Introduction
فيروس نقص المناعة البشري 1 يغزو (HIV-1) في الدماغ أثناء المرحلة الحادة للعدوى الفيروس، ويصيب منتجة كلا الخلايا الدبقية الصغيرة والضامة المقيمين الدماغ، مما يؤدي إلى تفعيلها - وإطلاق سراح كل المستمدة من المضيفة وسطاء التهابات وذوبان HIV-1 virotoxins مثل تات وgp120 (إعادة النظر في 1،2). ونتيجة لذلك، يصبح قيام دولة neuroinflammatory المزمنة في الجهاز العصبي المركزي، والتي يعتقد أنها تساهم في التسبب في HIV-1 اضطرابات أسوشيتد العصبي (HAND) 3-5.
وقد تبين overexpression المزمن من HIV-1 تات أو انترلوكين (IL) -17A داخل الجهاز العصبي المركزي من الفئران أن يؤدي في الاوعية الدموية الدقيقة الفراغ 6،7. هذا يثير احتمال أن neuroinflammation المزمن يمكن أن تسهم في التسبب في HAND من خلال التأثير على الأوعية الدموية في الدماغ. من أجل مواصلة النظر في هذه المسألة، وقد وضعنا أساليب لقياس struc الأوعية الدموية الدماغيةدرجات.
وتصف هذه الورقة طريقة لتحديد عدد العقد الشعرية، شرائح الشعرية، يعني طول الجزء، يبلغ الطول الإجمالي الجزء، يعني قطرها الشعرية، وإجمالي حجم الشعرية استخدام في التصوير المجراة من الشبكات الشعرية من خلال نافذة القشرية الجمجمة رقيقة (معدلة من وصفه سابقا بروتوكولات) 8،9، وكذلك خارج الجسم الحي التصوير من أقسام الدماغ، وذلك باستخدام اثنين من الفوتون المجهري. ويوفر هذا النهج مجتمعة لتحديد الكميات شاملة من المعلمات الأوعية الدموية الدماغية، منذ رقيقة الجمجمة النافذة القشرية في الجسم الحي يسمح للحفاظ على البيئة الدماغية، في حين فيفو السابقين التصوير الشبكات الشعرية في شرائح الدماغ يمكن إعادة بناء كاملة، ثلاثي الأبعاد الشبكات الشعرية - ومن ثم يمكن كميا باستخدام البرمجيات المتاحة تجاريا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وافقت جامعة جنة جامعة روتشستر على الثروة الحيوانية عن الإجراءات المتبعة في هذه الورقة.
1. إعداد ما قبل العمليات الجراحية (والفئران)
- إعداد المنطقة الجراحية مع كل المعدات المطلوبة. تعقيم جميع الأدوات المستخدمة أثناء الإجراء مسبقا باستخدام الايثانول 70٪. اختياريا، واستخدام تعقيم الزجاج حبة أو تعقيم لتعقيم الأدوات.
- ضع الماوس في غرفة الاستقراء الأيزوفلورين متصلة المرذاذ الأيزوفلورين. تحديد مستويات الأيزوفلورين إلى 4٪ بمعدل 1 لتر / دقيقة.
ملاحظة: بالنسبة لتجارب ذكرت هنا والفئران مع الدوكسيسيكلين (DOX) محرض HIV-1 تات التحوير مدفوعا نجمية محددة البروتين ييفي الدبقية (GFAP) المروج (HIV تات-TG الفئران) كانت تستخدم 10 لدراسة تأثير فيروس نقص المناعة البشرية -1 يسببها neuroinflammation على الدماغي بنية الأوعية الدموية، كما هو موضح سابقا 7،10. - بلطف ترجيح كفة غرفة تحريض لمراقبة الماوس &# 39؛ ق المنعكس المقوم. مرة واحدة وقد تم قمعها المنعكس المقوم، تعيين مستوى الأيزوفلورين إلى 2٪ وإعادة توجيه تدفق الهواء من غرفة تحريض للمخروط الأنف على مقاعد البدلاء الجراحي.
- بسرعة تحريك الماوس من غرفة تحريض على المياه التي غرست سادة التدفئة. الاستمرار في تطبيق الأيزوفلورين (1.5-2٪) من خلال مخروط الأنف. ضبط التخدير وفقا للتسامح الماوس الفردية تقييمها من خلال معدل التنفس (RR) الرصد.
ملاحظة: الاكتئاب من RR يمكن التشويش على المعلمات غاز الفسيولوجية تغيير تدفق الدم إلى المخ والتقييم قطر السفينة. محاولة للحفاظ على RR بين 55-65 نفسا في الدقيقة. ويمكن أيضا أن معدل ضربات القلب (HR) أن تستخدم تقييم عمق التخدير. الحفاظ HR بين 300-450 نبضة في الدقيقة لمنع التغييرات الفسيولوجية لقطر السفينة. عادة، سوف التخدير تكون كافية بين 1،5-2،0٪ الأيزوفلورين في 1 لتر / دقيقة للماوس معين. - تنفيذ قرصة أخمص القدمين إلى مزيد من التحقق من عمق التخدير. إذا لم يستجب الماوس، بالاتصالاتسينعقد العمليات الجراحية.
2. إعداد الجمجمة نافذة رقيقة الجمجمة
- تطبيق الاصطناعي هلام المسيل للدموع لعيون الماوس. تماما إزالة الشعر من فروة الرأس من الفأرة باستخدام مقص أو الحلاقة الكهربائية.
- تعقيم فروة الرأس من خلال تطبيق حل بوفيدون اليود. السماح ليجف. ثم، تحت المجهر ضوء، وإزالة الجلد من فروة الرأس من الفأرة، وفضح تماما العظام الجدارية والعظام الأمامية الذيلية، ووضع العلامات bregma.
- تطبيق كمية صغيرة من 10٪ من محلول كلوريد الحديديك إلى الجمجمة من أجل تجفيف الأغشية لإزالة سهلة. إزالة الأغشية المجففة مع # 5/45 ملقط عن طريق كشط بلطف الجمجمة.
- تطبيق طبقة رقيقة من الغراء حول نافذة headplate. اضغط بلطف headplate ضد الجمجمة من الفأرة، والحفاظ على المنطقة من اهتمام في وسط النافذة. تطبيق قطرة من الاسمنت الأسنان إلى headplate لبلمرة الغراء.
- تطبيق طبقة رقيقةمن الغراء على طول حافة النافذة headplate لإنشاء خزان الذي عقد المالحة. مرة واحدة قد جفت الغراء، المسمار headplate في تسخير الماوس headplate.
ملاحظة: تسخير الماوس headplate المستخدمة في هذا الإجراء هو بنية ذات قاعدة معدنية وأعمدة معدنية اثنين. على كل عمود هناك ربيع واحد والجوز الجناح. يتم وضع headplate على رأس النبع، وتشديد الجوز الجناح حتى الرأس وعلى مستوى لا يتحرك. - إزالة أي الغراء من نافذة headplate باستخدام مثقاب تعلق على الحفر microtorque وضعت في 6000 دورة في الدقيقة. وقف كل 10-15 ثانية لمنع ارتفاع درجة حرارة الماوس الجمجمة التي يمكن أن تؤدي إلى أضرار هيكلية للسفن.
- باستخدام مثقاب الجديد، ضع microtorque الحفر 1.5 ملم أفقيا من خط الوسط (ثلث القطر من النافذة headplate). تبدأ رقيقة الجمجمة حول هذا الموقع في 4000 دورة في الدقيقة. نقل حفر بلطف عبر الجمجمة مع عدم وجود ضغط هبوطي المباشر.
- وقف دريللينغ كل 10-15 ثانية لمنع الانهاك الجمجمة الماوس. خلال هذا الوقت، وإزالة الغبار المتراكم الجمجمة باستخدام اسطوانة الهواء المضغوط.
- استخدام قطرات من RT المالحة لتبريد الجمجمة لمدة 5-10 ثانية. بلطف إزالة جميع السوائل مع الأنسجة الرخوة لمواصلة الجمجمة رقيق.
- لترقق النهائي من الجمجمة، ضع كمية صغيرة من المياه المالحة في الخزان headplate وبخفة اكتساح microblade الأسنان فوق منطقة الفائدة حتى السفن الصغيرة هي واضحة للعيان.
3. رصد معلمات الفسيولوجي
- بمجرد ضعفت الجمجمة تماما، فصل الماوس من حامل ووضعها على ظهرها. الشريط بلطف إلى أسفل ساقيه الخلفيتين لفضح بوضوح الفخذين وسطي.
- إزالة الشعر على حد سواء الفخذين وسطي مع مقص أو آلة الحلاقة الكهربائية. تطهير موقع الجراحية من خلال تغطية الفخذين مع بوفيدون اليود.
- قرصة الجلد على الفخذ الأيمن وسطي فوق الوريد الفخذيوالشريان باستخدام ملقط # 5. برفق الجلد صعودا واستخدام المقص لقطع وإزالة الجلد.
ملاحظة: محجوز الفخذ الأيسر في حالة المضاعفات الجراحية (الشذوذ الأوعية الدموية والأوعية تمزق). - تطبيق ما يقرب من 3-5 قطرات من المياه المالحة 0.9٪ إلى موقع الجراحية. وهذا يسمح لأكبر التكبير من السفن، وكذلك الحفاظ على موقع رطب ومنع جفاف السفن. فصل الوريد الفخذي من الشريان عن طريق تشريح بصراحة في حزمة وعائية عصبية الفخذ باستخدام اثنين # 5/45 ملقط.
- وضع اثنين، 3 قطع سم من الخيط الجراحي تحت الشريان الفخذي حوالي 1 سم عن بعضها البعض. تطور في اتجاه عقارب الساعة خياطة العلوي لإنشاء وقف النزف الوعائي التي من شأنها أن تساعد في منع فقدان الدم بصورة مفرطة خلال القسطرة.
- إجراء شق صغير في الشريان الفخذي باستخدام مقص الربيع. وضع القسطرة في الشريان من خلال شق والتقدم حتى القسطرة آمن داخل الشريان.
- ضخ 10 ميكرولتر من الهيبارين (100 وحدة دولية / مل) من خلال القسطرة لمنع تخثر الدم. ثم، جراحيا إغلاق الفخذ الأيمن عن طريق خياطة الجلد مع خياطة 4-0 في نمط توقف بسيط.
- ضخ 50 ميكرولتر من يوريتان (1.2 ملغ / غ) البريتونى في الربع السفلي الأيمن. أكرر بعد خمس دقائق مع حقنة أخرى 50 ميكرولتر إلى الربع السفلي الأيسر ليصبح المجموع 100 ميكرولتر من يوريتان داخل الصفاق. خفض ببطء مستويات الأيزوفلورين إلى ما يقرب من 0.25٪ في حين إعادة فحص بالتزامن الماوس لعمق التخدير.
ملاحظة: حافظ على إبرة سطحية داخل التجويف البريتوني على طول جدار البطن الخلفي بحيث لا خرم الأمعاء. ويمكن تحقيق ذلك عن طريق معسر المستقيمة مو البطنscles بعيدا عن الأحشاء ثم عن طريق الحقن. - باستخدام الأنابيب الشعرية، وجمع عينة 40 ميكرولتر من الدم الشرياني من القسطرة. إرفاق القسطرة إلى محول ضغط الدم مزودة محبس رباعية مليئة المالحة ومليئة الهيبارين حقنة.
- الشريط محول ضغط الدم إلى جهاز جراحي لمنع إزالة غير مقصودة من القسطرة. بدء رصد الضغط الشرياني يعني.
- إدراج أنبوب الدم الشعرية شغل في منفذ دخول محلل غازات الدم. مرة واحدة وقد تم استخراج كافة الدم، وإزالة أنبوب شعري من ميناء الدخول. سوف تظهر مستويات O 2 و CO غاز 2 الدم على ورقة مطبوعة من محلل غازات الدم.
4. حقن من صبغ نيون
- قرصة الجلد على الفخذ الأيسر وسطي باستخدام ملقط # 5. برفق الجلد صعودا واستخدام المقص لقطع وإزالة الجلد. إعداد ديكستران مترافق الحمراء التي تنبعث منها رودامين صبغ(70 كيلو دالتون) (10 ملغم / كغم الذائبة في المياه المالحة).
- تحديد الفخذ vein.Using حقنة 1 مل مع 30 G إبرة المرفقة، رسم الحل أعدت مسبقا من صبغة الفلورسنت المناسب للتصوير على خط 130 ميكرولتر من الحقنة. إزالة جميع فقاعات الهواء عن طريق رسم الصبغة تماما في حقنة ويسددها بقوة الجدار حقنة.
- ثني G 30 إبرة في وحوالي 30 درجة زاوية عن طريق الضغط عليه ضد سطح صلب الجانب شطبة تصل. شغل الإبرة مع الصبغة وتجاهل أي السائل الزائد، وترك العينة 100 ميكرولتر.
- حقن العينة 100 ميكرولتر من صبغ ببطء في الوريد الفخذي. بعد إزالة الإبرة، وتطبيق ثابت والضغط برفق لموقع الحقن لوقف أي نزيف. السماح للصبغ أن تعمم لمدة 5 دقائق.
ملاحظة: بدلا من ذلك، الوريد الفخذي الأيمن يمكن أن تستخدم بدلا من ذلك لحقن صبغة الفلورسنت لمنع المزيد من فقدان الدم من خلال إنشاء موقع الجراحة أخرى. وبالإضافة إلى ذلك، إذا كانالحيوان ينزف دون حسيب ولا رقيب من موقع الجراحية، وهذا قد يكون دليلا على أن الكثير من الهيبارين أعطيت لطرد القسطرة. إذا لم يكن هناك تخثر في غضون 10-15 دقيقة والفأر لا يزال ينزف، والنظر في إعادة التجربة مع ماوس جديد. - إغلاق الفخذ اليسرى عن طريق خياطة الجلد جنبا إلى جنب مع خياطة 4-0، ثم الوجه بعناية الماوس على المعدة لها، ووضعه في تسخير الماوس headplate.
5. في فيفو ثنائي الفوتون التصوير
- نقل جهاز جراحي لالمجهر ثنائي الفوتون، مع التأكد من الحفاظ على مستويات التخدير مستمرة. وضع كمية صغيرة من المياه المالحة 0.9٪ إلى الخزان headplate وانخفاض الهدف المجهر بحيث يأتي في اتصال مع المياه المالحة. تحديد المنطقة ذات الاهتمام باستخدام الهدف-عرض brightfield
- ضبط الليزر الإثارة ثنائي الفوتون إلى الطول الموجي المناسب لصبغة الفلورسنت. بدء اثنين من الفوتون التصوير باستخدام 25X سbjective.
لاحظ أنه في هذه التجارب استخدمنا ديكستران مترافق إلى أحمر ينبعث منها صبغة رودامين الذي كان متحمس عند طول موجي 780 نانومتر ل. A 607/36 ممر الموجة مرشح الانبعاثات للكشف عن مضان من الصبغة، و480/20 ممر الموجة مرشح الانبعاثات كانت تستخدم للكشف عن تألق ذاتي الشرايين - تحديد موقع الشعرية سرير على شاشة عرض، وتضخيم هذا المجال باستخدام زووم بصري 2. صور اكتساب من الشعيرات الدموية باستخدام برامج التصوير ثنائي الفوتون.
- بعد اكتمال التصوير، تضحية الماوس بواسطة الخلع عنق الرحم تليها قطع الرأس.
6. التصوير فيفو السابقين ثنائي الفوتون
- باستخدام مقص غرامة اضافية، وجعل شق في فروة الرأس من العظام الجداريين في العظام الأمامية من الفأرة. تأمين الجلد على جانبي الجمجمة مع إصبع مؤشر والإبهام.
- وضع مقص غرامة اضافية تحت العظم الجداري وسطي وقطع الجمجمة على طول الدرز السهمي. وقف قطع الجمجمة حوالي 3 ملم بعد bregma علامات.
ملاحظة: تطبيق الضغط التصاعدي عندما قطع الجمجمة لمنع قطع الدماغ. - باستخدام ملقط # 5، فصل الجمجمة من الدماغ وإزالة بعناية أي السحايا من سطح الدماغ. يمكن السحايا المتبقية ممزق بالصدفه الدماغ. وينبغي اتخاذ الحذر الشديد لتجنب ذلك. الشريحة بلطف # 5 ملقط تحت المخ تتقدم ببطء إلى الأمام حتى الدماغ خالية من الجمجمة.
ملاحظة: هذا الضغط النزولي ينبغي أن تستخدم من أجل تجنب ثقب الدماغ. - وضع الدماغ في أداة الدماغ باجتزاء محددة للفئران. غسل الدماغ عن طريق تطبيق قطرات من السائل النخاعي المفتعل حول الدماغ.
- إزالة 2 مم قسم الاكليلية من الدماغ من bregma 0 إلى bregma -2. وضع قسم الاكليلية على شريحة زجاجية مقعرة تحتوي على السائل المخي الشوكي الاصطناعي مع 0 bregma (معظم جزء من الجمجمة القسم) التي تواجه صعودا. تغطية بلطف SL الدماغكريم مع زلة غطاء زجاجي.
ملاحظة: تجنب الضغط على الزجاج مرة واحدة وضعت في قسم المخ لأن هذا قد تشوه بنية الأوعية الدموية. - نقل الشريحة إلى مرحلة المجهر ووضع كمية صغيرة من المياه المالحة 0.9٪ على زلة غطاء. انخفاض الهدف المجهر حتى يأتي في اتصال مع المياه المالحة. تحديد موقع خط الوسط من الدماغ باستخدام الهدف brightfield.
- بدء التصوير ثنائي الفوتون وتحديد خط الوسط مرة أخرى باستخدام الهدف 25X. تحقيق هذا من خلال البحث عن الشق الطولي على السطح القشري من قسم الاكليلية. وضع الحافة اليمنى من الشاشة التصوير على خط الوسط وتحريك الشاشة أفقيا المشاهد على ثلاثة إطارات كاملة (حوالي 1.5 مم من خط الوسط).
لاحظ أنه في هذه التجارب، وكانت المعلمات التصوير مماثلة لتلك المذكورة في المذكرة في الخطوة 5.2. - تحديد العمق الذي الشعيرات الدموية هي بالكاد مرئية على الشاشة الرأي. خفض الطائرة من التركيز إضافي 20ميكرون لتحديد الجزء العلوي من ض المكدس.
- تعيين سمك الصورة ل1 ميكرون. خفض شاشة عرض 100 ميكرون وضبط قوة الليزر مثل جميع أنحاء أن أقل من 1٪ من وحدات البكسل مشبعة.
ملاحظة: يتم تجميع الصور ض المكدس من سلسلة من 100 500x500x1 التوالي الصور ميكرومتر. وكلما زاد ض المكدس فإن أكثر دقة الحسابات مرحلة ما بعد المعالجة تكون. عموما، محاولة لجمع ض المكدس من 100 ميكرون أو أكبر. - اضغط على أيقونة XY كرر يليه رمز XY المجاور. وبمجرد أن ض المكدس كاملة، اضغط على أيقونة سلسلة حررت وحفظ الملف.
7. معالجة البيانات
- فتح في الجسم الحي الصورة الشعرية في برنامج يماغيج. تعيين بكسل إلى نسبة المسافة على أساس القيم التي تم الحصول عليها من برنامج ثنائي الفوتون يدويا.
- حدد * * التوالي أيقونة من القائمة أدوات. رسم خط يمتد من جدار الشعيرات الدموية واحد إلى ممن لهمموقع جدار الشعيرات الدموية، وسجل طول المقدمة من يماغيج.
لاحظ أنه قد يكون من الضروري لتكبير الصورة من أجل وضع تصور واضح حواف جدران الشعيرات الدموية. - كرر الخطوة 7.1.1 في مواقع مختلفة على طول شعري، فضلا عن الشعيرات الدموية متعددة في الصورة.
- حدد * * التوالي أيقونة من القائمة أدوات. رسم خط يمتد من جدار الشعيرات الدموية واحد إلى ممن لهمموقع جدار الشعيرات الدموية، وسجل طول المقدمة من يماغيج.
- فتح ملف ض المكدس في البرنامج التحليلي مثل أميرة. حدد رمز الشعيرة محرر من شريط الأدوات التطبيق الفرعية
- تعيين سمك المشاهد إلى ما يقرب من 20. نقل المشاهد إما إلى أعلى أو أسفل ض المكدس.
- حدد رمز تتبع وتحريك المؤشر فوق الصورة المحملة. مكان العقد على الشعيرات الدموية في المواقع المذكورة في الشكل 2C. سوف تظهر تلقائيا قطاعات بين العقد المجاورة. تتبع الشعيرات الدموية في جميع أنحاء كامل ض المكدس.
ملاحظة: سوف يكون من الضروري وضع العقد في بين نقطة النهاية ونقطة فرع من أجل تتبع الشعيرات الدموية عبتيoughout ض المكدس. - لإزالة هذه العقد، انقر فوق رمز إزالة المتوسط.
ملاحظة: هذا يمكن أن تخلق شرائح الخاطئة يحلق التي يجب إزالتها يدويا عن طريق اختيار حلقة باستخدام اختر رمز واحد، ومن ثم اختيار أيقونة إزالة مختارة. إذا استمرت حلقات لتظهر في نفس المنطقة خلال تتبع، فمن المرجح أن وضعت العقد على الشعيرات الدموية المختلفة. - مرة واحدة تعقب اكتمال، حدد رمز الرسم البياني معلومات لفتح جدول بيانات تحتوي على المعلمات الأوعية الدموية استخراج تلقائيا. وهي متاحة على شاشة العرض الرئيسية عدد العقد والقطاعات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يسمح النافذة القشرية رقيقة الجمجمة في الجسم الحي اثنين الفوتون التصوير من الشعيرات الدموية القشرية (الشكل 1). منطقة مناسبة لصورة تظهر عديدة، الشعيرات الدموية متميزة (الشكل 1A). في نفس مجال الرؤية، ليس هناك الشرايين جدار الخلية تألق ذاتي، وربما تكون هناك إشارات الفلورسنت الأخرى، مثل الكولاجين مضان، الناجم عن الجيل التوافقي الثاني 11 (الشكل 1B).
مرة واحدة إعداد شريحة الدماغ اكتمال، وتبلغ مساحتها حوالي التصوير 1.5MM من خط الوسط يقع (الشكل 2A). A 100 ميكرون ض المكدس ينتج صورة ثلاثية الأبعاد المستخدمة للتحليل في أميرة البرامج التحليلية (الشكل 2B). ثم يتم تتبع شبكة الشعرية يدويا عن طريق وضع العقد في بداية ونهاية الشعرية، أو أي مكان حيث شعري واحد بالمزارع إلى آخر (الشكل 2C). وهذا ينتج صورة هيكلا عظميا كاملا من خلالها يتم استخراج المعلمات المورفولوجية تلقائيا (الشكل 2D). عدد العقد الشعرية، شرائح، يعني طول الجزء، يبلغ الطول الإجمالي الجزء، وإجمالي حجم الشعرية يمكن استخراجها باستخدام اثنين من الفوتون فيفو السابقين التصوير من شرائح مخ الفأر (الشكل 2).
ويبين الشكل 3 نتائج ممثلة تم الحصول عليها باستخدام الطريقة المعروضة في هذه الورقة. في هذه التجربة، تم استخدام نموذج الفأر وراثيا من فيروس نقص المناعة البشرية neuroinflammation 10. وكان المستحث إنتاج فيروس نقص المناعة البشرية virotoxin تات تات + في الفئران عن طريق الطعام التي غرست الدوكسيسيكلين لمدة 12 أسبوعا. وتألفت المجموعة الضابطة من تتزاحم Tat- تغذية نفس الطعام. لم يكن هناك فروق ذات دلالة إحصائية بين تات + والفئران Tat- في أي من المعلمات الشعرية قياسها. وهكذا، والتعرض لمدة 12 أسبوعا من الدماغ تيسمقاضاة لHIV-1 تات غير كافية لتسبب الفراغ من الأوعية الدموية الدقيقة في الدماغ. في المقابل، تشير البيانات المتوفرة لدينا نشرت سابقا أن أكثر فترات طويلة (20 أسبوعا) التعبير CNS المزمن النتائج تات في الفراغ من الأوعية الدموية الدماغية 7. وهكذا، فإن البيانات الواردة هنا (الشكل 3) معلومات جديدة وقيمة في ما يخص حركية تات التي يسببها الأوعية الدموية إعادة عرض داخل الجهاز العصبي المركزي من الفئران.
الشكل 1. اقتناء قطر الشعرية القشرية. (A) وبعد رقيقة الجمجمة القشرية إعداد إطار والوريد حقن صبغة الفلورسنت، تم استخدام اثنين من الفوتون المجهري لصورة الدماغي الأوعية الدموية. في تجاربنا، استخدمنا ديكستران مترافق إلى أحمر ينبعث منها صبغة رودامين الذي كان متحمس في 780 نانومتر، وتصور مضان من خلال 607/36 ممر الموجة مرشح الانبعاثات.
الشكل 2. الجيل من الشبكات الشعرية هيكلا عظميا. (A) الفئران تم حقن في الوريد مع صبغة الفلورسنت والتضحية. وقد اتخذ A 2 مم قسم الاكليلية من الدماغ بين bregma 0 وbregma -2، ويتم التصوير في 0 bregma حوالي 1.5 ملم من خط الوسط. ا وأظهرت صورة تمثيلية من موقع القشرية اختار للتصوير (الصندوق الأسود) من C57BL / 6 الماوس. هذه المنطقة، وسومالقشرة atosensory، وقد اختير لأننا أظهرنا في وقت سابق ان التقلبات من الدم في الدماغ يمكن أن يحدث في هذا الموقع في تات + الفئران 12. (B) التمثيلية ثلاث صور ض المكدس الأبعاد الشبكات الشعرية. (C) رسم تخطيطي لطريقة استخدامها لتعقب يدويا الشعيرات الدموية خلال الأوعية الكمي. (D) صورة الممثل من هيكلا عظميا صورة ض المكدس. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. الكمي العمارة الوعائية الدماغية لدى الفئران Tat- مقابل الفئران المعرضة للمرشح فيروس نقص المناعة البشرية virotoxin FO تاتواستخدمت ص 12 أسبوعا. الفئران مع الدوكسيسيكلين (DOX) محرض HIV-1 تات التحوير مدفوعا البروتين ييفي الدبقية (GFAP) المروج نجمية محددة (HIV تات-TG الفئران) لدراسة تأثير HIV-1 neuroinflammation الناجم عن هيكل الأوعية الدموية الدماغية، كما وصفها 7. هذه الفئران (تات +، ن = 3) تعرضوا لمزمن (12 أسبوع) نظام من تات الاستقراء (أي 12 أسبوعا من DOX). الفئران Tat- (ن = 4) كانت تستخدم لفي العمر كعينة ضابطة (هذه الفئران تتوافق مع تتزاحم غير المعدلة وراثيا من تات + الفئران، وبالتالي لا تعبر عن HIV-1 تات). مثل الفئران تات +، تلقى الفئران Tat- أيضا 12 أسبوعا من التعرض DOX. في الفئران التي تعرضت للتات لمدة 12 أسبوعا (تات +)، مقابل أولئك الذين لا يتعرضون لتات (Tat-)، لم يكن هناك فروق ذات دلالة إحصائية في عدد العقد (A)، وعدد من قطاعات (B)، يعني طول القطعة (C)، أو الطول الإجمالي الشعرية (D)، قطر الشعرية (لالفئران تات +، قمنا بتحليل 14 الشعيرات الدموية في 6 مجالات التصوير. بالنسبة للفئران Tat-، قمنا بتحليل 7 الشعيرات الدموية في 4 مناطق التصوير) (E)، أو إجمالي حجم الشعرية (F). لأن البيانات لم تكن موزعة بشكل عادي (على النحو الذي يحدده اختبار شابيرو-ويلك)، وقد استخدم الدقيق يلكوكسن اختبار مجموع رتبة لحساب دلالة إحصائية (تحدد في هذه الحالة كما P <0.05). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الطريقة الموصوفة هنا يمكن تطبيقها على تحليل الهياكل الاوعية الدموية الدقيقة في الدماغ في مجموعة واسعة من النماذج التجريبية / الإعدادات. لنجاح هذا الأسلوب، يجب أن يتقن ثلاث خطوات حاسمة. أولا، يجب على نافذة رقيقة الجمجمة لا ضرر الجمجمة أو الدماغ الكامنة. فمن السهل أن ثقب في الجمجمة خلال رقيق، أو التسبب في الحرارة الناجم عن تسرب الأوعية الدموية. هذا يمكن أن تتداخل مع التصوير مثل صبغة الفلورسنت سوف يتسرب إلى الطائرة من التركيز وتحجب الشعيرات الدموية. إذا الجمجمة كثيرا ما يكسر أثناء إعداد رقيقة الجمجمة، وعلى الأرجح سببه كبيرة جدا ضغط هبوطي. عقد حفر microtorque أقرب وقت ممكن للدغ تسمح للسيطرة عن طريق اللمس أكبر من شأنها أن تقلل من الضغط الهبوطي على الجمجمة.
ثانيا، ينبغي أن يحدث قسطرة الشرايين في أسرع وقت ممكن مرة واحدة وقد تم قطع الشريان. يمكن عدم إدراج القسطرة بسرعة يسبب فقدان الدم بصورة مفرطة من شأنها أن تراكبromise سلامة الفسيولوجية من الفأرة. صعوبة ادخال القسطرة هي عادة بسبب الحجم الكبير نسبيا للقسطرة مقارنة الشريان الفخذي. قد يكون من الضروري أن تمتد القسطرة من أجل الحد من قطرها. بالإضافة إلى ذلك، نصائح لل# 5 ملقط يمكن استخدامها لانتزاع وتكبير افتتاح المحرز في الشريان لتخفيف في وضع القسطرة.
ثالثا، يجب أن يكون الحد الأدنى لمدة العمليات الجراحية المجراة بحيث يمكن أن تدار التخدير يوريتان في أقرب وقت ممكن. التخدير الأيزوفلورين يمكن أن تسبب توسع الأوعية الأوعية الدموية المخية 13، مما جعل البيانات قطر الشعرية.
ينبغي الاعتراف بأن البرنامج التحليلي أميرة يمكن استخراج تلقائيا كعبرة السفن تتبع يدويا. ومع ذلك، عند استخدام هذه الميزة لتحليل الصور ض المكدس من العقول خارج الحي، وقيمة غير دقيقة. هذا هو لأنه، AFثالثا إزالة الدماغ، والشعيرات الدموية الدماغية لم تعد الضغط، ويمكن أن تصبح مشوهة شكليا. في الجسم الحي الشعرية قياس قطرها تلتف هذه المشكلة بسبب ضغط الشعيرات الدموية ظل ظروف فسيولوجية طبيعية.
كما يجب الإشارة إلى أن هذه الطريقة ليست دون قيود. أولا، هناك حاجة التدريب هام لإتقان في الجسم الحي إعداد التصوير. باحث يجب أن تعلم أن يؤدوا بكفاءة اثنين من التقنيات تحديا تقنيا (الجمجمة رقيقة نافذة القشرية وقسطرة الشرايين)؛ خطأ في أي تقنية يمكن أن تعرض للخطر التجربة ويبطل البيانات. ثانيا، تحليل خارج الجسم الحي ض مداخن هو الوقت كثيفة. وskeletonization من صورة واحدة ض المكدس يمكن أن تصل إلى 2.5 ساعة. وعلاوة على ذلك، فإنه من المستحسن أن هذا التحليل يتم الانتهاء من باحث من ذوي الخبرة لضمان اتساق عملية skeletonization (الذي ينطوي دقيق آر اليدويالتفوق الأوعية الدموية).
بمجرد يتقن جميع جوانب هذا البروتوكول، فإن البيانات التي تم الحصول عليها توفر أكثر تعمقا والكميات دقيقة من الناحية الفسيولوجية المعلمات الأوعية الدموية بالمقارنة مع غيرها من الأساليب المستخدمة تقليديا التي تظهر الكثافة الشعرية باسم الشعيرات لكل وحدة حجم، أو الشعيرات الدموية في مجال الرؤية. في الجسم الحي تقنية التصوير تسمح لدراسة العوامل الأخرى بما في ذلك، ولكن ليس على سبيل الحصر، أحمر سرعة خلايا الدم، شرين تمدد، والأحمر تدفق خلايا الدم 7،12، والتي قد تكون أيضا قادرة على أن تدرس في الدراسات الطولية. وعلاوة على ذلك، فإنه يمكن بسهولة أن تتكيف وتعديلها لدراسة المسائل البحوث المتعلقة بنية الاوعية الدموية الدقيقة في الدماغ. ويمكن أن تشمل هذه الدراسات quantitating التغيرات المرضية في التشكل الشعري في الأمراض العصبية المعرفية الأخرى، أو قياس التغيرات المرتبطة بالعمر في كثافة الشعيرات الدموية. ولذلك، فإن الطريقة المعروضة في هذه الورقة هو أداة مرنة وقوية لquantitatتحليل إيف العمارة الأوعية الدموية الدماغية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leica Microscope | Leica Inc. | MZ8 | |
| High Intensity Illuminator | Dolan-Jenner | 180 | |
| Heating Pad | Stryker | TP3E | |
| T/PUMP | Gaymar Industries, Inc. | TP-500 | |
| TEC-4 Isoflurane Vaporizer | Datex Ohmeda | 447 | |
| Artificial Tear Gel | Butler AHS | 7312 | |
| Povidone-Iodine solution | Aplicare | 52380-1855-9 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Dumot #5 Forceps | Fine Science Tools | 11295-10 | |
| Dumont #5/45 Forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Ferric Chloride Solution | Ricca Chemical Company | 3120-16 | |
| Loctite 454 Prism Instant Adhesive Gel | Henkel | 45404 | |
| Dental Cement | Stoelting | 51459 | |
| Microtoruqe II Handpiece Kit | Pearson Dental | R14-0002 | |
| 005 Burr for Micro Drill | Fine Science Tools | 19007-05 | |
| Norland Blade (Dental Microblade) | Salvin Dental | 6900 | |
| Urethane | Sigma-Aldrich | U2500 | Group 2B Carcinogen |
| Braided Suture | Ethicon | 735G | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | |
| Arterial Catheter | SAI Infusion Technologies | MAC-01 | The end of the catheter was manually stretched out in order to decrease its diameter. |
| Blood Pressure Moniter | World Precision Intruments | SYS-BP1 | |
| Blood Pressure Transducer and Cable | World Precision Intruments | BLPR2 | |
| RAPIDLab Blood Gas Analyzer | Siemens | 248 | |
| 40 μl Capillary Tube | VWR | 15401-413 | |
| Texas Red-dextran (70,000 MW, 10 mg/kg dissolved in saline) | Invitrogen | D-1830 | |
| Adult Mouse Brain Slicer Matrix | Zivic Instruments | BSMAS001-1 | |
| Olympus Fluoview 1000 AOM-MPM Multiphoton Microscope | Olypmus | FV-1000 MPE | |
| MaiTai HP DeepSee Ti:Sa laser | Spectra-Physics | ||
| ImageJ Software | National Institutes of Health (NIH) | Available at http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html | |
| Amira Software | Visage Imaging |
References
- Kraft-Terry, S. D., Buch, S. J., Fox, H. S., Gendelman, H. E. A coat of many colors: neuroimmune crosstalk in human immunodeficiency virus infection. Neuron. 64 (1), 133-145 (2009).
- Ghafouri, M., Amini, S., Khalili, K., Sawaya, B. E. HIV-1 associated dementia: symptoms and causes. Retrovirology. 3, 28 (2006).
- Antinori, A., et al. Updated research nosology for HIV-associated neurocognitive disorders. Neurology. 69 (18), 1789-1799 (2007).
- Clifford, D. B., Ances, B. M.
- Lindl, K. A., Marks, D. R., Kolson, D. L., Jordan-Sciutto, K. L. HIV-associated neurocognitive disorder: pathogenesis and therapeutic opportunities. Journal of neuroimmune pharmacology : the official journal of the Society on NeuroImmune Pharmacology. 5 (3), 294-309 (2010).
- Zimmermann, J., et al. CNS-targeted production of IL-17A induces glial activation, microvascular pathology and enhances the neuroinflammatory response to systemic endotoxemia. PloS one. 8 (2), e57307 (2013).
- Silva, J. N., et al. Chronic central nervous system expression of HIV-1 Tat leads to accelerated rarefaction of neocortical capillaries and loss of red blood cell velocity heterogeneity. Microcirculation. 21 (7), 664-676 (2014).
- Marker, D. F., Tremblay, M. E., Lu, S. M., Majewska, A. K., Gelbard, H. A. A thin-skull window technique for chronic two-photon in vivo imaging of murine microglia in models of neuroinflammation. Journal of visualized experiments : JoVE. (43), (2010).
- Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (26), 15741-15746 (1998).
- Bruce-Keller, A. J., et al. Morphine causes rapid increases in glial activation and neuronal injury in the striatum of inducible HIV-1 Tat transgenic mice. Glia. 56 (13), 1414-1427 (2008).
- Zoumi, A., Yeh, A., Tromberg, B. J. Imaging cells and extracellular matrix in vivo by using second-harmonic generation and two-photon excited fluorescence. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (17), 11014-11019 (2002).
- Silva, J., et al. Transient hypercapnia reveals an underlying cerebrovascular pathology in a murine model for HIV-1 associated neuroinflammation: role of NO-cGMP signaling and normalization by inhibition of cyclic nucleotide phosphodiesterase-5. Journal of neuroinflammation. 9, 253 (2012).
- Farber, N. E., et al. Region-specific and agent-specific dilation of intracerebral microvessels by volatile anesthetics in rat brain slices. Anesthesiology. 87 (5), 1191-1198 (1997).
