Summary
私たちは3無傷の蝸牛ターン（頂点、ミドル、ベース）としてコルチ大人の臓器を分離する手法を提案します。また、蛍光タグ付き抗体で免疫染色するための手順を示しています。一緒に、これらの技術は、蝸牛に見出さ有毛細胞、支持細胞、および他の細胞型の研究を可能にします。
Introduction
側頭骨内に含まれている内耳の螺旋状の蝸牛は、コルティ、哺乳類における聴覚感覚終末器官の器官を収容します。蝸牛はtonotopically編成、一般頂端、中間に分割され、基礎ベースの高周波音検出と頂点1における低周波検出に異なる周波数領域に対応するオン。れます有毛細胞、コルチ器官の機械刺激細胞は、マウス2,3で約6mmの長さである蝸牛の長さを実行します。これらの細胞は、中枢聴覚構造によって処理された神経信号に、液体で満たされた膜迷路を介して送信された音波の機械的エネルギーを変換します。ここに記載された技術は、蝸牛の石灰化は、（1週齢から成人期までのサンプルのため）が完了した後にコルチ器官の全体のマウントを製造する方法を提供します。また、immunostaための方法を提示全体ining蝸牛組織を搭載しています。蝸牛全体のマウントは、その自然の空間配置内のすべての有毛細胞と周囲の支持細胞の可視化のために重要であると共焦点顕微鏡を用いた三次元で分析が可能。
博士。ハンス・エングストロームハーローアデスは、もともと彼らは急速に顕微鏡分析4のためにコルチ器官の短い無傷のセグメントを維持し、固定し、哺乳類の様々な液体に浸さ石灰化蝸牛を分析する手法を詳述し1966年に全体のマウント蝸牛切開法を説明しました。未固定、石灰化したラットの蝸牛の解剖も教育ビデオ5に示されています。博士。バーバラBohneとワシントン大学のゲーリー・ハーディングは、この方法にはいくつかの重要な修正を行いました。蝸牛全体のマウント方法の彼らのバージョンでは、側頭骨は、脱灰したプラスチックに埋め込まれ、5ハーフターンまたは10四半期ターンはdissecましたテッド6,7。プラスチック埋め込 みが8を必要としていなかったように、イートンピーボディ研究所、マサチューセッツ州アイ、耳診療所での博士チャールズ・リーベルマンらは、この手法を変更しました。技術のさらなる変更はここに提示解剖法を知らさセントジュード小児研究病院9-12博士建祚の研究室で発生しました。我々は完全な頂端、中間、基底ターンの単離を可能にするBohneとリーベルマンよりコルチ器官へのアクセスを得るために異なる戦略を使用しています。したがって、解剖組織が大きく、解剖や免疫染色工程中に紛失または破損しにくくなります。さらに、現在の方法は、周波数領域を特定するために先端チップ部または基底フックとの距離の測定を容易にします。
多くのラボでは蝸牛組織の免疫染色を行うが、この方法は、元の場所、それは不明です。その結果、ブフェを遮断するための様々なレシピがあります個々の一次抗体の性能に影響を与える可能性のRSおよび抗体インキュベーションバッファー。ここでは、聴覚分野において最も一般的に使用される抗体に適用することができる蛍光タグ付き抗体で免疫染色するための1つの方法を提示します。
蝸牛の複雑な形状、コルチ器官の繊細な構造、および骨の箱詰めは、組織学的および生化学分析のための課題を提供しています。種々の技術は、現在、これらの困難な特徴を克服し、それ自身の利点と欠点を有するコルチ、各技術の臓器内の細胞を可視化するために聴覚分野で使用されています。ここに提示されたプロトコルは、全体の成体マウス蝸牛の解剖マウントを可能にし、わずかな修正を加えて、潜在的な分野で使用される他のモデル生物の様々な蝸牛内の重要な構造を調べるために使用することができます。
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Protocol
倫理の声明：動物を対象とする手順は、医学のサザンイリノイ大学での施設内動物管理使用委員会によって承認されています。
頭骨の1の抽出
- マウスの頭蓋骨13のベースに頭骨を識別し、標準パターン鉗子を使用して脳神経を削り取ります。
- カプセル化された蝸牛を取り除くために、耳のカプセルの先端に、下後部三半規管に反対ハンドプレスの親指で標準パターン鉗子を置きます。
- 親指と人差し指で、または10.5センチメートル細かいハサミを使用して手動で頭蓋骨から頭骨の下半分を解放します。
2.ポストフィックス頭骨
- 10mMのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）pHが7.4とincubで希釈し、500μlの4％パラホルムアルデヒド（PFA） - 250を含む2 mlのマイクロ遠心チューブに頭骨を配置20時間 - 2 RTで食べました。
注：円形または楕円形のウィンドウにPFAの頂端キャップまたは注射のいかなる開口部は必要ありません。ガラスバイアル中に16％の濃度で購入することができ、メタノール無料、超純、電子顕微鏡（EM）グレードPFAを使用することをお勧めします。バイアルを開け、1に希釈された後：PBS中4 4 O C（いくつかの抗体は、短い固定等を必要とする/ O（O / Nを許容することができるで保存した場合、4％の溶液を作り、それは最大2週間のために使用することができますN）固定）。
3.脱灰頭骨
- 固定後、ピペットを用いてPFAを削除し、120 mMのエチレンジアミン四酢酸（EDTA）、少し以上の2mlで交換してください。管が閉じているときに空気が気泡を防ぐために、全体の2ミリリットルのマイクロチューブを記入してください。
- すぐに脱灰されていない場合は、4 O℃で10mMのpH7.4のPBSと店舗のサンプルでPFAを交換
注：固定した後、側頭骨はvariab保存することができます検査されている抗原に応じて脱灰前の時間のル量。
- すぐに脱灰されていない場合は、4 O℃で10mMのpH7.4のPBSと店舗のサンプルでPFAを交換
- 転倒型回転器の上に置い管、室温で4 rpmで回転させます。ピペットを用いて毎日EDTA溶液を変更します。脱灰の長さは、サンプルの年齢および解剖をやって科学者の好みに依存します。
- インキュベーション時間については、次のガイドラインを使用して、EDTA中で頭骨をインキュベート：
8 P15のサンプル生後日（P）の場合：2から4時間。 P21のサンプルP15の場合：O / N。 P30のサンプルP21の場合：2 O / N。 3以上のO / N：P30より古いサンプルについて。
注：脱灰時間は、ユーザーの好みの対象となり、必要に応じて拡張することができます。脱灰時間は約8時間離れて、一日二回EDTA溶液を変化させることによって低減することができます。汚染を防止するために、より長い3日間脱灰すると、一部のラボでは、EDTA溶液に1％PFAを追加します。
- インキュベーション時間については、次のガイドラインを使用して、EDTA中で頭骨をインキュベート：
- サンプルが十分に脱灰であるかどうかを判断するには、側頭骨のOを配置シリコンエラストマーで被覆された解剖皿をNAと優しくカタツムリ状の蝸牛に鉗子を押してください。組織がspongeyである場合、脱灰は完了です。
- 脱灰が完了すると、ピペットを用いて、EDTAを除去し、10mMのpH7.4のPBSの500 -1000μlを添加します。解剖準備ができるまで4 O Cで保存サンプル。
4.シリコーンエラストマーで被覆された解剖皿を作成します。
- ベースとシリコーンエラストマー封止キットの硬化剤は、製造者の指示に従って結合し、十分に混合します。
- ソリューションが黒になるまで粉末木炭の大さじ3、よく混ぜる - 約2を追加します。
注：液体インクまたは液体木炭を溶液と混合せず、使用することはできません。シリコーンエラストマー封止キットは、ステップ4.2を省略することができるように、黒で購入することができます。 - 被覆に十分な底部を充填し、60 mmのガラスまたはプラスチック製のペトリ皿に溶液を注ぎます。 BU場合bblesは、表面上の空気とパフ存在しています。設定するには、室温で少なくとも24時間放置し。
注：シリコーンエラストマーで被覆された料理は何年も繰り返し使用することができます。これはシリコーンエラストマーに亀裂が発生しますしかし、洗浄のためにエタノールを使用しないでください。
（P7と古いサンプル用）蝸牛の5ホールマウント解剖
- 頂端/ミドルターンから基底回転を分離
- 10mMのpH7.4のPBSで三分の二のフル充填シリコーンエラストマーで被覆された解剖皿に1脱灰頭骨を置き、次のステップのためのステレオ解剖顕微鏡を使用しています。
- ＃4または＃5ストレート宝石商の鉗子を用いて前庭地域の頭骨を持ち、5ミリメートルVannas-テュービンゲン春のはさみを使用して、側面に沿って頂点上記過剰耳のカプセル組織を切り取ります。
- 2.5ミリメートルVannas春のはさみを使用して、楕円形のウィンドウに1ブレードを挿入し、スパイラル靭帯/横に沿っていくつかの小さなカットを作ります基底回転の壁。
- 5ミリメートルVannas-テュービンゲン春のはさみを使用して、ちょうど卵円窓に正中、側頭骨の外に他のブレードをカットし、配置領域に1ブレードを挿入します。このカットは、中間および頂端ターンから基底回転を分離します。
- 基底回転の完全解剖。
- 2.5ミリメートルVannas春のはさみを使用して、基底回転の緊張を解放し、前庭器官から分離するために基底回転の下にカットする蝸牛軸に接続し、螺旋神経節神経繊維をカット。
- 2.5ミリメートルVannas春のはさみを使用して、コルチ器官の上および下の両方からスパイラル靭帯/側壁を除去するために、小さなカットのシリーズを作ります。組織を導くために、＃4、＃5ストレート宝石商の鉗子を使用してください。シリコーンエラストマー被覆解剖皿にらせん神経節神経線維をピンが、組織が裂けるように、この領域に保持していません。
- 前の手順、ライスナーのmembranのいくつかの中にeは、多くの場合、削除されます。いずれかがまだ残っている場合は、＃4、＃5ストレート宝石商の鉗子でライスナーの膜を把握し、コルチ器官から引き離します。
注：被蓋膜がまれに表示され、一般的に除去するための具体的なステップを必要とせずに離れて浮きます。 - 最後に、できるだけ平坦ターンを行い、スパイラル神経節の残りの軸索を把握することで、解剖基底回転を転送するために＃4または＃5ストレート宝石商の鉗子を使用するように、スパイラル神経節軸索の厚さを減らすためにいくつかのカットを作ります10mMのpH7.4のPBSの〜500μLを含む48ウェルプレート（またはチャンバースライド）。
- 個別の真ん中と頂端ターン
- 蝸牛の残りの三分の二、頂端側を下に置きます。
- 2.5ミリメートルVannas春のはさみを使用して、中間ターンは基底回転に接続するために使用される中央階に1ブレードを挿入して、目のスパイラル靭帯/側壁に沿っていくつかの小さなカットを作ります電子真ん中のターン。
- 5ミリメートルVannas-テュービンゲン春のはさみを使用して、単に刃の上に置かミドルターンで切断領域に1ブレードを挿入し、先端チップ部から90 Oの角度で、骨迷路の外に他のブレードを配置します。これは、頂回転の中からターンを分離します。
- 基底回転と同様に、中間ターンの完全な解剖（5.2.4へのステップ5.2.2を参照）。
- 頂回転の完全解剖。
- 2.5ミリメートルVannas春のはさみを使用して、頂回転を覆うキャップを開きます。基底回転と同様に完全解剖（5.2.4へのステップ5.2.2を参照）。
注：解剖蝸牛ターンは免疫染色の前に数週間4°Cの時に48ウェルプレート（またはチャンバースライド）に10mMのpH7.4のPBSに格納することができます。しかし、PBS長い2よりも蒸発し、定期的に補充する必要があり、記憶されます - 3週間で、細菌または真菌の増殖をもたらすことができます画像の品質を低下させることができる組織。我々はundissected頭骨などの試料の長期保存をお勧めします。
- 2.5ミリメートルVannas春のはさみを使用して、頂回転を覆うキャップを開きます。基底回転と同様に完全解剖（5.2.4へのステップ5.2.2を参照）。
蛍光タグ付き抗体による免疫染色6.
- 解剖後、10mMのpH7.4のPBSの〜500μlの中に沈め、48ウェルプレート（またはチャンバースライド）で別々のウェル中の各蝸牛ターンを格納します。以下の各ステップについて蝸牛ターンは、液体中に浸漬されなければならない上に浮いていないか、ウェルの側面に付着しました。
注：各ウェルから液体を除去すると、それは蝸牛のターンを失うか、ピペットチップでそれを吸うのは簡単です。解剖スコープを使用して、200μlのピペットチップでソリューションを変更すると、これを防ぐことができます。 - ピペットを用いて、各ウェルからPBSを除去し、置き換える〜200と - /ブロッキング透過化溶液（ウェルあたり300μlの1％トリトンX-100、1％ウシ血清アルブミン（BSA）、及び10％正常ヤギ血清（NGS） 10mMのPBS Pに希釈H 7.4）。 3D回転体に室温で1時間インキュベートします。
注：使用される任意の一次抗体は、ヤギのホストで行われた場合、二次抗ヤギ抗体が必要とされ、NGSは、ステップのいずれかに使用することはできません。正常ウマ血清をNGSの代替として使用することができます。 - ピペットを用いてブロッキング/透過処理溶液を除去し、一次抗体溶液をウェル当たり〜100μlで置き換える（0.1％トリトンX-100、10mMのPBS（pH7.4）中に希釈し、1％BSAおよび5％NGS）。各一次抗体のための希釈率が変化します。 3D回転体に4 O℃で O / N（最低14時間）インキュベートします。
注：複数の一次抗体を使用している場合は、すべてのインキュベーションのために、同じ溶液中に組み合わせることができ、ちょうど各一次抗体は、別のホストを持っていることを確認してください。 - ピペットを用いて、一次抗体溶液を除去し、ウェル当たり〜500μlので10mMのpH7.4のPBSの3回の洗浄を行います。各洗浄は、3D回転体に室温で5分間の最小値をインキュベートします。
- 最後のPを削除しますBSは、ピペットを用いて洗浄し、二次抗体溶液（0.1％トリトンX-100、1％BSAおよび5％の10mM PBS pH7.4中で希釈したNGS）のウェル当たり〜100μlで置き換えます。それぞれについて、希釈係数は、蛍光二次抗体をタグ付け、通常は1：500または1：1,000。光から蛍光タグ付き二次抗体を保護するために、ブラックボックスに48ウェルプレートを置きます。 3D回転体に室温で3時間 - 2をインキュベートします。
注：複数の二次抗体を必要とする場合は、インキュベーションのために、同じ溶液中に組み合わせることができます。 （ 例えば 、ヤギ抗ウサギおよびニワトリ抗ヤギ二次抗体を用いて）は、クロス標識の可能性がないことを確認してください - ピペットを用いて、二次抗体溶液を除去し、ウェル当たり〜500μlので10mMのpH7.4のPBSの3回の洗浄を行います。 3D回転体に室温で5分間の最低各洗浄をインキュベートします。光から保護するために、ブラックボックスに48ウェルプレートを保管してください。
- ピペットを使用して、最後のPBS洗浄を外し、Hoecのウェル当たり〜100μlの置き換え核を標識する：HST 33342（10mMのpH7.4のPBSで2000倍に希釈）。 3D回転体に室温で20分 - 15インキュベートします。光から保護するために、ブラックボックスに48ウェルプレートを保管してください。 20分以上インキュベートしないでください。
- ピペットを用いて、ヘキスト溶液を除去し、ウェル当たり〜500μlので10mMのpH7.4のPBSの3回の洗浄を行います。 3D回転体に室温で5分間の最低各洗浄をインキュベートします。光から保護するために、ブラックボックスに48ウェルプレートを保管してください。
- 必要に応じて、すべてのステップは、数時間、ヘキストインキュベーション以外は、拡張することができます。 2日後に-ちょうど10mMのPBS pH7.4のの〜500 ulの中のサンプルを沈め、プロトコル時間を再開する準備または1まで4°Cの時に48型ウェルプレート（またはチャンバースライド）を保存、いずれかの段階で反応を一時停止するには。
7.マウント蝸牛は、スライドをオンにします
- ラベルは、使用した試料と抗体に関する適切な情報を摺動します。
- ピペット取り付けメディアの〜50μlの各スライドの上にと注意してください気泡を防止します。任意の気泡を除去するために取り付けたメディアを含むチューブを遠心。
- ＃4または＃5ストレート宝石商の鉗子を使用して、ゆっくりと取り付けメディアにスライドし、場所に48ウェルプレートから1蝸牛ターンを転送するために、螺旋神経節の軸索を把握。マウントイメージングプロセス中に露光し、光退色を防止するために、スライドごとに1蝸牛ターン。
- 蝸牛ターンは、折り畳まれたねじれた、または気泡の近くにされていないことを確実にするために、ステレオ解剖顕微鏡を使用してください。これらの条件のいずれかが発生した場合は、＃4を使用するか、＃5ストレート宝石商の鉗子は、蝸牛ターンを再配置します。
- スライド上のカバーガラスの一端を置き、静かにカバーガラスの落下させるために解放します。
- 蝸牛ターンは、折り畳まれたねじれた、または気泡の近くにされていないことを確認するために、ステレオ解剖顕微鏡を使用してください。これらの条件のいずれかが発生した場合は、そっと蝸牛ターンを再配置するために、前後にカバースリップを移動します。
- 場所スライドようにスライドフォルダにそれらが平らに横たわっていました。マウントしてみましょうメディア硬化O / RTでN（DARKておきます）
- C O RTでマニキュアと店舗クリアまたは-20でシールしたカバー画像化まで。スライドは、スライドフォルダまたはスライドボックスに格納することができます。
注：スライドは、C O -20 O Cまたは -80で長期に保存することができ、蛍光は、数ヶ月のために維持されます。 - 免疫染色の手順の間に使用される二次抗体に基づく適切な波長を有する共焦点顕微鏡を用いた画像スライド。明るさとコントラストの調整は、共焦点ベンダーによって提供イメージングソフトウェアを用いて行うことができます。
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Representative Results
我々は、開発の出生後第1週の間に。の石灰化を図1に示すキー解剖の手順で、石灰化である蝸牛組織から3無傷の蝸牛ターン（頂点、ミドル、ベース）とコルチ器官を単離するための方法を提示マウス蝸牛は不完全であり、より簡単な切開方法13を使用することができます。新生児全体を使用すると、P7から蝸牛と涙とコルチ器官の細断の高齢マウスの結果と解剖法をマウントします。スパイラル靭帯/側壁は今より強固に結合しており、ダメージを与えることなく、離れ感覚上皮から剥離することはできません。このように「大人」全体マウント解剖方法は、P6より古いサンプルのために必要とされます。我々は解剖し、有毛細胞と支持細胞のマーカー（ 図2）を用いて免疫染色されたP15マウス蝸牛のミドルターンの例を提示します。光クロスセクションCまた、全体のマウント技術（ 図3）で得られたこと。
いくつかの問題が全体のマウント解剖中に発生または蝸牛をマウントするときには、スライドをオンにすることができます。スパイラル靭帯/側壁の除去時には、あまりまたは十分ではないの切断との間の狭い窓があります。外有毛細胞の最後の行に次の発生カットは、この最後の行にある有毛細胞は、様々な角度（ 図4A）でマウントすることがあります。大きすぎるカットは、コルチ（ 図4B）の器官のセクションを削除することができます。ピンセットでサンプルの取り扱いに細心の注意を取り、多くの場合、鉗子が置き忘れたコルチ器官（ 図4C）の穴があります。蝸牛ターンをマウントするときに最後に、コルチ器官は、画像（ 図4D）を不明瞭にする折り畳むことができます。
図プロトコルステップ5.1.4の後に「大人」のホールマウント解剖マウス蝸牛。（A）1.重要なステップは 、蝸牛の基底回転は、中間/頂端ターンから分離し、それでも前庭領域に結合されます。スパイラル靭帯/側壁が削除された中央のターンの完成解剖のプロトコルステップ5.3.3、ミドルターンが頂回転から分離されている。（C）は、実施例の後（B）。 拡大版を表示するには、こちらをクリックしてくださいこの図の。
中央の図2.共焦点スライス画像P15マウスから分離された電源を入れます。四20X画像は全体ミドルターンを再構築するために重ねられます。 （1,000倍希釈）（マゼンタ）、ロバ抗ウサギアレクサ488結合二次抗体と組み合わせた（200倍希釈）、有毛細胞を一次抗体VIIa因子ウサギ抗ミオシンで標識されます。 （：1,000希釈1）（緑）ロバ抗ヤギアレクサ568結合二次抗体と結合し（1：500希釈）支持細胞を、ヤギ抗Sox2の一次抗体で標識されています。ヘキスト（青）は、すべての核を標識します。画像は405、488、および555の波長のツァイスLSM 700共焦点顕微鏡を用いて撮影されました。スケールバー=100μmである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
中央の図3.光クロスセクションでは、分離されたターン 6週齢のマウスから。 （A）のトップパネルの製剤全体（下）とXZ平面（上）の光の断面をマウントします。（B）の増加倍率（A）共焦点スライス画像、十字線は削除で。 （1,000倍希釈）（マゼンタ）、ロバ抗ウサギアレクサ647結合二次抗体と組み合わせた（200倍希釈）、有毛細胞を一次抗体VIIa因子ウサギ抗ミオシンで標識されます。 （：1,000希釈1）（緑）ロバ抗ヤギアレクサ568結合二次抗体と結合し（1：500希釈）支持細胞を、ヤギ抗Sox2の一次抗体で標識されています。画像は405、555、および647の波長のツァイスLSM 700共焦点顕微鏡を用いて撮影されました。スケールバー=20μmで、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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マウント蝸牛はスライドをオンにし、図4ホールマウント解剖時に発生する可能性のある問題の例や。画像の左側（A）は 、蝸牛組織の多くを引き起こして次の外有毛細胞の最後の行にカットし、様々な角度で装着されるこれらの細胞（B）画像の左側にコルチ器官の部分が切断されている。（C）の中央に外有毛細胞領域にパンチ穴があります画像は、（D）、コルチ器官は、いくつかの場所に折り畳まれます。 8週齢のマウス蝸牛 - 画像は4から採取しました。有毛細胞は、一次抗体VIIa因子ウサギ抗ミオシンで標識され（1：200希釈）、ヤギ抗ウサギアレクサ488と組み合わせた結合二次抗体（1：1,000希釈）またはロバ抗ウサギアレクサ488結合二次抗体（1：1,000希釈）（マゼンタ）。 C外有毛セル画で（1,000希釈1）（緑）、ロバ抗ウサギアレクサ568結合二次抗体と組み合わせた（200倍希釈）LSはヤギ抗プレスチン一次抗体で標識されます。画像は、405と488、および555 nmの波長をライカSP5共焦点顕微鏡を用いて撮影しました。スケールバー：ABで= 20ミクロン; CDに= 40ミクロン。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
成功した全体のマウント解剖および免疫染色のためにいくつかの重要なステップがあります。これらの方法のいずれかが実行される前に、しかし、蝸牛組織の適切な固定が必要とされています。我々は、超純粋な遊離メタノール、EMグレードPFAを使用することをお勧めします。 PFAは、メタノールおよび免疫蛍光の品質を低下させる不安定なpH値の痕跡を持つことができる粉末から作られました。他のグループも同様の解剖ホルムアルデヒド14-16を含まない固定剤を使用して可能であることを示しました。固定の長さも重要であり、特異的な抗体です。他の人がPFAでわずか1時間（ただし、これは稀である）とうまく動作しませんがいくつかの抗体は、O / Nの固定を許容することができます。組織が崩壊してしまうよう下で固定した組織は、解剖法に問題がある可能性があります。我々の経験では3から4時間の固定が十分な固定を提供し、一般的に聴覚分野で使用される一次抗体の大半を妨げることはありません。
jove_contentは ">これは、EDTAは一次抗体に干渉する可能性もある。このようにいくつかの抗体は、新生児組織ではなく、P7または脱灰された古い組織でうまく動作します固定後、頭骨は前の時間の可変量のために保存することができますいくつかの抗原が固定後数日から数週間内の脱灰と解剖が必要です。他は（脱灰の前または後のいずれか）年間保管することができるが、抗原に応じて脱灰は、免疫染色の品質を低下させることなく、検査されている。我々は、側頭骨として保存サンプルをお勧めします原因菌や細菌と48ウェルプレートおよび潜在的な汚染からの記憶媒体（PBS）の蒸発のリスクに。私たちは通常、免疫染色に事前に全体のマウント解剖1週間以内実行します。一度固定し、脱灰し、ホールマウント切開を液体に沈め頭骨を用いて行われます。過剰な骨とソフトの削除解剖の早い段階で迷路の周囲の組織は、組織の操作を容易にし、重要な構造の少ない隠れたビューを提供して、後の段階でスパイラル靭帯/側壁の除去に役立ちます。最初のいくつかのステップを実行する場合、鉗子は前庭領域における組織を保持するために使用することができます。しかしターンが隔離されると、それはコルチまたはスパイラル靭帯/側壁の臓器に鉗子を配置しないようにすることが重要です。代わりに、鉗子を閉じておくと、シリコーンエラストマーで被覆された解剖皿にらせん神経節神経線維ピン。組織が裂けるように、この領域に保持しないでください。一般的には、一度組織が把握し、3ターンに分割されていると引っ張っ演習は、多くの場合、コルチ器官に損傷を与えると、回避する必要があり、予期しない結果を引き起こす可能性があります。若い動物（P7-P21）からの組織はP21より古い動物からの組織よりもより寛容になる傾向があります。有毛細胞dで加えて、蝸牛サンプルamageは解剖するのがより困難です。マウスは騒音曝露を受けた場合、組織は特に脆弱です。かかわらず、組織の状態の、我々が提示解剖は、技術的に厳しいですし、習熟のための多くの練習試行を必要とします。
免疫染色の間、各蝸牛ターンが上に浮いていない、液体中に浸漬またはウェルの側面に貼り付けられていることが重要です。これは、組織へのトリトンおよび抗体のより完全な浸透を可能にします。各ウェルから液体を除去する際には、蝸牛のターンを失うか、ピペットチップにそれを描くことは容易です。解剖スコープを使用して、200μlのピペットチップでソリューションを変更すると、これを防ぐことができます。ゆっくりと液体を抽出し、蝸牛ターンが近づきすぎた場合にピペットの先端を移動します。また、きれいなチューブに廃液をpipettetingする順番が誤ってピペット内に引き上げられた場合、この廃液チューブを検索することができるように良い戦略であることができます。ターンは、ピペットチップで立ち往生している場合は、トン彼は先端がかみそりの刃で切り開いすることができますが、これが発生した場合、多くの場合、コルチ器官が損傷します。
トラブルシューティングのための免疫染色抗体を、このような抗原回復または信号強調などの追加のステップを追加することができます。低pHおよび高pHの抗原購入することができますアンマスキング試薬があります。抗体は、ここで説明した方法では動作しない場合は、しようとする最初のプロトコルの変更は、これらの抗原回復法の一つです。また、シグナルエンハンサーを使用しています。二次抗体からのシグナルを増幅するために使用することができる免疫染色の前に、またはチラミド増幅キットを使用するための商業的に入手可能な解決策があります。
我々は、本技術の重要性は、コルチ器官の三次元構造を維持し、臓器内のすべての細胞を可視化する能力です。蝸牛の全体の長さはわずか3ターンに分離される他の同様の技術、すなわち第一方免疫染色およびイメージングプロセスで操縦するサンプル数を増やす、10個6-8 -電子Bohneとリーベルマンの方法は、5への分割を必要とします。コスグローブとGrattonによって開発された蝸牛側壁の解剖は、スキルの同様のレベルを必要とし、脱灰組織内だけでなく、固定されていない、新鮮な組織で可能であるが、コルチ器官を単離する過程で剥離し、破棄され側壁17。別のグループは、無傷の臓器を残し、スパイラル靭帯/側壁を把握し、離れコルチ器官から取り除かれた3週齢のラットからの未定着、新鮮な蝸牛組織で同様の解剖を行いました。しかし、これは、頂端5順番で達成されました。離れコルチ器官からスパイラル靭帯/側壁を剥離する方法は、若いマウス（<P7）13で固定された組織の解剖のためのルーチンです。しかし、固定AN後のマウスP6よりも古い、と私たちの経験ではD脱灰は、この演習では、多くの場合、信頼できないやり方でコルチ器官を涙。また、ここで説明する手順は、中間および基底の単離は、同様になりますことができます。
パラフィン包埋した後に得られる凍結切片と切片は、一般に、聴覚分野で使用されています。これらの方法は、血管条、ライスナーの膜、および被蓋膜として他の構造の可視化を可能に、まだ各セクションでは、各蝸牛順番にコルチ器官の小領域の可視化を可能にします。従って切片法により、かかる細胞の損失または細胞分裂などのモザイクパターンで発生するイベントを調査するために、50以上のスライドを染色し、蝸牛の全体の長さをキャプチャするために画像化される必要があります。これとは対照的に、全体のマウント解剖プロトコルは、わずか3バラバラにコルチ器官全体を準備するという利点があります。コルチ器官の長手アーキテクチャを維持することの利点に加えて、このTEChniqueを簡素化するデータの収集と保存を可能にします。全体マウント解剖の1つの制限は、そのようなスパイラル靭帯、血管条、ライスナーの膜、および被蓋膜などの周囲の構造を破壊することです。別の制限は、単一の切開のための技術的な難しさと時間の長さです。スパイラル靭帯/側壁を削除するときにこれは、エラーのためにコルチ器官と小さなマージンの脆弱性のために主にあります。 30分 - 一度習得一蝸牛全体マウント切開は、約20で行うことができます。
上記のプロトコルは、成体マウスのための全体のマウント解剖方法が記載されているが、我々は聴覚分野で使用される他のモデル生物にこの手法を適用したいと考えています。私たちの研究室では、現在、ラットの蝸牛の解剖のためにこの技術を変更しています。ラットの大きな蝸牛は、より密に石灰化マウスよりも厚い耳のカプセルに包まれています。したがって、側頭骨には、電子である必要があります大きなはさみでxcised。 EDTAで固定し、脱灰する前に、耳のカプセルは、蝸牛組織へのより良いアクセスを許可するようにハサミで開かれるべきです。また、脱灰工程が長くなり、サンプルの年齢に応じて3週間ほどかかる場合があります。全体のマウント解剖のために、骨迷路の大きさは、技術に影響を与えます。ラット蝸牛のサイズの増加は、個々のカットのためにエラーの大きなマージンを提供し、スパイラル靭帯/側壁とコルチ器官の間にわずかに大きい距離を提供します。しかし、より大きな組織試料の操作のために把握するより多くの材料を提供することができる一方で、それはまた、らせん靭帯/側壁の全長を除去するために、カットのより多くを必要とします。我々は、類似の修正がチンチラ、スナネズミ、およびモルモットの蝸牛の解剖のために作ることができると信じています。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | can be purchased from other vendors |
| 10.5 cm fine scissors | Fine Science Tools | 14060-11 | can be purchased from other vendors |
| 2 ml microcentrifuge tubes | MidSci | AVSS2000 | can be purchased from other vendors |
| 16% formaldehyde, methanol free, ultra pure, EM grade | Polysciences | 18814 | TOXIC --wear gloves and cannot be disposed of in the sink. Can be purchased from other vendors. |
| PBS pH 7.4 | Sigma | P3813-10PAK | can be purchased from other vendors |
| EDTA | Fisher | BP118-500 | can be purchased from other vendors |
| end-over-end tube rotator | Fisher | 05-450-127 | can be purchased from other vendors |
| 60 mm petri dish | Fisher | 50-202-037 | can be purchased from other vendors |
| Dow Corning Sylgard 184 silicone encapsulant kit | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| activated charcoal | Fisher | AC134372500 | can be purchased from other vendors |
| stereo dissection microscope | Zeiss | Stemi 2000 | can be purchased from other vendors |
| Dumont #4 jeweler's forceps | Fine Science Tools | 11241-30 | |
| Dumont #5 jeweler's forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| 2.5 mm Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15001-08 | curved |
| 5 mm Vannas-Tubingen spring scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | straight |
| 48-well plates | Fisher | 08-772-52 | can be purchased from other vendors |
| 8-well chamber slides | Fisher | 1256518 | can be purchased from other vendors |
| Triton X-100 | Sigma | X100-500 | can be purchased from other vendors |
| BSA, fraction V | Fisher | BP1605 | can be purchased from other vendors |
| NGS | Vector labs | S-1000 | can be purchased from other vendors |
| NHS | Vector labs | S-2000 | can be purchased from other vendors |
| 3D rotator | Midsci | R3D-710 | can be purchased from other vendors |
| Western blot incubation box XL | Licor | 929-97401 | |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | can be purchased from other vendors |
| Prolong gold antifade mounting media | Life Technologies | P36930 | can be purchased from other vendors,but mounting medias vary in their ability to protect against photobleaching |
| Superfrost Plus Slides | Fisher | 12-550-15 | can be purchased from other vendors |
| coverslips 22 x 22 x 1 | Fisher | 12-548-B | can be purchased from other vendors |
| clear nail polish | Local drug store | can be purchased from other vendors | |
| cardboard slide folder | Fisher | 12-587-10 | can be purchased from other vendors |
| plastic slide box | Fisher | 03-448-10 | can be purchased from other vendors |
References
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- Ehret, G., Frankenreiter, M. Quantitattive analysis of cochlear structures in the house mouse in relation to mechanisms of acoustical information processing. J Comp Physiol. 122, 65-85 (1977).
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