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Chemistry

CN-GELFrEE - 지우기 기본 젤 - 용출 액체 분수 내포 전기 영동

doi: 10.3791/53597 Published: February 29, 2016
* These authors contributed equally

Abstract

단백질 복합체는 중요한 세포 기능의 배열을 수행한다. 자신의 비공유 상호 작용과 역 동성을 해명하는 것은 생물학적 시스템에서 단지의 역할을 이해하는 데 중요합니다. 생체 분자 어셈블리 직접 특성화 최근 점점 더 중요 해지고 있지만, 질량 분석법을 포함한 다운 스트림 분석 기술과 호환되는 기본 분류 기술은 더욱 이러한 연구를 확장 할 필요가있다. 그럼에도 불구하고, 필드는 천연 단백질 어셈블리에 대한 높은 처리량, 넓은 범위의 높은 회수 분리 방법이 부족하다. 여기서는 비공유 단백질 어셈블리 신규 분리 양상을 분명히 네이티브 겔 용출 액체 분획 포착 전기 (CN-GELFrEE)를 제시한다. CN-GELFrEE 분리 성능은 마우스 마음에서 추출 분획 복합체에 의해 입증되었다. 분수는 2 시간에 걸쳐 수집 ~ 30에서 500 kDa의에 이르기까지 개별 밴드를 표시했다. 콘분자량의 대역폭을 증가시키는 일관된 패턴은 각각 ~ 100 kDa의 범위를 관찰 하였다. 또한, SDS-PAGE를 통해 네이티브 분획 후의 재분석 분자량 단백질 복합체의 변성과 일치 이동 하였다. 따라서, CN-GELFrEE 하류 단백질 분석과 호환되는 분획을 제공하는 넓은 분자량 범위에서 단백질 복합체의 고해상도 및 높은 회복 네이티브 분리를 수행 할 수있는 능력을 제공하는 것으로 판명되었다.

Introduction

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셀 내에서 일어나고있는 생물학적 과정의 대부분은 단백질 어셈블리보다는 단일 단백질 (1)에 의해 수행 될 것으로 생각된다. 결과적으로, 셀의 서브 유닛 단백질의 특정 생물학적 역할을 규명하기 위하여는 단지이 다른 단백질 또는 리간드와의 상호 작용의 구조를 이해하는 것이 필요하다. 그러나, 그들의 비공유 상호 작용과 활동을 유지, 기본적으로 단백질을 공부하고, 도전 남아있다. 천연 단백질 연구의 단점 중 하나는 다양한 하류 단백질 분석 기술과 호환되는 적절한 원시 분리 기술이다. 따라서, 생체의 비공유 어셈블리를 특성화 할 수있는 분리 기술에 대한 관심은 최근에 급격히 증가하고있다 (3).

단백질 분리 기술은 생화학, 생물 물리학 등 다양한 연구하는 것이 필수적이다. 현재 기본 분리 기술을 intrinsi낮은 해상도, 낮은 처리량, 강수량 감소, 초기 샘플 많은 양의 요구 사항으로 다운 스트림 분석, 호환성을 줄일 C 결핍. 탠덤 친 화성 정제는 일반적으로 단백질 상호 작용 연구를 위해 사용되지만, 그것은 높은 처리량 분석 4와 호환되도록한다 각 단백질 타겟에 대해 개별적으로 수행되어야한다. 크기 배제 크로마토 그래피 (5) 모두 기본 분리를 제공하지만, 본질적으로 저해상도 기술이며 높은 초기 샘플 량을 필요로 한 이온 친 화성 크로마토 그래피 (5) 밀도 구배 분리 6 선택적 침전.

대안 적으로, 청색 기본 (BN) 및 클리어 네이티브 (CN)과 같은 PAGE 겔 기반 기술 (중 1-D 또는 2-D)는, 고해상도의 분리를 표시. 또한, 다른 기술이 언급 대조, 네이티브 PAGE 분리는 광범위한 연구의 용해도 및 기본 형태를 유지소수성 단백질을 포함하는 고분자 종의 플랜지. 이 기능은 또한 이러한 방법 7,8에 의해 도달 프로테옴 범위를 넓혀 및 CN 및 BN-PAGE 사이에 다른 화학을 통해 달성된다. CN-PAGE는 일반적으로 BN-PAGE에서 쿠마 파란색 염료를 대체 캐리어 분자 소프트 충전 세제를 사용합니다. 높은 해상도와 관련된 있지만 BN-PAGE는 이러한 분리 된 단백질 8 쿠마 분자 부가 형성의 감소 효소 활성,이 후자의 다운 스트림 MS에 크게 편파적 인 9를 분석 같은주의 사항이 있습니다. 이 두 가지 방법은, 그러나, 전통적으로 인해 염색 및 젤 추출 제한 7을 둘러 복구 및 좁은 프로테옴 범위와 관련이있다.

변성 된 단백질의 연구를 위해이 높은 단백질 회복 고해상도 분별을 행하면서 고분자의 용해도를 유지 몇몇 기술은 다음과 그 D와 호환분리 후 단백질 분석 기술을 iverse. 젤 - 용출 액체 분수 내포 전기 영동 (GELFrEE)는 모든 이러한 특성에 맞게 분류 기법 중 하나입니다. 이 방법은 대부분이 신속하고 다목적 인 것을 나타내는, 높은 처리량 하향식 프로테오믹스 연구에 적용된다. GELFrEE에서 단백질이 변성되고 관형 겔 매트릭스를 통해 분자량에 기초한 분리의 기공율은 샘플 요건 및 원하는 분류 결과에 기초하여 변화 될 수있다. 분획 따라서 고해상도를 유지하면서, SDS-PAGE와 연관된 회수 제한을 감소 액상으로 용출된다. 분획 분액 후 분자량 대역폭 선택 (11) 1-D의 PAGE에 의해 분석 될 수있다. 기본 분리 기술에 GELFrEE과 관련된 이점에 대한 수요가있다. 본원에 기재된 방법은, 클리어 네이티브 GELFrEE (CN-GELFrEE)는 GELFrEE의 네이티브 적응된다. 위해 폭 넓은들과 호환 가능합니다그 나라의 상태에서 거대 분자의 pectrum,이 방법은 소프트 CN-PAGE 화학에뿐만 아니라 불연속 겔 시스템 (9)에 존재하는 다공성의 거친 전환을 제거하여 단백질 침전을 감소 다공성 기울기 분리에뿐만 아니라 의존한다. 마우스의 심장으로부터 추출 된 단백질 복합체를 분별에 적용될 때, 용출 된 분획을 회수하고 높은 얻었다 광범위한 분자량 고해상도 분리 표시. 또한, 얻어진 분획 하류 생화학 및 생물 물리학 적 단백질 분석 대부분 호환된다.

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Protocol

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참고 :이 비디오 프로토콜은 관련 출판물 (9)을 기반으로합니다. 특정 시약, 재료와이 프로토콜에 설명 된 모든 단계를 수행하는 데 필요한 장비는 재료 섹션에 나열되어 있습니다. 필요한 모든 솔루션의 준비를위한 조리법 및 정보는 표 1에 항목별로된다.

1. 그라데이션 튜브 젤 쏟아져

  1. 주조 시스템 조립
    1. 화염 가열 면도날 또는 메스를 사용하여, 분배 팁의 상부로부터 수직 단면을 따라 10cm를 20 ㎖ 혈청 피펫을 자른다. 절단 표면이 부드러운 지 확인합니다. (끝) 하단 부분을 유지하고 상단 부분을 폐기합니다. 지원 스탠드에 수직으로 (원추형 끝이 아래를 향하도록) 아래 피펫 부분을 클램프.
      주의 : 화상을 방지하기 위해 적절한 핸들 또는 플라이어를 사용하여 가열 된 블레이드 금속을 만지지 마십시오.
    2. 유연한 튜브의 3cm를 잘라을 스트레칭하여 컷 피펫에 연결분배 팁. 튜브의 타단에 유량 제어 밸브를 연결한다.
    3. 튜브 부재를 사용하는 그라데이션 혼합기 분배 선단에 상기 밸브의 바닥을 연결한다. 개방 밸브를 유지합니다.
    4. 자기 교반기 위에 그라데이션 믹서 설정. 혼합 챔버 내부에 자기 막대를 놓습니다.
    5. 겔은 중력에 의해 주입 될 수 있도록 피펫 부재의 상단보다 5~10cm에서 허용 경사 혼합기 분배 팁을 위치.
    6. 탈 이온수로 누출 시스템을 테스트합니다. 누수가 발견되지 않으면 계속하기 전에 내부에 공기를 불어하여 ​​시스템을 건조.
    7. 테이프의 2 층 이상으로 피펫 부재의 상단을 커버. 원형 개구부의 중심에 테이프 층을 통해 구멍을 천공. 구멍이 유리관을 통해 긴밀하게 통과하기에 충분한 지 확인합니다.
    8. 유리 단단히 맞도록 겔 테이프를 연신, 천공 구멍을 캐스팅한다 유리관 슬라이드. 나는유리관 nsert 튜브의 하단은 상기 바닥 피펫 2mm가되도록.
    9. 유리 튜브가 개최되고 중앙 집중화 된 시스템이 준비되면 피펫 벽을 터치하지 않은 경우 확인하십시오. 이 시스템은 현재 캐스팅 준비가 된 것입니다.
  2. 주조 젤
    1. 겔 완충액 APS 쿠마 용액 (용액 1-3, 표 1)을 준비한다.
    2. 겔 용액을 분리하는 12 % T (용액 4, 표 1), 1 % T (용액 5, 표 1)을 준비한다. T 12 % 분리 겔 용액 쿠마 용액 10 μL를 추가한다. 바로 그라데이션 믹서에 주입하기 전에 두 솔루션의 APS와 TEMED를 추가합니다.
      주의 : 폴리 아크릴 아미드가 매우 신경 독성과 장갑을 착용해야합니다.
    3. 그라데이션 믹서의 분배 밸브가 닫혀 있는지 확인합니다. 분배 끝에서 혼합 챔버 먼에 겔 용액을 분리하는 12 % T를 추가합니다. 두 챔버 사이의 밸브를 열고 솔루션 흐름 내가하자다음 챔버 NTO.
    4. 밸브를 닫고 이전 챔버로 다시 탈구 12 % T의 분리 겔 용액을 피펫. 이것은 챔버들 사이의 공기 방울을 방지하기 위해 수행된다.
    5. 분배 팁에 가장 가까운 혼합 챔버 겔 용액을 분리하는 1 % T를 추가한다. 자석 교반기를 켭니다.
    6. 동시에 열 모두 그라데이션 믹서 밸브 분리 겔 용액 혼합하고 피펫 유리 튜브로 흐르게한다.
    7. 구배 혼합기 분리 겔 용액이 고갈되면, 10 ㎖ 주사기로 믹서를 커플에서 튜브를 풀다. 주사기를 단단히 부착 될 때까지 튜브의 단부 피펫 내의 액체 레벨 이상 남아 있는지 확인.
    8. 부드럽게 피펫 유리 튜브에 튜브에서 나머지 분리 겔 용액을 밀어 주사기를 사용합니다. 그것으로 공기 방울을 허용하기 전에 피펫 밸브를 닫습니다.
    9. 조심스럽게 물을 포화 butano 약 0.25 mL의 층을 추가유리관 내부 겔 용액 위에 리터 (액 6, 표 1) 공기 중의 산소에서 중합 반응을 밀봉하도록 상단 메 니스 커스를 평탄화.
    10. 탈 이온수 (세제를 사용하지 않음) 즉시 주입 장치를 청소합니다.
    11. 실온에서 완전한 겔 중합에 밤새 기다립니다.
  3. 장치 및 보관에서 젤 튜브를 분리
    1. 다음 날, 신중 단말기 위쪽 오프 테이프를 벗겨.
    2. 피펫에서 배관에서 밸브를 분리합니다. 클램프에서 피펫을 놓고 단계 1.3.3를 수행합니다. 및 1.3.4. 싱크대 위에.
    3. 커플 유연한 튜브에 탈 이온수 가득 10 ML의 주사기. 천천히 피펫에서 중합 된 겔을 슬라이딩, 피펫으로 튜브를 통해 물을 밀어 넣습니다.
    4. 수평 피펫을 잡고 조심스럽게 개방 단부에서 슬라이딩 젤을 고정합니다.
    5. 아래와 ARO를 초과하는 폴리 아크릴 아미드를 잘라면도날을 사용하여 유리관 핀클. 유리 튜브의 끝이 평평하게하여, 튜브 내에서 겔의 부드러운 끝을 작성해야합니다.
    6. 겔 상부면에 남아있는 부탄올 닿아 캡핑 15 mL의 원심 분리 튜브에 젤 튜브를 설정한다. 4.5 mL의 초순수로 0.5 ㎖의 겔 완충액 (용액 1, 표 1)을 혼합하고 젤 튜브의 용액 (유리관 내) 양 상측 및 (원심 튜브) 하부 측의 약 2 mL로 추가한다.
    7. 버퍼 증발을 방지하기 위해 파라 필름으로, 유리관의 개구를 포함하는 원심 분리 튜브의 전체 상부면을 커버. 겔은 약 2 주 동안 39 ° C에서 저장 될 수있다.

2. 샘플 준비

  1. 두 마우스의 마음을 달아 면도날을 사용하여 페트리 접시에서 그들을 말하다.
  2. 박격포로 처리 된 조직을 추가하고 샘플을 커버하기에 충분한 액체 질소를 추가 할 수 있습니다. 더 추가, 유봉과 조직을 분쇄이 증발 액체 질소.
  3. 조직을 완전히 분쇄되면, 질소 증발하게 조직마다 100 mg을 4 ° C에서 (용액 7, 표 1) 용해 완충액 1 ㎖를 추가한다. 원심 분리기 튜브에 솔루션을 이동합니다.
  4. 4 ℃에서 5 분 동안 2,000 XG에 원심 분리기. 조심스럽게 새로운 튜브에 뜨는를 수집하고 펠렛을 폐기합니다. bicinchoninic 산 제 12을 이용하여 상등액의 단백질 농도를 정량화하거나 바람직있다. 주 : 바람직한 네이티브 세포 용 해물 또는 세포 내 분획을 제조 할 수있다. CN-GELFrEE 다양한 다른 기본 샘플 준비와 호환됩니다.
  5. 가용화 완충액 로딩 용액 (용액 8 및 9 표 1)을 준비한다.
  6. 시료 펠릿 인 경우, 가용화 완충액 50-150 μL 그것을 재현 탁. 15 분 동안 얼음에 샘플 유지.
  7. 버퍼로 재현 탁 샘플 또는 solubilizat와 세포 용 해물을 교환30 kDa의-MWCO 초 원심 필터를 사용하여 이온 버퍼입니다.
  8. 단백질 4 ° C에서 샘플 5 ~ 10 분 동안 또는 유지 부분의 볼륨이 아래로 약 20 μL에 있습니다까지 10,000 XG를 원심 분리기. 흐름을 통해 폐기하십시오.
  9. 유지 부분에 용해 버퍼의 400 μl를 추가하고 피펫으로 혼합한다. 4 ° C에서 원심 분리기 및 5 ~ 10 분 동안 또는 유지 부분이 아래로 약 20 μL에 있습니다까지 10,000 XG. 흐름을 통해 폐기하십시오.
  10. 단계를 반복 2.9 두 개의 추가 시간.
  11. 용해 완충액 100 ㎕로 여과 샘플 (약 20 μL)을 희석.
  12. 샘플 로딩 용액 20 μl를 추가합니다.

3. CN-GELFrEE 장치

  1. , CN-GELFrEE 분획을 수행 기계 공장을 참조하여 장치의 부품을 제조한다. 테프론에서 장치의 부품 제조. 필요한 모든 정보가 부품 t을 생산하는 그림 1 참조하시기 바랍니다하나의 장치에 필요한 부품의 수 O 표 2.
    안전 고려 사항 : 적절한 개인 보호 장비를 착용하십시오. 케어 고전압 전원 장치 주위를 촬영해야하고, 모든 접합 제대로 장착해야한다. 전압이 켜져있는 동안 장치 또는 인접 젖은 영역을 터치하여 전기 영동시 주변 벤치 영역 건조를 유지하지 마십시오. 장치 처리 및 / 또는 분획을 수집 할 때 또한, 전원이 완전히 오프한다.
  2. 양극과 음극 버퍼 버퍼 (솔루션 10-11, 표 1)을 준비하고 4 ° C 또는 얼음에 보관하십시오.
  3. "샌드위치"방식으로, 스페이서, O 링 및 제 2 스페이서를 통해 젤 튜브 (겔없이 단)의 상단부를 장착한다.
  4. , 제 2 스페이서 후 버퍼 챔버 (음극)를 추가 측면 구멍을 통해 나사를 완전히 통과, 양쪽에 너트를 추가하고 조입니다. 있는지 확인 한 유리의 상단S 튜브 버퍼 챔버의 상부 개구 전에 아닌 바로 아래 또는 과거에 고정된다.
  5. 스페이서, O 링, 수집 챔버, 및 제 2 스페이서를 통해 젤 튜브의 하단부를 장착한다.
  6. , 제 2 스페이서 후 버퍼 챔버 (양극)를 추가 측면 구멍을 통해 나사를 완전히 통과, 양쪽에 너트를 추가하고 조입니다. 가깝지만 후벽 닿지 않으면, 젤 튜브의 하단부는 상기 버퍼 챔버의 상부 개구를지나 고정되어 있는지 확인.
  7. 음극 버퍼 챔버 위쪽 클램프와 지원 스탠드를 사용하여 수직으로 CN-GELFrEE 장치를 설정합니다.
  8. 음극 버퍼 챔버 (위) 애노드 버퍼 챔버 (아래)와 캐소드 버퍼 애노드 버퍼를 추가한다. 4 ° C에서 모든 버퍼를 유지합니다.
  9. 부드럽게 유리관을 눌러 유리관 내부로부터 공기 방울을 제거하고 누설 검사 시스템.
  10. 백금 전극이 챔버에 모두 해당 버퍼에 접촉되어 있는지 확인합니다젤 튜브 단부는 각 챔버 내의 버퍼에 침지된다.
  11. 양극 버퍼 챔버 (아래)에 음극 버퍼 챔버 (위)에 음과 양 : 각각의 바나나 플러그에 전원 공급 장치에서 전원 코드를 연결합니다.
  12. 젤 튜브 내부 겔의 표면 상단으로 젤로드 팁을 사용하여 샘​​플을로드합니다.
  13. 붉은 염료 프론트 젤 튜브의 바닥에 도달하기까지 과열을 방지하기 위해, 1 W 상수에서 겔을 실행.
    주의 : 계속하기 전에 전원 공급 장치를 끄십시오.
  14. 양극과 음극 버퍼를 폐기하십시오.
  15. 스페이서와 O 링 유지 음극 버퍼 챔버 의해 너트 Untighten 및 하부 스페이서 및 챔버를 분해. 상단 조리개, 과거 또는 직접 그 아래되지 전에, 수집 챔버 내부의 젤 튜브의 하단을 배치합니다. 수집 챔버에 가까운 스페이서와 O 링을 밀어 넣습니다.
  16. 셀룰로오스 투석막의 조각을 잘라내어 애노드 버퍼 immerging하여 재수. AP 커버수집 챔버 및 투석막을 이용하여 하부 스페이서 사이 erture.
  17. 상기 제 2 스페이서 후의 양극 버퍼 챔버를 조립 추가 나사 볼트를 조인다.
  18. 얼음 양동이에 걸쳐 수평으로 장치를 놓습니다. 버퍼 챔버에 신선한 양극과 음극 버퍼를 추가 누출을 위해 시스템을 확인합니다.
  19. 수집 챔버에 양극 버퍼의 150 μl를 추가합니다. 각각의 바나나 플러그에 전원 코드를 다시 연결합니다.
  20. 3mA 정전류에서 전원을 켭니다. 염료 프론트는 수집 챔버에 버퍼로 용리되기 시작한다.
  21. 전체 염료 전면이 용출되면, 낮은 단백질 결합 microcentrifuge 관으로 이송, 전원을 차단 한 후 제 1 분획 (0 분)를 수집한다.
  22. 애노드 완충액 150 μL와 수집 챔버 리필. 얼음에 수집 된 모든 분수를 유지합니다.
  23. 컬렉션에서 다음 시간 간격 이후에 분수를 수집제 1 분획 2 분, 4 분, 6 분, 8 분, 10 분, 15 분, 20 분, 25 분, 30 분, 45 분 및 60 분. 전원 공급 장치가 꺼져있는 동안 시간을​​ 고려하지 마십시오. 분수를 수집하기 전에 전원 공급 장치를 해제하는 것을 잊지 마십시오과 샘플 사이의 양극 버퍼 150 μL와 수집 챔버를 보충 할 수 있습니다. 다음 부분을 용출 시작 수집 후 다시 전원을 켜십시오.
  24. 양극과 음극 버퍼를 분배하고 60 분 후 버퍼 챔버에 신선한 솔루션을 추가 할 수 있습니다. 90 분, 120 분에서 분수를 수집합니다.
  25. 양극과 음극 버퍼 모든 시간을 변경합니다.
  26. 명확한 기본 또는 분수와 푸른 기본 페이지를 실행하고 선호로 얼룩. 제조업체의 지침 또는 선호하는 프로토콜을 따르십시오.
  27. 환원성 SDS-PAGE를 실행하고 선호로 얼룩. 제조업체의 지침 또는 선호하는 프로토콜을 따르십시오.
  28. GELFrEE 분획을 정리하고 기본 질량 분석에 제출 설명한 홍보로 분석eviously 9.

그림 1
그림 1 :. CN-GELFrEE 장치 (A) GELFrEE 장치 부품 도면과 제조 부품 (B) 사진; (C) CN-GELFrEE 장치 조립체 방식 : (1) 버퍼 실 (2) 스페이서 (3)에 O 링 (4) 겔 관 (5)에 수집 챔버, 및 (6) 투석막.

1 번 테이블
표 1 : 솔루션의 표.

표 2
표 2 : GELFrEE 장치 부의 표.

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Representative Results

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극저온 접지 마우스 하트 추출 단백질 200 μg의은 1-12% T 겔 관 CN-GELFrEE 방법을 이용하여, 150 ㎕의 각각의 14 분획으로 기본적 분획 하였다. 각 부분의 10 μL의 분취 스테인드 CN-PAGE 슬래브 젤은 실행되었다. CN-GELFrEE 분획 얻어진 분획 해상도의 명확한 묘사는도 2a에 도시된다. 분획을 두 시간에 걸쳐 수집하고, 겔 분석은 30 ~ 500 kDa의 범위의 분자량을 증가시키는 일관된 패턴을 나타낸다. 각 분획 ~ 100 kDa의를 통해 대중에 이르기까지 종을 포함한다. 분수는 더 컬렉션 분수​​ 사이에 발생으로 점점 감소 분자량-범위의 낮은 중복을 표시합니다. 여기에 표시된 CN-PAGE 슬래브 겔은 각각 150 ㎕를 분획으로부터 회수 된 단백질의 6 %를 나타냅니다.

fract의 각이온은 CN-GELFrEE 이후 감소 및 SDS-PAGE 슬래브 겔을 실행하기 전에 변성 된에서 기본적으로 용출. 환원 SDS-PAGE 슬랩 겔 (도 2B)에서, 본래 단백질 복합체 분해시키고 이황화 감소되었음을 나타내는 각 네이티브 분획 (도 2A)에 비해 모든 분획의 질량 변화를 볼 수있다.

그림 2
그림 2 :. 시간 간격 0 분 (120)에서 수집 CN-GELFrEE 분획의 마우스 심장 저온 분쇄 추출물의 CN-GELFrEE 분리 (A) 클리어 기본 PAGE. 왼쪽 : 기본 분자량 사다리. A. 채 동일한 분획의 SDS-PAGE를 환원 (B) 감소 및 변성 분자량 래더.

분수는 청소 및 submitt 할 수 있습니다기본 질량 분석에 에드 9를 분석합니다. GELFrEE 분획 일부에서 식별 된 동종이 량체 말산 탈수소 효소, 네이티브 MS 스펙트럼, 및 16+ 20+ 및 72843 다 (도 3a)의 분자량 사이의 전하 분포를 보여준다. 18+ 충전 상태는 격리 36,421.7 (도 3b)의 분자량을 가진 단량체 말산 탈수소 토출 결과 collisionally 활성화시켰다. 소스 활성화는 토출 단량체, 수 분리 및 단량체 더 분열을 유도하기 위해 복잡한 그대로 적용 하였다. 11 + 단량체의 조각지도 그림 3C에서 관찰 할 수있다. CN-GELFrEE 질량 분석법 거대 분자 어셈블리 비공유 단백질 - 단백질 상호 작용에 어떠한 방해를 보여주는, 분석과 호환 될 것으로 입증되었다.

그림 3 도 3 : 질량 스펙트럼 단편화 호모 다이머 말산 탈수소 맵 (A) 본래 복잡 MS1 스펙트럼 (B) 착물로부터 토출 MS2 스펙트럼 나타내는 단량체, 및 (c) 모노머의 분열로부터 수득 된 분열지도. . 빨간 N은 N 말단이 아세틸 화되어 있음을 나타냅니다.

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Discussion

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CN-GELFrEE은 겔 매트릭스를 통해 분자량 계 단백질 분획에 대한 담체 분자 9 음이온 성 및 중성 세제의 혼합물을 사용하여 클리어 네이티브 (CN) 페이지 버퍼 시스템으로부터 유도된다. 네이티브 마우스 심장 단백질 추출물 CN-GELFrEE의 애플리케이션 생체 분자 어셈블리의 비공유 상호 작용을 유지하면서, 이산 대역폭과 낮은 복잡도 분획 생성. CN-PAGE 및 SDS-PAGE 환원 슬랩 겔 분획 사이의 비교 분획 고분자 단백질 사슬 간 이황화 결합의 파괴와 비공유 상호 작용의 감소를 보여 질량 변화를 보였다. 결과는 CN-GELFrEE 분리 기본 문자를 확인한다.

이 프로토콜의 일부 단계는 중요하며, 따라서 더 많은 관심을 보증합니다. 우선, 주조 후 젤 튜브를 서서히 조심스럽게 잘라 장치 외부 아크릴 아미드로부터 분리되어야한다. 하지 않으면그렇게 메시 내에 기포를 발생하거나 유리관에서 겔을 분리, 겔을 손상 할 수있다. 이러한 손실은 분리 분해능을 저하 철저히 피해야한다. 둘째, 전기 영동시, 시스템의 전기 저항은 따라서 감기 챔버의 절차를 수행하거나 샘플에 넣은 후 얼음 통에 장치를 이동하거나 매우 중요 발열 연장전 증가 젤 순서 열에 의해로드 된 단백질을 변성하지. 또한, 기재된 프로토콜을 수행 할 때 기술의 몇몇 주요 한계를 염두에 중요하다. 고 단백질로드 CN-GELFrEE 해상도를 줄일 수 있습니다. 그 단백질 종의 원인, 특히 몇 종 더 풍부 샘플로, 것 과부하하는 연속 분수의 숫자를 통해 용출한다. 마우스 저온 지상 샘플의 경우, 최상의 결과는 200과 400 μg의 사이에 양 볼 수 있었다, 그러나이 문제는 샘플에 의존합니다. 또한, 시간샘플 염 IGH 레벨 대 패턴을 변경하고 분별 해상도를 감소 단백질의 전기 영동 특성을 변화 할 것이다. 이러한 중요한 단계 및 제한 사항은 더 나은 결과를 달성하기 위해이 프로토콜의 성능 동안 고려되어야한다.

또한, CN-GELFrEE은 기본 크로마토 그래피에 여러 고도의 요구 특성을 갖는 것으로 나타났다. 이 간단한 분리 방법은 광범위한 분자량을 단백질 분획의 부하 및 높은 양의 수용성 단백질 복합체의 고해상도의 분획을 얻을 수있다. CN-GELFrEE는 생물과 다른 준비 (9)의 대형 다양한 생물학적 샘플을 분별 할 수있는 매우 다양한 것으로 입증되었다.

또한,이 기술의 액체 분획 용출 다른 젤 기반 네이티브 분리 관찰되지 않는 고단백 복구 할 수 있습니다. 또한, 다른 방법과 달리 그 E류트 어셈블리는 액상, CN-GELFrEE 샘플의 농도를 감소하지 않습니다. 실제로, 본원에 기술 프로토콜 분획 시료로부터 1 ~ 2 배로하여 각 단백질 어셈블리의 농도를 증가시킨다. 마지막으로,이 방법은 생성하는 액체 샘플을 질량 분석을 포함한 분석 다양한 다운 스트림 생화학 및 생물 물리학 천연 단백질과 쉽게 호환됩니다. 하나의 정리 단계 후 우리는 또한이 기술의 기본 패션과의 호환성을 보여주는 원시 질량 분석, CN-GELFrEE 분획에서 알 수없는 단백질 복합체를 통해 확인하고 특성화 할 수 있었다.

마찬가지로 GELFrEE 변성에,이 소설 기본 분류 기술은 매우 적응력이다. 용액 주조 농도 실행 중에 해결 분자량 범위를 변화시키기 위해, 다른 구배 겔을 생성하도록 조정될 수있다. 높은 resolut에서 분리 겔 솔루션 결과의 %의 T 증가감소시키면서 낮은 질량의 이온 종은 고 분자량 종의 분리를 개선한다. 실험이 수행되는 회수 시간은 필요에 따라 각 분획 달성 분자량 대역폭을 최적화하기 위해 적응 될 수있다. 이 프로토콜에 묘사 된 것보다 더 높은 분자량 범위가 생성됩니다 120 분 이상 확장 실험 시간. 또한, 분획 수집 사이의 시간을 감소시키는 것은 각각의 분획의 복잡성을 줄일 수있다. 따라서, 다수의 파라미터가 쉽게 다양한 연구와 기술의 사용을 최적화 미세 조정 할 수있다.

결론적으로, CN-GELFrEE 장점은 분자량, 높은 단백질 복구 넓은 범위에서 고해상도 분리를 제시하고, 단백질 부하 다량 접수 네이티브 분리 기술 분야의 갭을 ​​점유한다. 마지막으로 얻어진 분획 중 가장 하류 천연 및 변성 단백질 분석 기술과 호환된다.

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Acknowledgments

WM 켁 재단은 관대하게이 일을 위해 자금을 제공했다. 정부에서, 고등 교육 인력의 개선을 위해 조정에서 테두리 장학금 88888.075416 / 2013-00없이 RDM 브라질, 과학 - 본 자료는 리오 데 자네이로 국가의 정부로부터 FAPERJ 연구 보조금 100.039 / 2014 지원 작업을 기반으로 브라질의, HSS를 들면, 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 대학원 연구 OSS에 대한 교제 번호 2014171659에서 친목 및 CNPq 연구 보조금 LHFDVPCH에 대한 브라질 정부의 202,011 / 2012-7에 의해 생명의 노스 웨스턴 대학의 화학받는 사람은 연구소 박사후을 처리하다 원정대 수상.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
30% acrylamide/bis solution, 37.5:1 Bio-Rad 161-0158 This solution is neurotoxic.
6-aminohexanoic acid (ε-aminocaproic acid) Sigma-Aldrich A2504 This chemical is an irritant.
Ammonium persulfate (APS) Fisher Scientific 7727-54-0 This chemical is flammable, toxic, and corrosive.
Coomassie blue G250 Bio-Rad 161-0406
Dodecylmaltoside Sigma-Aldrich D4641 This chemical is an irritant.
Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA) FLUKA 3777 This chemical is toxic.
Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) Fisher Scientific BP120 This chemical is toxic.
Glycerol Fisher Scientific 56-81-5
Imidazole Sigma-Aldrich I2399
Liquid nitrogen Any supplier n/a Store liquid nitrogen in containers
designed for low-temperature
liquids
Mouse heart Bioreclamation LLC MSE-HEART
n-butanol Fisher Scientific 71-36-3 This chemical is flammable and toxic.
Ponceau S Sigma-Aldrich BP103
Protease Inhibitor Cocktail Thermo Fisher Scientific 78430 This chemical is toxic.
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich 30970 This chemical is an irritant.
Sucrose JTBaker 4097
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Bio-Rad 161-0800 This chemical flammable and irritant.
Tris-HCl Amresco M151
Trycine Bio-Rad 161-071
Equipment
Gradient mixer Hoefer SG15
Magnetic stir  Any supplier n/a
Magnetic bars  Any supplier n/a Small enough to fit inside the gradiet mixer chambers.
Power supply Bio-Rad 164-5056 Voltage up to 1,500 V
Refrigerated centrifugue Eppendorf 022622552 Up to 15,000 x g
Materials
15 ml conical tube Any supplier n/a
30 kDa-MWCO ultra centrifugal filter Millipore UFC503096
Flexible tubing Saint-Gobain B000FOV1J0 Approximately 1 m length
Ice bucket Any supplier n/a
Liquid/air metallic or plastic valve. (e.g. aquarium air/water flow control lever valve) Any supplier  n/a Aquarium valves are compatible.
Mortar and pestle Any supplier n/a
Native PAGE 3-12% T slab gel Invitrogen BN1003
Parafilm Bemis PM-996
Petri dish Fisher Scientific 08-757-13
Protein low bind tube 1.5 ml Eppendorf 022431081
Razor blade IDL Tools TE05-091C
Regenerated cellulose dialysis tubing 3,500 MWCO Fisher Scientific 21-152-9
SDS-PAGE slab gel for any kDa Bio-Rad 456-9036
Serological pipets (25 ml) VWR 89130-900
Syringe (10 ml) Any supplier n/a

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References

  1. Alberts, B. The Cell as a Collection of Protein Machines: Preparing the Next Generation of Molecular Biologists. Cell. 92, (3), 291-294 (1998).
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  4. Puig, O., Caspary, F., et al. The Tandem Affinity Purification (TAP) Method: A General Procedure of Protein Complex Purification. Methods. 24, (3), 218-229 (2001).
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  12. Smith, P. K., Krohn, R. I., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150, (1), 76-85 (1985).
CN-GELFrEE - 지우기 기본 젤 - 용출 액체 분수 내포 전기 영동
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Melani, R. D., Seckler, H. S., Skinner, O. S., Do Vale, L. H. F., Catherman, A. D., Havugimana, P. C., Valle de Sousa, M., Domont, G. B., Kelleher, N. L., Compton, P. D. CN-GELFrEE - Clear Native Gel-eluted Liquid Fraction Entrapment Electrophoresis. J. Vis. Exp. (108), e53597, doi:10.3791/53597 (2016).More

Melani, R. D., Seckler, H. S., Skinner, O. S., Do Vale, L. H. F., Catherman, A. D., Havugimana, P. C., Valle de Sousa, M., Domont, G. B., Kelleher, N. L., Compton, P. D. CN-GELFrEE - Clear Native Gel-eluted Liquid Fraction Entrapment Electrophoresis. J. Vis. Exp. (108), e53597, doi:10.3791/53597 (2016).

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