una pipetta, rimuovere PBS da ogni pozzetto e sostituirlo con ~ 200-300 ml per pozzetto di bloccare / soluzione permeabilizzazione (1% Triton X-100, 1% di albumina sierica bovina (BSA), e siero di capra normale il 10% (NGS) diluito in 10 PBS mm PH 7.4). Incubare 1 ora a RT su un rotatore 3D.
NOTA: Se un anticorpo primario utilizzato è stato fatto in una serie di capra, quindi sarà necessario un anticorpo anti-capra secondario e NGS NON deve essere utilizzato per uno dei passaggi. Siero di cavallo normale può essere utilizzato in sostituzione di NGS. - Rimuovere soluzione bloccante / permeabilizzazione con una pipetta e sostituirlo con ~ 100 microlitri per pozzetto di soluzione di anticorpo primario (0,1% Triton X-100, 1% BSA e 5% NGS diluito in PBS 10 mM pH 7,4). Il fattore di diluizione per ogni anticorpo primario varia. Incubare O / N (minimo 14 ore) a 4 ° C su un rotatore 3D.
NOTA: Se si usa più di un anticorpo primario, tutti possono essere combinati nella stessa soluzione per l'incubazione, basta assicurarsi che ogni anticorpo primario ha un host diverso. - Rimuovere la soluzione primaria di anticorpi con una pipetta ed eseguire 3 lavaggi di 10 mm PBS pH 7,4 a ~ 500 microlitri per bene. Ogni lavaggio incuba un minimo di 5 minuti a temperatura ambiente su un rotatore 3D.
- Rimuovere ultima PBS lavata con una pipetta e sostituire con ~ 100 ml per pozzetto di soluzione di anticorpo secondario (0,1% Triton X-100, 1% BSA, e 5% NGS diluito in 10 mM PBS pH 7,4). Il fattore di diluizione per ogni fluorescente contrassegnati anticorpo secondario è di solito 1: 500 o 1: 1.000. Mettere piatto 48-bene in una scatola nera per proteggere fluorescente contrassegnati anticorpi secondari dalla luce. Incubare 2-3 ore a temperatura ambiente su un rotatore 3D.
NOTA: Se è necessario più di un anticorpo secondario, possono essere combinati nella stessa soluzione per l'incubazione. Assicurarsi che non vi è alcuna possibilità di cross-etichettatura (ad es., Utilizzando capra anti-coniglio e pollo anti-capra anticorpi secondari) - Rimuovere la soluzione anticorpo secondario con una pipetta ed eseguire 3 lavaggi di 10 mm PBS pH 7,4 a ~ 500 microlitri per bene. Incubare ogni lavaggio per almeno 5 minuti a temperatura ambiente su un rotatore 3D. Tenere piatto 48-bene in una scatola nera per proteggerla dalla luce.
- Rimuovere ultimo lavaggio PBS utilizzando una pipetta e sostituirlo con ~ 100 pl per pozzetto di HOECHST 33342 (diluito 1: 2.000 in 10 mM PBS pH 7,4) per etichettare nuclei. Incubare 15 - 20 minuti a temperatura ambiente su un rotatore 3D. Tenere piatto 48-bene in una scatola nera per proteggerla dalla luce. NON incubare più lungo di 20 minuti.
- Rimuovere la soluzione Hoechst con una pipetta ed eseguire 3 lavaggi di 10 mm PBS pH 7,4 a ~ 500 microlitri per bene. Incubare ogni lavaggio per almeno 5 minuti a temperatura ambiente su un rotatore 3D. Tenere piatto 48-bene in una scatola nera per proteggerla dalla luce.
- Tutte le fasi possono essere estesi, tranne Hoechst incubazione, per diverse ore, se necessario. Per mettere in pausa la reazione in qualsiasi momento, basta immergere campioni in ~ 500 ul di 10mM PBS pH7.4 e conservare la piastra 48 be '(o una diapositiva da camera) a 4 ° C fino al momento di riprendere le ore di protocollo o 1 - 2 giorni dopo .
7. Montare Cochlear Attiva diapositive
- Etichetta vetrini con informazioni pertinenti sul campione e anticorpi utilizzati.
- Pipettare ~ 50 ml di supporti di montaggio sul ogni diapositiva e stia attentoper evitare bolle. Centrifugare la provetta contenente il supporto di montaggio per rimuovere eventuali bolle.
- Utilizzando # 4 o pinze # 5 del gioielliere dritto, afferrare gli assoni del ganglio spirale di trasferire delicatamente un giro cocleare dalla piastra 48 pozzetti alla diapositiva e posto nei media di montaggio. Montare un giro cocleare per diapositiva per evitare l'esposizione alla luce e photobleaching durante il processo di imaging.
- Utilizzare un microscopio dissezione stereo per garantire quel turno cocleare non sia piegata, contorto, o vicino ad una bolla d'aria. Se una di queste condizioni, pinza uso # 4 o # 5 del gioielliere dritto per riposizionare il turno cocleare.
- Luogo un'estremità di un coprioggetto sul vetrino e delicatamente rilasciare far cadere coprioggetto.
- Utilizzare un microscopio dissezione stereo per garantire che il turno cocleare non sia piegata, contorto, o vicino ad una bolla d'aria. Se una di queste condizioni, spostare delicatamente il coprioggetto avanti e indietro per riposizionare il turno cocleare.
- Collocare i vetriniin una cartella diapositiva in modo che essi rimangano piatti. Lasciate montaggio supporti cura O / N a temperatura ambiente (tenere al buio)
- Coprioggetto Seal con smalto trasparente e conservare a temperatura ambiente o -20 ° C fino a creare l'immagine. Le diapositive possono essere memorizzati in una cartella diapositiva o scivolo box.
NOTA: Le diapositive possono essere conservati a lungo termine a -20 ° C o -80 ° C e fluorescenza verrà mantenuto per diversi mesi. - Le diapositive di immagini utilizzando un microscopio confocale con la lunghezza d'onda appropriata sulla base delle anticorpi secondari utilizzati durante la procedura di immunocolorazione. Luminosità e contrasto regolazioni possono essere eseguite utilizzando il software di imaging fornito dal venditore confocale.
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Representative Results
Presentiamo un metodo per isolare l'organo del Corti come tre giri intatte cocleari (apice, medio e base) dal tessuto cocleare che è calcificata, con gradini dissezione chiave presentati in Figura 1. Durante la prima settimana postnatale dello sviluppo, calcificazione Mouse coclea è incompleta e più semplice metodo di dissezione 13 può essere utilizzato. Utilizzando l'intero metodo di dissezione monte neonatale con coclea da P7 e anziani topi risultati in lacrime e triturazione dell'organo del Corti. Il / parete laterale spirale legamento è ora più saldamente fissata e non può essere staccato dal dell'epitelio sensoriale senza causare danni. Così è necessario l'intero metodo di dissezione "adulto" supporto per i campioni di età superiore a P6. Presentiamo un esempio del turno mezzo di un mouse coclea P15 che è stato dissezionato e immunoistochimica con cella capelli e sostegno marcatori di cellule (Figura 2). Sezioni ottici cun essere ottenuto anche con l'intera tecnica di montaggio (Figura 3).
Diversi problemi possono verificarsi durante l'intero dissezione montaggio o durante il montaggio del cocleare accende diapositive. Durante la rimozione del / parete laterale spirale legamento, vi è una stretta finestra tra taglio troppo o non abbastanza. Tagli che si verificano vicino al l'ultima fila di cellule ciliate esterne possono causare le cellule ciliate in questa ultima fila per montare ad angoli vari (Figura 4A). Tagli che sono troppo grandi possono rimuovere le sezioni dell'organo di Corti (Figura 4B). Manipolazione del campione con una pinza pone molta cura e spesso ci sono buchi nel dell'organo del Corti, dove sono stati fuori luogo pinza (Figura 4C). Infine, quando si montano i giri cocleari, l'organo del Corti può piegare che oscura l'immagine (figura 4D).
Figura 1. passi importanti nel Monte intera dissezione del "Adult" Mouse Coclea. (A), dopo il protocollo punto 5.1.4, il giro basale della coclea è separato dal turno medio / apicali, ma ancora attaccato alla regione vestibolare. (B) Dopo protocollo passo 5.3.3, la volta centrale è separato dal turno apicale. (C) Esempio di dissezione completa di un turno di mezzo in cui il / parete laterale spirale legamento è stato rimosso. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. confocale Fetta Immagine del MedioGirare isolato da un P15 Mouse. Quattro 20x immagini sono sovrapposte a ricostruire l'intero giro di mezzo. Cellule ciliate sono etichettati con un coniglio anti-miosina VIIa anticorpo primario (diluizione 1: 200) in combinazione con un 488-coniugato anticorpo asino anti-coniglio Alexa secondario (1: 1.000 diluizione) (magenta). Cellule di supporto sono etichettati con un anticorpo di capra anti-Sox2 primaria (diluizione 1: 500) abbinato ad un asino anti-capra Alexa 568-coniugato anticorpo secondario (1: 1.000 diluizione) (verde). Hoechst (blu) etichetta tutti i nuclei. L'immagine è stata scattata con un microscopio confocale Zeiss LSM 700 con 405, 488, e 555 lunghezze d'onda. Scala bar = 100 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. ottico Sezione del Medio Girare isolato da un 6 settimane vecchio mouse. (A) immagine confocale fetta di tutta la preparazione montaggio (inferiore) e sezione ottica nel piano XZ (in alto). (B) Aumento di ingrandimento del pannello superiore in (A), con il mirino rimossi. Cellule ciliate sono etichettati con un coniglio anti-miosina VIIa anticorpo primario (diluizione 1: 200) in combinazione con un 647-coniugato anticorpo asino anti-coniglio Alexa secondario (1: 1.000 diluizione) (magenta). Cellule di supporto sono etichettati con un anticorpo di capra anti-Sox2 primaria (diluizione 1: 500) abbinato ad un asino anti-capra Alexa 568-coniugato anticorpo secondario (1: 1.000 diluizione) (verde). L'immagine è stata scattata con un microscopio confocale Zeiss LSM 700 con 405, 555, e 647 lunghezze d'onda. Barre di scala = 20 micron Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Figura 4. Esempi di problemi che possono verificarsi durante l'intero monte Dissection o durante il montaggio Cochlear Accende diapositive. (A) Sul lato sinistro dell'immagine, il tessuto è stato tagliato cocleare penultima fila delle cellule ciliate esterne causando molti di queste cellule da montare ad angoli varie. (B) Una sezione dell'organo di Corti sul lato sinistro dell'immagine è stata tagliata. (C) C'è un foro punzonato nella regione cellule ciliate esterne nel mezzo della immagine. (D), l'organo del Corti è piegato in più punti. Le immagini sono state scattate 4-8 settimane vecchio topo coclee. Cellule ciliate sono etichettati con un coniglio anti-miosina VIIa anticorpo primario (diluizione 1: 200) in combinazione con una capra anti-coniglio Alexa 488-coniugato anticorpo secondario (1: 1.000 diluizione) o un asino anti-coniglio Alexa 488-coniugato anticorpo secondario (1: 1.000 diluizione) (magenta). In C esterno cel capellils sono etichettati con un anticorpo di capra anti-prestin primaria (diluizione 1: 200) in combinazione con un 568-coniugato anticorpo asino anti-coniglio Alexa secondario (1: 1.000 diluizione) (verde). Le immagini sono state scattate con una SP5 microscopio confocale Leica con 405, 488, e 555 lunghezze d'onda nm. Barre di scala: in AB = 20 micron; in CD = 40 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Ci sono diversi passaggi critici per il successo dell'intero dissezione mount e immunocolorazione. Tuttavia prima di uno di questi metodi vengono eseguiti, è necessaria un'adeguata fissazione del tessuto cocleare. Si consiglia di utilizzare metanolo gratuito, ultra-pura, grado EM PFA. PFA ottenuta dalla polvere può avere tracce di metanolo e un pH instabile che diminuisce la qualità di immunofluorescenza. Altri gruppi hanno anche dimostrato che le dissezioni simili sono possibili utilizzando fissativi che non contengono formaldeide 14-16. La lunghezza di fissaggio è importante e specifico anticorpo. Alcuni anticorpi possono tollerare una fissazione O / N, mentre altri non funzionano bene con appena 1 ora in PFA (ma questo è raro). Sotto-fisso tessuto può essere problematico per il metodo di dissezione come il tessuto cade a pezzi. Nella nostra esperienza 3 - fissaggio 4 hr fornisce fissaggio adeguato e non interferisce con la maggior parte degli anticorpi primari comunemente usati nel campo dell'udito.
jove_content "> E 'anche possibile che l'EDTA può interferire con gli anticorpi primari;. così alcuni anticorpi funziona bene nel tessuto neonatale, ma non in P7 o tessuto vecchio che è stato decalcificata Dopo la fissazione, ossa temporali possono essere conservati per una quantità variabile di tempo prima decalcificazione seconda delle antigeni in esame. Alcuni antigeni richiedono decalcificazione e dissezione entro giorni o settimane dopo la fissazione, mentre altri possono essere conservati per anni (prima o dopo la decalcificazione) senza diminuire la qualità della immunocolorazione. Si consiglia di campioni di memorizzazione come ossa temporali a causa del rischio di evaporazione del supporto di memorizzazione (PBS) dalla piastra 48 pozzetti e potenziale contaminazione con funghi o batteri. Noi di solito ad effettuare l'intero dissezione monte meno di una settimana di anticipo per immunocolorazione.Una volta fisso e decalcificata, tutta dissezione monte viene eseguita con l'osso temporale sommerso nel liquido. Rimozione eccesso di osso e morbidotessuto circostante il labirinto presto la dissezione sarà di aiuto nella rimozione del / parete laterale legamento spirale in fasi successive, facilitando la manipolazione del tessuto e di fornire una visione meno oscurata strutture critiche. Quando si eseguono i primi passi, pinze possono essere utilizzate per tenere il tessuto nella regione vestibolare. Tuttavia, una volta le spire sono isolate, è importante evitare di mettere forcipe sull'organo di Corti oa spirale legamento / parete laterale. Invece, tenere la pinza chiusi e perno le fibre nervose spirale gangliari al piatto dissezione elastomero siliconico rivestite. Non tenere su questa regione come il tessuto si strappa. In generale, una volta che il tessuto è stato suddiviso in tre turni, afferrare e manovre di trazione può causare risultati imprevedibili, che sono spesso dannosi per l'organo del Corti e deve essere evitato. Tessuto da animali più giovani (P7-P21) tende ad essere più indulgente rispetto al tessuto di animali di età superiore a P21. Inoltre, i campioni con cellule cocleari capelli dAmage sono più difficili da sezionare. Se il mouse esposizione al rumore ricevuto il tessuto è particolarmente fragile. Indipendentemente dallo stato del tessuto, la dissezione presentiamo è tecnicamente impegnativo e richiede molti tentativi pratica per competenza.
Durante immunostaining, è importante che ogni giro cocleare è immerso nel liquido, non galleggia sulla parte superiore o attaccato al lato del bene. Questo permette più completa penetrazione triton e anticorpi nel tessuto. Quando si rimuove il liquido da ogni pozzetto, è facile perdere la svolta cocleare o disegnare in su nella punta della pipetta. Modifica soluzioni con una punta della pipetta 200 microlitri utilizzando un ambito dissezione aiuterà a prevenire questo. Lentamente estrarre il liquido e spostare la punta della pipetta se la svolta cocleare si avvicina troppo. Pipetteting anche soluzione di scarico in una provetta pulita può essere una buona strategia come questo tubo di scarico può essere cercato se una volta viene accidentalmente redatto nella pipetta. Se la svolta è bloccato nella punta della pipetta, tegli punta può essere tagliato aperto con una lama di rasoio, ma spesso l'organo di Corti verrà danneggiato se questo si verifica.
Quando, passaggi aggiuntivi come il recupero di un antigene o il potenziamento del segnale possono essere aggiunti risoluzione dei problemi anticorpi per immunoistochimica. Ci sono basso pH e l'antigene pH elevato reagenti smascheramento che possono essere acquistati. Se un anticorpo non funziona con il metodo descritto qui, il primo cambiamento protocollo da provare è uno di questi metodi di recupero antigene. In alternativa, utilizzare un potenziatore di segnale. Ci sono soluzioni disponibili in commercio per uso prima immunostaining, o Tyramide kit di amplificazione che possono essere usati per amplificare il segnale dal anticorpo secondario.
Il significato della tecnica presentiamo è la capacità di mantenere la struttura tridimensionale dell'organo di Corti e visualizzare tutte le celle all'interno dell'organo. L'intera lunghezza della coclea è divisa in soli tre turni mentre altre tecniche simili, cioè thmetodi e Bohne e Liberman, richiedono divisione in 5 - 10 parti 6-8, aumentando il numero di campioni da manovrare nei processi immunocolorazione e di imaging. La dissezione parete laterale cocleare sviluppato da Cosgrove e Gratton richiede un livello simile di abilità ed è possibile non fissato, tessuto fresco, così come nel tessuto decalcificata, ma l'organo di Corti viene strappato via e distrutto nel processo di isolare il parete laterale 17. Un altro gruppo si è esibito dissezioni simili non fissato, tessuto fresco cocleare da tre settimane di età ratti in cui il / parete laterale spirale legamento viene afferrato e strappato via dalla dell'organo del Corti, lasciando intatto l'organo. Tuttavia questo è stato raggiunto solo nel giro apicale 5. Il metodo di peeling il / parete laterale spirale legamento dalla dell'organo del Corti è di routine per la dissezione dei tessuti fissa in un giovane topo (<P7) 13. Tuttavia, nella nostra esperienza con i topi di età superiore a P6, dopo la fissazione di und decalcificazione, questa manovra spesso strappa l'organo del Corti in modo inaffidabile. Inoltre, il procedimento qui descritto consente l'isolamento di media e basale risulta pure.
Criosezioni e sezioni ottenute dopo incorporamento paraffina sono comunemente utilizzati in campo uditivo. Questi metodi consentono la visualizzazione di altre strutture come il vascularis stria, la membrana di Reissner, e la membrana tectorial, ma ogni sezione permette solo la visualizzazione di una piccola regione dell'organo del Corti in ogni turno cocleare. Così per indagare gli eventi che si verificano in un mosaico, come la perdita delle cellule o la divisione cellulare, con il metodo di sezionamento, 50 o più diapositive devono essere tinto e ripreso per catturare l'intera lunghezza della coclea. Al contrario, l'intero protocollo dissezione montaggio ha il vantaggio di preparare l'intero organo di Corti in soli tre pezzi. Oltre al vantaggio di preservare l'architettura longitudinale dell'organo di Corti, questo technique consente per la raccolta dei dati semplificata e di stoccaggio. Una limitazione di tutta la dissezione monte è che distrugge le strutture circostanti, come il legamento spirale, stria vascularis, membrana di Reissner e tectorial. Un'altra limitazione è la difficoltà tecnica e durata per un singolo dissezione. Ciò è in gran parte a causa della natura fragile dell'organo del Corti e piccolo margine di errore quando si rimuove il / parete laterale spirale legamento. Una volta masterizzato, il tutto dissezione monte di una coclea può essere eseguita in circa 20 - 30 min.
Mentre il protocollo di cui sopra descrive un intero metodo dissezione montaggio per il topo adulto, speriamo di applicare questa tecnica ad altri organismi modello utilizzati nel campo uditivo. Il nostro laboratorio è attualmente modificando questa tecnica per la dissezione della coclea del ratto. Il più grande coclea del ratto è racchiuso in una capsula otica più spessa che è più densamente calcificato che il mouse. Così l'osso temporale deve essere invita per excised con grandi forbici. Prima fissazione e la decalcificazione con EDTA, la capsula otica dovrebbe essere aperto con le forbici per consentire un migliore accesso al tessuto cocleare. Anche il processo di decalcificazione è più lungo e può richiedere fino 3 settimane a seconda dell'età del campione. Per tutta la dissezione monte, la dimensione del labirinto osseo colpisce la tecnica. La maggiore dimensione della coclea di ratto fornisce una distanza leggermente più grande tra la / parete laterale spirale legamento e organo di Corti, fornendo un più ampio margine di errore per i singoli tagli. Tuttavia, mentre il tessuto più grande può fornire più materiale da afferrare per la manipolazione del campione, ma richiede anche un maggior numero di tagli per rimuovere l'intera lunghezza del / parete laterale legamento a spirale. Noi crediamo che le modifiche analoghi potrebbero essere fatti per la dissezione della coclea da cincillà, gerbillo e la cavia.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | can be purchased from other vendors |
| 10.5 cm fine scissors | Fine Science Tools | 14060-11 | can be purchased from other vendors |
| 2 ml microcentrifuge tubes | MidSci | AVSS2000 | can be purchased from other vendors |
| 16% formaldehyde, methanol free, ultra pure, EM grade | Polysciences | 18814 | TOXIC --wear gloves and cannot be disposed of in the sink. Can be purchased from other vendors. |
| PBS pH 7.4 | Sigma | P3813-10PAK | can be purchased from other vendors |
| EDTA | Fisher | BP118-500 | can be purchased from other vendors |
| end-over-end tube rotator | Fisher | 05-450-127 | can be purchased from other vendors |
| 60 mm petri dish | Fisher | 50-202-037 | can be purchased from other vendors |
| Dow Corning Sylgard 184 silicone encapsulant kit | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| activated charcoal | Fisher | AC134372500 | can be purchased from other vendors |
| stereo dissection microscope | Zeiss | Stemi 2000 | can be purchased from other vendors |
| Dumont #4 jeweler's forceps | Fine Science Tools | 11241-30 | |
| Dumont #5 jeweler's forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| 2.5 mm Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15001-08 | curved |
| 5 mm Vannas-Tubingen spring scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | straight |
| 48-well plates | Fisher | 08-772-52 | can be purchased from other vendors |
| 8-well chamber slides | Fisher | 1256518 | can be purchased from other vendors |
| Triton X-100 | Sigma | X100-500 | can be purchased from other vendors |
| BSA, fraction V | Fisher | BP1605 | can be purchased from other vendors |
| NGS | Vector labs | S-1000 | can be purchased from other vendors |
| NHS | Vector labs | S-2000 | can be purchased from other vendors |
| 3D rotator | Midsci | R3D-710 | can be purchased from other vendors |
| Western blot incubation box XL | Licor | 929-97401 | |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | can be purchased from other vendors |
| Prolong gold antifade mounting media | Life Technologies | P36930 | can be purchased from other vendors,but mounting medias vary in their ability to protect against photobleaching |
| Superfrost Plus Slides | Fisher | 12-550-15 | can be purchased from other vendors |
| coverslips 22 x 22 x 1 | Fisher | 12-548-B | can be purchased from other vendors |
| clear nail polish | Local drug store | can be purchased from other vendors | |
| cardboard slide folder | Fisher | 12-587-10 | can be purchased from other vendors |
| plastic slide box | Fisher | 03-448-10 | can be purchased from other vendors |
References
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- Ehret, G., Frankenreiter, M. Quantitattive analysis of cochlear structures in the house mouse in relation to mechanisms of acoustical information processing. J Comp Physiol. 122, 65-85 (1977).
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