Summary
Nós apresentamos um método para isolar o órgão de Corti adulto como três voltas intactas cocleares (Apex, médio e base). Nós também demonstrar um procedimento para a imunocoloração com anticorpos marcados por fluorescência. Em conjunto estas técnicas permitem o estudo de células ciliadas, células de suporte, e outros tipos de células encontradas na cóclea.
Introduction
A cóclea em forma de espiral do ouvido interno, contida dentro do osso temporal, abriga o órgão de Corti, o órgão auditivo final sensorial em mamíferos. A cóclea é tonotopically organizado e comumente dividido em apical, médio e basal voltas correspondente a regiões de frequência diferentes, com a detecção de som de alta freqüência na base e detecção de baixa frequência no ápice 1. As células ciliadas, as células mecanosensorial do órgão de Corti, executar o comprimento da cóclea, que é de aproximadamente 6 mm de comprimento de ratos 2,3. Estas células converter a energia mecânica de ondas sonoras, que são transmitidas através do labirinto membranoso cheio de fluido, em sinais neurais que são processadas pelas estruturas auditivas centrais. A técnica aqui descrita fornece um método para a preparação de peças inteiras de o órgão de Corti, após a calcificação da cóclea está completa (para as amostras que vão desde uma semana de idade até à idade adulta). Nós também apresentamos um método para immunostaining tudo montado tecido coclear. Cocleares peças inteiras são cruciais para a visualização de todas as células do cabelo e que envolve as células de suporte nos seus arranjos espaciais naturais e permitir a análise em três dimensões, com a utilização de microscopia confocal.
Drs. Hans Engstrom e Harlow Ades originalmente descrito um método de montar todo dissecção coclear em 1966. Eles detalhado uma técnica para corrigir rapidamente e dissecar cócleas calcificada submersa no líquido a partir de uma variedade de mamíferos, preservando curtos segmentos intactos do órgão de Corti para análise microscópica 4. A dissecção de um unfixed, calcificada cóclea de rato também foi ilustrado em um vídeo instrutivo 5. Drs. Barbara Bohne e Gary Harding na Universidade de Washington fez várias modificações importantes a este método. Em sua versão da coclear método montar todo, o osso temporal foi descalcificado, embutido no plástico, e cinco meias-voltas ou dez quartos-de-voltas foram dissecçãoted 6,7. Dr. Charles Liberman e colegas Eaton Peabody, Massachusetts Eye Laboratories e Ear Infirmary, modificou esta técnica para que a incorporação de plástico não foi necessário 8. Além disso modificação da técnica ocorreu no laboratório do Dr. Jian Zuo no Hospital de Pesquisa St. Jude Children 9-12 que informou o método de dissecação aqui apresentada. Nós usamos uma estratégia diferente para obter acesso ao órgão de Corti que Bohne e Liberman, que permite o isolamento completo da apical, média e basal voltas. Assim, o tecido dissecado é maior e menos susceptível de ser danificado ou perdido durante os processos de dissecção ou imunocoloração. Além disso, o método actual de facilitar a medição da distância a partir da extremidade apical ou gancho basal para identificar uma região de frequência.
Embora muitos laboratórios realizar immunostaining de tecido coclear, não está claro onde este método foi originada. Como resultado, há várias receitas para o bloqueio da-manhãrs e tampões de incubação de anticorpos que podem afetar o desempenho de anticorpos primários individuais. Aqui, nós apresentamos um método para a imunocoloração com anticorpos marcados por fluorescência que é aplicável aos anticorpos mais comumente utilizados no campo auditivo.
A forma complexa da cóclea, delicada estrutura do órgão de Corti, e encaixe ósseo proporcionar um desafio para análise histológica e bioquímica. Uma variedade de técnicas são actualmente usados no campo de audiência para superar estas características difíceis e visualizar as células dentro do órgão de Corti, cada técnica com as suas próprias vantagens e desvantagens. O protocolo aqui apresentado permite a montagem de dissecção toda a cóclea de rato adulto e, com ligeira modificação, pode potencialmente ser usado para examinar as estruturas críticos dentro do cócleas a partir de uma variedade de outros organismos modelo utilizados no campo.
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Protocol
Declaração de Ética: Procedimentos envolvendo indivíduos animais foram aprovados pelo Institutional Animal Care e do Comitê Use da Escola de Medicina da Universidade de Southern Illinois.
1. Extração de ossos temporais
- Identificar ossos temporais na base do crânio do rato 13 e raspar os nervos cranianos, usando uma pinça padrão normal.
- Coloque uma pinça padrão normal na ponta da cápsula ótica e com o polegar da mão oposta a imprensa para baixo no canal semicircular posterior para desalojar a cóclea encapsulado.
- Liberte a metade inferior do osso temporal a partir do crânio manualmente com o polegar eo dedo indicador ou usando 10,5 cm tesoura fina.
2. Pós-fix temporais Bones
- Coloque ossos temporais em 2 ml de tubos de microcentrífuga contendo 250 - 500 ul de paraformaldeido a 4% (PFA) diluído em solução salina tamponada com fosfato 10 mM (PBS) pH 7,4 e incubComeram à temperatura ambiente durante 2 - 20 horas.
NOTA: Não é necessário qualquer abertura da tampa apical ou injeção de PFA para a rodada ou janela oval. Recomendamos o uso livre, ultra-pura, microscopia eletrônica (EM) grau metanol PFA que podem ser comprados em uma concentração de 16% em frascos de vidro. Uma vez que o frasco é aberto e diluído 1: 4 em PBS, fazer uma solução a 4%, ele pode ser usado por até 2 semanas, quando armazenadas a 4 ° C (Alguns anticorpos requerem curta fixação e outros podem tolerar S / N (O / N) Fixação).
3. descalcificação dos ossos temporais
- Após a fixação, remover PFA utilizando uma pipeta e substituir com 120 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), um pouco mais do que 2 ml. Certifique-se de preencher todo o tubo de microcentrífuga de 2 ml para evitar bolhas de ar quando o tubo é fechado.
- Se não descalcificação imediatamente, recoloque PFA com pH 7,4 e armazenar amostras de PBS 10 mM a 4 o C.
NOTA: Após a fixação, os ossos temporais podem ser armazenadas para variable quantidades de tempo antes da descalcificação dependendo dos antigénios a ser examinado.
- Se não descalcificação imediatamente, recoloque PFA com pH 7,4 e armazenar amostras de PBS 10 mM a 4 o C.
- Colocar os tubos no fim-over-end rotador e rodar a 4 rpm à temperatura ambiente. Alterar solução EDTA diariamente usando uma pipeta. Comprimento de descalcificação depende da idade da amostra e da preferência do cientista fazendo a dissecção.
- Incubar ossos temporais em EDTA usando as seguintes diretrizes para tempos de incubação:
Para amostras de dia pós-natal (P) a 8 P15: 2 - 4 horas; Para amostras de P15 a P21: O / N; Para amostras de P21 a P30: 2 O / N; Para amostras mais velhas do que P30: 3 ou mais S / N.
NOTA: Os tempos de descalcificação estão sujeitos a preferência dos usuários e pode ser estendido conforme necessário. A descalcificação tempo pode ser reduzida alterando a solução de EDTA a duas vezes por dia, cerca de 8 horas de intervalo. Alguns laboratórios adicionar 1% PFA para a solução de EDTA quando descalcificação por mais de 3 dias para evitar a contaminação.
- Incubar ossos temporais em EDTA usando as seguintes diretrizes para tempos de incubação:
- Para determinar se a amostra é adequadamente descalcificados, coloque o ossos temporaisna silício elastômero revestido dissecção prato e pressione suavemente fórceps na cóclea em forma de caracol. Se o tecido é spongey, em seguida, descalcificação é completa.
- Uma vez descalcificação é completa, remover o EDTA usando uma pipeta e adicionar 500 ul -1.000 de PBS 10 mM pH 7,4. Armazene as amostras a 4 ° C até que esteja pronto para dissecar.
4. Criar Silicone Elastomer-revestido Dish Dissection
- Combinar a base e o agente de cura de um kit encapsulante elastómero de silicone de acordo com as instruções do fabricante e homogeneiza-se.
- Adicionar cerca de 2 - 3 colheres de sopa de carvão em pó até que a solução é preto e misturar bem.
NOTA: tinta líquida ou carvão vegetal líquido não se mistura com a solução e não pode ser utilizado. Kits de elastómero de silicone encapsulantes pode ser comprado em preto, permitindo que o passo 4.2 ser omitido. - Despeje a solução no 60 milímetros de vidro ou placas de Petri de plástico, enchendo o suficiente para cobrir o fundo. Se bubbles estão presentes, sopro de ar sobre a superfície. Deixar repousar pelo menos 24 horas à temperatura ambiente para ajustar.
NOTA: pratos revestido de elastômero de silicone pode ser usado repetidamente por anos. No entanto, não usar álcool para limpeza, pois isso fará com que o elastômero de silicone de crack.
5. Monte todo Dissecção da cóclea (para P7 e amostras mais antigas)
- Separe o giro basal do giro médio / apical
- Coloque um osso temporal descalcificadas em um prato de dissecação elastómero de silicone com revestimento preenchido dois terços cheio com PBS 10 mM pH 7,4 e usar um microscópio de dissecção estéreo para as seguintes etapas.
- Segure o osso temporal na região vestibular com # 4 ou # 5 fórceps de joalheiro em linha reta e com 5 mm Vannas-Tübingen tesoura primavera, corte o excesso de tecido cápsula ótica ao longo dos lados e acima do ápice.
- Usando 2,5 mm Vannas tesoura primavera, inserir uma lâmina para a janela oval e fazer vários pequenos cortes ao longo do ligamento espiral lateral /parede do giro basal.
- Usando 5 mm Vannas-Tübingen tesoura primavera, inserir uma lâmina na região apenas cortar e coloque a outra lâmina na parte externa do osso temporal, medial à janela oval. Este corte separa o giro basal de voltas médio e apical.
- Dissecção completa do giro basal.
- Usando 2,5 mm Vannas tesoura primavera, cortar as fibras nervosas do gânglio espiral que se conectam à modiolus para liberar a tensão no giro basal e corte abaixo do giro basal se separar de órgãos vestibulares.
- Usando 2,5 mm Vannas tesoura primavera, fazer uma série de pequenos cortes para remover / parede lateral do ligamento espiral de ambos acima e abaixo do órgão de Corti. Use # 4 ou # 5 fórceps de joalheiro em linha reta para orientar o tecido. Pin as fibras nervosas do gânglio espiral ao silicone revestido com elastômero dissecção prato, mas não agarrar esta região como o tecido vai rasgar.
- Durante os passos anteriores, alguns dos Membran de Reissnere, muitas vezes, ser removido. Se alguma ainda permanece, segure a membrana de Reissner com uma pinça # 4 ou # 5 de joalheiro em linha reta e se afastar do órgão de Corti.
NOTA: A membrana tectorial é raramente visível e tipicamente flutua para longe sem a necessidade de uma etapa específica para a remoção. - Finalmente fazer vários cortes para reduzir a espessura dos axônios do gânglio espiral, para fazer a volta mais plano possível e usar # 4 ou # 5 fórceps de joalheiro em linha reta para transferir o giro basal dissecado, segurando os axônios restantes do gânglio espiral, para uma placa de 48 poços (ou corrediça câmara) contendo ~ 500 mL de 10 mM de PBS a pH 7,4.
- Meio e voltas apicais separado
- Coloque os restantes dois terços da cóclea, lado apical para baixo.
- Usando 2,5 mm Vannas tesoura primavera, inserir uma lâmina na escala média, onde o giro médio costumava ser conectados ao giro basal, e fazer vários pequenos cortes ao longo do ligamento espiral / parede lateral do the giro médio.
- Utilizando 5 mm Vannas-Tubingen tesoura primavera, inserir uma lâmina na região imediatamente cortada com a espira média colocada em cima da lâmina, e colocar a outra lâmina do lado de fora do labirinto ósseo, com um ângulo de 90 ° a partir da extremidade apical. Isso separa o giro médio do giro apical.
- Dissecção completa do giro médio de um modo semelhante ao giro basal (ver passos 5.2.2 a 5.2.4).
- Dissecção completa do giro apical.
- Usando 2,5 mm Vannas tesoura primavera, abra a tampa que cobre o giro apical. Dissecção completa de uma forma semelhante à espira basal (ver passos 5.2.2 a 5.2.4).
NOTA: dissecado cada espira pode ser armazenado em 10 mM de PBS a pH 7,4 numa placa de 48 poços (ou corrediça câmara) a 4 ° C durante várias semanas antes de imunocoloração. No entanto PBS irá evaporar e necessita de ser reabastecido periodicamente e de armazenagem superior a 2 - 3 semanas pode resultar em crescimento de bactérias ou fungos notecido, que pode diminuir a qualidade da imagem. Recomendamos armazenamento de longo prazo de amostras como ossos temporais não dissecado.
- Usando 2,5 mm Vannas tesoura primavera, abra a tampa que cobre o giro apical. Dissecção completa de uma forma semelhante à espira basal (ver passos 5.2.2 a 5.2.4).
6. Immunostaining com fluorescente etiquetado anticorpos
- Após a dissecção, armazenar cada espira em um bem separado em uma placa de 48 poços (ou slide câmara), submerso em ~ 500 mL de 10 mM PBS pH 7,4. Para cada um dos seguintes passos a espira deve ser submersa em líquido, não flutuante no topo ou preso ao lado do poço.
NOTA: Ao remover o líquido de cada bem, é fácil perder os giros cocleares ou chupar-lo na ponta da pipeta. Mudando soluções com uma ponta de pipeta de 200 mL usando um escopo dissecção vai ajudar a evitar isso. - Usando uma pipeta, remover PBS de cada poço e substitui com ~ 200 - 300 ul por poço de bloqueio / solução de permeabilização (1% de Triton X-100, 1% de albumina sérica bovina (BSA), e 10% de soro de cabra normal (NGS) diluído em PBS 10 mM de pH 7,4). Incubar 1 hora à temperatura ambiente num agitador rotativo 3D.
NOTA: Se qualquer anticorpo primário utilizado foi feita num hospedeiro de cabra, em seguida, um anticorpo anti-cabra secundário irá ser necessário e NGS não deve ser utilizado para qualquer uma das etapas. Soro normal de cavalo pode ser utilizado como um substituto para o NGS. - Remover solução de bloqueio / permeabilização usando uma pipeta e substituir com 100 ul ~ por poço de solução de anticorpo primário (0,1% de Triton X-100, 1% de BSA, NGS e 5% diluído em PBS 10 mM, pH 7,4). O factor de diluição para cada anticorpo primário varia. Incubar O / N (mínimo 14 horas) a 4 ° C em um rotador 3D.
NOTA: Se mais de um anticorpo primário é usado, todos podem ser combinados na mesma solução para incubação, apenas certifique-se de que cada anticorpo primário tem um host diferente. - Remoção da solução de anticorpo primário, utilizando uma pipeta e lavagens de executar 3 10 mM de PBS a pH 7,4 em ~ 500 ul por poço. Cada lavagem incuba um mínimo de 5 minutos à temperatura ambiente num agitador rotativo 3D.
- Retirar última PBS uma lavagem usando uma pipeta e substitua com ~ 100 ul por poço de solução de anticorpo secundário (0,1% de Triton X-100, 1% de BSA, NGS e 5% diluído em PBS 10 mM, pH 7,4). O factor de diluição para cada fluorescente etiquetado o anticorpo secundário é usualmente 1: 500 ou 1: 1.000. Coloque de 48 poços em uma caixa preta para proteger fluorescente etiquetado anticorpos secundários da luz. Incubar 2 - 3 horas à temperatura ambiente num agitador rotativo 3D.
NOTA: Se for necessário mais do que um anticorpo secundário, eles podem ser combinados na mesma solução durante a incubação. Certifique-se de que não há possibilidade de rotulagem cruzada (por exemplo., Usando cabra anti-coelho e frango anti-cabra anticorpos secundários) - Remoção da solução de anticorpo secundário, utilizando uma pipeta e lavagens de executar 3 10 mM de PBS a pH 7,4 em ~ 500 ul por poço. Incubar cada lavagem durante um mínimo de 5 minutos à temperatura ambiente num agitador rotativo 3D. Mantenha de 48 poços em uma caixa preta para proteger da luz.
- Retirar última lavagem PBS com uma pipeta e substituir com ~ 100 ul por poço de HoecHST 33342 (diluído 1: 2000 em 10 mM de PBS, pH 7,4) para rotular núcleos. Incubar 15 - 20 min à temperatura ambiente num agitador rotativo 3D. Mantenha de 48 poços em uma caixa preta para proteger da luz. Não incubar mais tempo do que 20 min.
- Remover Hoechst solução utilizando uma pipeta e lavagens de executar 3 10 mM de PBS a pH 7,4 em ~ 500 ul por poço. Incubar cada lavagem durante um mínimo de 5 minutos à temperatura ambiente num agitador rotativo 3D. Mantenha de 48 poços em uma caixa preta para proteger da luz.
- Todos os passos podem ser estendidos, excepto incubação a Hoechst, por várias horas, se necessário. Para pausar a reação em qualquer fase, apenas submergir amostras em ~ 500 ul de 10 mM PBS pH 7,4 e armazenar a placa de 48 -bem (ou slide câmara) a 4 ° C até que esteja pronto para retomar as horas de protocolo ou 1 - 2 dias depois .
7. Monte Coclear Liga Slides
- Etiqueta de slides com informações pertinentes sobre a amostra e os anticorpos utilizados.
- Pipeta ~ 50 ul de mídia montagem em cada slide e ter cuidadopara evitar as bolhas. Centrifuga-se o tubo contendo os meios de montagem para remover quaisquer bolhas.
- Usando # 4 ou # 5 fórceps de joalheiro em linha reta, segure os axônios do gânglio espiral para transferir suavemente uma vez coclear a partir da placa de 48 poços para o slide e lugar nos meios de montagem. Monte uma espira por lâmina para evitar a exposição à luz e fotodegradação durante o processo de criação de imagens.
- Use um microscópio de dissecção estéreo para garantir que espira não está dobrado, torcido, ou perto de uma bolha de ar. Se qualquer uma dessas condições ocorrer, fórceps uso # 4 ou # 5 de joalheiro em linha reta para reposicionar a espira.
- Colocar uma extremidade de uma lamela sobre a lâmina e libertar suavemente para permitir a queda lamela.
- Usar um microscópio de dissecção estéreo para assegurar que a espira não está dobrado, torcido, ou perto de uma bolha de ar. Se alguma dessas condições ocorrer, mova suavemente a lamela para trás e para reposicionar a espira.
- Colocar as lâminasem uma pasta slide para que eles colocar o plano. Vamos montar cura mídia O / N à temperatura ambiente (manter no escuro)
- Lamelas Selo com clara unha polonês e armazenar a RT ou -20 ° C até trabalhada. Slides podem ser armazenados em uma pasta ou caixa de slides slide.
NOTA: Os slides podem ser armazenados a longo prazo a -20 ° C ou -80 ° C e fluorescência será mantida por vários meses. - Lâminas de imagem usando um microscópio confocal com o comprimento de onda apropriado com base nos anticorpos secundários utilizados durante o procedimento de imunocoloração. Ajustes de brilho e contraste pode ser realizada utilizando o software de imagem fornecida pelo vendedor confocal.
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Representative Results
Nós apresentamos um método para isolar o órgão de Corti como três voltas intactas cocleares (Apex, médio e base) a partir de tecido da cóclea que é calcificada, com passos de dissecação chave apresentados na Figura 1. Durante a primeira semana pós-natal de desenvolvimento, a calcificação do do mouse cóclea é incompleta e um método de dissecação mais simples pode ser usado 13. Usando todo o método de dissecação montagem neonatal com cóclea de P7 e mais velhos resultados ratos em lágrimas e destruição do órgão de Corti. A / parede lateral ligamento espiral é agora mais firmemente presa e não pode ser desprendida a partir do epitélio sensorial, sem causar danos. Assim, o método de dissecação todo mount "adulto" é necessário para amostras com idade superior a P6. Apresenta-se um exemplo da espira média da cóclea P15 um rato que tenha sido dissecados e imunocoradas com a célula de cabelo e que suportam marcadores de células (Figura 2). Secções transversais ópticos cum também ser obtida com o conjunto da técnica de montagem (Figura 3).
Vários problemas podem ocorrer durante toda a dissecção de montagem ou ao montar o coclear gira em torno de slides. Durante a remoção da / parede lateral do ligamento espiral, há uma janela estreita entre o corte demasiado ou não suficiente. Cortes que ocorrem próximo a última fileira de células ciliadas externas pode causar as células do cabelo nesta última linha para montar em ângulos variados (Figura 4A). Os cortes que sejam muito grandes podem remover secções do órgão de Corti (Figura 4B). Manuseio da amostra com uma pinça toma muito cuidado e muitas vezes há buracos no órgão de Corti, onde fórceps foram extraviado (Figura 4C). Finalmente, quando a montagem dos giros cocleares, o órgão de Corti pode dobrar que obscurece a imagem (Figura 4D).
Figura 1. Passos importantes no Monte todo Dissecção da "Adulto" mouse cóclea. (A) após o protocolo passo 5.1.4, o giro basal da cóclea é separado do giro médio / apical, mas ainda ligado à região vestibular. (B) Após protocolo passo 5.3.3, o giro médio está separada do giro apical. (C) Exemplo da dissecção concluído de uma volta do meio onde / parede lateral do ligamento espiral é removido. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. confocal Slice Imagem do OrienteVire isolado de um P15 Mouse. Quatro 20x imagens são sobrepostas para reconstruir todo o giro médio. As células capilares são marcadas com um anticorpo de coelho anti-miosina VIIa anticorpo primário (diluição 1: 200) combinado com um anticorpo de burro anti-coelho Alexa 488-secundário conjugado (1: 1000 de diluição) (magenta). Células de suporte são marcados com um anticorpo de cabra anti-Sox2 primário (diluição 1: 500) combinado com um burro anti-cabra Alexa 568 de anticorpo secundário conjugado (1: 1000 de diluição) (verde). Hoechst (azul) rotula todos os núcleos. A imagem foi tomada usando um microscópio confocal Zeiss LSM 700 com 405, 488, e 555 comprimentos de onda. Scale bar = 100 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Optical Cross-seção do Oriente Vire Isolado a partir de um 6 semanas de idade rato. Fatia de imagem confocal de toda a preparação de montagem (inferior) e secção transversal óptico no plano XZ (topo) (A). (B) Aumento da ampliação do painel de topo em (A), com a mira removidos. As células capilares são marcadas com um anticorpo de coelho anti-miosina VIIa anticorpo primário (diluição 1: 200) combinado com um anticorpo de burro anti-coelho Alexa 647-secundário conjugado (1: 1000 de diluição) (magenta). Células de suporte são marcados com um anticorpo de cabra anti-Sox2 primário (diluição 1: 500) combinado com um burro anti-cabra Alexa 568 de anticorpo secundário conjugado (1: 1000 de diluição) (verde). A imagem foi tomada usando um microscópio confocal Zeiss LSM 700 com 405, 555, e 647 comprimentos de onda. Barras de escala = 20 mm Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Figura 4. Exemplos de problemas que podem ocorrer durante todo Mount dissecção ou ao montar Coclear Liga Slides. (A) No lado esquerdo da imagem, o tecido da cóclea foi cortado ao lado da última linha de células ciliadas externas fazendo com que muitos dos estas células a serem montados em ângulos variados. (B) Uma secção do órgão de Corti do lado esquerdo da imagem foi cortada. (C) Existe um buraco perfurado na região das células ciliadas externas no meio do imagem. (D), o órgão de Corti é dobrado em vários lugares. As imagens foram tiradas 4-8 semana cochleae velho mouse. As células capilares são marcadas com um anticorpo de coelho anti-miosina VIIa anticorpo primário (diluição 1: 200) combinado com um anticorpo de cabra anti-coelho Alexa 488 conjugado com anticorpo secundário (1: 1000 de diluição) ou de burro anti-coelho Alexa 488 conjugado com anticorpo secundário (1: 1000 de diluição) (magenta). Em C cel ciliadas externasLS são marcados com um anticorpo de cabra anti-prestin primário (diluição 1: 200) combinado com um anticorpo de burro anti-coelho Alexa 568-secundário conjugado (1: 1000 de diluição) (verde). As imagens foram tiradas com uma Leica SP5 microscópio confocal com 405, 488, e 555 comprimentos de onda nm. Barras de escala: em AB = 20 um; em CD = 40 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Há vários passos críticos para toda bem sucedido dissecção montagem e immunostaining. Contudo, antes de qualquer um destes métodos são realizados, é necessária a fixação adequada do tecido coclear. Recomendamos a utilização de metanol livre, ultra-pura, EM grau PFA. PFA feita a partir de pó pode ter vestígios de metanol e um pH instável o que diminui a qualidade de imunofluorescência. Outros grupos também mostraram que dissecções semelhantes são possíveis usando fixadores que não contêm formaldeído 14-16. O comprimento de fixação também é importante e é específico do anticorpo. Alguns anticorpos podem tolerar uma fixação O / N, enquanto outros não funcionam bem com apenas 1 hora em PFA (no entanto isso é raro). Sub-fixo tecido pode ser problemático para o método de dissecação o tecido como se desfaz. Na nossa experiência a 3 - 4 horas de fixação proporciona uma fixação adequada e não interfere com a maioria dos anticorpos primários vulgarmente usados no campo audição.
jove_content "> É também possível que o EDTA pode interferir com anticorpos primários;. Assim, alguns anticorpos irá funcionar bem no tecido neonatal, mas não em P7 ou tecidos mais velhos que descalcificado Após a fixação, os ossos temporais podem ser armazenados por quantidades variáveis de tempo antes descalcificação dependendo dos antigénios a ser examinado. Alguns antigénios exigem descalcificação e dissecção em poucos dias ou semanas após a fixação, enquanto outros podem ser armazenadas durante anos (ou antes ou depois da descalcificação) sem diminuir a qualidade da imunocoloração. Sugerimos que as amostras armazenando como ossos temporais devido ao risco de evaporação do suporte de armazenamento (PBS) a partir da placa de 48 poços e uma potencial contaminação com fungos ou bactérias. Nós normalmente executar toda a montagem de dissecção menos do que uma semana antes para a imunocoloração.Uma vez fixo e descalcificados, toda a montagem de dissecção é feita com o osso temporal submerso no líquido. Removendo o excesso de osso e suavetecido circundante do labirinto no início da dissecção ajudará na remoção de / parede lateral do ligamento espiral em fases posteriores, facilitando a manipulação do tecido e proporcionando uma visão menos obscurecida de estruturas críticas. Ao executar os primeiros passos, uma pinça pode ser utilizado para segurar o tecido na região vestibular. No entanto uma vez que as voltas são isolados, é importante para evitar a colocação de uma pinça sobre o órgão de Corti, ou ligamento / parede lateral espiral. Em vez disso, manter a pinça fechada e fixar as fibras nervosas do gânglio espiral para a dissecção prato silicone elastômero revestido. Não se agarre esta região como o tecido vai rasgar. Em geral, uma vez que o tecido foi dividido em três turnos, agarrando e puxando manobras pode causar resultados imprevisíveis, os quais são muitas vezes prejudiciais para o órgão de Corti e deve ser evitado. Tecidos de animais mais jovens (P7-P21) tende a ser mais indulgente do que o tecido de animais com idade superior a P21. Além disso, amostras de células ciliadas da cóclea com dAmage são mais difíceis de dissecar. Se o rato recebeu a exposição ao ruído do tecido é especialmente frágil. Independentemente do estado do tecido, a dissecção apresentamos é tecnicamente exigente e requer muitas tentativas de prática de proficiência.
Durante a imunocoloração, é importante que cada espira está submersa no líquido, não flutuante no topo ou preso ao lado do poço. Isto permite a penetração mais completa de Triton e anticorpos para o tecido. Ao remover o líquido de cada bem, é fácil perder a vez coclear ou desenhá-la para dentro da ponta da pipeta. Mudando soluções com uma ponta de pipeta de 200 mL usando um escopo dissecção vai ajudar a evitar isso. Extrair o líquido devagar e mover a ponta da pipeta se a espira chegar muito perto. Também pipetteting solução resíduos para um tubo limpo pode ser uma boa estratégia como este tubo de resíduos podem ser pesquisados se uma vez é acidentalmente elaborado para a pipeta. Se o giro está preso na ponta da pipeta, tele ponta pode ser aberta com uma lâmina de barbear, mas muitas vezes o órgão de Corti será danificado se isso ocorrer.
Quando, podem ser adicionados passos adicionais, tais como a recuperação do antígeno ou a valorização sinal anticorpos para immunostaining de resolução de problemas. Há baixo pH e antígeno pH elevado reagentes desmascarar que podem ser comprados. Se um anticorpo não funciona com o método descrito aqui, o primeiro protocolo de mudança para tentar é um desses métodos de recuperação de antigénio. Em alternativa, usar um potenciador de sinal. Há soluções disponíveis no mercado para ser utilizado antes da imunocoloração, ou kits de tiramida de amplificação que podem ser utilizados para amplificar o sinal a partir do anticorpo secundário.
O significado da técnica apresentamos é a capacidade para manter a estrutura tridimensional do órgão de Corti e para visualizar todas as células dentro do órgão. O comprimento total da cóclea é separado em apenas três voltas enquanto outras técnicas semelhantes, ou seja thmétodos e Bohne e Liberman, exigem divisão em 5 - 10 peças 6-8, aumentando o número de amostras de manobra nos processos de positividade e de imagem. A dissecção da parede lateral, coclear, que foi desenvolvido por Cosgrove e Gratton requer um nível semelhante de habilidade e é possível no tecido não fixado, fresco, bem como no tecido descalcificada, mas o órgão de Corti é arrancada e destruídos no processo de isolamento do parede lateral 17. Outro grupo realizou dissecções semelhantes no tecido da cóclea não fixada, fresco de três semana ratos velhos onde / parede lateral do ligamento espiral é agarrado e afastado do órgão de Corti despojado, deixando o órgão intacto. No entanto, isto só foi alcançada no giro apical 5. O método de peeling / parede lateral do ligamento espiral para fora do órgão de Corti é rotina para dissecção do tecido fixado em um rato jovem (<P7) 13. No entanto, em nossa experiência com ratos mais velhos do que P6, após a fixação de umd descalcificação, essa manobra frequentemente rasga o órgão de Corti de forma confiável. Além disso, o processo aqui descrito permite o isolamento de média e basal transforma bem.
Criocortes e secções obtidas após inclusão em parafina também são vulgarmente utilizados no campo auditivo. Estes métodos permitem a visualização de outras estruturas, tais como a stria vascularis, a membrana de Reissner, e membrana tectória, no entanto, cada secção só permite a visualização de uma pequena região do órgão de Corti em cada espira. Assim, para investigar acontecimentos que ocorrem na forma de mosaico, tais como a perda de células ou a divisão celular, com o método de corte, de 50 ou mais lâminas necessitam de ser marcadas e fotografada para capturar todo o comprimento da cóclea. Em contraste, todo o protocolo de dissecção de montagem tem a vantagem de preparar todo o órgão de Corti em apenas três peças. Além da vantagem de preservar a arquitectura do comprimento do órgão de Corti, este technique permite a recolha de dados simplificado e armazenamento. Uma limitação de toda a dissecção de montagem é que ela destrói estruturas circundantes, tais como o ligamento espiral, estria vascular, membrana de Reissner, e membrana tectorial. Outra limitação é a dificuldade técnica e duração de tempo para uma única dissecção. Isto é principalmente devido à natureza frágil do órgão de Corti e pequena margem para erro ao remover / parede lateral do ligamento espiral. Uma vez dominado, toda a dissecção montagem de uma cóclea pode ser realizada em cerca de 20 - 30 min.
Enquanto o protocolo acima descreve um método todo dissecção de montagem para o rato adulto, esperamos aplicar esta técnica a outros organismos-modelo utilizados no campo auditivo. Nosso laboratório está atualmente modificando esta técnica para a dissecção da cóclea de ratos. O maior cóclea do rato é envolto em uma cápsula ótica mais grosso que é mais densamente calcificado do que o mouse. Assim, o osso temporal deve ser um excised com grandes tesouras. Antes da fixação e descalcificação com EDTA, a cápsula ótica deve ser aberto com uma tesoura para permitir um melhor acesso ao tecido coclear. Além disso, o processo de descalcificação é mais tempo e pode levar até 3 semanas, dependendo da idade da amostra. Para toda a dissecção de montagem, o tamanho do labirinto ósseo afecta a técnica. O aumento do tamanho da cóclea de ratos fornece uma distância ligeiramente maior entre ligamento espiral / parede lateral e o órgão de Corti, proporcionando uma maior margem de erro para os cortes individuais. No entanto, enquanto o tecido maior pode proporcionar mais material para agarrar para a manipulação da amostra, que também requer um maior número de cortes para remover todo o comprimento da / parede lateral do ligamento espiral. Acreditamos que as modificações análogas poderiam ser feitas para dissecção da cóclea de chinchila, gerbil, e cobaia.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | can be purchased from other vendors |
| 10.5 cm fine scissors | Fine Science Tools | 14060-11 | can be purchased from other vendors |
| 2 ml microcentrifuge tubes | MidSci | AVSS2000 | can be purchased from other vendors |
| 16% formaldehyde, methanol free, ultra pure, EM grade | Polysciences | 18814 | TOXIC --wear gloves and cannot be disposed of in the sink. Can be purchased from other vendors. |
| PBS pH 7.4 | Sigma | P3813-10PAK | can be purchased from other vendors |
| EDTA | Fisher | BP118-500 | can be purchased from other vendors |
| end-over-end tube rotator | Fisher | 05-450-127 | can be purchased from other vendors |
| 60 mm petri dish | Fisher | 50-202-037 | can be purchased from other vendors |
| Dow Corning Sylgard 184 silicone encapsulant kit | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| activated charcoal | Fisher | AC134372500 | can be purchased from other vendors |
| stereo dissection microscope | Zeiss | Stemi 2000 | can be purchased from other vendors |
| Dumont #4 jeweler's forceps | Fine Science Tools | 11241-30 | |
| Dumont #5 jeweler's forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| 2.5 mm Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15001-08 | curved |
| 5 mm Vannas-Tubingen spring scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | straight |
| 48-well plates | Fisher | 08-772-52 | can be purchased from other vendors |
| 8-well chamber slides | Fisher | 1256518 | can be purchased from other vendors |
| Triton X-100 | Sigma | X100-500 | can be purchased from other vendors |
| BSA, fraction V | Fisher | BP1605 | can be purchased from other vendors |
| NGS | Vector labs | S-1000 | can be purchased from other vendors |
| NHS | Vector labs | S-2000 | can be purchased from other vendors |
| 3D rotator | Midsci | R3D-710 | can be purchased from other vendors |
| Western blot incubation box XL | Licor | 929-97401 | |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | can be purchased from other vendors |
| Prolong gold antifade mounting media | Life Technologies | P36930 | can be purchased from other vendors,but mounting medias vary in their ability to protect against photobleaching |
| Superfrost Plus Slides | Fisher | 12-550-15 | can be purchased from other vendors |
| coverslips 22 x 22 x 1 | Fisher | 12-548-B | can be purchased from other vendors |
| clear nail polish | Local drug store | can be purchased from other vendors | |
| cardboard slide folder | Fisher | 12-587-10 | can be purchased from other vendors |
| plastic slide box | Fisher | 03-448-10 | can be purchased from other vendors |
References
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- Ehret, G., Frankenreiter, M. Quantitattive analysis of cochlear structures in the house mouse in relation to mechanisms of acoustical information processing. J Comp Physiol. 122, 65-85 (1977).
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