Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Chemistry

CN-GELFrEE - Klar Native Gel-elueres væskefraktion Fastklemning Elektroforese

doi: 10.3791/53597 Published: February 29, 2016
* These authors contributed equally

Abstract

Proteinkomplekser udføre en række vigtige cellulære funktioner. Belyse deres ikke-kovalente interaktioner og dynamik er afgørende for at forstå betydningen af ​​komplekser i biologiske systemer. Mens den direkte karakterisering af biomolekylære samlinger er blevet stadig vigtigere i de senere år, native fraktioneringsteknikker der er kompatible med efterfølgende analyse teknikker, herunder massespektrometri, er nødvendige for yderligere at udvide disse undersøgelser. Alligevel feltet mangler en high-throughput, wide-range, high-recovery separation fremgangsmåde til nativt protein samlinger. Her præsenteres klar nativ væskefraktion gel-elueret fastklemning elektroforese (CN-GELFrEE), som er en hidtil ukendt adskillelse modalitet for ikke-kovalente protein-aggregater. CN-GELFrEE adskillelse præstation blev demonstreret ved fraktionering komplekser udvundet af mus hjerte. Fraktioner blev opsamlet over 2 timer og vises adskilte bånd spænder over ~ 30 til 500 kDa. En conkonsistent mønster af stigende molekylvægt båndbredder blev observeret, hver spænder ~ 100 kDa. Endvidere efterfølgende reanalyse af native fraktioner ved SDS-PAGE viste molekylvægt flytter overensstemmelse med denaturering af proteinkomplekser. Derfor blev CN-GELFrEE vist sig at tilbyde evnen til at udføre høj opløsning og høj-recovery native separationer på proteinkomplekser fra et stort molekylvægtsområde, giver fraktioner, der er kompatible med nedstrøms protein analyser.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Størstedelen af biologiske processer finder sted i en celle menes at blive udført af protein samlinger snarere end enkelte proteiner 1. For således at belyse den specifikke biologiske rolle af et protein subunit i en celle er det nødvendigt at forstå dens strukturelle interaktioner med andre proteiner eller ligander i komplekser 2. Men studerer proteiner indbygget, at opretholde deres ikke-kovalente interaktioner og aktivitet, er fortsat udfordrende. En af ulemperne ved native proteinstudier er en egnet nativt separationsteknik, der er kompatibel med forskellige downstream protein analyseteknikker. Derfor har de seneste interesse i separationsteknikker stand til at karakterisere ikke-kovalente samlinger af biomolekyler steget kraftigt 3.

Protein separationsteknikker er bydende nødvendigt at biokemi, biofysik og forskellige andre undersøgelser. Aktuelle native separationsteknikker har intrinsic mangler, der reducerer kompatibilitet med efterfølgende analyser, såsom lav opløsning, lille produktion, tab til nedbør, og kravet om store mængder oprindelige stikprøve. Tandem affinitetsoprensning er almindeligt anvendt for protein interaktionsstudier, men det skal udføres separat for hvert protein mål, får det til at være uforenelig med high-throughput analyse 4. Gelpermeationskromatografi 5, selektiv fældning med ion-affinitetskromatografi 5 og densitet-gradient separation 6 alle har givet native separationer, men er i sagens natur lav opløsning teknikker og kræver høje indledende prøvemængde.

Alternativt gel-baserede teknikker, såsom blå Native (BN) og Clear Native (CN) PAGE (enten 1-D eller 2-D), viser høj opløsning separation. Desuden, i modsætning til andre teknikker nævnt, både indfødte SIDE separationer opretholde opløselighed og native konformation af en bred range af makromolekyle arter, herunder hydrofobe proteiner. Denne evne udvider yderligere proteomet dækning nås med disse fremgangsmåder 7,8, og der opnås gennem forskellige kemi mellem CN og BN-PAGE. CN-PAGE almindeligt afhængig blød ladede rengøringsmidler som bærermolekyler, erstatter Coomassie blå farvestof i BN-PAGE. BN-PAGE, selv forbundet med højere opløsning, har forbehold såsom reduceret enzymatisk aktivitet i de separerede proteiner 8 og Coomassie molekyle adduktdannelse, hvor sidstnævnte er meget skadelig for downstream MS-analyser 9. Begge disse metoder er imidlertid traditionelt forbundet med lav genopretning og smal proteomanalyse dækning på grund af farvning og gel udvinding begrænsninger 7.

Til studiet af denaturerede proteiner, er der flere teknikker, der opretholder makromolekyle opløselighed, mens de udfører høj opløsning fraktionering med højt proteinindhold genvinding og som er kompatible med diVerse post-separation protein analyseteknikker. Gel-Elueret flydende fraktion Entrapment Elektroforese (GELFrEE) er en af ​​de fraktioneringsteknikker der passer alle disse egenskaber. Denne metode anvendes i vidt omfang i højt gennemløb top-down proteomics studier, hvilket indikerer, at den er hurtig og alsidig. I GELFrEE, proteiner denatureres og separerede baseret på molekylvægt gennem en rørformet gelmatrix, kan porøsiteten af ​​hvilken varieres baseret på prøve krav og de ønskede fraktioneringstrin resultater. Fraktioner elueres i flydende fase, og dermed reducere de inddrivelsesprocedurer begrænsninger forbundet med SDS-PAGE og samtidig opretholde en høj opløsning. Fraktion alikvoter kan derefter analyseres ved 1-D PAGE for molekylvægt båndbreddevalg 11. Der er stor efterspørgsel efter de fordele, der er forbundet med GELFrEE i native separationsteknikker. Den her beskrevne metode, Clear Native GELFrEE (CN-GELFrEE), er en indfødt tilpasning af GELFrEE. For at være forenelig med en bred spectrum af makromolekyler i deres native tilstand, denne metode beror ikke blot på den bløde KN-PAGE kemi, men også på en porøsitet gradient separation, hvilket reducerer proteinpræcipitation ved at eliminere den barske overgang mellem porøsiteter stede i diskontinuerlige gelsystemer 9. Når den anvendes på fraktionere proteinkomplekser ekstraheret fra muse hjerte, eluerede fraktioner viste høj genvinding og en høj opløsning separation af en lang række molekylvægte blev opnået. Endvidere er de resulterende fraktioner er kompatible med de fleste nedstrøms biokemisk og biofysisk protein analyser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bemærk: Denne video protokol er baseret på en tilhørende publikation 9. Specifikke reagenser, materiel og udstyr er nødvendigt for at udføre alle de trin, der er beskrevet i denne protokol er angivet i afsnittet materialer. Opskrifterne og oplysninger til udarbejdelse af alle nødvendige løsninger er specificeret i tabel 1.

1. Hælde af Gradient Tube Gels

  1. Montering af Casting System
    1. Ved hjælp af en flamme-opvarmet barberblad eller skalpel, skæres en 20 ml serologisk pipette langs en ortogonal sektion 10 cm fra toppen af ​​udleveringsspidsen. Sørg for, at snitfladen er glat. Hold det nederste stykke (med spids) og kassér øverste stykke. Spænd det nederste pipette stykke lodret (konisk spids vender nedad) til en støtte stativ.
      ADVARSEL: Rør ikke den opvarmede klinge metal, bruge ordentlige håndtag eller en tang for at undgå forbrændinger.
    2. Skær 3 cm af fleksible rør og tilslut det til cut pipette ved at strække det overudleveringsspidsen. Tilslut strømstyreventilen i den anden ende af røret.
    3. Forbinde bunden af ​​ventilen til udleveringsspidsen af ​​gradienten mixer med et stykke slange. Hold ventilen åben.
    4. Indstil gradient mixer på toppen af ​​en magnetisk omrører. Placer magnetiske stænger inde blandekamrene.
    5. Placer udleveringsspidsen af ​​gradienten mixer 5-10 cm højere end toppen af ​​pipetten stykke for at tillade gelen skal hældes ved hjælp af tyngdekraften.
    6. Test systemet for utætheder med deioniseret vand. Hvis der ikke findes lækager, tørre systemet ved at blæse luft inde i det før der fortsættes.
    7. Dække toppen af ​​pipetten stykke med to eller flere lag af båndet. Punktere et hul gennem båndlagene i midten af ​​den cirkulære åbning. Sørg for, at punktere er stor nok til glasrøret at passere stramt igennem.
    8. Skub glasrør, hvor gelen vil blive kastet gennem det punkterede hul, strækker den, så glasset slutter tæt. jegnsert glasrøret så bunden af ​​røret er 2 mm over pipette bunden.
    9. Kontroller, om glasrøret holdes, og centraliseret og ikke rører pipette væg, når systemet er forberedt. Systemet er nu klar til støbning.
  2. Casting Gel
    1. Forbered gel buffer, APS og Coomassie løsninger (løsninger 1-3, tabel 1).
    2. Forbered 12% T (opløsning 4, tabel 1) og 1% T (opløsning 5, tabel 1) adskillelse gel løsninger. Tilsæt 10 pi Coomassie opløsning i 12% T separerende gel-opløsning. Tilføj APS og TEMED i begge løsninger umiddelbart før hælde i gradient mixer.
      ADVARSEL: polyacrylamid er yderst neurotoksisk og handsker skal bæres.
    3. Sørg for, at udlevering ventil af gradienten mixer er lukket. Tilsæt 12% T adskillende gel opløsning til blandekammeret længst borte fra udleveringsspidsen. Åbn ventilen mellem de to kamre, og lad løsningen flow into næste kammer.
    4. Luk ventilen og pipette den forvredet 12% T adskillende gel løsning tilbage til forrige kammer. Dette gøres for at undgå luftbobler mellem kamrene.
    5. Tilsæt 1% T adskillende gel opløsning til blandekammeret nærmest udleveringsspidsen. Tænd magnetomrører.
    6. Åbne både gradient blandingsventiler på samme tid, at de adskillende gel løsninger, der skal blandes, og at strømme ind i pipetten og glasrør.
    7. Når de adskillende gel løsninger i gradient mixer decimeres afkoble slangen fra blanderen og koble det til en 10 ml sprøjte. Sørg for enden af ​​røret forbliver over væskeniveauet i pipetten, indtil sprøjten er solidt fastgjort.
    8. Brug sprøjten til forsigtigt at skubbe den resterende adskillende gel-opløsning fra slangen ind i pipetten og glasrør. Luk pipette ventil, før de giver luftbobler ind i det.
    9. Forsigtigt tilføje et lag af ca. 0,25 ml vandmættet Butanol (opløsning 6, tabel 1) på toppen af gelen opløsningen inde i glasrøret at forsegle polymerisationsreaktionen fra oxygen i luften og at flade den øverste menisk.
    10. Rengør hælde apparatet straks med demineraliseret vand (brug ikke opvaskemiddel).
    11. Vent natten over til fuldstændig gel polymerisation ved stuetemperatur.
  3. Afmontering Gel Tube fra enhed og Lagring
    1. Den følgende dag, skræl forsigtigt tapen fra toppen af ​​enheden.
    2. Afbryd ventilen fra slangen under pipetten. Slip pipetten fra klemmen og udføre trin 1.3.3. og 1.3.4. over en vask.
    3. Par en 10 ml sprøjte fyldt med deioniseret vand til den fleksible slange. Skub vand gennem slangen ind i pipetten, langsomt glide den polymeriserede gel ud af pipetten.
    4. Hold pipetten vandret og fastgør omhyggeligt gelen glider ud af den åbne ende.
    5. Skær overskydende polyacrylamid under og around glasrøret under anvendelse af et barberblad. Sørg for at skabe en glat ende på gelen inden i røret, ved at gøre det flugter med spidsen af ​​glasrøret.
    6. Dispensere eventuel resterende butanol fra oversiden af ​​gelen og indstil gel røret i en ikke-reducerede 15 ml centrifugerør. Bland 0,5 ml gel buffer (opløsning 1, tabel 1) med 4,5 ml ultrarent vand og tilsæt ca. 2 ml af opløsningen til både oversiden (inden glasrør) og bundsiden (i centrifugeglas) gel rør.
    7. Dække hele oversiden af ​​centrifugeglasset, herunder glasrøret åbning, med parafilm at forhindre buffer fordampning. Geler kan opbevares ved 4 ° C i ca. 2 uger.

2. Prøvefremstilling

  1. Afvej to mus hjerter og hakkekød dem i en petriskål ved anvendelse af et barberblad.
  2. Tilsæt forarbejdede væv til en morter og tilsæt tilstrækkeligt flydende nitrogen til at dække prøven. Pulverisere vævet med en støder, tilføje mereflydende nitrogen, når det fordamper.
  3. Når vævet formales grundigt, lade nitrogen fordampe, og der tilsættes 1 ml lysisbuffer (opløsning 7, tabel 1) ved 4 ° C for hver 100 mg væv. Flyt løsning i et centrifugerør.
  4. Centrifuger ved 2.000 xg i 5 min ved 4 ° C. indsamle omhyggeligt supernatanten i et nyt rør og kassere bundfaldet. Kvantificer proteinkoncentrationen i supernatanten under anvendelse af bicinchoninsyre metode 12, eller som foretrukne. Bemærk: Native Cellelysater eller subcellulære fraktioner kan fremstilles som foretrukne. CN-GELFrEE er kompatibel med forskellige indfødte prøve præparater.
  5. Forbered solubiliseringsbuffer opløsning og lastning opløsning (opløsninger 8 og 9, tabel 1).
  6. Hvis prøven er en pellet, resuspendere den i 50-150 pi solubiliseringsbuffer. Hold prøven på is i 15 min.
  7. Buffer udveksle resuspenderes prøve eller cellelysatet med solubilization puffer under anvendelse af en 30 kDa-MWCO ultra centrifugal filter.
  8. Centrifugeres proteinprøven ved 4 ° C og 10.000 x g i 5-10 min, eller indtil den tilbageholdte fraktion volumen ned til ca. 20 pi. Kassér gennemløbet.
  9. Tilføj 400 pi solubiliseringsbuffer til den tilbageholdte fraktion og bland ved pipettering. Der centrifugeres ved 4 ° C og 10.000 x g i 5-10 min, eller indtil den tilbageholdte fraktion er ned til ca. 20 pi. Kassér gennemløbet.
  10. Gentag trin 2.9 to yderligere gange.
  11. Fortynd den filtrerede prøve (ca. 20 pi) i 100 pi solubiliseringsbuffer.
  12. Tilsæt 20 pi lastning løsning til at prøve.

3. KN-GELFrEE Device

  1. For at udføre CN-GELFrEE fraktionering, fremstilling printerens dele ved at henvise til et maskinværksted. Fremstilling enhedens dele i teflon. Der henvises til figur 1 for alle nødvendige oplysninger for at fremstille de dele og to Tabel 2 for antallet af nødvendige dele til én enhed.
    Sikkerhedsregler: Bær egnede personlige værnemidler. Der bør udvises forsigtighed omkring højspændingsledninger strømforsyninger, og alle vejkryds skal monteres korrekt. Rør ikke enheden eller ethvert tilstødende våde område, mens spændingen er på og vedligeholde det omkringliggende bænk område tørt under elektroforese. Endvidere bør strømforsyningen være helt slukket, når du håndterer enheden og / eller opsamling af fraktioner.
  2. Forbered anodebuffer og katode-buffer (opløsninger 10-11, tabel 1) og opbevares ved 4 ° C eller i is.
  3. Monter den øverste ende af gelen rør (enden uden gel) gennem et afstandsstykke, en O-ring og en anden spacer, i en "sandwich" mode.
  4. Tilsæt buffer kammer (katode) efter den anden spacer, passerer skruerne helt gennem side huller, tilføje og spænd møtrikkerne til begge sider. Sørg for, at den øverste ende af glass rør fastsættes inden den øverste åbning af bufferen kammer, ikke direkte under det eller forbi den.
  5. Placer bunden enden af ​​gelen rør gennem en spacer, en O-ring, opsamlingskammeret, og et andet afstandsstykke.
  6. Tilsæt buffer kammer (anode) efter den anden spacer, passerer skruerne helt gennem side huller, tilføje og spænd møtrikkerne til begge sider. Sikre, at den nederste ende af gelen røret er fastgjort forbi den øverste åbning i bufferkammeret, tæt, men ikke rører bagvæggen.
  7. Indstil KN-GELFrEE enhed lodret med katoden buffer kammer opad ved hjælp af en støtte stativ med klemmer.
  8. Tilføj anodebuffer til anoden buffer kammer (nederst) og katode puffer til katoden buffer kammer (øverst). Hold alle buffere ved 4 ° C.
  9. Fjern luftbobler fra inde i glasrøret ved forsigtigt at trykke på glasrør og kontrollere systemet for utætheder.
  10. Sørg for, at platin elektroder er i kontakt med de buffere i kamrene, og at beggegel rørender er nedsænket i bufferen i hvert kammer.
  11. Slut netledninger fra strømforsyningen til de respektive bananstik: negativ på katoden buffer kammer (øverst) og positiv på anoden buffer kammer (nederst).
  12. Indlæse prøven under anvendelse af en gel belastning spids til top overflade af gelen, inden i gelen røret.
  13. Gelen løbe ved 1 W konstant, for at undgå overophedning, indtil den røde farvestof fronten er i bunden af ​​gelen rør.
    ADVARSEL: Sluk strømmen, før du fortsætter.
  14. Kassér anode og katode buffere.
  15. Skru møtrikkerne ved anodebuffer kammer og adskille den nederste afstandsstykke og kammeret, at opretholde en spacer og O-ringen. Anbring den nederste ende af gelen røret inde i opsamlingskammeret, før den øverste åbning, ikke tidligere eller direkte under den. Skub afstandsstykket og O-ring tæt opsamlingskammeret.
  16. Klip et stykke cellulose dialyse membran og rehydrere det ved immerging i anode buffer. Dæk aperture mellem opsamlingskammeret og bunden spacer hjælp af dialysemembran.
  17. Saml anodebuffer kammer efter den anden spacer, tilføje og stram skruer og bolte.
  18. Lægge anordningen vandret over en ice bucket. Tilføj friske anode og katode buffere til bufferen kamre og kontrollere systemet for utætheder.
  19. Tilføj 150 pi anodebuffer ind i opsamlingskammeret. Slut netledningerne til de respektive bananstik.
  20. Tænd for strømmen på 3 mA konstant strøm. Farvefronten bør derefter begynde at eluere i bufferen i opsamlingskammeret.
  21. Når hele farvestof foran elueres, slukke for strømmen og indsamle den første fraktion (0 min), overføre det til en lav-protein binding mikrocentrifugerør.
  22. Refill kollektionen kammer med 150 pi anode buffer. Hold alle de opsamlede fraktioner på is.
  23. Saml fraktioner efter følgende tidsintervaller fra indsamling afførste fraktion: 2 min, 4 min, 6 min, 8 min, 10 min, 15 min, 20 min, 25 min, 30 min, 45 min og 60 min. Må ikke højde for tid, mens strømmen er slukket. Husk at slukke for strømmen, før opsamling fraktionerne og at genopfylde kollektionen kammer med 150 pi anode buffer mellem prøverne. Tænd strømforsyningen igen efter indsamling til begynde eluering næste fraktion.
  24. Dispensere anoden og katoden buffere og tilføje nye løsninger til bufferen kamre efter 60 min. Opsaml fraktioner på 90 min og 120 min.
  25. Skift anode og katode buffere hver time.
  26. Kør en klar nativt eller en blå nativ PAGE med fraktionerne og plette det som foretrukne. Følg producentens instruktioner eller foretrukne protokol.
  27. Kør en reducerende SDS-PAGE og plette det som foretrukne. Følg producentens instruktioner eller foretrukne protokol.
  28. Ryd op i GELFrEE fraktioner og forelægger indfødte massespektrometri analyser som beskrevet PReviously 9.

Figur 1
Figur 1:. CN-GELFrEE enhed (A) GELFrEE enhed dele tegninger og (B) fotografi af fremstillede dele; (C) CN-GELFrEE Enhed med indretning skema: (1) puffer kammer, (2) spacer, (3) O-ring, (4) gel rør, (5) opsamlingskammer, og (6) dialysemembran.

tabel 1
Tabel 1: Tabel over løsninger.

tabel 2
Tabel 2: Tabel over GELFrEE enhedens dele.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

200 ug af proteiner ekstraheret fra kryogent formalet mus hjerter blev fraktioneret indbygget i 14 fraktioner på 150 pi hver, ved anvendelse af KN-GELFrEE metoden i en 1-12% T gel rør. En portion på 10 pi af hver fraktion blev kørt på en CN-PAGE slab gel og sølvfarvet. En klar afbildning af fraktionering og opløsning opnået med CN-GELFrEE fraktionering er vist i figur 2A. Fraktioner blev opsamlet over to timer og gelen assayet viser et konsistent mønster med stigende molekylvægte i området fra ~ 30 til 500 kDa. Hver fraktion indeholder arter varierer i masse og ~ 100 kDa. Brøker vise en lav overlapning af molekylvægt-intervaller, der i stigende grad reduceret, efterhånden som flere samlinger ske mellem fraktioner. CN-PAGE pladegel vist her kun udgør 6% af proteinet udvundet fra hver 150 pi fraktion.

Hver af FRACTioner elueres nativt fra CN-GELFrEE blev efterfølgende reduceret og denatureret forud for at køre dem på en SDS-PAGE slab gel. I reducerende SDS-PAGE pladegel (figur 2B), er det muligt at se masseskift i alle fraktioner i forhold til de respektive native fraktioner (figur 2A), hvilket indikerer, at intakt protein komplekser blev skilt ad og disulfidbroer blev reduceret.

Figur 2
Figur 2:. CN-GELFrEE adskillelse af mus hjerte kryogen slibning ekstrakt (A) Klar Native PAGE af KN-GELFrEE fraktioner indsamlet på tidsintervaller 0 til 120 min. Venstre: native molekylevægt stigen. (B) reduktion SDS-PAGE af samme fraktioner som A. Venstre: reduceret og denatureret molekylvægt stigen.

Fraktioner kan derefter renses og submitted til nativt massespektrometri analyser 9. Native MS-spektrum af den homodimere malat dehydrogenase, der er konstateret i nogle af GELFrEE fraktioner, viser en ladningsfordeling mellem 16+ og 20+ og en molekylmasse på 72.843 Da (figur 3A). 18 + ladetilstand blev isoleret og kollisionalt-aktiveret, hvilket resulterer i udstødning af monomere malat dehydrogenase med en molekylmasse på 36,421.7 (figur 3B). Kilde aktivering blev påført på det intakte kompleks for at inducere monomer udstødning, hvilket tillader isolering og yderligere fragmentering af monomererne. Opsplitningen kort over 11+ monomer kan observeres i figur 3C. CN-GELFrEE viste sig at være kompatible med massespektrometri analyser, der viser nogen afbrydelse af de ikke-kovalente protein-protein-interaktioner af makromolekylære aggregater.

Figur 3 Figur 3: Massespektre og fragmentering kort over homodimeren malat dehydrogenase (A) MS1 spektrum af den intakte kompleks, (B) MS2 spektrum udstiller monomer udstødt fra komplekset, og (C) et fragmentering kort fås fra fragmenteringen af monomeren. . Den røde N betyder, at den N-terminale er acetyleret.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

CN-GELFrEE er afledt af den klare native (CN) PAGE buffer system, der bruger en blanding af anioniske og neutrale rengøringsmidler som bærermolekyler 9 til molekylær-vægtbaseret protein fraktionering gennem en gelmatrix. Anvendelsen af ​​KN-GELFrEE til en indfødt mus hjerte proteinekstrakt genereret lav kompleksitet fraktioner med diskrete båndbredder samtidig bevare ikke-kovalente interaktioner af biomolekylære forsamlinger. Sammenligning af fraktioner mellem CN-PAGE og reducerende SDS-PAGE-pladegeler viste masseskift der demonstrerer tabet af ikke-kovalente interaktioner mellem makromolekyler i fraktionerne og brud af disulfidbindinger mellem proteinkæder. Resultaterne bekræfter den native karakter af KN-GELFrEE separation.

Nogle skridt i denne protokol er kritiske og dermed garanterer mere opmærksomhed. Først efter støbning, gelen slangen skal frigøres fra indretningen langsomt og den eksterne polyacrylamid skåret omhyggeligt. Undladelse af at gøreså kan beskadige gel, der forårsager luftbobler inden masken eller afmonterer gelen fra glasrøret. Disse skader forringe adskillelse opløsning og bør grundigt undgås. For det andet i løbet af elektroforese vil den elektriske modstand i systemet stige overtid, genererer varme, og dermed er det meget vigtigt at enten udføre proceduren i et koldt kammer eller for at flytte enheden til en isspand, efter at prøven er blevet lagt i gel, for ikke at denaturere de indlæste proteiner ved varme. Desuden er det vigtigt at huske nogle vigtige begrænsninger i teknikken ved udførelse den beskrevne protokol. Høje protein belastninger kan reducere CN-GELFrEE opløsning. Overbelastning, især for prøver, hvor nogle få arter er mere rigelig, vil forårsage disse protein arter, der skal elueres gennem en række på hinanden følgende fraktioner. For muse kryogent formalede prøver blev de bedste resultater ses med mængder mellem 200 og 400 ug, men denne adfærd er prøve-afhængig. Også, hIgH niveauer af salt i prøven vil ændre elektroforetiske egenskaber af proteiner, ændring af båndmønster og reducere fraktionering opløsning. regnskabsmæssigt skal Disse kritiske trin og begrænsninger for under udførelsen af ​​denne protokol til at opnå bedre resultater.

Endvidere blev CN-GELFrEE vist sig at have flere stærkt efterspurgte egenskaber i nativ kromatografi. Denne enkle separationsmetode opnår høj opløsning fraktionering af proteinkomplekser, accepterer høje mængder protein belastning og fraktionering gennem en lang række molekylvægte. CN-GELFrEE blev også vist sig at være meget alsidig, er i stand til at fraktionere biologiske prøver fra en lang række organismer og forskellige præparater 9.

Desuden væskefraktionen eluering i denne teknik muliggør højt proteinindhold nyttiggørelse, der ikke er observeret i andre gel-baserede native separationer. Derudover, i modsætning til andre metoder, der elut samlinger i flydende fase, går CN-GELFrEE ikke reducere koncentrationen prøve. Faktisk er den heri beskrevne protokol øger koncentrationen af ​​hvert protein samling med ~ 2-fold fra prøve til fraktioner. Endelig væskeprøverne Denne metode genererer er let forenelige med forskellige nedstrøms biokemisk og biofysisk nativ protein analyser, herunder massespektrometri. Efter en enkelt rydde op skridt var vi i stand til at identificere og karakterisere gennem indfødte massespektrometri, ukendte protein-komplekser i KN-GELFrEE fraktioner, hvilket yderligere understreger den indfødte mode og kompatibilitet mellem disse teknikker.

I lighed med denaturering GELFrEE, denne roman indfødte fraktionering teknik er også meget fleksible. Koncentrationerne af støbning opløsninger kan justeres til at skabe forskellige gradientgeler, for at variere den molekylære-vægtområde der er løst under en kørsel. Øge% T af adskillelse gel løsninger resulterer i høj resolution af lavere masse arter mens faldende det forbedrer adskillelsen af ​​højmolekylære bestanddele. Indsamlingsmålene gange hvorigennem forsøget udføres, kan også tilpasses for at optimere de molekylvægt båndbredder opnået i hver fraktion efter behov. Udvidet eksperiment tid over 120 min vil generere endnu højere molekylvægt intervaller end afbildet i denne protokol. Desuden kan reducere tiden mellem fraktionsopsamling reducere kompleksiteten i hver fraktion. Derfor flere parametre kan let finjusteres, optimere anvendelsen af ​​teknikken til forskellige undersøgelser.

Afslutningsvis CN-GELFrEE fordele besætte et hul inden for indfødte separationsteknikker præsenterer høj opløsning separation i en bred vifte af molekylære vægte, højt proteinindhold opsving, og accepterer store mængder af protein belastning. Endelig er de resulterende fraktioner er kompatible med de fleste nedstrøms native og denaturerende protein analyseteknikker.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

WM Keck Foundation generøst ydet støtte til dette arbejde. Dette materiale er baseret på arbejde støttet af FAPERJ forskningsbevilling 100,039 / 2014 fra regeringen i Rio de Janeiro - Brasilien for RDM, videnskab uden Grænser stipendium 88888,075416 / 2013-00 fra Koordinering til Forbedring af de videregående uddannelser Personale, under regeringens Brasilien, for HSS, National Science Foundation Graduate Research Fellowship under fællesskab nummer 2014171659 for OSS, og ved CNPq forskningsbevilling 202.011 / 2012-7 fra regeringen i Brasilien for LHFDVPCH er en modtager af en Northwestern Universitys kemi livsprocesser Institute Postdoc Fellowship Award.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
30% acrylamide/bis solution, 37.5:1 Bio-Rad 161-0158 This solution is neurotoxic.
6-aminohexanoic acid (ε-aminocaproic acid) Sigma-Aldrich A2504 This chemical is an irritant.
Ammonium persulfate (APS) Fisher Scientific 7727-54-0 This chemical is flammable, toxic, and corrosive.
Coomassie blue G250 Bio-Rad 161-0406
Dodecylmaltoside Sigma-Aldrich D4641 This chemical is an irritant.
Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA) FLUKA 3777 This chemical is toxic.
Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) Fisher Scientific BP120 This chemical is toxic.
Glycerol Fisher Scientific 56-81-5
Imidazole Sigma-Aldrich I2399
Liquid nitrogen Any supplier n/a Store liquid nitrogen in containers
designed for low-temperature
liquids
Mouse heart Bioreclamation LLC MSE-HEART
n-butanol Fisher Scientific 71-36-3 This chemical is flammable and toxic.
Ponceau S Sigma-Aldrich BP103
Protease Inhibitor Cocktail Thermo Fisher Scientific 78430 This chemical is toxic.
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich 30970 This chemical is an irritant.
Sucrose JTBaker 4097
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Bio-Rad 161-0800 This chemical flammable and irritant.
Tris-HCl Amresco M151
Trycine Bio-Rad 161-071
Equipment
Gradient mixer Hoefer SG15
Magnetic stir  Any supplier n/a
Magnetic bars  Any supplier n/a Small enough to fit inside the gradiet mixer chambers.
Power supply Bio-Rad 164-5056 Voltage up to 1,500 V
Refrigerated centrifugue Eppendorf 022622552 Up to 15,000 x g
Materials
15 ml conical tube Any supplier n/a
30 kDa-MWCO ultra centrifugal filter Millipore UFC503096
Flexible tubing Saint-Gobain B000FOV1J0 Approximately 1 m length
Ice bucket Any supplier n/a
Liquid/air metallic or plastic valve. (e.g. aquarium air/water flow control lever valve) Any supplier  n/a Aquarium valves are compatible.
Mortar and pestle Any supplier n/a
Native PAGE 3-12% T slab gel Invitrogen BN1003
Parafilm Bemis PM-996
Petri dish Fisher Scientific 08-757-13
Protein low bind tube 1.5 ml Eppendorf 022431081
Razor blade IDL Tools TE05-091C
Regenerated cellulose dialysis tubing 3,500 MWCO Fisher Scientific 21-152-9
SDS-PAGE slab gel for any kDa Bio-Rad 456-9036
Serological pipets (25 ml) VWR 89130-900
Syringe (10 ml) Any supplier n/a

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alberts, B. The Cell as a Collection of Protein Machines: Preparing the Next Generation of Molecular Biologists. Cell. 92, (3), 291-294 (1998).
  2. Gingras, A. C., Gstaiger, M., Raught, B., Aebersold, R. Analysis of protein complexes using mass spectrometry. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, (8), 645-654 (2007).
  3. Gavin, A. C., Bösche, M., et al. Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes. Nature. 415, (6868), 141-147 (2002).
  4. Puig, O., Caspary, F., et al. The Tandem Affinity Purification (TAP) Method: A General Procedure of Protein Complex Purification. Methods. 24, (3), 218-229 (2001).
  5. Cremer, K. D., Hulle, M. V., et al. Fractionation of vanadium complexes in serum, packed cells and tissues of Wistar rats by means of gel filtration and anion-exchange chromatography. JBIC J. Biol. Inorg. Chem. 7, (7-8), 884-890 (2002).
  6. Tanese, N. Small-Scale Density Gradient Sedimentation to Separate and Analyze Multiprotein Complexes. Methods. 12, (3), 224-234 (1997).
  7. Bunai, K., Yamane, K. Effectiveness and limitation of two-dimensional gel electrophoresis in bacterial membrane protein proteomics and perspectives. J. Chromatogr. B. 815, (1-2), 227-236 (2005).
  8. Wittig, I., Schägger, H. Advantages and limitations of clear-native PAGE. PROTEOMICS. 5, (17), 4338-4346 (2005).
  9. Skinner, O. S., Do Vale, L. H. F., et al. Native GELFrEE: A New Separation Technique for Biomolecular Assemblies. Anal. Chem. 87, (5), 3032-3038 (2015).
  10. Nijtmans, L. G. J., Henderson, N. S., Holt, I. J. Blue Native electrophoresis to study mitochondrial and other protein complexes. Methods. 26, (4), 327-334 (2002).
  11. Tran, J. C., Doucette, A. A. Gel-Eluted Liquid Fraction Entrapment Electrophoresis: An Electrophoretic Method for Broad Molecular Weight Range Proteome Separation. Anal. Chem. 80, (5), 1568-1573 (2008).
  12. Smith, P. K., Krohn, R. I., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150, (1), 76-85 (1985).
CN-GELFrEE - Klar Native Gel-elueres væskefraktion Fastklemning Elektroforese
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Melani, R. D., Seckler, H. S., Skinner, O. S., Do Vale, L. H. F., Catherman, A. D., Havugimana, P. C., Valle de Sousa, M., Domont, G. B., Kelleher, N. L., Compton, P. D. CN-GELFrEE - Clear Native Gel-eluted Liquid Fraction Entrapment Electrophoresis. J. Vis. Exp. (108), e53597, doi:10.3791/53597 (2016).More

Melani, R. D., Seckler, H. S., Skinner, O. S., Do Vale, L. H. F., Catherman, A. D., Havugimana, P. C., Valle de Sousa, M., Domont, G. B., Kelleher, N. L., Compton, P. D. CN-GELFrEE - Clear Native Gel-eluted Liquid Fraction Entrapment Electrophoresis. J. Vis. Exp. (108), e53597, doi:10.3791/53597 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter