Summary
Biz üç bozulmamış koklear döner (apeks, orta ve üs) olarak Corti yetişkin organı izole etmek için bir yöntem mevcut. Biz de floresan levhası 'antikorlar ile immün için bir prosedür ortaya koymaktadır. Birlikte bu teknikler kokleadaki bulunan saç hücreleri, destek hücreler ve diğer hücre türleri çalışma sağlar.
Introduction
Temporal kemik içinde yer alan iç kulağın spiral şekilli koklea, Corti, memelilerde işitsel duyu uç organ organı ev sahipliği yapmaktadır. Koklea tonotopically düzenlenen ve yaygın olarak apikal ortadan ayrılır ve bazal tepesi 1 taban ve düşük frekans tespiti yüksek frekanslı ses algılama ile farklı frekans bölgelerine tekabül eden döner bir. Saç hücreleri, Corti organı mechanosensory hücreleri, farelerin 2,3 yaklaşık 6 mm uzunluğunda koklea, uzunluğu çalıştırın. Bu hücreler, merkezi işitsel yapıları tarafından işlenen sinirsel sinyalleri içine, sıvı dolu Membranöz labirent aracılığıyla iletilen ses dalgalarının, mekanik enerjiyi dönüştürmek. Burada anlatılan teknik, (yaş bir hafta yetişkinliğe kadar numuneler için) koklea kalsifikasyonu sonra Corti organı tüm bağlar hazırlanması için bir yöntem, tamamlandığında içerir. Ayrıca immunosta için bir yöntem mevcutbütün ining koklear doku monte edilebilir. Koklear bütün bağlar tüm saç hücrelerinin görselleştirme ve doğal uzamsal düzenlemeler destekleyici hücrelerin çevredeki için çok önemlidir ve konfokal mikroskopi kullanılarak üç boyutlu olarak analiz için izin.
Dr. Hans Engstrom ve Harlow Ades aslında onlar hızla mikroskopik analiz 4 Corti organı kısa bozulmamış kesimleri koruyarak, düzeltmek ve memelilerin çeşitli sıvı batık kalsifiye cochleae incelemek için bir teknik detaylı 1966 yılında bir bütün montaj koklear diseksiyon yöntemi tarif. Bir sabitlenmemiş, kalsifiye sıçan Kokleanın diseksiyonu da bir öğretim video 5'te gösterilen edilmiştir. Dr. Barbara Bohne ve Washington Üniversitesinde Gary Harding bu yönteme pek çok önemli değişiklikler yaptı. Koklear tüm montaj yönteminin kendi versiyonunda, temporal kemik, dekalsifiye oldu plastik gömülü ve beş yarım dönüşler veya on çeyrek dönüşler dissec edildited 6,7. O plastik gömme 8 gerekli değildi bu yüzden Dr. Charles Liberman ve Eaton Peabody Laboratories, Massachusetts Göz ve Kulak Infirmary'de meslektaşları, bu tekniği modifiye. Tekniğin daha da modifikasyon Burada sunulan diseksiyon yöntemi haberdar St. Jude Çocuk Araştırma Hastanesi 9-12 Dr. Jian Zuo'nun laboratuarında meydana geldi. Biz tam apikal, orta ve bazal dönüşler izolasyonuna izin veren Bohne ve Liberman daha Corti, organı erişmek için farklı bir strateji kullanın. Böylece disseke doku büyük ve diseksiyon veya immün işlemleri sırasında kayıp ya da hasar olasılığı daha azdır. Buna ek olarak, güncel yöntem apikal uç veya frekans bölgesini tanımlamak için bazal kanca mesafenin ölçülmesini kolaylaştırır.
Birçok laboratuarları koklear dokusunun immün gerçekleştirin rağmen bu yöntem nereden geldiğini, bu belli değildir. Bunun sonucunda Buffe engellemek için çeşitli tarifler vardırrs ve bireysel birincil antikor performansını etkileyebilir antikor inkübasyon tamponları. Burada, işitsel alanda en yaygın olarak kullanılan antikorlar için de geçerlidir floresan isim levhası antikor ile immünboyama için bir yöntem sunulmaktadır.
Koklea karmaşık şekli, Corti organı hassas yapısı ve kemik kapatma histolojik ve biyokimyasal analiz için bir meydan okuma sağlamak. Çeşitli teknikler şu anda bu zor özellikleri aşmak ve Corti, kendi avantajları ve dezavantajları ile her tekniğin organı içindeki hücreleri görselleştirmek için işitme alanında kullanılmaktadır. Burada sunulan protokol küçük bir değişiklikle, potansiyel olarak bu alanda kullanılan diğer model organizmaların çeşitli cochleae içindeki kritik yapılara incelemek için kullanılabilir, yetişkin fare koklea bütün montaj diseksiyon sağlar ve.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik Beyanı: Hayvan denekleri Prosedürler Tıp Southern Illinois University School Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır.
Temporal Bones 1. Ekstraksiyon
- Fare kafatası 13 tabanındaki zamansal kemikler tespit ve standart model forseps kullanılarak kranial sinirler kazınması.
- Kapsüllü koklea çıkarmak için otik kapsül ucunda aşağı posteriyor semisirküler kanal üzerinde ters elle basının başparmak ile standart model forseps yerleştirin.
- El başparmak ve işaret parmağı ile ya da 10.5 cm ince makas kullanarak kafatası temporal kemiğin alt yarısı boşaltın.
2. Geçici Bones Post-fix
- 10 mM fosfat tamponlanmış tuzlu su içinde seyreltilmiş 500 ul% 4 paraformaldehit (PFA) (PBS) pH 7.4 ile inkubasyondan - 250 ihtiva eden 2 ml mikrosantrifüj tüpleri içine zamansal kemikler yerleştirin20 saat - 2 RT'de yedik.
NOT: yuvarlak veya oval pencereye PFA apikal kap veya enjeksiyon Hiçbir açılması gereklidir. Cam şişe içinde% 16 konsantrasyonda satın alınabilir metanol ücretsiz, ultra saf, elektron mikroskobu (EM) notu PFA kullanmanızı öneririz. Bir şişe açıldı ve 1 seyreltilmiş sonra:% 4 çözelti haline PBS 4 (Bazı antikorlar tolere edebilir kısa tespiti ve diğerleri gerektiren 4 o C'de saklandığında, o kadar 2 hafta boyunca kullanılabilecek O / N (O / N) tespit).
3. decalcify Temporal Bones
- Tespit edildikten sonra, bir pipet kullanılarak, PFA çıkarın ve 120 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA), biraz daha fazla 2 ml ile değiştirin. Tüp kapalı olduğunda hava kabarcıkları önlemek için tüm 2 ml'lik ependorf tüp doldurmak için emin olun.
- Hemen dekalsifiye Eğer değilse, o 4 ° C'de 10 mM PBS, pH 7,4 ve mağaza örnekleri ile PFA yerine
Not: Tespit edildikten sonra, temporal kemik variab saklanabilirle antijenleri bağlı dekalsifikasyon incelenmeden önce zaman tutarındadır.
- Hemen dekalsifiye Eğer değilse, o 4 ° C'de 10 mM PBS, pH 7,4 ve mağaza örnekleri ile PFA yerine
- Uçtan aşırı uca rotator yerleştirin tüpler ve RT'de 4 rpm'de döndürün. Bir pipet kullanarak günlük EDTA çözeltisi değiştirin. Dekalsifikasyon uzunluğu numunesinin yaş ve diseksiyon yaparak bilim adamı tercihine bağlıdır.
- Inkübasyon sürelerinde aşağıdaki yönergeleri kullanarak EDTA temporal kemikler inkübe:
8 P15 numunelerin doğum sonrası gün (P): 2-4 saat; P21 için numuneler P15 için: O / N; P30 örnekleri P21 için: 2 O / N; 3 ya da daha fazla, O / N: P30 daha büyük numuneler için.
NOT: Decalcification süreleri kullanıcıların tercihine tabidir ve gerektiği gibi uzatılabilir. Decalcification süresi yaklaşık 8 saat arayla, günde iki kez EDTA çözeltisi değiştirerek düşürülebilir. Bulaşmasını önlemek için daha uzun bir süre için 3 gün dekalsifiye Bazı laboratuarlar EDTA solüsyonuna% 1 PFA ekleyin.
- Inkübasyon sürelerinde aşağıdaki yönergeleri kullanarak EDTA temporal kemikler inkübe:
- Numune yeterince dekalsifiye ise o zamansal kemikler koyun belirlemek içinna silikon diseksiyonu çanak elastomer kaplamalı ve yavaşça salyangoz şeklindeki koklea üzerine forseps basın. Doku süngerimsi ise, yumuşatma işlemi tamamlanır.
- Yumuşatma işlemi tamamlandıktan sonra, bir pipet kullanılarak EDTA çıkarın ve 10 mM PBS pH 7.4, 500 -1000 ul ekle. Kadar hazır 4 o C'de saklayın örnekleri incelemek için.
4. Silikon Elastomer kaplı Diseksiyon Dish oluştur
- Taban ve üreticinin talimatlarına göre bir silikon elastomer kapsülleyici kitinin sertleştiriciyi birleştirin ve iyice karıştırın.
- Çözüm siyah olana kadar toz kömür 3 yemek kaşığı ve iyice karıştırın - yaklaşık 2 ekleyin.
NOT: Sıvı mürekkep veya sıvı kömür solüsyonu ile karıştırmak olmaz ve kullanılamaz. Silikon elastomer enkapsülant kitleri adım 4.2 atlanabilir sağlayan siyah satın alınabilir. - Kaplamak için yeterli alt doldurma 60 mm cam veya plastik petri kaplarının içine solüsyonu dökülür. Bu takdirdebbles, mevcut yüzey üzerinde hava ile puf. Ayarlamak için oda sıcaklığında en az 24 saat bekletilir.
Not: Silikon elastomer kaplı tabaklar yıl tekrar tekrar kullanılabilir. Bu silikon elastomer çatlamasına neden olur Ancak, temizlik için etanol kullanmayın.
(P7 ve Yaşlı Örnekleri için) Kohlea 5. Tüm Dağı Diseksiyon
- Orta / apikal döner bazal dönüş ayırın
- 10 mM PBS pH 7.4 ile üçte ikisi dolu dolu bir silikon elastomer kaplı diseksiyon çanak bir dekalsifiye zamansal kemik yerleştirin ve aşağıdaki adımlar için bir stereo diseksiyon mikroskobu kullanın.
- 4. veya 5. düz kuyumcu forseps ve 5 mm Vannas-Tübingen yaylı makas kullanılarak vestibüler bölgede zamansal kemiği tutun, kenarları boyunca ve apeks yukarıda aşırı otik kapsül doku kesip.
- 2.5 mm Vannas yaylı makas kullanarak, oval pencere içine bir bıçak takın ve spiral ligament / yanal boyunca birkaç küçük kesikler yapmakBazal dönüş duvarı.
- 5 mm Vannas-Tübingen yaylı makas kullanarak, sadece kesilmiş bölgeye bir bıçak takın ve temporal kemik dışında diğer bıçağı yerleştirin oval pencereye medial. Bu kesim, orta ve apikal döner gelen bazal dönüş ayırır.
- Bazal dönüş tam diseksiyonu.
- 2.5 mm Vannas yaylı makas kullanarak, bazal sırayla gerginliği ve vestibüler organların ayrılması bazal dönüş kesim için modiolus bağlanmak spiral ganglion sinir liflerini kesti.
- 2.5 mm Vannas yaylı makas kullanarak, Corti organı yukarıda ve aşağıda hem spiral ligament / lateral duvar kaldırmak için küçük kesikler bir dizi yapmak. Doku rehberlik 4. veya 5. düz kuyumcu forseps kullanın. Silikon elastomer kaplı diseksiyon çanak spiral ganglion sinir liflerini Pin, ancak doku gözyaşı gibi bu bölgede tutunmaya yok.
- Önceki adımlarda, Reissner en membranın bazı sırasındae sık sık silinecektir. Herhangi hala kalırsa, 4. veya 5. düz kuyumcu forseps ile Reissner en zarı kavramak ve Corti organı uzak çekin.
NOT: örtü oluşturan zar nadiren görülür ve genellikle kaldırılması için özel bir adım gerektirmeden uzak yüzer. - Sonunda için, mümkün olduğunca düz dönüş yapmak ve spiral ganglion kalan aksonlar tutarak, disseke bazal dönüşü aktarmak için 4. veya 5. düz kuyumcu forseps kullanmak için, spiral ganglion akson kalınlığını azaltmak için çeşitli kesimler yapmak Bir 48-yuvalı plaka (veya odacık slayt) 10 mM PBS, pH 7.4 ~ 500 ul ihtiva etmektedir.
- Ayrı orta ve apikal dönüşler
- Koklea, aşağı apikal tarafında kalan üçte ikisini yerleştirin.
- 2.5 mm Vannas yaylı makas kullanarak, kullanılan orta dönüş bazal dönüş bağlanacak scala ortamı içine bir bıçak yerleştirin ve th spiral ligament / yan duvar boyunca birkaç küçük kesikler yapmake orta dönüş.
- 5 mm Vannas-Tübingen yaylı makas kullanarak, sadece bıçağın üstüne yerleştirilir orta çevirmek ile kesilmiş bölgeye bir bıçak takın ve apikal ucundan 90 o açıyla, kemikli labirent dışında diğer bıçağı yerleştirin. Bu tepe dönüş gelen orta dönüş ayırır.
- Bazal da benzer bir şekilde, orta dönüş tam diseksiyon (5.2.4 adımları 5.2.2 bakınız).
- Apikal dönüş tam diseksiyonu.
- 2.5 mm Vannas yaylı makas kullanarak, apikal dönüş kapsayan kapağı açın. Bazal da benzer bir şekilde komple diseksiyon (5.2.4 adımları 5.2.2 bakınız).
Not: Dissected koklear döner immün önce birkaç hafta içinde 4 o C'de 48 oyuklu plaka (veya oda slayt) içinde 10 mM PBS, pH 7.4 içinde saklanabilir. Üzerine bakteriyel veya mantar büyümesi neden olabilir 3 hafta - Ancak PBS uzun 2'den buharlaşması ve periyodik olarak doldurulan gerekiyor ve depolama olacakgörüntünün kalitesini düşürebilir doku. Biz undissected temporal kemik olarak numunelerin uzun vadeli depolama öneririz.
- 2.5 mm Vannas yaylı makas kullanarak, apikal dönüş kapsayan kapağı açın. Bazal da benzer bir şekilde komple diseksiyon (5.2.4 adımları 5.2.2 bakınız).
Floresan Tagged Antikorlar 6. immün
- Diseksiyon sonra, 10 mM PBS, pH 7.4 ~ 500 ul batırılmış bir 48 oyuklu plaka (veya oda slayt) ayrı bir kuyunun her koklear dönüş depolar. Aşağıdaki adımlardan her biri için koklear dönüş, sıvı batık gereken üstte yüzen değil ya da kuyunun yanına yapışmış.
NOT: her bir sıvının sökerken, bu koklear dönüşler kaybetmek ya da pipet o kadar emmek için kolaydır. Bir diseksiyon kapsamı kullanarak 200 ul pipet ile çözümler Değişen bu önlemeye yardımcı olur. - Bir pipet kullanarak, her bir oyuğa PBS çıkarıp yerine ~ 200 - / bloke permeabilizasyon çözeltisi (oyuk başına 300 ul% 1 Triton X-100,% 1 sığır serum albümini (BSA) ve% 10 normal keçi serumu (NGS) 10 mM PBS içinde seyreltilmiş pH 7.4). 3B rotator oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
Not: kullanılan herhangi bir birincil antikor, bir keçi konukçuda yapılmış ise, o zaman ikinci bir anti-keçi antikoru gerekli olacak ve NGS herhangi bir aşaması için kullanılmamalıdır gerekir. Normal at serumu NGS için bir yedek olarak kullanılabilir. - Bir pipet kullanılarak bloke / geçirimli hale çözeltisini çıkarın ve primer antikor çözeltisi, oyuk başına 100 ul ~ ile değiştirin (% 0.1 Triton X-100, 10 mM PBS, pH 7.4 içinde sulandırılmış% 1 BSA ve% 5 NGS). Her primer antikor için sulandırma faktörü değişir. 3D döndürücüde 4 o C'de O / N (en az 14 saat) inkübe edin.
Not: birden çok birincil antikoru kullanıldığında, tüm sadece her birincil antikor farklı ev sahibi olduğundan emin olun, inkübasyon için aynı çözelti içinde kombine edilebilir. - Bir pipet kullanılarak birincil antikor çözeltisi çıkarın ve oyuk başına 500 ul ~ 10 mM PBS, pH 7.4 3 yıkama yapar. Her bir yıkama 3B rotator oda sıcaklığında 5 dakikalık bir minimum kuluçkaya.
- Geçen P kaldırBS, bir pipet kullanılarak ve ikincil antikor çözeltisinin oyuk başına 100 ul ile ul yerine yıkama (% 0.1 Triton X-100, 10 mM PBS, pH 7.4 içinde sulandırılmış% 1 BSA ve% 5 NGS). 500 ya da 1: 1000 her biri için sulandırma faktörü floresan ikincil antikor, genellikle 1 olan etiketli. Floresan ışıktan korumak sekonder antikorlar etiketli bir kara kutu 48-plaka koyun. 3B rotator oda sıcaklığında 3 saat - 2 inkübe edin.
Not: birden fazla ikincil antikor ihtiyaç varsa, inkubasyondan için aynı çözelti içinde kombine edilebilir. Çapraz etiketleme imkanı yoktur emin olun (örn., Keçi anti-tavşan ve tavuk anti-keçi ikincil antikorlar kullanarak) - Bir pipet kullanılarak ikincil antikor çözeltisi çıkarın ve oyuk başına 500 ul ~ 10 mM PBS, pH 7.4 3 yıkama yapar. 3B rotator oda sıcaklığında 5 dakikalık bir minimum her yıkama inkübe edin. Işıktan korumak için bir kutu olarak 48 oyuklu plaka tutun.
- Bir pipet kullanarak son PBS yıkama çıkarın ve Hoec oyuk başına ~ 100 ul ile değiştirinçekirdekleri etiketlemek için: hst 33.342 (10 mM PBS pH 7.4 2,000 1 seyreltilmiş). 3B rotator oda sıcaklığında 20 dakika - 15 inkübe edin. Işıktan korumak için bir kutu olarak 48 oyuklu plaka tutun. Uzun 20 dakika inkübe yapmayın.
- Bir pipet kullanılarak Hoechst çözeltisi çıkarın ve oyuk başına 500 ul ~ 10 mM PBS, pH 7.4 3 yıkama yapar. 3B rotator oda sıcaklığında 5 dakikalık bir minimum her yıkama inkübe edin. Işıktan korumak için bir kutu olarak 48 oyuklu plaka tutun.
- Gerekirse tüm adımlar birkaç saat, Hoechst inkübasyon hariç uzatılabilir. Herhangi bir aşamada reaksiyonu durdurmak için, sadece 10 mM PBS pH 7.4 ~ 500 ul örnekleri batırmayın ve protokol saat veya 1 sürdürmek için hazır olana kadar 4 o C'de 48 eh plaka (veya bölme slayt) saklamak - 2 gün sonra .
7. Dağı Koklear slaytlar açar
- Etiket kullanılan örnek ve antikorlar konusunda ilgili bilgiler slaytlar.
- Pipet montaj medya ~ 50 ul her slayt üzerine ve dikkatli olmakkabarcıklarını engellemek için. Herhangi bir kabarcıklarını çıkarmak için montaj ortamı içeren tüp santrifüj.
- 4. veya 5. düz kuyumcu forseps kullanarak, hafifçe montaj medyada slayt ve yere 48 plaka itibaren bir koklear dönüş transfer spiral ganglion aksonları kavramak. Slayt başına Dağı tek koklear dönüş görüntüleme işlemi sırasında ışığa maruz ve photobleaching önlemek için.
- Koklear dönüş, katlanmış bükülmüş veya hava kabarcığı yakın olmadığından emin olmak için bir stereo diseksiyon mikroskobu kullanın. Bu koşullardan herhangi biri meydana gelirse, kullanım # 4 ya da 5. düz kuyumcu forseps koklear dönüş yeniden konumlandırmak için.
- Slayt üzerinde bir lamel bir ucunu yerleştirin ve yavaşça lamel düşmesine izin için bırakın.
- Koklear dönüş, katlanmış bükülmüş veya hava kabarcığı yakın olmadığından emin olmak için bir stereo diseksiyon mikroskobu kullanın. Bu koşullardan herhangi biri meydana gelirse, yavaşça koklear dönüş yeniden konumlandırmak için ileri ve geri lamel hareket ettirin.
- Yer slaytlarböylece bir slayt klasörüne onlar düz koymak. Montaj edelim medya kür O / oda sıcaklığında N (DARK tutmak)
- Net oje ve mağaza oda sıcaklığında veya -20 o C Seal lamelleri kadar görüntülenmiş. Slaytlar slayt klasör veya slayt kutusunda saklanabilir.
NOT: Slaytlar -20 o C veya -80 o C ve floresan uzun süreli saklanabilir birkaç ay için muhafaza edilecektir. - Immün işlemi sırasında kullanılan ikincil antikorlar göre uygun dalga boyunda bir konfokal mikroskop kullanılarak Görüntü slaytlar. Parlaklık ve kontrast ayarı konfokal satıcı tarafından sunulan görüntüleme yazılımı kullanılarak gerçekleştirilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Biz üç bozulmamış koklear döner (apeks, orta ve tabanı) Şekil 1'de sunulan anahtar diseksiyon adımlarla, kalsifiye olan koklear dokudan olarak Corti organı izole etmek için bir yöntem mevcut. Gelişiminin ilk doğum sonrası haftasında, kalsifikasyon sırasında Fare koklea eksiktir ve daha basit bir diseksiyon yöntemi 13 kullanılabilir. Corti organı P7 gelen kokleadaki ve gözyaşları içinde eski fareler sonuçları ve parçalama ile neonatal tüm montaj diseksiyonu yöntemi kullanarak. Spiral ligament / yan duvar artık daha sıkı bağlı olduğu ve zarar vermeden uzak duyusal epitel soyulmuş edilemez. Böylece "yetişkin" tüm montaj diseksiyonu yöntemi P6 daha eski örnekler için gereklidir. Biz disseke ve saç hücresi ve destekleyici hücre belirteçleri (Şekil 2) ile boyanmış olan bir P15 fare Kokleanın orta dönüş bir örnek sunuyoruz. Optik kesitleri cBir de tüm montaj tekniği (Şekil 3) ile elde edilebilir.
Birkaç sorunlar tüm montaj diseksiyonu sırasında veya koklear monte ederken slaytlar açar olabilir. Spiral bağ / yan çeperinin uzaklaştırılması sırasında, çok fazla ya da yeterli kesme arasında dar bir penceresi vardır. Dış saç hücrelerinin son satırın yanında meydana gelen keser çeşitli açılarda (Şekil 4A) de takmak için bu son satırda saç hücrelerinin neden olabilir. Çok büyük Cuts Corti (Şekil 4B) organ bölümleri kaldırabilirsiniz. Forseps ile numuneyi Taşıma büyük özen gösterir ve genellikle forseps yanlış edildi Corti organı (Şekil 4C) delikler vardır. Koklear dönüşler monte ederken son olarak, Corti organı görüntüsü (Şekil 4D) gizler hangi katlayabilirsiniz.
Şekil protokol adımı 5.1.4 sonra "Yetişkin" Whole Dağı Diseksiyon Fare Cochlea. (A) 1. Önemli Adımlar, koklea bazal kıvrımı orta / apikal döner ayrılmış, ama yine de vestibüler bölgeye takılır. protokol adımı 5.3.3, orta dönüş apikal dönüş ayrıldıktan sonra (B). sarmal bağ / yan duvar kaldırılır orta dönüşün tamamlanan diseksiyon (C) Örnek. büyük halini görmek için tıklayınız bu rakamın.
Orta 2. Konfokal Dilim Resmi ŞekilBir P15 Fare İzole çevirin. Dört 20x görüntüleri bütün orta dönüş yeniden üst üste. (: 1000 seyreltme 1) (kırmızı), bir maymun anti-tavşan Alexa 488-konjuge sekonder antikor ile birlikte: (200 seyreltme 1) Saç hücrelerin, birincil antikor VIIa'nın bir tavşan anti-miyozin etiketlenir. (: 1000 seyreltme 1) (yeşil) eşek anti-keçi Alexa 568-konjuge sekonder antikor ile birlikte: (500 seyreltme 1) desteklemek hücreler, bir keçi anti-Sox2 primer antikor ile etiketlenir. Hoechst (mavi) tüm çekirdeklerin etiketler. Görüntü 405, 488, ve 555 dalga boyları ile bir Zeiss LSM 700 konfokal mikroskop kullanılarak alınmıştır. Ölçek çubuğu = 100 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Orta Şekil 3. Optik Kesit İzole çevirin 6 haftalık Eski Mouse. (A) XZ düzleminde (üst) 'de bütün montaj hazırlanması (alt) ve optik kesiti Konfokal kesit görüntüsünü. (B) (A)' daki üst panel büyütme Artan kaldırıldı hedef tahtalı. (: 1000 seyreltme 1) (kırmızı), bir maymun anti-tavşan Alexa 647-konjuge sekonder antikor ile birlikte: (200 seyreltme 1) Saç hücrelerin, birincil antikor VIIa'nın bir tavşan anti-miyozin etiketlenir. (: 1000 seyreltme 1) (yeşil) eşek anti-keçi Alexa 568-konjuge sekonder antikor ile birlikte: (500 seyreltme 1) desteklemek hücreler, bir keçi anti-Sox2 primer antikor ile etiketlenir. Görüntü 405, 555, ve 647 dalga boyları ile bir Zeiss LSM 700 konfokal mikroskop kullanılarak alınmıştır. Ölçek çubukları = 20 mikron bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
/files/ftp_upload/53561/53561fig4.jpg "/>
Tüm Dağı Diseksiyon sırasında oluşuyor veya koklear Montaj yaparken slaytlar açar edebilirsiniz Şekil Sorunları 4. örnekleri. (A) Görüntünün sol tarafında, koklear doku birçok neden sonraki dış saç hücrelerinin son satıra kesildi Bu hücreler değişik açılarda monte edilecek. (B) Görüntünün sol tarafında Corti organı bir bölümü kesildi. (C) ortasında dış saç hücre bölgede delikli bir delik vardır görüntüsü. (D), Corti organı çeşitli yerlerde katlanır. 8 hafta eski fare cochleae - Görüntüler 4 alındı. Saç hücrelerin, birincil antikor VIIa'nın bir tavşan anti-miyozin ile etiketlenmiştir (1: 200 seyreltme) bir keçi anti-tavşan ile birlikte Alexa 488-konjuge sekonder antikor (1: 1000 seyreltme) ya da bir eşek anti-tavşan Alexa 488-konjuge sekonder antikor (1: 1000 seyreltme) (Eflatun). C Dış saç cel olarak(: 1000 seyreltme 1) (yeşil) eşek anti-tavşan Alexa 568-konjuge sekonder antikor ile birlikte: (200 seyreltme 1) mı, bir keçi anti-Prestin primer antikor ile etiketlenir. Görüntüler, 405 ile 488 ve 555 nm dalga boylarında Leica SP5 konfokal mikroskop kullanılarak alınmıştır. Ölçek çubukları: AB içinde = 20 um; CD'de = 40 mm. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Başarılı tüm montaj diseksiyonu ve immün için birkaç kritik adımlar vardır. Bu yöntemlerden birini gerçekleştirilir Ancak önce, koklear dokusunun uygun sabitleme gereklidir. Biz metanol, ücretsiz, ultra saf, EM dereceli PFA kullanmanızı öneririz. PFA metanol ve immünofloresan kalitesini düşüren dengesiz bir pH izlerini olabilir toz yaptı. Diğer gruplar, benzer diseksiyon formaldehit 14-16 içermeyen kullanılarak mümkün olan sabitleyiciler olduğunu göstermiştir. Sabitleme uzunluğu da önemlidir ve antikor özgüdür. Diğerleri PFA sadece 1 saat ile iyi çalışmaz yok ederken bazı antikorlar (ancak bu nadir), bir O / N fiksasyonu tolere edebilir. Doku yıkılır olarak altında sabit doku diseksiyonu yöntemi için sorunlu olabilir. Bizim tecrübelerimize göre bir 3-4 saat tespit yeterli fiksasyon sağlar ve yaygın işitme alanında kullanılan primer antikorlar çoğunluğu engel değildir.
"jove_content> Bu EDTA primer antikorlar ile karışabilir olması da mümkündür;. Bu nedenle, bazı antikorlar, neonatal dokusunda iyi çalışır, ancak P7 ve sabitlemeden sonra dekalsifiye edildi eski dokuda olacaktır, temporal kemik zaman değişken miktarlarda önce depolanabilir Bazı antijenler tespit sonrasında hafta gün içinde dekalsifikasyon ve diseksiyon gerektirir. diğerleri (yumuşatma önce ya da sonra) yıl muhafaza edilebilir ise antijenlere bağlı Dekalsifikasyon immün kalitesini düşürmeden, incelenen. Biz temporal kemik olarak depolama örnekleri tavsiye bağlı mantar veya bakteriler ile 48 oyuklu plaka ve potansiyel kirlenme depolama ortamı (PBS) buharlaşma riski vardır. Genellikle immün önceden bütün montaj diseksiyon az bir hafta daha gerçekleştirin.Bir kez sabit ve dekalsifiye, tüm montaj diseksiyonu sıvı batık temporal kemik ile yapılır. Aşırı kemik ve yumuşak ÇıkarmaDiseksiyon erken labirent çevreleyen doku doku manipülasyonu kolaylaştırmak ve kritik yapıların daha az belirsiz bir görünüm sağlayarak ileriki aşamalarında spiral ligament / lateral duvarda uzaklaştırılması yardımcı olacaktır. İlk birkaç adım gerçekleştirirken, forseps vestibüler bölgede doku tutmak için de kullanılabilir. Ancak döner izole kez, o Corti ya da spiral ligaman / lateral duvar organ forseps yerleştirerek önlemek için önemlidir. Bunun yerine, forseps kapalı tutun ve silikon elastomer kaplı diseksiyon çanak spiral ganglion sinir liflerini pin. Doku gözyaşı gibi bu bölgede tutunmaya etmeyin. Genel olarak, bir kez doku kavrama, üç döner ayrılmıştır ve çekme manevraları genellikle Corti organı zarar veren ve kaçınılmalıdır öngörülemeyen sonuçlara neden olabilir. Genç hayvanlarda (P7-P21) dan Doku P21 daha yaşlı hayvanlarda doku daha affedici olma eğilimindedir. Saç hücre d ek olarak, koklear örnekleriincelemek için daha zor Amage vardır. Fare gürültü maruziyetini aldıysanız doku, özellikle kırılgan. Ne olursa olsun doku devlet, biz sunuyoruz diseksiyon teknik zorlu ve yeterlilik için birçok uygulama girişimleri gerektirir.
Immün sırasında, her koklear dönüş üstünde yüzen değil, sıvı batık ya da iyi tarafına yapışmış olması önemlidir. Bu doku içine triton ve antikor daha tam nüfuz etmesini sağlar. Her bir sıvıyı sökerken, bu koklear dönüş kaybetmek ya da pipet içine hazırlamak kolaydır. Bir diseksiyon kapsamı kullanarak 200 ul pipet ile çözümler Değişen bu önlemeye yardımcı olur. Yavaş yavaş sıvı çıkarmak ve koklear dönüş çok yakın alırsa pipet hareket ettirin. Ayrıca temiz bir tüpe atık çözümü pipetteting bir dönüş yanlışlıkla pipet içine çekilir, bu atık borusu aranabilir olarak iyi bir strateji olabilir. Dönüş pipet, t sıkışmış iseo ucu bir jilet ile açık kesilebilir, ancak bu oluşursa genellikle Corti organı hasar görür.
Sorun giderme immün antikorlar, bu tür antijen alma veya sinyal donanım olarak ek adımlar eklenebilir zaman. Düşük pH ve yüksek pH antijeni satın alınabilir unmasking tepkin madde vardır. Bir antikor burada tarif edilen yöntem ile çalışmazsa, deneyin birinci protokol değişikliği bu antijen geri alım yöntemlerden biridir. Alternatif şekilde bir sinyal arttırıcı kullanılacaktır. Sekonder antikor sinyali amplifiye etmek için kullanılabilir immün öncesi veya tiramid amplifikasyon kitleri kullanmak için ticari olarak temin edilebilir bir çözüm bulunmamaktadır.
Biz, bu tekniğin anlamı Corti organı üç boyutlu yapısını muhafaza etmek ve organ içindeki tüm hücreleri görselleştirmek yeteneğidir. Koklea tüm uzunluğu sadece üç döner ayrılır diğer benzer teknikler, yani inci süreimmun ve görüntüleme süreçleri manevra örneklerin sayısını artırarak, 10 adet 6-8 - e Bohne ve Liberman yöntemleri, 5 içine bölünme gerektirir. Cosgrove ve Gratton'un tarafından geliştirilen koklear yanal duvar diseksiyonu beceri benzer düzeyde gerektirir ve dekalsifiye dokuda yanı sıra, sabitlenmemiş, taze doku mümkündür, ancak Corti organı izole sürecinde uzak elimden ve tahrip Yanal duvar 17. Başka bir grup bozulmamış organı bırakarak, spiral ligament / yan duvar kavradı ve uzak Corti organı şeritli üç haftalık sıçanlardan sabitlenmemiş, taze koklear dokuda benzer diseksiyonu yürüttü. Ancak bu sadece apikal da 5 elde edildi. Uzakta Corti organı spiral ligament / yanal duvar soyulması yöntemi bir genç fare (<P7) 13 sabit doku diseksiyonu için rutindir. Ancak, tespit bir sonra farelere P6 daha yaşlı, bizim deneyimd Dekalsifikasyon, bu manevra genellikle güvenilmez bir biçimde Corti organı gözyaşları. Ayrıca burada açıklanan prosedür orta ve bazal izolasyonu de döner verir.
Parafine sonra elde edilen Cryosections ve bölümleri de yaygın işitsel alanda kullanılmaktadır. Bu yöntemler, stria vaskularis, Reissner en membran örtü oluşturan ve zar olarak diğer yapıların görselleştirme izin, henüz her bölümde yalnızca her koklear sırayla Corti organı küçük bir bölgenin görselleştirme sağlar. Böylece kesit yöntemi ile bu tür hücre kaybı veya hücre bölünmesi gibi mozaik desen meydana gelen olayları, araştırmak, 50 veya daha fazla slaytlar lekeli ve koklea tüm uzunluğu yakalamak için görüntülü gerekmektedir. Buna karşılık, tüm montaj diseksiyonu protokolü sadece üç adet Corti tüm organı hazırlama avantajına sahiptir. Corti organı uzunlamasına mimarisini koruyarak, bu tec yararına ek olarakhnique basitleştirilmiş veri toplama ve saklama sağlar. Tüm montaj diseksiyonu bir sınırlama böyle spiral ligaman, stria vaskularis, Reissner en membran örtü oluşturan ve zar olarak yapıları çevreleyen yok olmasıdır. Başka bir sınırlama tek diseksiyon için teknik zorluk ve zaman uzunluğudur. Spiral ligament / yan duvarı çıkartırken Bu durum hata için Corti organı ve küçük bir farkla kırılgan doğasına çoğunlukla. 30 dakika - Once hakim bir koklea tüm montaj diseksiyonu yaklaşık 20 yapılabilir.
Yukarıdaki protokol erişkin fare için bir bütün montaj diseksiyon yöntemi tarif ederken, biz işitme alanda kullanılan diğer model organizmalar için bu tekniği uygulamak istiyoruz. Bizim laboratuvar şu anda sıçan Kokleanın diseksiyonu için bu tekniği modifiye edilir. Sıçan büyük koklea daha yoğun fare daha kalsifiye bir kalın otik kapsül kaplı. Böylece temporal kemik e gerekmektedirBüyük makasla xcised. EDTA ile fiksasyon ve yumuşatma önce, otik kapsül koklear dokuya daha iyi erişim sağlamak için makas ile açılmalıdır. Ayrıca Dekalsifikasyon süreci uzundur ve numune yaşına bağlı olarak 3 hafta kadar sürebilir. Tüm montaj diseksiyonu için, kemik labirent boyutu tekniğini etkiler. Sıçan koklea artan boyutu bireysel kesimler için hata büyük bir marj sağlayarak, spiral ligament / lateral duvar ve Corti organı arasında biraz daha büyük bir mesafe sağlar. Bununla birlikte, daha büyük bir doku örneğinden manipülasyonu için kavramak için daha fazla malzeme özellikleri sağlamakla birlikte, aynı zamanda, spiral bağ / yan duvarın tüm uzunluğu boyunca kaldırmak için kesim daha fazla sayıda gerektirir. Biz benzer değişiklikler chinchilla, gerbil, ve kobay gelen Kokleanın diseksiyonu için yapılmış olabilir inanıyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | can be purchased from other vendors |
| 10.5 cm fine scissors | Fine Science Tools | 14060-11 | can be purchased from other vendors |
| 2 ml microcentrifuge tubes | MidSci | AVSS2000 | can be purchased from other vendors |
| 16% formaldehyde, methanol free, ultra pure, EM grade | Polysciences | 18814 | TOXIC --wear gloves and cannot be disposed of in the sink. Can be purchased from other vendors. |
| PBS pH 7.4 | Sigma | P3813-10PAK | can be purchased from other vendors |
| EDTA | Fisher | BP118-500 | can be purchased from other vendors |
| end-over-end tube rotator | Fisher | 05-450-127 | can be purchased from other vendors |
| 60 mm petri dish | Fisher | 50-202-037 | can be purchased from other vendors |
| Dow Corning Sylgard 184 silicone encapsulant kit | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| activated charcoal | Fisher | AC134372500 | can be purchased from other vendors |
| stereo dissection microscope | Zeiss | Stemi 2000 | can be purchased from other vendors |
| Dumont #4 jeweler's forceps | Fine Science Tools | 11241-30 | |
| Dumont #5 jeweler's forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| 2.5 mm Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15001-08 | curved |
| 5 mm Vannas-Tubingen spring scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | straight |
| 48-well plates | Fisher | 08-772-52 | can be purchased from other vendors |
| 8-well chamber slides | Fisher | 1256518 | can be purchased from other vendors |
| Triton X-100 | Sigma | X100-500 | can be purchased from other vendors |
| BSA, fraction V | Fisher | BP1605 | can be purchased from other vendors |
| NGS | Vector labs | S-1000 | can be purchased from other vendors |
| NHS | Vector labs | S-2000 | can be purchased from other vendors |
| 3D rotator | Midsci | R3D-710 | can be purchased from other vendors |
| Western blot incubation box XL | Licor | 929-97401 | |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | can be purchased from other vendors |
| Prolong gold antifade mounting media | Life Technologies | P36930 | can be purchased from other vendors,but mounting medias vary in their ability to protect against photobleaching |
| Superfrost Plus Slides | Fisher | 12-550-15 | can be purchased from other vendors |
| coverslips 22 x 22 x 1 | Fisher | 12-548-B | can be purchased from other vendors |
| clear nail polish | Local drug store | can be purchased from other vendors | |
| cardboard slide folder | Fisher | 12-587-10 | can be purchased from other vendors |
| plastic slide box | Fisher | 03-448-10 | can be purchased from other vendors |
References
- Robles, L., Ruggero, M. A.
- Ehret, G., Frankenreiter, M. Quantitattive analysis of cochlear structures in the house mouse in relation to mechanisms of acoustical information processing. J Comp Physiol. 122, 65-85 (1977).
- Ou, H. C., Bohne, B. A., Harding, G. W. Noise damage in the C57BL/CBA mouse cochlea. Hear Res. 145 (1-2), 111-122 (2000).
- Engstrom, H., Ades, H. W., Andersson, A. Structural pattern of the organ of Corti. A systematic mapping of sensory cells and neural elements. , Almqvist and Wiksell. (1966).
- Grant, L., Yi, E., Goutman, J. D., Glowatzki, E. Postsynaptic Recordings at Afferent Dendrites Contacting Cochlear Inner Hair Cells: Monitoring Multivesicular Release at a Ribbon Synapse. J Vis Exp. (48), e2442 (2011).
- Bohne, B. A., Harding, G. W. Processing and analyzing the mouse temporal bone to identify gross, cellular and subcellular pathology. Hear Res. 109 (1-2), 34-45 (1997).
- Bohne, B. A., Harding, G. W., Ou, H. C. Handbook of Mouse Auditory Research. Willott, J. , CRC Press. 171-187 (2001).
- Eaton-Peabody Laboratories. Video Tutorial for Cochlear Dissection. , Massachusetts Eye and Ear. Available from: http://www.masseyeandear.org/research/otolaryngology/investigators/laboratories/eaton-peabody-laboratories/epl-histology-resources/video-tutorial-for-cochlear-dissection/ (2015).
- Weber, T., et al. Rapid cell-cycle reentry and cell death after acute inactivation of the retinoblastoma gene product in postnatal cochlear hair cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (2), 781-785 (2008).
- Yu, Y., et al. In vivo proliferation of postmitotic cochlear supporting cells by acute ablation of the retinoblastoma protein in neonatal mice. J Neurosci. 30 (17), 5927-5936 (2010).
- Steigelman, K. A., et al. Polycystin-1 Is Required for Stereocilia Structure But Not for Mechanotransduction in Inner Ear Hair Cells. J Neurosci. 31 (34), 12241-12250 (2011).
- Liu, Z., et al. Age-dependent in vivo conversion of mouse cochlear pillar and Deiters' cells to immature hair cells by Atoh1 ectopic expression. J Neurosci. 32 (19), 6600-6610 (2012).
- Parker, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. Primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of Corti. J Vis Exp. (36), e1685 (2010).
- Burns, J. C., On, D., Baker, W., Collado, M. S., Corwin, J. T. Over half the hair cells in the mouse utricle first appear after birth, with significant numbers originating from early postnatal mitotic production in peripheral and striolar growth zones. J Assoc Res Otolaryngol. 13 (5), 609-627 (2012).
- Collado, M. S., et al. The postnatal accumulation of junctional E-cadherin is inversely correlated with the capacity for supporting cells to convert directly into sensory hair cells in mammalian balance organs. J Neurosci. 31 (33), 11855-11866 (2011).
- Meyers, J. R., Corwin, J. T. Shape change controls supporting cell proliferation in lesioned mammalian balance epithelium. J Neurosci. 27 (16), 4313-4325 (2007).
- Gratton, M. A., Rao, V. H., Meehan, D. T., Askew, C., Cosgrove, D. Matrix metalloproteinase dysregulation in the stria vascularis of mice with Alport syndrome: implications for capillary basement membrane pathology. Am J Pathol. 166 (5), 1465-1474 (2005).
