Kvantificering af cerebral vaskulær arkitektur ved hjælp af to-foton mikroskopi i en musemodel af HIV-induceret Neuroinflammation

Introduction

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) invaderer hjernen under den akutte fase af virusinfektion og produktivt inficerer både microglia og hjerne residente makrofager, hvilket fører til deres aktivering - og frigivelse af begge værtsafledte inflammatoriske mediatorer og opløseligt HIV-1 virotoxins som Tat og gp120 (revideret ⁱ 1,2). Som følge heraf bliver en kronisk neuroinflammatoriske, der er etableret i CNS, hvilket menes at bidrage til patogenesen af HIV-1 associeret neurokognitive Disorders (hånd) ^3-5.

Kronisk overekspression af HIV-1 Tat eller interleukin (IL) -17a i CNS hos mus har vist sig at resultere i mikrovaskulære fortynding ^6,7. Dette giver den mulighed, at kronisk neuroinflammation kan bidrage til patogenesen af ​​hånden gennem virkninger på de cerebrale kar. For yderligere at undersøge dette spørgsmål, har vi udviklet metoder til at kvantificere cerebrale vaskulære Structurer.

Dette papir beskriver en fremgangsmåde til kvantificering af antallet af kapillære knudepunkter, kapillære segmenter, betyder segmentlængde, total segmentlængde, betyder kapillær diameter, og den samlede kapillarvolumen hjælp in vivo billeddannelse af kapillære netværk gennem et tyndt kranium cortical vindue (modificeret fra den tidligere beskrevne protokoller) ^8,9, samt ex vivo billeddannelse af hjernen sektioner, ved anvendelse af to-foton mikroskopi. Dette kombineret tilgang giver en holistisk kvantificering af cerebrale vaskulære parametre, da in vivo tynde kranium kortikal vindue giver mulighed for bevarelse af den cerebrale miljø, mens ex vivo billeddannelse af kapillarnetværk i hjernen skiver muliggør genopbygning af komplette, tre-dimensionelle kapillære netværk - som derefter kan kvantificeres ved anvendelse af kommercielt tilgængeligt software.

Protocol

University of Rochester University Komité for Dyrs Resources godkendt alle procedurer udføres i dette papir.

1. Præ-kirurgisk forberedelse (og mus)

1. Forbered kirurgiske område med alle nødvendige udstyr. Sterilisere alle værktøjer, der anvendes under proceduren på forhånd ved hjælp af 70% ethanol. Eventuelt bruge en glas-perle sterilisator eller autoklavere at sterilisere redskaberne.
2. Placer musen i et isofluran induktion kammer forbundet til en isofluran fordamper. Set isofluran niveauer til 4% ved en hastighed på 1 l / min.
   Bemærk: til forsøgene rapporteret her, mus med en doxycyclin (DOX) inducerbart HIV-1-Tat transgen drevet af astrocyt-specifikke gliafibrillært protein (GFAP) promotor (HIV Tat-Tg mus) ^{10 blev} anvendt til at undersøge effekten af HIV -1 induceret neuroinflammation på cerebral vaskulær struktur, som tidligere beskrevet ^7,10.
3. Forsigtigt tip induktion kammer at observere mus &# 39; s opretningsrefleksen. Når opretningsrefleksen er undertrykt, indstille isofluran niveau til 2% og omdirigere luftstrømmen fra induktion kammer til næsekeglen på operationsstedet bænk.
4. Hurtigt flytte musen fra induktion kammer til vandet infunderes varmepude. Fortsæt med at anvende isofluran (1,5-2%) gennem næsen kegle. Juster anæstesi efter individuel mus tolerance vurderes gennem respirationsfrekvens (RR) overvågning.
   Bemærk: depression af RR kan forstyrre fysiologiske gasparametre ændrer cerebral blodgennemstrømning og vurdering fartøj diameter. Forsøg på at holde RR 55-65 vejrtrækninger per minut. (HR) kan også anvendes vurdere dybden af ​​bedøvelse; holde HR mellem 300-450 slag i minuttet for at forhindre fysiologiske ændringer fartøj diameter. Typisk vil anæstesi være tilstrækkelig mellem 1,5-2,0% isofluran på 1 l / min for en given mus.
5. Udfør en tå knivspids for yderligere at kontrollere dybden af ​​bedøvelse. Hvis musen ikke reagerer, commdelse de kirurgiske procedurer.

2. Forberedelse af Thin-kraniet Kranie Window

1. Kunstigt tåre gel på øjnene af musen. Helt at fjerne hår fra hovedbunden af ​​musen med en saks eller en elektrisk barbermaskine.
2. Steriliser hovedbunden ved at anvende povidon-iod-opløsning; lad det tørre. Derefter, under et lysmikroskop, fjern skindet fra hovedbunden af ​​musen, helt udsætte parietale knogler, caudale frontale knogler, og bregma mærkning.
3. Anvende en lille mængde af en 10% ferrichloridopløsning til kraniet med henblik på at tørre membraner til nem fjernelse. Fjern de tørrede membraner med # 5/45 pincet ved forsigtigt at skrabe kraniet.
4. Påfør et tyndt lag lim omkring hovedpladen vinduet. Tryk forsigtigt hovedpladen mod kraniet af musen, holde området af interesse i midten af ​​vinduet. En dråbe dental cement til hovedpladen at polymerisere limen.
5. Påfør et tyndt lagaf lim langs kanten af ​​hovedpladen for at oprette et reservoir til at holde saltvand. Når limen er tørret, skru hovedpladen i musen hovedpladen sele.
   Bemærk: musen hovedpladen seletøj anvendes i denne procedure er en struktur med en metal base og to metal kolonner. På hver søjle er en fjeder og en vingemøtrik. Hovedpladen er placeret på toppen af ​​fjederen, og vingemøtrik spændes indtil hovedet er plan og bevæger sig ikke.
6. Fjern eventuelle lim fra hovedpladen vindue ved hjælp af et bor knyttet til en microtorque boremaskine sat ved 6.000 omdrejninger i minuttet. Stop hver 10-15 sek for at forhindre overophedning af mus kraniet, der kan resultere i strukturel skade på fartøjer.
   1. Ved hjælp af en ny borekrone, placere microtorque boret 1,5 mm lateralt fra midterlinjen (en tredjedel af diameteren af ​​hovedpladen vindue). Begynd at tynde kraniet omkring denne placering på 4.000 rpm. Flyt boret blidt hen over kraniet uden direkte nedadgående pres.
   2. Cease drilLing hver 10-15 sek for at forhindre overophedning af musen baghovedet. I løbet af denne tid, fjernes den akkumulerede kraniet støv med en trykluft beholder.
   3. Brug dråber RT saltvand til afkøling baghovedet for 5-10 sek. Fjern forsigtigt al væske med en blødt væv fortsætte kraniet udtynding.
7. For den endelige udtynding af kraniet, placere en lille mængde saltvand i hovedpladen reservoir og let feje en tand mikroblad over området af interesse, indtil mindre fartøjer er klart synlige.

3. Overvågning af fysiologiske parametre

1. Når kraniet er helt tyndet, frigøre musen fra holderen og læg den på ryggen. Tape forsigtigt ned begge bagben til klart eksponere mediale lår.
2. Fjerne hår over begge mediale lår med saks eller en elektrisk barbermaskine. Desinficer operationsstedet ved at dække lårene med povidon-jod.
3. Klem huden på den mediale højre lår ovenfor femoralvenenog arterie ved hjælp af # 5 pincet. Træk forsigtigt huden opad og bruge en saks til at klippe og fjerne huden.
   Bemærk: venstre lår er reserveret i tilfælde af kirurgiske komplikationer (vaskulære anomalier, bristede fartøjer).
4. Anvend ca. 3-5 dråber 0,9% saltopløsning til operationsstedet. Dette giver mulighed for større forstørrelse af skibe, samt at holde sitet fugtet og forhindre udtørring af skibene. Adskil femorale vene fra arterie ved ligeud dissekere i den femorale nerveforgrening med to # 5/45 pincet.
5. Placere to, 3 cm stykker af kirurgisk sutur under femorale arterie ca. 1 cm fra hinanden. Drej den øverste sutur uret for at skabe en vaskulær årepresse, der vil bidrage til at forhindre overdreven blodtab under kateterisering.
6. Lave et lille snit i arteria femoralis ved hjælp af foråret saks. Placer kateteret i arterien gennem snittet og gå videre, indtil kateteret er fast inden i arterien.
7. Injicer 10 pi heparin (100 IE / ml) gennem kateteret til forebyggelse af blodpropper. Derefter kirurgisk lukke højre lår ved syning huden sammen med en 4-0 sutur i en enkel afbrudt mønster.
8. Injicer 50 pi urethan (1,2 mg / g) intraperitonealt i højre nedre kvadrant. Fem minutter senere gentages med en anden 50 pi injektion til venstre nedre kvadrant i alt 100 pi intraperitoneal urethan. Langsomt reducere isofluran niveauer til ca. 0,25%, mens samtidig en kontrol af musen til dybden af ​​anæstesi.
   Bemærk: Hold nålen overfladiske i bughulen langs den bageste bugvæggen, så den ikke perforere tarmen. Dette kan opnås ved at klemme den abdominale rectus muscles væk fra indvoldene og derefter injicere.
9. Anvendelse af et kapillarrør, indsamle en 40 pi prøve af arterieblod fra kateteret. Fastgør kateteret til blodtrykstransducer udstyret med en saltopløsningsfyldt fire-vejs stophane og heparin-fyldt sprøjte.
10. Tape blodtrykstransducer til kirurgiske apparater for at forhindre utilsigtet fjernelse af kateteret. Begynd overvågning af gennemsnitlige arterielle tryk.
11. Sæt blodet fyldt kapillarrør i en blodgas post analysator port. Når alt blodet er blevet udvundet, fjerne kapillarrøret fra indgangsporten. Ö ₂ og CO ₂ blodgas niveauer vil blive vist på et papir udskrives fra blodgas analysatoren.

4. Injektion af fluorescerende farvestof

1. Klem huden på den mediale venstre lår ved hjælp af # 5 pincet. Træk forsigtigt huden opad og bruge en saks til at klippe og fjerne huden. Forbered dextran konjugeret røde udsender rhodaminfarvestof(70 kDa) (10 mg / kg opløst i saltvand).
2. Find den femorale vein.Using en 1 ml sprøjte med en 30 G nål fastgjort, trækker en tidligere fremstillet opløsning af et fluorescerende farvestof egnet til billeddannelse til 130 pi linje i sprøjten. Fjern alle luftbobler ved at trække farvestoffet helt ind i sprøjten og fast zappe sprøjten væg.
   1. Bøj 30 G nål på en 30 graders vinkel ved at trykke den mod en hård overflade facet opad. Fyld nålen med farvestoffet og kasseres eventuel overskydende væske, der forlader en 100 pi prøve.
3. Injicer 100 pi prøve af farvestof langsomt i den femorale vene. Efter fjernelse af nålen, anvender stabil, let tryk på injektionsstedet for at stoppe blødning. Tillad farvestoffet cirkulere i 5 minutter.
   Bemærk: Alternativt kan den rigtige femorale vene anvendes i stedet for det fluorescerende farvestof injektion for at undgå yderligere blodtab gennem oprettelse af et andet operationsstedet. Desuden, hvis detdyr bløder ukontrollabelt fra operationsstedet, kan dette være en indikation at for meget heparin fik at skylle kateteret. Hvis der ikke er størkning inden for 10-15 minutter, og musen stadig bløder, overveje at genstarte eksperimentet med en ny mus.
4. Luk venstre lår ved at sy huden sammen med en 4-0 sutur, derefter forsigtigt flip musen på dens mave, og læg den i musen hovedpladen sele.

5. In vivo to-foton Imaging

1. Flyt kirurgiske apparater til to-foton mikroskop, og sørg for at opretholde kontinuerlig anæstesi niveauer. Placer en lille mængde 0,9% saltvand i hovedpladen reservoiret og sænke mikroskopobjektivet, så den kommer i kontakt med saltvand. Find det område af interesse ved hjælp af lysfelt-visning mål
2. Indstil to-foton excitation laser til en bølgelængde passende for det fluorescerende farvestof. Begynd to-foton billeddannelse ved hjælp af 25x oÅL.
   Bemærk, at vi i disse eksperimenter anvendt en dextran konjugeret til et rødt udsender rhodaminfarvestof, der var spændt ved en bølgelængde på 780 nm. En 607/36 båndpasfilter emission filter til at detektere fluorescens fra farvestoffet, og en 480/20 Bandpass emission filter blev anvendt til at detektere arteriel autofluorescens
3. Find en kapillær seng på visningen skærmen, og forstørre dette område ved hjælp af optiske zoom 2. optage billeder af kapillærerne ved hjælp af to-foton imaging software.
4. Efter billeddannelse er færdig, ofrer musen ved cervikal dislokation efterfulgt af halshugning.

6. Ex vivo to-foton Imaging

1. Brug af ekstra fine sakse, lave et snit i hovedbunden fra interparietal knogler ved frontal knogler i musen. Fastgør huden til siderne af kraniet med pegefinger og tommelfinger.
2. Placer de ekstra fine sakse under mediale interparietal knogle og skære kraniet langs sagittale sutur. Stoppe med at skære kraniet ca. 3 mm efter bregma mærkning.
   Bemærk: Påfør opadgående pres, når der skæres kraniet for at forhindre at skære hjernen.
3. Med # 5 pincet, adskille kraniet fra hjernen og omhyggeligt fjerne meninges fra overfladen af ​​hjernen. Resterende meninges kan skyldes lacerate hjernen; bør tages ekstrem forsigtighed for at undgå dette. Skub forsigtigt # 5 pincet under hjernen fremrykkende langsomt fremad, indtil hjernen er fri kraniet.
   Bemærk: at nedadgående pres bør anvendes for at undgå at punktere hjernen.
4. Placer hjernen i en hjerne sektionering værktøj specifikt for mus. Vask hjernen ved at anvende dråber kunstig cerebrospinalvæske i hjernen.
5. Fjern en 2 mm koronale del af hjernen fra bregma 0 til bregma -2. Placer koronale snit på en konkav objektglas indeholdende kunstige cerebrospinalvæske med 0 bregma (tættest på kraniet del af afsnittet) vendende opad. Dække forsigtigt hjernen slis med et glas cover slip.
   Bemærk: Undgå at trykke glasset når det først er hjernen afsnit, da dette kan deformere vaskulære arkitektur.
6. Overfør objektglasset til mikroskopbordet og placere en lille mængde 0,9% saltvand på dækglasset. Sænk mikroskopobjektivet, indtil det kommer i kontakt med saltvand. Find midterlinjen af ​​hjernen ved hjælp af lysfelt mål.
7. Begynd to-foton billedbehandling og find midterlinjen igen med 25x målsætning. Opnå dette ved at finde den langsgående revne på kortikale overflade af koronale sektion. Placer den højre kant af den billeddannende skærm på midterlinjen og flytte beskueren skærm over sideværts tre komplette rammer (ca. 1,5 mm fra midterlinjen).
   Bemærk, at i disse eksperimenter, billeddannelsesparametrene var identiske med dem, der nævnes i noten i trin 5.2.
8. Find den dybde, hvori kapillærer er knap synlige på visningen skærmen. Sænk fokusplanet yderligere 20um til bestemmelse af toppen af ​​z-stakken.
9. Indstil billedet tykkelse til 1 um. Sænk visningen skærm til 100 um og justere laser magt i hele sådan, at mindre end 1% af alle pixel overmættede.
   Bemærk: z-stack billeder er indsamlet fra en serie af 100 på hinanden følgende 500x500x1 um billeder. Jo større z-stack de mere præcise beregninger for efterbehandling vil være. Generelt forsøger at samle en z-stak 100 um eller større.
10. Tryk på ikonet for XY Gentag efterfulgt af den tilstødende XY ikon. Når z-stakken er færdig, skal du trykke på ikonet serien Udført og gem filen.

7. Databehandling

1. Åbn en in vivo kapillær billede i ImageJ softwaren. Manuelt indstille pixelafstand forholdet baseret på værdier opnået fra de to-foton-software.
   1. Vælg den * lige * ikon fra menuen Funktioner. Tegn en linje strækker sig fra en kapillærvæggen til oppowebsted kapillærvæggen, og registrere længden fra ImageJ.
      Bemærk, at det kan være nødvendigt at zoome ind på billedet med henblik på klart at visualisere kanterne af de kapillære vægge.
   2. Gentag trin 7.1.1 ved forskellige steder langs kapillær, samt for flere kapillærer i billedet.
2. Åbn z-stakken fil i den analytiske software som Amira. Vælg ikonet Filament Editor fra værktøjslinjen sub-ansøgning
   1. Indstil seeren tykkelse til ca. 20. Flyt seeren til enten toppen eller bunden af ​​Z-stakken.
   2. Vælg ikonet Trace og flytte markøren hen over indlæste billede. Place noder på kapillærerne på de steder, der er beskrevet i figur 2C; segmenter vises automatisk mellem tilstødende noder. Trace kapillærer i hele Z-stakken.
      Bemærk: det vil være nødvendigt at placere noder i mellem endepunkter og filial punkter for at spore kapillærerne thrOughout z-stakken.
   3. For at fjerne disse knudepunkter, klik på Fjern Intermediate ikon.
      Bemærk: Dette kan skabe fejlagtige loopes segmenter, der skal fjernes manuelt ved at vælge sløjfen ved hjælp af Vælg Enkelt ikonet og derefter vælge ikonet Fjern Selected. Hvis sløjfer fortsat vises i samme område i sporing, er det sandsynligt, at noderne blev placeret på forskellige kapillærer.
   4. Når sporing er færdig, skal du vælge ikonet Graph oplysninger til åbne et regneark, der indeholder de automatisk udtrukket vaskulære parametre. Antallet af knuder og segmenter er tilgængelige på hovedvisningen skærmen.

Representative Results

Den tynde kranium cortical vindue muliggør in vivo to-foton-billeddannelse af kortikale kapillærer (figur 1). Et egnet område af billedet viser talrige, forskellige kapillærer (figur 1A). I samme synsfelt, er der ingen arteriel cellevæg autofluorescens, og der kan være andre fluorescerende signaler, såsom collagen fluorescens induceret af anden harmoniske generation ¹¹ (figur 1B).

Når fremstillingen af hjernen skive er færdig, et billedbehandlingssystem område ca. 1,5 mm fra midterlinien er placeret (figur 2A). En 100 um z-stack frembringer et tredimensionalt billede anvendes til analyse i Amira analytisk software (figur 2B). Det kapillære netværk er derefter manuelt spores ved at placere knudepunkter ved begyndelsen og slutningen af ​​en kapillær eller ethvert sted, hvor en kapillær branches i en anden (figur 2C). Dette frembringer en fuldt skeletonized billede, som morfologiske parametre automatisk ekstraheres (figur 2D). Antallet af kapillære knudepunkter, segmenter, betyder segmentlængde, total segmentlængde, og den samlede kapillarvolumen kan udvindes under anvendelse af to-foton ex vivo-billeddannelse af muse hjerneskiver (figur 2).

Figur 3 viser repræsentative resultater opnået ved anvendelse af fremgangsmåden i dette papir. I dette forsøg blev en transgen musemodel for HIV neuroinflammation anvendes ^10. Produktion af HIV virotoxin Tat blev induceret i Tat + mus ved doxycyclin-infused fødevarer i 12 uger. Kontrolgruppen bestod af Tat- søskende fodret den samme mad. Der var ingen statistisk signifikant forskel mellem Tat + og Tat- mus i nogen af ​​de kapillære målte parametre. Således 12 ugers eksponering af hjernen tissue til HIV-1 Tat er utilstrækkelig til at forårsage fortynding af hjernen mikrovaskulaturen. I modsætning hertil viser vores tidligere offentliggjorte data, mere forlænget (20 uger) kronisk CNS udtryk for Tat medfører fortynding af cerebral vaskulatur ^7. Således her viste data (Figur 3) giver værdifuld ny information i forhold til kinetikken af Tat-induceret vaskulær remodellering inden for CNS af mus.

Figur 1. Erhvervelse af kortikal kapillær diameter. (A) Efter en tynd-kranium kortikal vindue forberedelse og intravenøs fluorescerende farvestof injektion blev to-foton mikroskopi bruges til billedet cerebrale kar. I vores eksperimenter, vi brugte en dextran konjugeret til et rødt udsender rhodaminfarvestof, der var begejstret ved 780 nm, og fluorescens blev visualiseret gennem en 607/36 Bandpass emissionsfilter. 11. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2. Generering af skeletonized kapillære netværk. (A) Mus blev injiceret intravenøst ​​med et fluorescerende farvestof og aflivet. En 2 mm koronale del af hjernen blev taget mellem bregma 0 og bregma -2, og billeddannelse blev udført ved 0 bregma ca. 1,5 mm fra midterlinien. EN repræsentativt billede af den kortikale valgte placering for imaging (black box) fra en C57BL / 6 mus er vist. Denne region, whichatosensory cortex, blev valgt, fordi vi tidligere har vist, at dysregulering af cerebral blod kan forekomme på dette websted i Tat + mus ^12. (B) Repræsentative tredimensionelle z-stak billeder af kapillære netværk. (C) Diagram over den anvendte metode til manuelt at spore kapillærer under fartøj kvantificering. (D) repræsentativt billede af skeletteret z-stack billede. Klik her for at se en større version af denne figur. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3. Kvantificering af cerebral vaskulær arkitektur i Tat- mus versus mus udsat for kandidaten hiv virotoxin Tat foR 12 uger. Mus med doxycyclin (DOX) inducerbar HIV-1 Tat transgen drevet af astrocyt-specifikke gliafibrillært protein (GFAP) promotor (HIV Tat-Tg-mus) blev anvendt til at undersøge effekten af HIV-1-induceret neuroinflammation på cerebral vaskulær struktur, som beskrevet ^7. Disse mus (Tat +, n = 3) blev udsat for en kronisk (12 uger) regime af Tat induktion (dvs., 12 uger af DOX). Tat- mus (n = 4) blev anvendt som aldersmatchede kontroller (disse mus svarer til ikke-transgene individer fra samme kuld af Tat + mus, og derfor ikke udtrykker HIV-1-Tat). Ligesom Tat + mus, de Tat- mus modtog også 12 ugers DOX eksponering. I de mus udsat for Tat i 12 uger (Tat +), versus dem, der ikke udsættes for Tat (Tat-), var der ingen statistisk signifikant forskel i antallet af knudepunkter (A), antallet af segmenter (B), betyder segmentlængde (C) eller total Kapillarlængde (D), kapillær diameter (fortat + mus, analyserede vi 14 kapillærer i 6 billeddiagnostiske områder; for Tat- mus, analyserede vi 7 kapillærer i 4 billeddiagnostiske områder) (E), eller total kapillær volumen (F). Da oplysningerne ikke var normalfordelt (som bestemt ved Shapiro-Wilk test), blev den nøjagtige Wilcoxon rank sum test, der anvendes til at beregne statistisk signifikans (bestemt i dette tilfælde som P <0,05). Klik her for at se en større version af dette tal. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Den her beskrevne fremgangsmåde kan anvendes til at analysere hjerne mikrovaskulære strukturer i en lang række forsøgsmodeller / indstillinger. For succes i denne metode, skal tre kritiske trin skal beherskes. For det første skal det tynde kranium vinduet ikke skade kraniet eller underliggende hjerne. Det er let at punktere kraniet under udtynding eller forårsage varmeinduceret vaskulær lækage. Dette kan forstyrre billeddannelse som det fluorescerende farvestof vil sive ind i fokusplanet og skjule kapillærerne. Hvis kraniet ofte bryder under tilberedning af tynde kranium, er det mest sandsynligt forårsaget af for stor en nedadgående pres. Holder microtorque bore så tæt som muligt på Burr giver mulighed for større taktil kontrol, som vil mindske det nedadgående pres på kraniet.

For det andet bør arteriel kateterisation ske så hurtigt som muligt, når arterien er blevet skåret. Manglende indsætte kateteret hurtigt kan forårsage overdreven blodtab som vil compromise den fysiologiske integritet af musen. Problemer med at indsætte kateteret er normalt på grund af den relativt store størrelse af kateteret i forhold til den femorale arterie. Det kan være nødvendigt at strække kateteret med henblik på at reducere dens diameter. Derudover kan spidserne af # 5 pincet anvendes til at få og forstørre åbningen lavet i arterien for at lette i placeringen af ​​kateteret.

For det tredje bør varigheden af in vivo kirurgiske procedurer minimeres, således at urethan anæstesi kan administreres så hurtigt som muligt. Den isoflurananæstesi kan forårsage vasodilation af cerebrale blodkar ^13, således skævvridning data de kapillære diameter.

Det bør anerkendes, at Amira analytisk software automatisk kan udtrække radier manuelt spores fartøjer; men når du bruger denne funktion til at analysere z-stack billeder fra ex vivo hjerner, værdien er unøjagtige. Dette skyldes, at AFter fjernelse af hjernen, de cerebrale kapillærer ikke længere er under tryk, og kan blive morfologisk forvrænget. In vivo kapillær diametermålingen omgår dette problem, fordi kapillærerne er under tryk under normale, fysiologiske betingelser.

Det skal også bemærkes, at denne metode er ikke uden begrænsninger. For det første er betydelig undervisning, der kræves til at mestre in vivo imaging forberedelse. En forsker skal lære at effektivt at udføre to teknisk udfordrende teknikker (tynde kranium kortikal vindue og arteriel kateterisation); en fejl i enten teknik kan kompromittere eksperimentet og ugyldiggøre dataene. For det andet, analyse af ex vivo z-stakke er tidskrævende. Den skeletonization af en z-stak billedet kan tage op til 2,5 timer. Desuden er det tilrådeligt, at denne analyse skal udfyldes af en erfaren forsker til at sikre sammenhængen i skeletonization processen (som involverer omhyggelig manuel tracing af blodkar).

Når alle aspekter af denne protokol er styr på den, de opnåede data giver en mere dybdegående og fysiologisk nøjagtig kvantificering af vaskulære parametre i forhold til andre traditionelt anvendte metoder, der viser kapillær densitet som kapillærer pr volumen eller kapillærer per synsfelt. In vivo imaging teknik gør det muligt for studiet af andre parametre, herunder, men ikke begrænset til, røde blodlegemer hastighed, arteriole dilatation og røde blodlegemer flux ^7,12, som også kan være i stand til at blive behandlet i langsgående undersøgelser. Endvidere kan det let tilpasses og modificeres til at studere forskningsspørgsmål relateret til hjernens mikrovaskulære struktur. Sådanne undersøgelser kunne omfatte kvantificering patogene ændringer i kapillær morfologi i andre neurokognitive sygdomme, eller måling aldersrelaterede forandringer i kapillær densitet. Derfor er metoden præsenteres i dette papir er en alsidig og kraftfuldt værktøj til quantitative analyse af cerebral vaskulær arkitektur.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Leica Microscope	Leica Inc.	MZ8
High Intensity Illuminator	Dolan-Jenner	180
Heating Pad	Stryker	TP3E
T/PUMP	Gaymar Industries, Inc.	TP-500
TEC-4 Isoflurane Vaporizer	Datex Ohmeda	447
Artificial Tear Gel	Butler AHS	7312
Povidone-Iodine solution	Aplicare	52380-1855-9
Extra Fine Bonn Scissors	Fine Science Tools	14084-08
Dumot #5 Forceps	Fine Science Tools	11295-10
Dumont #5/45 Forceps	Fine Science Tools	11251-35
Ferric Chloride Solution	Ricca Chemical Company	3120-16
Loctite 454 Prism Instant Adhesive Gel	Henkel	45404
Dental Cement	Stoelting	51459
Microtoruqe II Handpiece Kit	Pearson Dental	R14-0002
005 Burr for Micro Drill	Fine Science Tools	19007-05
Norland Blade (Dental Microblade)	Salvin Dental	6900
Urethane	Sigma-Aldrich	U2500	Group 2B Carcinogen
Braided Suture	Ethicon	735G
Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	15000-03
Arterial Catheter	SAI Infusion Technologies	MAC-01	The end of the catheter was manually stretched out in order to decrease its diameter.
Blood Pressure Moniter	World Precision Intruments	SYS-BP1
Blood Pressure Transducer and Cable	World Precision Intruments	BLPR2
RAPIDLab Blood Gas Analyzer	Siemens	248
40 μl Capillary Tube	VWR	15401-413
Texas Red-dextran (70,000 MW, 10 mg/kg dissolved in saline)	Invitrogen	D-1830
Adult Mouse Brain Slicer Matrix	Zivic Instruments	BSMAS001-1
Olympus Fluoview 1000 AOM-MPM Multiphoton Microscope	Olypmus	FV-1000 MPE
MaiTai HP DeepSee Ti:Sa laser	Spectra-Physics
ImageJ Software	National Institutes of Health (NIH)		Available at http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html
Amira Software	Visage Imaging