Summary
我々は、マウスの耳と尾から初代線維芽細胞を生成するための簡単かつ迅速に実験手順を説明します。手順は、特別の動物の訓練を必要とせず、最大10日間室温で保存された耳からの線維芽細胞培養物の生成のために使用することができます。
Abstract
初代細胞は、組織から直接誘導され、確立された細胞株よりも、インビボでの細胞の生理学的状態をより代表すると考えられています。しかし、初代細胞培養は通常、有限の寿命を有しており、頻繁に再確立される必要があります。線維芽細胞は、初代細胞の容易にアクセス可能な供給源です。ここでは、マウスの耳と尾からの一次線維芽細胞培養物を確立するための簡単かつ迅速な実験手順を説明します。プロトコルは、最大10日間室温で保存された耳からの一次線維芽細胞培養物を確立するために使用することができます。プロトコルを注意深く続く場合、汚染は、場合によっては長時間保存された非滅菌組織を使用しても発生しにくいです。線維芽細胞は、培養液中で急速に増殖し、複製老化を受ける前に、かなりの数に拡張することができます。
Introduction
初代細胞は 、in vitro条件下で組織培養を生きから誘導されます。それは一般的に一次細胞は、より密接に生理学的状態、それらが不死化より由来する組織または腫瘍細胞株1の遺伝的背景に似ていることが想定されます。そのため、一次細胞は、生物学的な質問の2,3を研究するための有用なモデルを表します。しかし、無制限に成長する樹立細胞株とは異なり、一次細胞培養物は、最終的に老化を受け、頻繁に再確立される必要があります。
一般的に使用される一次細胞は、線維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、T細胞、B細胞、骨髄由来マクロファージ（BMDM）及び骨髄由来樹状細胞（BMDC）を含みます。線維芽細胞は、多くの場合、一次細胞培養モデルとして利用されます。彼らは、他の一次細胞を超える重要な利点を提供します。細胞培養物は、簡単に容易に維持し、設立され、何のpurificaを必要とされていません培養前の細胞の化。彼らは、迅速な初期の増殖および特殊な媒体や活性化のプロトコルのための要件があります。線維芽細胞は、効率的に4,5、生物学的、化学的、および物理的なプロトコルを使用してトランスフェクトすることができます。細胞培養を確立する前に、室温で最大10日間の耳を格納する可能性があります。線維芽細胞培養物は、細胞質プロセスの可視化に資すると人工多能性幹（iPS）細胞6に再プログラミングするのに適しています。
線維芽細胞は、コラーゲンタンパク質及び細胞外マトリックス7を分泌する結合組織の重要な細胞です。彼らは多くの組織8の構造フレームワークを提供し、創傷治癒および組織修復9,10において重要な役割を果たしています。
ここでは、マウス11の耳と尾から線維芽細胞培養物を確立するための簡単かつ迅速（<4時間）プロトコルを記述します。プロトコルは、最小限のマウスが必要です経験は、（他のプロトコル12,13とは対照的に）組織を採取し、最大10日間室温で媒体に記憶された耳からの培養物を確立するために使用することができます。
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Protocol
マウスを安楽死（シンガポール国立大学の施設内動物管理使用委員会（IACUC）のガイドラインおよび実験動物研究のための国家諮問委員会（NACLAR）ガイドライン）まで機関のガイドラインに準拠して無菌状態で飼育しました。
1.マウス
- 適切な遺伝的背景の一つにマウスを注文。このプロトコルは、1つのC57BL / 6マウス由来の組織に基づいています。
完全培地の調製
- 10％ウシ胎児血清（FCS）、50μM2-メルカプトエタノール、100μMのアスパラギン、2mMグルタミン、1％ペニシリン - ストレプトマイシン溶液：ロズウェルパーク記念研究所（RPMI）1640培地に、以下の成分を添加することによって、完全培地を調製します。
酵素液の調製
- 15ミリリットルコニカルチューブ中のコラゲナーゼD溶液を調製します。
- コラゲナーゼD・ディ10mgを秤量4ミリリットルでssolveコラゲナーゼD完全培地。
- 1.7ミリリットルのマイクロチューブにプロナーゼ溶液を調製します。
- プロナーゼ10mgを秤量します。
- 1Mトリス緩衝液（pH8.0）の5μLを追加します。 0.5 M EDTA（pH8.0）を1μLを加えます。
- 滅菌水494μlのアップトップ。
- 30分間、水浴中で37℃でのプロナーゼ溶液をインキュベートします。
コラゲナーゼD-プロナーゼミックスの4準備（≤2尾）
注：無菌細胞培養フード内の後続の手順を実行します。
- コラゲナーゼDの溶液4mlにプロナーゼ溶液の250μlのを追加します。
- 滅菌15ミリリットルコニカルチューブに0.2μmのシリンジフィルターを通してコラゲナーゼD-プロナーゼ混合物を渡します。
耳としっぽ組織からの線維芽細胞の5抽出
- 適切な機関のガイドラインに従ってマウスを安楽死させます。
- 細胞培養フード内でオートクレーブ処理手術器具（ハサミやピンセット）を配置します。
- 2つの10センチ細胞培養皿それぞれに10ミリリットルを完全培地を追加します。
- 耳（〜1cmの半径）とはさみでマウスの（尾の先端から）尾の5センチカットし、滅菌50mlコニカル底チューブに40ミリリットルの70％エタノールで5分間インキュベートします。
- 空気乾燥耳と尻尾5分間フード内で開いた10cmの細胞培養皿に置くこともできます。ステップ5.3で説明したように10ミリリットルを完全培地を含む「耳」と「テール」と表示された2つの培養皿に乾燥後、転送耳と尾の部分。
- はさみを使用して、耳と尻尾から髪を削除します。
- はさみを使用して、サイズが3ミリメートル未満の片に耳と尻尾を切ります。
- 「耳」と「テール」と表示された1.8ミリリットルクライオチューブバイアルにカット組織を移し、バイアルに1.8ミリリットルのマークに到達するために、ボリュームのために十分なコラゲナーゼD-プロナーゼ溶液を添加。
- Pシェーカー上で水平にクライオチューブバイアルレース、37℃で90分間、200rpmでサンプルを振ります。
- 90分間のインキュベーション後、シェーカーからクライオチューブバイアルを削除し、フード内でバイアルを配置します。
- 2つの10センチ細胞培養皿、標識された「耳」と「テール」それぞれに10ミリリットルを完全培地を追加し、各皿に70μmのセルストレーナーを置きます。
- ステップ5.11で製造さに応じてラベル皿に70μmのセルストレーナーで消化耳と尾の組織を置き、強制的に> 5分間10mLのシリンジプランジャーを使用して組織を挽きます。セルストレーナーの外に細胞を洗浄するために培地中で時折セルストレーナーを振ります。
- 「耳」と「テール」というラベルの付いた2つの15ミリリットルコニカルチューブに各皿から細胞懸濁液をピペット。さらに10 mlの一品とストレーナーを洗浄し、完全培地および適切な15ミリリットルコニカルチューブに培地を追加します。
- 細胞をスピンダウン〜580 XGと冷蔵細胞遠心機を用いて4℃で7分間のサスペンション。
- 上清を除去し、15ミリリットルコニカルチューブ内の細胞ペレットに完全培地10ミリリットルを加えて細胞を懸濁します。
- 繰り返しステップ5.14と5.15。
細胞混合物の6培養
- 上清を取り除きます。細胞ペレットを邪魔されずに残っていることを確認してください。
- 10ml中の細胞完全培地を再懸濁し、「耳」と「テール」というラベルの付いた2つの10センチメートル細胞培養皿に、それぞれの混合物を追加します。
- 培養液に10μlのアムホテリシンB溶液（250 / mlのストック溶液）を追加します。
- 加湿した5％CO 2インキュベーター中37℃で細胞をインキュベートします。
- 三日目に、10 mlの破片（ 図1および2）を除去するために、アムホテリシンBの10μLを含む新鮮な完全培地を培地を交換してください。
線維芽細胞の7サブカルチャー
- WHEn個の培養物は、約70％コンフルエンシー（日培養の3-4）培地を除去し、5 mlの滅菌1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で細胞を洗浄するに至ります。
- PBSを削除し、セルに2ミリリットルの滅菌1×トリプシン-EDTA溶液を加えます。
- 加湿した5％CO 2インキュベーター中、37℃で5分間、細胞をインキュベートします。
- 5分後、静かに培養皿をタップし、細胞に6ミリリットルを完全培地を追加します。
- 15 mlのコニカルチューブに細胞懸濁液を移し、冷蔵細胞遠心機を使用して〜450×gで、4℃で5分間チューブをスピン。
- 上清を除去し、静かに5ミリリットルの完全培地中で細胞ペレットを再懸濁。
- シード2×10 10cmの細胞培養皿で5個の細胞と、手順7.6から7.1を繰り返す前に3~4日、37℃、加湿5％CO 2インキュベーター中で細胞を培養します。
出荷のための耳の8準備
注意：Tを実行彼無菌細胞培養フード中でその後の工程。
- 適切な機関のガイドラインに従ってマウスを安楽死させます。
- 細胞培養フードにオートクレーブ処理ハサミやピンセットを配置します。
- 50ミリリットルコニカルチューブに50ミリリットルを完全培地を追加します。
- はさみでマウスの耳（〜1cmの半径）をカットします。
- ピンセットを用いて（ステップ3で調製した）を50mlのコニカルチューブに耳を転送します。
- 適切なボックスにRTで出荷する前にパラフィルムで50mlコニカルチューブを密封。
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Representative Results
組織破片のかなりの量の組織の結果からの線維芽細胞の抽出（ 図1）。組織片とは対照的に、線維芽細胞を1日培養の3との間の組織培養プラスチック表面に付着します。線維芽細胞培養物の培地は、安全に大幅文化（ 図2）に存在するデブリのレベルを減少させるべきである文化、の3日目に変更することができます。線維芽細胞は、細長い形態とはっきりと見える細胞質（ 図1および2）を表示 。有糸分裂細胞は、以降の文化の3日目から存在していなければならないと細胞は、培養の3〜4日以内に、細胞集密度の70〜80％に到達する必要があります。 10cmの培養皿で耳と尾組織からの収量は4〜5〜5×10（耳）と文化の3日目の5×10 6個の細胞（尾）の範囲です。線維芽細胞の単離の三日後、細胞を継代することができ、10cmの培養皿あたり2×10 5細胞で播種しました。
10日間室温で保存された耳からの線維芽細胞の抽出は、培養5〜6日以内に70〜80％の細胞集密度（ 図3）を生じるはずです。 5日後に10センチ培養皿あたり2×10 5個の細胞で細胞を播種することも、文化の3〜4日以内に、約1×10 6細胞を生じさせる必要があります。長期保存には、線維芽細胞（データは示さず）我々の経験で老化を入力するのにかかる時間に影響を与えません。
培養3日後に細胞の身元を確認するために、細胞は、上記のプロトコルを使用した線維芽細胞のマーカーであるビメンチン14のために標識することができるビメンチン染色（ 図4）で示したように、私たちは日常的に純粋な線維芽細胞培養物を得ます。
前の媒体の変化に後3日目の抽出の図1線維芽細胞培養。文化の3日目に存在する細胞の破片（白矢印）の代表的な明視野像。画像は、光学顕微鏡を用いて100倍の倍率で撮影されました。スケールバーは100μmを表す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
新しい培地の添加後後3日目の抽出の図2線維芽細胞培養。文化の中で3日目に線維芽細胞の代表的な明視野像。画像は、光学顕微鏡を用いて100倍及び320倍の倍率で撮影されました。スケールバーは100μmを表す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3. 10日間室温で保存された耳組織から後3日目の抽出の線維芽細胞培養。文化の中で3日目に線維芽細胞の代表的な明視野像。画像は、光学顕微鏡を用いて100倍及び320倍の倍率で撮影されました。スケールバーは100μmを表す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
ビメンチンのための線維芽細胞培養物の図4.標識。文化の3日目に、耳と尾の線維芽細胞の代表的な共焦点画像。組織から抽出された線維芽細胞はビメンチン（赤）およびDAPI（青）のために標識しました。蛍光画像は共焦点MICROSによって取得しましたコピー。スケールバーは10μmで表しています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
ここでは、マウスの耳と尾からの一次線維芽細胞培養物を確立するために、単純な、安価で高速な実験手順を提供します。抽出は、組織の3日後に分離以内に付着し、急速に分裂する線維芽細胞を生じるはずです。初代細胞の重要な制限は、老化、永久的な増殖停止15です。プロトコルを使用して、線維芽細胞培養物は、サイズの増加（2〜3倍の増加）と拡大に失敗、線維芽細胞が老化する前に、5〜6回継代細胞の平坦化によって示すことができます。
線維芽細胞の単離を行う場合は、注意が線維芽細胞の回収率が低いことになります不十分な切断または消化として、組織の破壊時に支払わなければなりません。これは、線維芽細胞の数を増やすために、耳と尾の線維芽細胞をプールすることが可能です。同様に処理腹膜及び肺組織を含む追加の組織Tを増加させるために添加することができます線維芽細胞の彼は数。デブリは、線維芽細胞抽出培養後に存在しているが、それは、線維芽細胞が細胞培養皿に付着する時間を取るようにのみ三日後に培地を変更することをお勧めします。
プロトコルの潜在的な制限は、非滅菌組織や微生物汚染の可能性関連の使用です。汚染のリスクを軽減するために、耳と尻尾は、線維芽細胞を回収する前に70％エタノール中でインキュベートします。さらに、抗真菌剤アムホテリシンBは、線維芽細胞の培養物を確立する際に、一般的な問題は、酵母および真菌の増殖を防止するために、初代培養に添加されます。媒体はまた、細菌汚染を防ぐために、ペニシリンおよびストレプトマイシンが含まれています。これらの注意を使用して、汚染はほとんど数日間室温で保持した耳と尾部からの線維芽細胞を確立する場合にも観察されません。
このプロトコルの主な利点の一つであるABIL性は、線維芽細胞の単離の前に最大10日間室温で培地中に保存した耳からの線維芽細胞を生成します。私たちは、ストレージ（70〜80％の密集度は、新たに単離された組織のための3-4日に比べて5〜6日以内に到達した）の10日後に耳の線維芽細胞培養の確立に緩やかに減少し、効率を観察しました。特急出荷が推奨されているが故に、マウスの耳には、標準の出荷を使用する研究者が交換することができます。我々の経験では、使いやすさは、耳や組織はほとんど実験手順のために使用されていないという事実を得るために、多くの場合、時間がかかりそうでなければ得ることであるかもしれない遺伝的に改変されたマウスの組織へのアクセスを可能にします。尾のために保存した後に、線維芽細胞の回収効率は広く変えることができると耳が出荷のために利用できない場合テールはのみ使用してください。組織の収穫は、マウスの処理に最小限の専門知識と訓練を必要とする。最後に、ほとんどの人は、プロトコルを実行することができるはずです。
プロトコルは、マウスだけの組織を使用してテストされていますが、理論的には、プロトコルをさらに最適化が必要になることがありますが、他の種の組織を使用して、線維芽細胞培養物の生成を可能にする必要があります。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI-1640 | HyClone | SH30027.01 | |
| Fetal Calf Serum | HyClone | SV30160.03 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Asparagine | Sigma-Aldrich | A4159 | |
| Glutamine | Sigma-Aldrich | G8540 | |
| Penicillin/Streptomycin | HyClone | SV30010 | |
| Ethanol | Merck Millipore | 107017 | Absolute for analysis |
| Collagenase D | Roche Diagnostics | 11088866001 | From Clostridium histolyticum, lyophilized, non-sterile |
| Pronase protease | Merck Millipore | 53702 | From Streptomyces griseus |
| Tris buffer (pH 8) | 1st BASE | 1415 | Ultra pure grade |
| 0.5M EDTA (pH 8) | 1st BASE | BUF-1053 | Biotechnology grade |
| 10X Phosphate Buffered Saline (PBS) | 1st BASE | BUF-2040-10X4L | Ultra pure grade |
| Trypsin-EDTA solution 10X | Sigma-Aldrich | 59418C-100ML | 0.5% trypsin, 0.2% EDTA, trypsin gamma irradiated by SER-TAIN process, without phenol red, in saline |
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2492-20ml | 250 μg/ml in deionized water, sterile-filtered |
| Scissors | Aesculap | ||
| Forcep | Aesculap | AE-BD312R | |
| 0.2 μM syringe filter | Sartorius Stedim | 16534 | |
| 70 μM cell strainer | SPL | 93070 | |
| Syringe plunger | Terumo | SS+10L | |
| Cryovial tube | NUNC | 368362 | |
| 1.7 ml microcentrifuge tube | Axygen | MCT-175-C | |
| 10 cm cell culture dish | Greiner | 664160 | Cell culture treated dish |
| 15 ml conical bottom tube | Greiner | 188271 | |
| 50 ml conical bottom tube | Greiner | 227261 | |
| Water bath | GFL | 1002 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Incubation shaker | Sartorius Stedim | Certomat-BS1 | |
| Zeiss Axiovert 25 light microscope | Carl Zeiss AG |
References
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