Summary
우리는 세 가지 그대로 인공 회전 (정점, 중,베이스)로 코르티 성인 기관을 분리하는 방법을 제시한다. 또한 형광 태그 항체 면역 염색을위한 절차를 보여준다. 함께 이들 기술은 달팽이관 검색된 유모 세포,지지 세포 및 다른 세포 유형의 연구를 허용한다.
Introduction
측두골에 포함 된 내이의 나선형 모양의 달팽이관은 코르티, 포유 동물의 청각 감각 최종 기관의 장기 주택. 달팽이관 tonotopically 편성 일반적 혀끝, 중앙으로 분할하고, 기초가 정점 1베이스와 낮은 주파수 검출에 고주파 사운드 검출과 상이한 주파수 영역들에 대응하도록 설정 한. 헤어 셀, 코르티 기관의 mechanosensory 세포는 쥐 2,3 약 6mm 길이 달팽이관의 길이를 실행합니다. 이러한 셀 구조체 중심부의 청각 신경에 의해 처리되는 신호들로, 유체 충전식 멤브레인 미로를 통해 전송되는 음파의 기계적 에너지로 변환. 여기에 설명 된 기술은 (나이 일주일로부터 성인에 이르기까지의 샘플에 대해) 달팽이관의 석회화 후 코르티 기관의 전체 마운트를 제조하는 방법이 완료 제공한다. 우리는 또한 immunosta에 대한 방법을 제시한다전체 ining 인공 조직을 설치. 인공 와우 전체 마운트는 모든 유모 세포의 시각화 및 자연 공간 배치에서 지원하는 세포를 둘러싸는 매우 중요하며, 공 초점 현미경을 사용하여 세 가지 차원에서 분석 할 수 있습니다.
박사. 한스 엥 스트롬과 할로우 아데스는 원래 그들은 빠르게 현미경 분석 4 코르티 기관의 짧은 그대로 세그먼트를 보존, 수정 및 포유 동물의 다양한 액체에 잠긴 석회화 cochleae를 해부하는 방법을 자세히 설명 1966 년 전체 마운트 인공 해부 방법을 설명했다. 고정되지 않은, 석회화 쥐 달팽이관의 해부는 교육 비디오 5에 도시되어있다. 박사. 바바라 BOHNE 워싱턴 대학의 게리 하딩은이 방법에 몇 가지 중요한 수정을했다. 인공 전체 마운트 방법의 자신의 버전에서는 시간적 뼈, 탈회했다 플라스틱에 포함, 5 반 회전, 10 분기 턴은 dissec했다테드 6,7. 그 플라스틱 삽입이 8 필요하지 그래서 찰스 박사 Liberman과 이튼 피바디 연구소, 매사추세츠 눈과 귀 의무실에서 연구팀은이 기술을 수정했습니다. 기술의 추가 수정은 여기에 제시된 해부 방법을 알려 세인트 주드 아동 연구 병원 9-12 박사 지안 주오의 실험실에서 발생했습니다. 우리는 완전한 혀끝의, 중간 및 기저 회전의 분리를 허용 BOHNE와 Liberman보다 코르티의 기관에 액세스하기 위해 다른 전략을 사용합니다. 따라서 해부 조직은 크고 해부 또는 면역 염색 과정에서 손실되거나 손상 될 가능성이 적습니다. 또한, 현재의 방법은 팁 선단 또는 주파수 영역을 식별하는 기저 후크로부터의 거리 측정을 용이하게한다.
많은 연구소가 인공 조직의 면역 염색을 수행하지만이 방법이 발생한 위치, 그것은 명확하지 않다. 그 결과 buffe을 차단하기위한 다양한 조리법이있다RS 및 개별 일차 항체의 성능에 영향을 미칠 수있다 항체 인큐베이션 버퍼. 여기서는 청각 분야에서 가장 일반적으로 사용되는 항체에도 적용 가능하다 형광 태그 항체로 면역 염색을위한 하나의 방법을 제시한다.
달팽이관의 복잡한 모양, 코르티 기관의 섬세한 구조 및 뼈에 넣음은 조직 학적 및 생화학 적 분석을위한 도전을 제공합니다. 다양한 기술이 현재 어려운 특징을 극복하고 코르티 자체 장단점 각 기술의 장기 내에서 세포를 시각화하기 위해 청각 분야에서 사용된다. 여기에 제시된 프로토콜은 약간의 수정과, 잠재적으로 다른 분야에서 사용되는 모델이 다양한 유기체로부터 cochleae 내의 중요한 구조를 검사하는 데 사용될 수 있으며, 성인 마우스 달팽이관의 전체 마운트 박리 가능하고.
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Protocol
윤리 문 : 동물 주제와 관련된 절차는 의학의 서던 일리노이 대학에서 기관 애니멀 케어 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.
시간적 뼈 1. 추출
- 마우스 두개골 (13)의베이스에 시간적 뼈를 확인하고 표준 패턴 집게를 사용하여 두개골 신경을 멀리 쳤어요.
- 캡슐화 된 달팽이관을 제거하기 위해 귀의 캡슐의 끝에서 아래로 후부 반원의 운하에 반대 손으로 언론의 엄지 손가락으로 표준 패턴 집게를 놓습니다.
- 수동으로 엄지와 검지 손가락으로 또는 10.5 cm 미세 가위를 사용하여 두개골에서 시간적 뼈의 아래쪽 절반을 무료로 제공됩니다.
2. 임시 뼈를 포스트 - 수정
- 10 mM의 인산 완충 식염수에 희석 500 μL 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA) (PBS)의 pH 7.4와 incub - (250)를 포함하는 2 ml의 마이크로 원심 튜브에 시간적 뼈를 배치20 시간 - 2 RT에서 먹었다.
참고 : 원형 또는 타원형 창에 PFA의 정점 캡 또는 주입의 어떠한 개구가 필요하지 않습니다. 유리 병에 16 % 농도에서 구입할 수 있습니다 메탄올 무료, 초순수, 전자 현미경 (EM) 등급 PFA를 사용하는 것이 좋습니다. 유리 병은 개방 한 희석되면 : 4 % 용액을, PBS로 4 (일부 항체가 허용 할 수있는 짧은 정착 등을 필요로 4 ℃로 저장 될 때, 그것은 최대 2 주 동안 사용할 수있는 O / N (O / N) 고정).
3. 석회 시간적 뼈
- 고정 후, 피펫을 사용하여 PFA를 제거하고 120 mM의 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA), 약간 이상 2 ㎖로 대체합니다. 튜브를 닫을 때 공기가 거품 방지하기 위해 전체 2 ML의 microcentrifuge 관을 채우기해야합니다.
- 바로 decalcifying하지 않는 경우, 4 O ℃에서 10 mM의 PBS 산도 7.4 저장 샘플 PFA 교체
참고 : 고정 후, 시간적 뼈가 variab 저장할 수 있습니다제작 : 항원에 따라 탈회가 조사되기 전에 시간의 양.
- 바로 decalcifying하지 않는 경우, 4 O ℃에서 10 mM의 PBS 산도 7.4 저장 샘플 PFA 교체
- 엔드 오버 엔드 회전에 장소 튜브 및 실온에서 4 rpm으로 회전. 피펫을 사용하여 매일 EDTA 솔루션을 변경합니다. 탈회의 길이는 시료의 나이와 절개를하고있는 과학자의 취향에 따라 달라집니다.
- 배양 시간에 대한 다음 지침을 사용하여 EDTA에 시간적 뼈를 품어 :
8 P15에 샘플 출생 후 하루 (P)의 경우 : 2-4 시간; P21에 샘플 P15의 경우 : O / N; P30에 샘플 P21의 경우 : 2 O / N; 3 개 이상의 O / N : P30보다 오래된 샘플하십시오.
참고 : 탈회 시간은 사용자의 환경에 제한이있을 수 있으며, 필요에 따라 확장 할 수 있습니다. 탈회 시간은 약 8 시간 간격, 하루 두번 EDTA 용액을 변화시킴으로써 감소 될 수있다. 오염을 방지하기 위해 이상 3 일간 decalcifying 때 일부 연구소는 EDTA 용액에 1 % PFA를 추가합니다.
- 배양 시간에 대한 다음 지침을 사용하여 EDTA에 시간적 뼈를 품어 :
- 시료가 적절하게 탈회하는 경우 O 시간적 뼈를 배치, 확인하려면NA 실리콘 해부 접시를 엘라스토머 코팅 부드럽게 달팽이 모양의 달팽이관에 집게를 누릅니다. 조직 spongey이면 탈회가 완료되었습니다.
- 탈회가 완료되면, 피펫을 사용하여 EDTA를 제거하고 10 mM의 PBS 산도 7.4의 500 -1,000 μl를 추가합니다. 준비까지 4 O C에서 보관 샘플을 해부합니다.
4. 실리콘 엘라스토머 코팅 해부 접시 만들기
- 베이스와 제조자의 지시에 따라 실리콘 엘라스토머 밀봉 키트 경화제 수확기 철저히 혼합한다.
- 이 솔루션은 검은 색이 될 때까지 가루 숯 3 큰술과 잘 혼합 - 약 2를 추가합니다.
주 : 습식 잉크 또는 액체 숯 용액과 혼합되지 않고 사용할 수 없다. 실리콘 엘라스토머 밀봉 키트는 4.2 단계를 생략 할 수 있도록, 검정에서 구입할 수있다. - 코트에 충분히 바닥을 작성, 60mm 유리 또는 플라스틱 배양 접시에 솔루션을 붓는다. BU 경우bbles이 존재하는 표면에 공기 퍼프. 설정 실온에서 최소 24 시간을 서 보자.
주 : 실리콘 엘라스토머 코팅 접시 년간 반복 사용할 수있다. 이 실리콘 엘라스토머는 균열의 원인이됩니다 그러나, 청소를 위해 에탄올을 사용하지 마십시오.
(P7과 이전 샘플) 달팽이관 5. 전체 마운트 해부
- 중간 / 혀끝의 회전에서 기저 회전을 분리
- 10 mM의 PBS pH를 7.4으로 3 분의 2 가득 채워진 실리콘 엘라스토머 코팅 해부 접시에 한 탈회 측두골을 놓고 다음 단계에 대한 스테레오 해부 현미경을 사용합니다.
- # 4, # 5 연속 보석상의 집게를하고 5mm Vannas-튀빙겐 스프링 가위를 이용하여 전정 지역에서 측두골을 잡고, 측면을 따라 꼭대기 위에 여분의 귀 캡슐 조직을 절단.
- 2.5 mm의 Vannas 스프링 가위를 사용하여 타원형 창에 하나의 블레이드를 삽입하고 나선 인대 / 측면을 따라 여러 개의 작은 상처를 만들기초 차례의 벽.
- 5mm Vannas-튀빙겐 스프링 가위를 사용하여, 그냥 잘라 영역에 하나의 블레이드를 삽입하고 측두골 외부의 다른 블레이드를 배치, 타원형 창으로 내측. 이 컷은 중간과 혀끝의 회전에서 기저 회전을 분리한다.
- 기초 차례의 전체 해부.
- 2.5 mm의 Vannas 스프링 가위를 사용하여, 기초 차례로 긴장을 풀고 전정 기관에서 별도의 기저 차례 이하로 잘라 modiolus에 연결 나선 신경절 신경 섬유를 잘라.
- 2.5 mm의 Vannas 스프링 가위를 사용하여, 코르티 기관 위와 아래 모두에서 나선 인대 / 측면 벽을 제거하기 위해 작은 상처의 시리즈를 확인합니다. 조직을 안내하는 # 4, # 5 연속 보석상의 집게를 사용합니다. 실리콘 엘라스토머 코팅 해부 접시에 나선 신경절 신경 섬유를 핀하지만 조직이 눈물로이 지역에 보유하지 않습니다.
- 이전 단계, Reissner의 membran의 일부 중전자는 종종 제거됩니다. 어떤이 여전히 남아있는 경우, # 4, # 5 직선 보석의 집게와 Reissner의 멤브레인을 파악하고 코르티 기관에서 멀리 당기십시오.
참고 : tectorial 멤브레인은 거의 볼 수 있고 일반적으로 제거를위한 특정 단계를 필요로하지 않고 멀리 수레. - 마지막에, 가능한 한 평면 회전을하고 나선 신경절의 나머지 축삭을 잡고, 해부 기저 차례 전송 # 4 또는 # 5 직선 보석의 집게를 사용하여, 나선 신경절 축삭의 두께를 감소시키기 위해 여러 컷을 만드는 48 웰 플레이트 (또는 챔버 슬라이드) 10 mM의 PBS pH가 7.4 ~ 500 μl를 포함.
- 별도의 중간과 혀끝의 회전
- 달팽이관, 아래로 정점 측의 나머지 3 분의 2를 놓습니다.
- 2.5 mm의 Vannas 스프링 가위를 사용하여, 사용 중간 차례 기초 차례에 연결되는 스칼라 매체에 하나의 블레이드를 삽입하고 일의 나선 인대 / 측면 벽을 따라 여러 개의 작은 상처를 만들전자 중앙의 전원을 켭니다.
- 5mm Vannas-튀빙겐 스프링 가위를 사용하여, 바로 블레이드의 상단에 배치 된 중간 차례 절단 영역에 하나의 블레이드를 삽입하고 혀끝의 끝에서 90 오 각도, 뼈 미로 외부에 다른 블레이드를 배치합니다. 이 혀끝의 차례에서 중간 차례를 분리한다.
- 기초 차례 유사한 방식으로 중간 차례의 전체 해부 (5.2.4 단계 5.2.2 참조).
- 혀끝의 차례의 전체 해부.
- 2.5 mm의 Vannas 스프링 가위를 사용하여, 혀끝의 회전을 커버 뚜껑을 엽니 다. 기초 차례 유사한 방식으로 완전 해부 (5.2.4 단계 5.2.2 참조).
주 : 해부 달팽이관 회전은 면역 염색 전에 몇 주 동안 4 O C에서 48 웰 플레이트 (또는 챔버 슬라이드)에 10 mM의 pH 7.4의 PBS에 저장 될 수있다. 에 세균이나 곰팡이의 성장을 초래할 수 3 주 - 그러나 PBS는 더 이상 2보다 증발 주기적으로 보충 할 필요가 및 저장합니다화상의 품질을 감소시킬 수있다 조직. 우리 undissected 시간적 뼈 같은 샘플 장기간 저장을 추천한다.
- 2.5 mm의 Vannas 스프링 가위를 사용하여, 혀끝의 회전을 커버 뚜껑을 엽니 다. 기초 차례 유사한 방식으로 완전 해부 (5.2.4 단계 5.2.2 참조).
찬란 태그 항체 6. 면역 염색
- 절개 한 후, 10 mM의 PBS pH를 7.4 ~ 500 μL에 잠긴 48 웰 플레이트 (또는 챔버 슬라이드)에 별도의 잘 각각의 인공 차례를 저장합니다. 다음 각 단계를 들어 인공 차례, 액체에 잠긴한다 위에 떠 있지 않거나 잘의 측면에 붙어.
참고 : 물론 각에서 액체를 제거 할 때, 그것은 인공 회전을 잃거나 피펫 팁에서 그것을 빨아 쉽다. 해부 범위를 사용하여 200 μL 피펫 팁과 솔루션을 변경하면이 문제를 방지하는 데 도움이됩니다. - 피펫을 사용하여, 각 웰로부터 PBS를 제거하고 교체 ~ 200 - / 차단 투과성으로 용액 (웰당 300 ㎕의 1 % 트리톤 X-100, 1 % 소 혈청 알부민 (BSA), 및 10 % 정상 염소 혈청 (NGS) 10 mM의 PBS 피에 희석H 7.4). 3D 회전에 실온에서 1 시간을 품어.
주 : 사용 된 일차 항체가 염소 숙주에서 만들어진 경우, 보조 항 - 염소 항체를 필요로 할 것이며, NGS는 어떤 단계에 사용되어서는 안된다. 정상 말 혈청 NGS위한 대체로서 사용할 수있다. - 피펫을 사용하여 차단 / 투과성으로 솔루션을 제거하고 차 항체 용액을 잘 당 ~ 100 μL로 교체 (0.1 % 트리톤 X-100, 10 mM의 PBS의 pH 7.4에 희석 1 % BSA, 5 % NGS). 각각의 일차 항체의 희석 배수는 다릅니다. 3D 회전에서 4 ℃로 O / N (최소 14 시간)을 품어.
주 : 하나 이상의 차 항체가 사용되는 경우, 모든 단지 각 차 항체가 다른 호스트를 가지고 있는지 확인 인큐베이션 동일한 용액에 결합 될 수있다. - 피펫을 사용하여 일차 항체 솔루션을 제거하고 잘 당 ~ 500 μL에서 10 mM의 PBS 산도 7.4의 3 세척을 수행합니다. 각 세척 3D 회전기에 RT에서 5 분의 최소 잠복.
- 마지막으로 P를 제거BS는 피펫을 사용하여 이차 항체 용액을 웰 당 100 μL ~와 교체 워시 (0.1 % 트리톤 X-100, 10 mM의 pH 7.4의 PBS로 희석하고, 1 % BSA, 5 % NGS). 500 또는 1 : 1,000 각 희석 배수는 형광 이차 항체는 일반적으로 1 태그. 찬란 보호 빛 차 항체를 태그하기 위해 블랙 박스에 48 웰 플레이트를 놓습니다. 3D 회전에 실온에서 3 시간 - 2를 품어.
주 : 둘 이상의 이차 항체가 필요한 경우, 그들은 동일한 배양 용 용액에 결합 될 수있다. 크로스 라벨의 가능성이없는 것을 확인합니다 (예., 염소 항 - 토끼와 닭고기 방지 염소 이차 항체 사용) - 피펫을 사용하여 이차 항체 솔루션을 제거하고 잘 당 ~ 500 μL에서 10 mM의 PBS 산도 7.4의 3 세척을 수행합니다. 3D 회전에 실온에서 5 분의 최소 각 세척을 품어. 빛으로부터 보호하기 위해 블랙 박스에 48 웰 플레이트를 유지합니다.
- 피펫을 사용하여 마지막 PBS 세척을 제거하고 Hoec 잘 당 ~ 100 μL로 교체핵을 레이블 : HST 33342 (10 mM의 PBS pH를 7.4에서 2000 1 희석). 3D 회전에 실온에서 20 분 - 15 품어. 빛으로부터 보호하기 위해 블랙 박스에 48 웰 플레이트를 유지합니다. 이상 20 분 부화하지 마십시오.
- 피펫을 사용하여 훽스트 (Hoechst) 솔루션을 제거하고 잘 당 ~ 500 μL에서 10 mM의 PBS 산도 7.4의 3 세척을 수행합니다. 3D 회전에 실온에서 5 분의 최소 각 세척을 품어. 빛으로부터 보호하기 위해 블랙 박스에 48 웰 플레이트를 유지합니다.
- 필요한 경우 모든 단계는 몇 시간, 훽스트 배양을 제외하고, 확장 할 수 있습니다. 모든 단계에서의 반응을 일시 중지하려면 단지 10 mM이 PBS pH 7.4로의 ~ 500 UL의 샘플 잠수함 및 프로토콜 시간 1 재개 할 준비가 될 때까지 4 ℃로 48 - 글쎄 플레이트 (또는 챔버 슬라이드)를 저장 - 2 일 이상 .
7. 산 달팽이는 슬라이드를 켭니다
- 라벨에 사용되는 샘플과 항체에 대한 관련 정보를 슬라이드.
- 피펫 설치 미디어의 ~ 50 μL를 각 슬라이드에 및주의거품을 방지한다. 임의의 기포를 제거하기 위해 설치 미디어를 포함하는 튜브를 원심 분리기.
- # 4, # 5 연속 보석상의 집게를 사용하여 부드럽게 장착 매체에 슬라이드와 장소에 48 웰 플레이트에서 하나의 인공 차례를 전송하기 위해 나선 신경절의 축삭을 파악. 슬라이드 당 장착 한 인공 차례 이미징 과정에서 빛 노출과 광표백을 방지합니다.
- 인공 차례, 접힌 트위스트, 또는 기포 근처되지 않도록 스테레오 해부 현미경을 사용합니다. 이러한 상황이 발생하면, 사용 # 4, # 5 직선 보석의 집게는 인공 차례의 위치를 변경합니다.
- 슬라이드 커버 슬립의 한쪽 끝을 놓고 부드럽게 coverslip에 가을 있도록 놓습니다.
- 인공 차례, 접힌 트위스트, 또는 기포 근처되지 않도록 스테레오 해부 현미경을 사용합니다. 이러한 상황이 발생하면, 부드럽게 인공 차례의 위치를 앞뒤로 coverslip에 이동합니다.
- 장소 슬라이드그래서 슬라이드 폴더에 그들은 평면 배치. 설치하자 미디어 경화 O / RT에서 N (어둠 속에서 계속)
- 명확한 매니큐어 및 저장 실온에서 또는 -20 O를 C와 인감 된 커버가 될 때까지 몇 군데. 슬라이드는 슬라이드 폴더 또는 슬라이드 박스에 저장 될 수있다.
참고 : 슬라이드 -20 O를 C 또는 -80 O C와 형광에서 장기 저장 될 수는 몇 달 동안 유지됩니다. - 면역 염색 과정 중에 사용되는 이차 항체에 따라 적절한 파장의 공 초점 현미경을 사용하여 화상 슬라이드. 명도 및 콘트라스트 조정 촛점 벤더에 의해 제공된 이미지 소프트웨어를 이용하여 수행 될 수있다.
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Representative Results
우리는 세 가지 그대로 인공 회전 (정점, 중,베이스) 그림 1에 제시된 키 해부 단계, 석회화이다 인공 조직에서 같이 코르티 기관을 분리하는 방법을 제시한다. 개발의 첫 번째 출생 후 주의 석회화 중 마우스 달팽이관이 불완전하고 더 간단한 박리 법 (13)을 사용할 수있다. 코르티 기관의 P7에서 달팽이관과 눈물의 오래된 마우스 결과와 분쇄와 신생아 전체 마운트 해부 방법을 사용. 나선형 인대 / 측벽은 이제 더 단단히 부착되고 손상을 초래하지 않고 얻어 감각 상피로부터 박리 될 수 없다. 따라서 "성인"전체 마운트 해부 방법은 P6보다 오래된 샘플이 필요하다. 우리는 해부 헤어 셀 및 지원 세포 마커 (그림 2)와 면역 염색 된 P15 마우스 와우의 중간 차례의 예를 제시한다. 광 단면의 C또한, 전체의 실장 기술 (도 3)로 취득 될 수있다.
몇 가지 문제는 전체 마운트 해부 동안 발생 또는 인공 와우를 장착 할 때하면 슬라이드에 전환 할 수 있습니다. 나선형 인대 / 측벽의 제거시, 또는 너무 충분하지를 절단 간의 좁은 윈도우있다. 외부 유모 세포의 마지막 행 다음에 발생 인하는 다양한 각도 (그림 4A)에 장착이 마지막 행의 유모 세포의 원인이 될 수 있습니다. 너무 큰 인하는 코르티 (그림 4B)의 기관의 섹션을 제거 할 수 있습니다. 집게로 샘플을 취급 큰 관심을 받아 자주 집게가 잘못되었다 코르티 기관 (그림 4C)에 구멍이있다. 인공 회전을 장착 할 때 마지막으로, 코르티 기관은 이미지 (그림 4D)을 모호하게하는 접을 수 있습니다.
그림 프로토콜 단계 5.1.4 후 "성인"의 전체 마운트 해부 마우스 달팽이관. () 1. 중요한 단계는 달팽이관의 기저 차례는 중간 / 혀끝의 회전 분리, 아직 여전히 전정 부위에 부착되어 있습니다. 프로토콜 단계 5.3.3가, 중간 차례가 혀끝의 차례에서 분리 한 후 (B). 나선 인대 / 측면 벽이 제거 중간 차례의 완성 된 해부의 (C) 예. 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오 이 그림의.
중동의 2. 공 촛점 슬라이스 이미지 그림P15 마우스에서 고립십시오. 네 개의 20 배 이미지는 전체 중앙 차례를 재구성 중첩된다. (1,000 희석 1) (마젠타) 당나귀 항 - 토끼 알렉사 488 - 복합 이차 항체와 결합 : (200 희석 1) 머리 세포는 일차 항체 VIIA 토끼 반 마이 오신으로 표시됩니다. (1,000 희석 1) (녹색) 당나귀 방지 염소 알렉사 568 - 복합 이차 항체와 결합 : (500 희석 1) 지원 세포는 염소 항 - Sox2이 차 항체로 표시되어 있습니다. 훽스트 (파란색) 모든 핵 레이블. 이미지는 405, 488, 및 555 파장 자이스 혈구 LSM 700 공 초점 현미경을 사용 하였다. 스케일 바 = 100 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
중동의 그림 3. 광 크로스 섹션 고립십시오 6 주령의 마우스에서. (A) XZ 평면 (위)의 전체 산 제제 (하부) 및 광 단면의 공 초점 슬라이스 화상. (B) (A)에서 상부 패널의 배율을 증가 제거 십자선. (1,000 희석 1) (마젠타) 당나귀 항 - 토끼 알렉사 647 - 복합 이차 항체와 결합 : (200 희석 1) 머리 세포는 일차 항체 VIIA 토끼 반 마이 오신으로 표시됩니다. (1,000 희석 1) (녹색) 당나귀 방지 염소 알렉사 568 - 복합 이차 항체와 결합 : (500 희석 1) 지원 세포는 염소 항 - Sox2이 차 항체로 표시되어 있습니다. 이미지는 405, 555, 및 647 파장 자이스 혈구 LSM 700 공 초점 현미경을 사용 하였다. 스케일 바 = 20 μm의 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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전체 마운트 해부하는 동안 발생 또는 인공 와우를 장착 할 때하는 슬라이드를 켤 수도 문제 4. 예. () 이미지의 왼쪽 측면은, 인공 조직은 여러 원인이 다음 외부 유모 세포의 마지막 행에 절단 이들 세포는 다양한 각도로 장착 될 수있다. (B) 화상의 좌측 코르티 기관의 부분이 차단되었다. (C)은 중앙에 외부 머리 셀 영역에 펀치 구멍이있다 이미지. (D), 코르티 기관은 여러 곳에서 접혀. 8 주령의 마우스 cochleae - 이미지는 4에서 촬영되었다. 유모 세포가 차 항체 VIIA 토끼 반 마이 오신으로 표시된다 (1 : 200 희석) 염소 항 - 토끼와 함께 알렉사 488 - 복합 이차 항체 (1 : 1000 희석) 또는 당나귀 항 - 토끼 알렉사 488 - 복합 이차 항체 (1 : 1000 희석) (마젠타). C 외부 머리 CEL에서(1,000 희석 1) (녹색) 당나귀 항 - 토끼 알렉사 568 - 복합 이차 항체와 결합 : (200 희석 1) LS는 염소 항 - prestin 차 항체로 표시되어 있습니다. 이미지는, 405 488, 555 nm의 파장을 라이카 SP5 공 초점 현미경을 사용하여 촬영 하였다. 스케일 바 : AB에 = 20 μm의; CD에 = 40 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
성공적인 전체 마운트 해부 및 면역 염색에 대한 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 이러한 방법 중 하나를 수행하지만 전에, 인공 조직의 적절한 고정이 필요하다. 우리는 메탄올 무료, 초순수, EM 등급 PFA를 사용하는 것이 좋습니다. PFA는 메탄올과 면역의 품질을 감소 불안정의 pH의 흔적을 가질 수 분말했다. 다른 그룹은 유사한 해부 포름 알데히드 14-16를 포함하지 않는 수 사용하여 고정 제는 것을 보여 주었다. 고정의 길이도 중요 항체 다릅니다. 다른 사람들이 PFA 단지 1 시간 잘 작동하지 않는 동안 일부 항체 (그러나이 드문), O / N 고정을 허용 할 수 있습니다. 조직이 떨어져 떨어지는에서 고정 조직은 절개 방법에 대한 문제가 될 수 있습니다. 우리의 경험에서 3-4 시간 고정 적절한 고정을 제공하며, 일반적으로 청각 분야에서 사용되는 일차 항체의 대부분을 방해하지 않습니다.
"jove_content> 그것은 EDTA 차 항체를 방해 할 수있는 것이 가능하다. 따라서 일부 항체가 신생아 조직에서 잘 작동하지만 P7 또는 고정 후 탈회 된 오래된 조직 것, 시간적 뼈는 시간의 다양한 양 전에 저장할 수 있습니다 일부 항원 고정 후 주 일 이내에 탈회와 절개가 필요합니다. 다른 사람이 (탈회 전후 중) 년 동안 저장 될 수 있지만 항원에 따라 탈회가 면역 염색의 품질을 저하시키지 않고, 검사를 받고. 우리는 시간적 뼈로 저장하는 샘플 추천 때문에 곰팡이 나 박테리아로 48 웰 플레이트 및 잠재적 인 오염 저장 매체 (PBS)의 증발의 위험에. 우리는 일반적으로 면역 염색에 사전에 전체 마운트 해부 이하 일주보다 수행합니다.일단 고정 탈회, 전체 마운트 해부 액체에 잠긴 측두골 수행됩니다. 과도한 뼈와 부드러운 제거해부 초기 미로 주변 조직은 조직의 조작을 용이하게하고 중요한 구조 덜 모호한 관점을 제공함으로써 이후 단계에서 나선형 인대 / 측벽의 제거에 도움이된다. 먼저 몇 가지 단계를 수행 할 때, 집게 전정 부위에 조직을 유지하기 위해 사용될 수있다. 그러나 회전이 고립되면, 그것은 코르티 나 나선 인대 / 측면 벽의 기관에 집게를 배치하지 않도록하는 것이 중요하다. 대신, 집게가 폐쇄 유지하고 실리콘 엘라스토머 코팅 해부 접시에 나선 신경절 신경 섬유를 고정. 조직이 눈물로이 지역에 주저하지 마세요. 일반적으로, 한 번 조직을 파악, 세 개의 회전으로 구분되었으며, 당기 기동들은 코르티 기관에 손상을하고 피해야한다 예기치 않은 결과가 발생할 수 있습니다. 어린 동물 (P7-P21)에서 조직은 P21보다 나이가 동물의 조직보다 더 관대 한 경향이있다. 머리 셀 D와 또, 인공 샘플해부하기 어려운 amage 있습니다. 마우스가 소음 노출을받은 경우 조직은 특히 취약하다. 에 관계없이 조직의 상태, 우리가 제시 해부 기술적 요구하고 능력에 대한 많은 연습 시도가 필요합니다.
면역시, 각 인공 턴 위에 떠 있지 액체 내에 담그어 또는 웰의 측면에 부착되는 것이 중요하다. 이 조직에 트리톤과 항체의보다 완전한 침투를 할 수 있습니다. 물론 각각의 액체를 제거 할 때, 그것은 인공 회전을 잃거나 피펫 팁으로 그것을 작성하기 쉽습니다. 해부 범위를 사용하여 200 μL 피펫 팁과 솔루션을 변경하면이 문제를 방지하는 데 도움이됩니다. 천천히 액체를 추출하고 인공 차례 너무 가까이 얻는 경우에 피펫 팁을 이동합니다. 또한 깨끗한 튜브에 폐액을 pipetteting 것은 차례 실수 피펫으로 작성되는 경우이 폐기물 튜브를 검색 할 수있는 좋은 전략이 될 수 있습니다. 턴은 피펫 팁, T에 갇혀 경우그 팁 면도날 절개 될 수 있지만, 이러한 경우 종종 코르티 기관이 손상 될 것이다.
고장 처리에 대한 면역 항체, 항원 또는 검색 신호 향상과 같은 추가 단계가 추가 될 수있는 경우. 낮은 pH 및 높은 pH 항원 구입하실 수 있습니다 마스크 해제 시약이 있습니다. 항체는 여기에 설명 된 방법으로 작동하지 않는 경우, 시도하는 최초의 프로토콜의 변화는 이러한 항원 검색 방법 중 하나입니다. 대안 적으로, 신호 인핸서를 사용한다. 이차 항체로부터의 신호를 증폭하기 위해 사용될 수있다 면역 염색하기 전 또는 tyramide 증폭 키트를 사용하는 시판의 솔루션이있다.
우리가 제공하는 기술의 중요성은 코르티 기관의 입체 구조를 유지하고 기관 내 모든 세포를 시각화 할 수있는 능력이다. 달팽이관의 전체 길이는 세 개의 교대로 분리되어 다른 유사한 기술들, 즉 일 동안면역 염색 및 이미징 프로세스에서 기동하는 샘플 수를 증대 10 개 6-8 - E BOHNE 및 Liberman 방법, (5)에 분열을 필요로한다. 코스 그 로브 및 그라 톤 개발 한 인공 측벽 해부 스킬의 유사한 수준을 요구하고 탈회 조직뿐만 아니라, 미 정착, 신선한 조직에서 가능하지만, 코르티 기관은 분리 과정에서 멀리 벗겨 소멸 측벽 (17). 또 다른 그룹은 그대로 장기를 떠나, 나선 인대 / 측면 벽 파악 멀리 코르티 기관에서 제거된다 3 주 오래 된 쥐에서 고정되지 않은, 신선한 인공 조직에 유사한 해부를 수행하고있다. 그러나 이것은 단지 혀끝의 차례 5에 달성되었다. 멀리 코르티 기관에서 나선 인대 / 측면 벽을 박리 방법은 젊은 마우스 (<P7) (13)에 고정 된 조직의 해부에 대한 루틴입니다. 그러나 고정 후 마우스 P6보다 나이와 경험에D 탈회,이 책략은 종종 신뢰할 수없는 방식으로 코르티 기관 눈물. 또한 여기에서 설명하는 절차는 중간 및 기초의 분리뿐만 아니라 회전 할 수 있습니다.
파라핀 삽입 후의 저온부 및 섹션은 또한 일반적으로 청각 분야에서 사용된다. 이러한 방법은 맥리의 vascularis, Reissner의 막과 tectorial 막으로 다른 구조의 시각화를 허용, 아직 각 섹션은 각각의 인공 차례로 코르티 기관의 작은 영역을 시각화 할 수 있습니다. 따라서 단면의 방법으로 휴대 손실 또는 세포 분열로 모자이크 패턴에서 발생하는 이벤트를, 조사, 50 개 이상의 슬라이드를 염색 달팽이관의 전체 길이를 캡처 이미지를 만들 필요가있다. 대조적으로, 전체 마운트 박리 프로토콜은 세 조각 코르티 기관 전체를 제조하는 장점을 갖는다. 코르티 기관의 길이 아키텍처를 보존,이 절반의 이익에 추가hnique는 단순화 된 데이터 수집 및 저장이 가능합니다. 전체 마운트 해부 하나의 한계는 이러한 나선 인대, 맥리의 vascularis, Reissner의 막과 tectorial 막으로 구조를 둘러싼 파괴한다는 것이다. 또 다른 제한은 하나의 해부에 대한 기술적 인 어려움과 시간의 길이입니다. 나선 인대 / 측면 벽을 제거 할 때이 오류로 인해의 코르티 기관과 작은 여백의 깨지기 쉬운 특성으로 대부분입니다. 30 분 - 한번 마스터 번 달팽이관의 전체 마운트 박리는 약 20에서 수행 될 수있다.
위의 프로토콜은 성인 마우스 전체 마운트 해부 방법을 설명하는 동안, 우리는 청각 분야에서 사용되는 다른 모델 생물에이 기술을 적용 할 수 있기를 바랍니다. 우리 연구실은 현재 쥐 달팽이관의 해부에 대한이 기술을 수정하는 것입니다. 쥐의 큰 달팽이관은 더 조밀하게 마우스보다 석회화 된 두꺼운 귀 캡슐에 싸여있다. 따라서 시간적 뼈 전자해야큰 가위로 xcised. EDTA와 고정 및 탈회하기 전에 귀 캡슐은 인공 조직에 더 잘 접근 할 수 있도록 가위로 열 수 있습니다. 또한 탈회 과정은 이상과 샘플의 나이에 따라 3 주까지 걸릴 수 있습니다. 전체 마운트 박리를 들어, 뼈 미로의 크기는 그 기술에 영향을 미친다. 쥐 달팽이관의 증가 크기는 개인 인하 오류의 더 큰 마진을 제공 나선 인대 / 측벽과 코르티 기관 사이에 약간 큰 거리를 제공한다. 그러나, 더 큰 조직 표본의 조작에 더욱 파악하기 재료를 제공 할 수 있지만, 또한 나선 인대 / 측벽의 전체 길이를 제거하기 위해 절단의 더 많은 수를 필요로한다. 우리는 유사한 수정 친칠라, 햄스터, 기니 돼지에서 달팽이관의 해부를 위해 만들어 질 수 있다고 생각합니다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | can be purchased from other vendors |
| 10.5 cm fine scissors | Fine Science Tools | 14060-11 | can be purchased from other vendors |
| 2 ml microcentrifuge tubes | MidSci | AVSS2000 | can be purchased from other vendors |
| 16% formaldehyde, methanol free, ultra pure, EM grade | Polysciences | 18814 | TOXIC --wear gloves and cannot be disposed of in the sink. Can be purchased from other vendors. |
| PBS pH 7.4 | Sigma | P3813-10PAK | can be purchased from other vendors |
| EDTA | Fisher | BP118-500 | can be purchased from other vendors |
| end-over-end tube rotator | Fisher | 05-450-127 | can be purchased from other vendors |
| 60 mm petri dish | Fisher | 50-202-037 | can be purchased from other vendors |
| Dow Corning Sylgard 184 silicone encapsulant kit | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| activated charcoal | Fisher | AC134372500 | can be purchased from other vendors |
| stereo dissection microscope | Zeiss | Stemi 2000 | can be purchased from other vendors |
| Dumont #4 jeweler's forceps | Fine Science Tools | 11241-30 | |
| Dumont #5 jeweler's forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| 2.5 mm Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15001-08 | curved |
| 5 mm Vannas-Tubingen spring scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | straight |
| 48-well plates | Fisher | 08-772-52 | can be purchased from other vendors |
| 8-well chamber slides | Fisher | 1256518 | can be purchased from other vendors |
| Triton X-100 | Sigma | X100-500 | can be purchased from other vendors |
| BSA, fraction V | Fisher | BP1605 | can be purchased from other vendors |
| NGS | Vector labs | S-1000 | can be purchased from other vendors |
| NHS | Vector labs | S-2000 | can be purchased from other vendors |
| 3D rotator | Midsci | R3D-710 | can be purchased from other vendors |
| Western blot incubation box XL | Licor | 929-97401 | |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | can be purchased from other vendors |
| Prolong gold antifade mounting media | Life Technologies | P36930 | can be purchased from other vendors,but mounting medias vary in their ability to protect against photobleaching |
| Superfrost Plus Slides | Fisher | 12-550-15 | can be purchased from other vendors |
| coverslips 22 x 22 x 1 | Fisher | 12-548-B | can be purchased from other vendors |
| clear nail polish | Local drug store | can be purchased from other vendors | |
| cardboard slide folder | Fisher | 12-587-10 | can be purchased from other vendors |
| plastic slide box | Fisher | 03-448-10 | can be purchased from other vendors |
References
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