Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Chemistry

CN-GELFrEE - net yerli jel-elüt sıvı kısmı Tuzak Elektroforez

doi: 10.3791/53597 Published: February 29, 2016
* These authors contributed equally

Abstract

Protein kompleksleri önemli hücresel fonksiyonların bir dizi yerine getirir. onların kovalent olmayan etkileşimleri ve dinamikleri açıklık biyolojik sistemlerde komplekslerinin rolünün anlaşılması için her şeyden önemlidir. biyomoleküler meclislerinin doğrudan karakterizasyonu son yıllarda giderek daha önemli hale gelmiştir iken, kütle spektrometresi dahil mansap analiz teknikleri ile uyumlu doğal fraksiyon teknikleri, daha bu çalışmaları genişletmek için gereklidir. Bununla birlikte, saha doğal protein tertibatları için yüksek verimli, geniş aralıklı, yüksek geri kazanım ayırma yöntemi yoktur. Burada, kovalent olmayan protein meclislerinin için yeni bir ayırma yöntemidir net yerli jel-akıtılan sıvı kısmı tuzak elektroforezi (CN-GELFrEE) sunduk. CN-GELFrEE ayırma performansı fare kalp çıkarılan bölme kompleksleri ile gösterilmiştir. Fraksiyonlar 2 saat boyunca toplandı ve ~ 30 ila 500 kDa arasında değişen farklı bantlar sergilendi. bir conmoleküler ağırlık bant genişliği artırma tutarlıdır desen, her kadar ~ 100 kDa gözlenmiştir. Bundan başka, SDS-PAGE aracılığıyla yerel kısımların daha sonraki bir analiz tekrarı molekül ağırlıklı protein komplekslerinin denatürasyonu ile tutarlı değişimleri göstermiştir. Bu nedenle, CN-GELFrEE aşağı protein analizleri ile uyumlu kesirler sağlayan, büyük bir molekül ağırlığı aralığından protein kompleksleri üzerinde yüksek çözünürlüklü ve yüksek geri kazanım yerli ayrımları gerçekleştirme olanağı sunmak için kanıtlanmıştır.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bir hücre içinde meydana biyolojik işlemlerin büyük kısmı, bir protein düzenekleri yerine tek protein 1 ile gerçekleştirilebilir düşünülmektedir. Sonuç olarak, bir hücrede bir protein alt-birimi belirli bir biyolojik rolünü açıklamak amacıyla kompleksleri 2 başka proteinler veya ligandlarla yapısal etkileşimleri anlamak gerekmektedir. Ancak, onların kovalent olmayan etkileşimleri ve aktivitesini muhafaza, doğal proteinler okuyan, zorlu kalır. doğal protein çalışmaları eksiklikleri biri, çeşitli alt proteini analiz teknikleri ile uyumlu olan, uygun bir ana ayırma tekniğidir. Bu nedenle, biyomoleküllerin kovalent olmayan derlemeler karakterize edebilen ayırma teknikleri son faiz keskin 3 artmıştır.

Protein ayırma teknikleri biyokimya, biyofizik ve diğer çeşitli çalışmalara zorunludur. Güncel yerli ayırma teknikleri intrinsi varBöyle düşük çözünürlük, düşük verim, yağış kaybı ve ilk numunenin büyük miktarlarda gereği olarak aşağı analizler, uyumluluk azaltmak c eksiklikleri. Tandem afinite saflaştırma yaygın protein etkileşim çalışmaları için kullanılır, fakat yüksek verimli analizi 4 ile uyumlu olmasını neden her bir protein hedefi için ayn olarak da vardır. Boyut dışlama kromatografisi 5, tüm yerli ayırımları sağlanan, ancak doğal olarak düşük çözünürlüklü teknikleri ve yüksek ilk numune miktarlarda ihtiyaç var iyon afinite kromatografisi 5 ve yoğunluk-gradyan ayrımı 6 seçmeli çöktürme.

Seçenek olarak ise, bu mavi yerel (BN) ve Clear yerel (CN) PAGE gibi jel bazlı teknikler (ya 1-B ya da 2-D), yüksek çözünürlüklü ayırma gösterir. Ayrıca, diğer teknikler söz ile zıt, hem yerli SAYFA ayrımları geniş bir r çözünürlüğünü ve yerli yapısını korumakhidrofobik proteinler de dahil olmak üzere makromolekül türlerin ange. Bu özellik ayrıca bu yöntemlerin 7,8 ulaştığı proteom kapsamı genişletilmektedir ve CN ve BN-PAGE arasında farklı kimya ile elde edilir. CN-PAGE yaygın BN-PAGE Coomassie Mavi boya yerine taşıyıcı moleküllerin gibi yumuşak yüklü deterjanlar, dayanır. Daha yüksek çözünürlüğe ile ilişkili olmasına rağmen BN-PAGE, bu tür ayrılmış proteinlerin 8 ve Coomassie molekülü yaklaşımlı oluşumunda azalma enzimatik aktivite, ikincisi aşağı MS büyük ölçüde zarar olmak 9 analizler olarak uyarılar vardır. Her iki yöntem, bununla birlikte, geleneksel olarak, boyama ve jel özütleme sınırlamaları 7'ye düşük verime ve dar proteom kapsamı ile ilişkilidir.

denatüre proteinlerin çalışma için, orada yüksek protein geri kazanımı ile yüksek çözünürlüklü parçalaması yaparken makromolekül çözünürlüğü korumak çeşitli teknikler olduğunu ve d ile uyumludurayrılık sonrası protein analiz teknikleri alemin. Gel-Seyreltilmiş Sıvı Fraksiyon Tuzak Elektroforez (GELFrEE) tüm bu özelliklere uygun fraksiyonlara tekniklerden biridir. Bu yöntem büyük ölçüde hızlı ve çok yönlü olduğunu belirten, yüksek hacimli yukarıdan aşağıya proteomik çalışmalarında uygulanır. GELFrEE proteinler denatüre ve boru şeklinde bir jel matrisi ile molekül ağırlığına göre birbirinden ayrılarak, gözenekliliği Örnek şartları ve arzu edilen fraksiyon sonuçlara göre değiştirilebilir. Fraksiyonlar böylece yüksek çözünürlükte korurken, SDS-PAGE ile bağlantılı geri kazanım sınırlamaları indirgeme sıvı fazda elüte edilir. Fraksiyon alikuot'u daha sonra molekül ağırlıklı bant genişliği seçimi 11 1-B PAGE ile analiz edilebilir. Yerel ayırma teknikleri GELFrEE ilişkili avantajları yüksek bir talep vardır. Burada açıklanan yöntem Clear Yerli GELFrEE (CN-GELFrEE), GELFrEE bir yerli uyarlamasıdır. için bir geniş s ile uyumlu olacak şekildekendi doğal yapısında makromoleküllerin pectrum, bu yöntem, yumuşak CN-PAGE kimya, hem de süreksiz jel sistemleri 9 mevcut gözenek arasındaki sert geçiş ortadan protein çökelmesine azaltan bir gözeneklilik değişim derecesine ayrılması üzerine sadece dayanmaktadır. Fare kalp ekstre protein kompleksleri fraksiyonlanması uygulandığında, elüt fraksiyonlar yüksek bir geri kazanım ve elde edilen molekül ağırlıkları çok geniş bir aralık bir yüksek çözünürlüklü ayırma gösterilir. Bundan başka, elde edilen fraksiyonlar alt biyokimyasal ve biyofiziksel proteini analizleri çok uyumludur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Not: Bu video protokolü ilişkili bir yayının 9 dayanmaktadır. Belirli reaktifler, malzeme ve bu protokolü açıklanan tüm adımları gerçekleştirmek için gerekli ekipman malzemeleri bölümünde listelenmiştir. Gerekli tüm solüsyonların hazırlanması için yemek tarifleri ve bilgi Tablo 1'de maddeler halinde sıralanır.

1. Gradient Tüp jeller dökülmesi

  1. Döküm Sistemi Montaj
    1. Bir alev ısıtıldı tıraş bıçağı veya neşter kullanılarak, dağıtma ucu üst tarafından dikey bir bölümü boyunca, 10 cm, 20 mi serolojik pipet kesti. kesim yüzeyi pürüzsüz olduğundan emin olun. (Ucu ile) alt parça tutmak ve üst parça atın. Bir destek standına dikey (konik ucu aşağı bakacak şekilde) alt pipet parçası kelepçe.
      DİKKAT: yanıklardan kaçınmak için uygun kolları ya da Pense, ısıtmalı bıçak metal dokunmayın.
    2. Esnek boru 3 cm kesin ve ters gererek kesme pipet bağlayındağıtma ucu. borunun diğer ucunda akış kontrol valfi bağlayın.
    3. Hortumun bir parçası kullanarak degrade mikser dağıtma ucuna vana altını bağlamak. açık vanayı tutun.
    4. bir manyetik karıştırıcı üzerine gradyan karıştırıcı ayarlayın. karıştırma odası içindeki manyetik çubukları yerleştirin.
    5. Jel yerçekimiyle dökülecek için pipet parçasının üst daha yüksek 5-10 cm izin degrade mikser boşaltım ucunu yerleştirin.
    6. deiyonize su ile kaçak olup olmadığını sistemi test. Herhangi bir sızıntı bulunursa, devam etmeden önce içindeki havayı üfleyerek sistemi kurutun.
    7. bandın iki ya da daha fazla tabaka ile pipet parçasının üst kapağı. Dairesel açıklık merkezinde bant katmanlarının bir delik delinmesi. delinme cam tüp içinden sıkıca geçmek için yeterince büyük olduğundan emin olun.
    8. Cam sıkıca uygun şekilde jel bandı germe, delinmiş deliğinden, atılacaktır cam tüp, kaydırın. benCam tüp nsert borunun alt pipet alt yukarıda 2 mm üzerinde olacak şekilde.
    9. cam tüp tutulur ve merkezi sistem hazırlanır kez pipet duvar dokunmadan değilse kontrol edin. Sistem artık döküm için hazırdır.
  2. döküm Jel
    1. Jel tamponu, APS ve Coomassie çözümler (çözeltiler 1-3, Tablo 1) hazırlayın.
    2. Jel çözüm ayrılması% 12 (solüsyon 4, Tablo 1) ve% 1 (solüsyon 5, Tablo 1) hazırlayın. % 12 T ayırıcı jel çözeltisi içinde, Coomassie çözeltisi 10 ul ekle. hemen degrade mikserde dökülmeden önce her iki çözümleri APS ve TEMED ekleyin.
      DİKKAT: poliakrilamid son derece nörotoksik ve eldiven giyilmelidir.
    3. degrade mikser dağıtım vanası kapalı olduğundan emin olun. dağıtma ucundan karıştırma bölmesi en uzak jel çözeltisi ayrılması% 12 T ekleyin. Her iki odacıkları arasındaki vanasını açın ve çözelti akış i letBir sonraki odasına nto.
    4. vanasını kapatın ve bir önceki odaya geri yerinden% 12 T ayırma jel çözüm pipetle. Bu odacıklar arasında hava kabarcıklarını önlemek için yapılır.
    5. dağıtma ucuna yakın karıştırma bölmesine jeli çözeltisi ayıran% 1 T ekleyin. manyetik karıştırıcı açın.
    6. aynı anda açık hem de gradyan karıştırıcı valf ayırma jeli çözeltiler karıştırılır ve pipet ve cam tüp içine akışına olanak vermek üzere.
    7. degrade mikserde ayıran jel çözümler tükenmiş sonra, 10 ml şırınga mikser ve çift bunu hortumunu ayırınız. şırınga sıkıca tutturulmuş kadar tüpün uç pipet sıvı seviyesinin üzerinde kalması emin olun.
    8. yavaşça pipet ve cam tüp içine boru kalan ayıran jel çözümü itmek şırınga kullanın. içine hava kabarcıkları izin vermeden önce pipet vanasını kapatın.
    9. Yavaşça su, doymuş butano yaklaşık 0.25 ml'lik bir katman eklemekCam tüp içinde jel çözeltisi üzerine l (çözelti 6, Tablo 1), havadaki oksijenle polimerizasyon reaksiyonu mühür ve en menisküs düzleştirin.
    10. deiyonize su (deterjan kullanmayın) ile hemen dökme aparatı temizleyin.
    11. Oda sıcaklığında tam jel polimerizasyonu için bir gece boyunca bekleyin.
  3. Cihaz ve saklamasını Jel Tüp çıkarılması
    1. Ertesi gün, dikkatli bir şekilde, cihazın üst kapalı bant soyma.
    2. pipet altında tüp valfini ayırın. kelepçe pipet bırakın ve adımlarını 1.3.3 gerçekleştirin. ve 1.3.4. Bir lavabonun üzerinde.
    3. Çift hortumun kadar deiyonize su ile dolu bir 10 ml'lik bir şırınga. yavaşça pipet dışarı polimerize jel sürme, pipet içine tüp aracılığıyla su itin.
    4. yatay pipet tutun ve dikkatli bir şekilde açık ucundan dışarı kayma jeli sabitleyin.
    5. altında ve aro fazla poliakrilamid kestiBir jilet kullanarak cam tüp und. cam tüp ucu ile floş yaparak, tüp içinde jel üzerinde düzgün bir uç oluşturmak için emin olun.
    6. jel üst kısmında kalan butanol koyun ve kapağını açıp 15 ml santrifüj tüpüne jel tüp ayarlayın. 4.5 mi ultra saf su ile 0.5 ml jel tamponu (çözelti 1, Tablo 1) karıştırın ve jel tüpünün çözeltisi (cam tüp içinde) iki üst kısmı ve (santrifüj tüpüne) alt tarafına yaklaşık 2 ilave edin.
    7. tampon buharlaşmasını önlemek için parafilm, cam tüp açılması da dahil olmak üzere santrifüj tüpünün tam üst tarafını, örtün. Jeller, yaklaşık 2 hafta boyunca 4 ° C'de saklanabilir.

2. Numune Hazırlama

  1. iki fare kalpleri tartılır ve bir jilet kullanarak bir Petri kabındaki onları kıyma.
  2. Bir harç işleme doku ekleme ve örnek karşılamak için yeterli sıvı azot ilave edin. daha ekleyerek, bir tokmak ile doku pulverizebuharlaşır sıvı azot.
  3. Doku iyice öğütülmüş sonra, azot buharlaşmasını sağlar ve doku, her 100 mg, 4 ° C 'de (çözelti 7, Tablo 1) liziz tamponu 1 ml. bir santrifüj tüpüne solüsyonu getirin.
  4. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 2000 x g'de santrifüjleyin. Dikkatle, yeni bir tüp süpernatant toplamak ve pelet atın. Bisinkoninik asit yöntemi 12 kullanarak süpernatant protein konsantrasyonu ölçmek ya da tercih olarak. Not: tercih edildiği yerel hücre lizatları ve hücre içi fraksiyonlar hazırlanabilir. CN-GELFrEE çeşitli yerli numune hazırlama ile uyumludur.
  5. Çözündürme tampon çözeltisi ve yükleme çözeltisi (çözeltiler 8 ve 9, Tablo 1) hazırlayın.
  6. Örnek pelet ise, çözücü tampon 50-150 ul içinde tekrar süspansiyon. 15 dakika boyunca buz üzerinde örnek tutun.
  7. Tampon yeniden süspansiyon haline örnek veya solubilizat hücre lizatı alışverişi30 kDa-MWCO ultra santrifüj filtre kullanarak iyon tampon.
  8. Protein, 4 ° C 'de örnek ve 5-10 dakika ya da muhafaza kısmı hacmi yaklaşık olarak 20 ul kadar 10,000 x santrifüjleyin. flow-through atın.
  9. tutulan fraksiyonu çözücü tampon 400 ul ekleyin ve pipetleme karıştırın. 4 ° C'de santrifüj ve 5-10 dakika için ya da muhafaza kısmı yaklaşık olarak 20 ul kadar 10,000 x. flow-through atın.
  10. Adımı yineleyin 2.9 iki ek kez.
  11. çözücü tampon 100 ul, süzüldü örnek (yaklaşık 20 ul) ile seyreltilir.
  12. örnek yükleme solüsyonu 20 ul ekleyin.

3. CN-GELFrEE Cihazı

  1. CN-GELFrEE fraksiyonasyon gerçekleştirmek bir makine atölyesi bakarak cihaz parça üretimi için. Teflon aygıt parçaları imalatı. Gerekli olan bütün bilgilerin parçaları ve t üretmek için Şekil 1 bakınızBir cihaz için gerekli olan parça sayısı o Tablo 2.
    Güvenlik İle İlgili Hususlar: Uygun kişisel koruyucu ekipman kullanın. Bakım yüksek gerilim güç kaynakları etrafında alınmalı ve tüm kavşaklar doğru monte edilmelidir. gerilim açıkken cihaz veya herhangi bir komşu ıslak alana dokunun ve elektroforez sırasında çevredeki tezgah alanı kuru korumak etmeyin. kotarma ve / veya kesirleri toplayan Dahası, güç kaynağı tamamen kapalı olmalıdır.
  2. Anot tampon ve katot tampon (çözümler 10-11, Tablo 1) hazırlayın ve 4 ° C'de veya buz saklayın.
  3. "sandviç" bir şekilde, bir aralayıcı, bir O-halka ve bir ikinci ara parça üzerinde silika jel borusu (jel olmayan uç) üst ucunu monte edin.
  4. İkinci aralama sonra tampon odasını (katot) ekleyin yan deliklerden tamamen vida geçmesi, her iki tarafa da fındık ekleyip sıkın. Emin olun glas üst ucus tüp tampon odasının üst diyafram önce doğrudan altında ya da geçmiş sabittir.
  5. bir aralayıcı, bir O-ring, toplama bölmesi ve bir ikinci ara parça vasıtasıyla jel tüpünün alt ucu monte edin.
  6. İkinci aralama sonra tampon odasını (anot) ekleyin yan deliklerden tamamen vida geçmesi, her iki tarafa da fındık ekleyip sıkın. yakın ama arka duvarına temas değil, jel tüpünün alt uç tampon odasının üst diyafram geçmiş sabit olduğundan emin olun.
  7. katot tampon haznesi yukarı kelepçeler ile bir destek standı kullanarak dikey CN-GELFrEE cihazı ayarlayın.
  8. katot tampon odasının (üst) anot tampon odasının (altta) ve katot tamponuna anot tamponu ekleyin. 4 ° C'de tüm tamponları tutun.
  9. hafifçe cam tüp dokunarak cam tüp içindeki hava kabarcıklarını çıkarın ve sızıntı sistemi kontrol ediniz.
  10. platin elektrot odalarında ve her ikisi de bu tamponlar ile temas olduğundan emin olunJel boru uçlarının, her bölme içinde tampon içine daldırılmaktadır.
  11. anot tampon odasının (altta) üzerine katot tampon odasının (üstte) negatif ve pozitif: İlgili muz fişler güç kaynağından güç kablolarını bağlayın.
  12. Jel tüpünün içinde, jel yüzeyinin üst bir jel yük ucunu kullanarak örnek yükleyin.
  13. kırmızı boya ön jel tüpün dibinde kadar, aşırı ısınmayı önlemek için, 1 W sabiti de jel çalıştırın.
    DİKKAT: devam etmeden önce güç kaynağını kapatın.
  14. anot ve katot tamponlar atın.
  15. Bir boşluk ve O-ring muhafaza, anot tampon odası tarafından fındık gevşetin ve alt ayırıcı ve odasına sökmeye. Üst diyafram, geçmiş ya da doğrudan bunun altında değil önce, toplama haznesi içerisindeki jel tüpünün alt ucunu yerleştirin. toplama haznesinin yakın boşluk ve O-ring itin.
  16. selüloz diyaliz membranı bir parça kesin ve anot tamponunda yükselmekte bunu rehydrate. ap KapakToplama odası ve diyaliz membranı kullanılarak alt ara parçasının erture.
  17. İkinci aralama sonra anot tampon odasına monte eklemek ve vidaları ve cıvataları sıkın.
  18. bir buz kovası üzerinde yatay cihazı yatırın. tampon odalarına taze anot ve katot tamponlar ekleyin ve sızıntı sistemi kontrol ediniz.
  19. toplama odasına anot tampon 150 ul ekleyin. İlgili muz fişler için güç kablolarını yeniden takın.
  20. 3 mA sabit akımda güç kaynağı açın. Boya ön daha sonra toplama odasında tampon içine Zehir başlamalıdır.
  21. Tüm boya ön ayrıştırılır zaman düşük protein bağlama mikrosantrifüj tüpe aktarılması, güç kaynağını kapatın ve birinci kısmını (0 dakika) toplamak.
  22. anot tampon 150 ul toplama haznesini doldurun. Buz üzerinde toplanan atık fraksiyonları tutun.
  23. koleksiyonundan aşağıdaki zaman aralıklarından sonra kesirler toplamakİlk kısım: 2 dakika, 4 dak, 6 dakika, 8 dakika, 10 dakika, 15 dakika, 20 dakika, 25 dakika, 30 dakika, 45 dakika ve 60 dakika. Güç kaynağı kapalı iken zaman hesap yok. kesirleri toplayan önce güç kaynağını kapatın unutma ve örnekler arasındaki anot tampon 150 ul toplama haznesini doldurmak için. Bir sonraki kısmını akıtılarak başlamak için toplandıktan sonra tekrar güç kaynağını açın.
  24. Anot ve katot tamponlar koyun ve 60 dakika sonra tampon haznelerinin taze çözüm ekleyin. 90 dakika ve 120 dakika da kesirler toplayın.
  25. anot ve katot tamponlar her saat değiştirin.
  26. net bir yerli ya da fraksiyonları ile mavi yerli PAGE çalıştırın ve tercih gibi leke. üreticinin talimatlarına ya da tercih edilen protokol izleyin.
  27. bir indirgeyici SDS-PAGE çalıştırın ve tercih gibi leke. üreticinin talimatlarına ya da tercih edilen protokol izleyin.
  28. GELFrEE kesirler temizleyin ve yerli kütle spektrometresi boyun tarif pr olarak analizlerieviously 9.

Şekil 1
Şekil 1:. CN-GELFrEE cihazı (A) GELFrEE cihazı parçaları çizimler ve imal edilmiş parçaların (B) fotoğrafıdır; (C) CN-GELFrEE cihazı Şema: (1) tampon maddesi haznesi (2) boşluk (3) O-ring, (4) Gel tüpü (5) toplama haznesi, ve (6) diyaliz zarı.

tablo 1
Tablo 1: çözümlerin Tablo.

Tablo 2
Tablo 2: GELFrEE cihaz parçalarının Tablo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

kriyojenik zemin fare kalpleri çıkarılan proteinlerin 200 mikrogram bir 1-12% T jel tüp CN-GELFrEE yöntemi kullanılarak, 150 ul her 14 bölüme doğal parçalandı. Her fraksiyonun 10 ul bir alikosu boyanmış bir CN-PAGE levha jel ve gümüş çalıştırıldı. CN-GELFrEE fraksiyon elde edilen fraksiyon ve çözünürlük net tasviri Şekil 2A gösterilmiştir. Fraksiyonlar bir iki saat boyunca toplandı ve bir jel tahlili ~ 30 ila 500 kDa arasında değişen moleküler ağırlıklara artan tutarlı bir modelini göstermektedir. Her fraksiyon ~ 100 kDa üzerinde kitle arasında değişen türleri bulunur. Kesirler daha fazla koleksiyonlar fraksiyonları arasında ne gibi giderek azalır molekül ağırlıklı-aralıkları düşük örtüşme gösterir. Burada gösterilen CN-PAGE levha jel her 150 ul fraksiyon elde proteinin sadece% 6 temsil etmektedir.

Fract heriyonları CN-GELFrEE daha sonra indirgendi ve bir SDS-PAGE jeli üzerinde kütük çalıştırarak önce denatüre edildi gelen doğal olarak yıkandı. SDS-PAGE levha jel (Şekil 2B), sağlam protein kompleksleri sökülmüş ve disülfit köprüleri azaltılmış gösteren ilgili ana fraksiyon (Şekil 2A) ile karşılaştırıldığında, tüm fraksiyonlar toplu vardiya görmek mümkündür.

şekil 2
Şekil 2:. Zaman aralıkları 0 dakika 120 toplanan CN-GELFrEE fraksiyonların fare kalp kriyojenik taşlama ekstraktının CN-GELFrEE ayırma (A) Temizle Doğal PAGE. Sol: Yerli molekül ağırlıklı merdiven. C. sol aynı fraksiyonların SDS-PAGE azaltılması (B): indirgenmiş ve denatüre molekül ağırlıklı merdiveni.

Fraksiyonlar daha sonra temizlenir ve submitt edilebiliryerli kütle spektrometresi ed 9 analiz eder. GELFrEE fraksiyonların bir kısmı tespit homodimerik malat dehidrojenaz, bir yerli MS spektrumu, 16 + 20 + ve 72.843 Da (Şekil 3A) bir molekül kütlesi arasındaki yük dağılımını gösterir. 18 yaş ve üzeri şarj durumu izole edilmiş ve 36,421.7 (Şekil 3B) bir moleküler kütleye sahip monomerik malat dehidrojenaz ejeksiyon sonuçlanan çarpışmayla aktive edildi. Kaynak aktivasyonu monomer çıkarma, izin izolasyonu ve monomerler daha parçalanma uyarmak için sağlam kompleks uygulanmıştır. 11 + monomer parçalanma haritası Şekil 3C'de gözlenebilir. CN-GELFrEE kütle spektrometrisi makromoleküler düzeneklerinin kovalent olmayan protein-protein etkileşimlerine hiçbir bozulma gösteren, analiz ile uyumlu olduğu kanıtlanmıştır.

Şekil 3, Şekil 3: kütle spektrumu ve parçalanma homodimer malat dehidrojenaz haritası (A) olduğu gibi kompleks MS1 spektrumu, (B), kompleksten çıkarılan MS2 tayfı sergileyen bir monomer, ve (C) monomer parçalanma elde edilen bir parçalanma haritası. . Kırmızı N, N-terminali asetile olduğunu gösterir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

CN-GELFrEE jel matrisi ile molekül ağırlıklı bazlı protein paya ayırma için taşıyıcı moleküllere 9 gibi anyonik ve nötral deterjanların bir karışımını kullanan net yerli (CN) PAGE tamponu sistemi elde edilir. yerel bir fare kalp protein özü CN-GELFrEE uygulanması biyomoleküler düzeneklerinin kovalent olmayan etkileşimleri korurken farklı bant genişlikleri ile birlikte düşük karmaşıklık kısımlar oluşturdu. CN-PAGE ve SDS-PAGE jellerinin levha arasındaki kısımların karşılaştırması fraksiyonlarında makromoleküller ve protein zincirleri arasındaki disülfıd bağlarının kırılmasına arasındaki kovalent olmayan etkileşimlerin kaybı göstermektedir toplu değişimleri göstermiştir. Sonuçlar CN-GELFrEE ayrılması yerli karakteri onaylamak.

Bu protokolde bazı adımlar kritik ve böylece daha fazla dikkat gerektirirler. İlk olarak, döküm sonrası, jel tüpü yavaşça cihaz ve dikkatlice kesilmiş dış poliakrilamid ayrılmış olmalıdır. Aksi takdirdeyani örgü içinde hava kabarcıkları neden veya cam tüpten jel ayrılmakta, jel zarar verebilir. Bu hasarlar ayırma çözünürlüğü bozabilir ve iyice kaçınılmalıdır. İkinci olarak, elektroforez sırasında, sistemin, elektrik direnci bu nedenle soğuk bölme prosedürü gerçekleştirmek ya da örnek olarak yüklendikten sonra bir buz kovası cihazı taşımak ya da çok önemlidir, ısı üreten, fazla artar jel, sırayla ısı tarafından yüklenen proteinleri denatüre etmek değil. Ayrıca, tarif edilen protokol gerçekleştirirken tekniğin bazı temel sınırlamalar akla önemlidir. Yüksek proteinli yükler CN-GELFrEE çözünürlüğü azaltabilir. bu protein türleri neden özellikle birkaç tür daha bol örneklerin, olacak Aşırı yükleme ardışık kesirler bir numara ile yıkandı edilecek. Fare kriyojenik olarak topraklanır numuneler için, en iyi sonuçlar 200 ve 400 ug arasındaki miktarlarda görülmüştür, ancak bu davranış örneği bağlıdır. Ayrıca, Hnumune tuz üksek seviyeleri bant deseni değiştirerek ve fraksiyon çözünürlüğü azaltarak, proteinlerin elektroforetik özelliklerini değiştirecektir. Bu kritik adımlar ve sınırlamalar daha iyi sonuçlar elde etmek için bu protokolün yerine getirilmesi sırasında göz önüne alınmalıdır.

Ayrıca, CN GELFrEE yerel kromatografi birden çok talep özelliklere sahip olduğu gösterilmiştir. Bu basit ayırma yöntemi molekül ağırlıkları geniş bir aralık içerisinde bir protein yükü ve damıtık maddelere bölünmesi yüksek miktarda kabul, protein kompleksleri, yüksek çözünürlüklü fraksiyonasyon elde edilir. CN-GELFrEE da organizma ve farklı preparatlar 9 büyük bir çeşitlilik biyolojik numunelerin paylarına ayırabilen olmak çok yönlü olduğu kanıtlanmıştır.

Ayrıca bu teknikle sıvı fraksiyon elüsyon için diğer jel bazlı ana ayırmalar görülmez yüksek protein iyileşme sağlar. Buna ek olarak, diğer yöntemlerin aksine, eUd düzenekleri, sıvı fazda, CN-GELFrEE örnek konsantrasyon azaltmaz. Aslında, burada tarif edilen bir protokol fraksiyonlara numuneden • 2-kat, her bir protein takımının konsantrasyonunu arttırır. Son olarak, bu yöntem oluşturur, sıvı numune kütle spektrometrisi analizlerinin, çeşitli alt biyokimyasal ve biyofiziksel nativ protein ile kolaylıkla uyumludur. Tek temizlemek adımdan sonra biz daha fazla bu teknikler arasında yerli moda ve uyumluluk gösteren yerli kütle spektrometresi, CN-GELFrEE kesirler bilinmeyen protein kompleksleri sayesinde, belirlemek ve tanımlamak için başardık.

Benzer GELFrEE denatüre, bu yeni yerli fraksiyonlara tekniği de son derece uyumludur. çözümler döküm konsantrasyonları çalışma sırasında çözülene molekül ağırlığı aralığına değiştirilmesi için farklı gradyan jelleri oluşturmak için ayarlanabilir. yüksek resolut ayırma jel çözümleri sonuçların% T artırılmasıdüşürürken düşük kütleli türler iyonu yüksek molekül ağırlıklı türlerin ayrılmasına artırır. Deney gerçekleştirildiği toplanmasını süreleri de gerektiğinde, her fraksiyon elde molekül ağırlıklı bant genişliklerini optimize etmek amacıyla uyarlanabilir. Bu protokol tasvir daha yüksek molekül ağırlıklı aralıkları üretecektir 120 dakika yukarıdaki genişletilmiş deney süresi. Buna ek olarak, fraksiyon toplama arasındaki süreyi azaltarak her fraksiyon karmaşıklığı azaltabilir. Bu nedenle, birden çok parametre kolayca farklı çalışmalara tekniğin kullanımını optimize ince ayar yapılabilir.

Sonuç olarak, CN-GELFrEE avantajları moleküler ağırlıkları, yüksek protein toparlanma geniş yelpazede yüksek çözünürlüklü ayrımı sunan ve protein yükünün yüksek miktarda kabul yerli ayırma teknikleri alanında bir boşluğu işgal. Son olarak, elde edilen fraksiyonlar en aşağı yerli ve denatüre protein analiz teknikleri ile uyumludur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

WM Keck Vakfı cömertçe bu iş için fon sağladı. hükümet altında, Yükseköğretim Personel İyileştirme Koordinasyon gelen Sınırlar burs 88888.075416 / 2013-00 olmadan RDM için Brezilya, Fen - Bu madde Rio de Janeiro Devlet hükümetten FAPERJ araştırma bursu 100,039 / 2014 tarafından desteklenen çalışma dayanmaktadır Brezilya, HSS için, Ulusal Bilim Vakfı Lisansüstü Araştırma OSS için burs numarası 2014171659 altında Kardeşliği ve CNPq araştırma bursu LHFDVPCH için Brezilya hükümetinden 202011 / 2012-7 tarafından Hayat bir Northwestern Üniversitesi Kimya alıcı Enstitüsü Postdoktora Süreçleri olduğunu Kardeşlik Ödülü.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
30% acrylamide/bis solution, 37.5:1 Bio-Rad 161-0158 This solution is neurotoxic.
6-aminohexanoic acid (ε-aminocaproic acid) Sigma-Aldrich A2504 This chemical is an irritant.
Ammonium persulfate (APS) Fisher Scientific 7727-54-0 This chemical is flammable, toxic, and corrosive.
Coomassie blue G250 Bio-Rad 161-0406
Dodecylmaltoside Sigma-Aldrich D4641 This chemical is an irritant.
Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA) FLUKA 3777 This chemical is toxic.
Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) Fisher Scientific BP120 This chemical is toxic.
Glycerol Fisher Scientific 56-81-5
Imidazole Sigma-Aldrich I2399
Liquid nitrogen Any supplier n/a Store liquid nitrogen in containers
designed for low-temperature
liquids
Mouse heart Bioreclamation LLC MSE-HEART
n-butanol Fisher Scientific 71-36-3 This chemical is flammable and toxic.
Ponceau S Sigma-Aldrich BP103
Protease Inhibitor Cocktail Thermo Fisher Scientific 78430 This chemical is toxic.
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich 30970 This chemical is an irritant.
Sucrose JTBaker 4097
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Bio-Rad 161-0800 This chemical flammable and irritant.
Tris-HCl Amresco M151
Trycine Bio-Rad 161-071
Equipment
Gradient mixer Hoefer SG15
Magnetic stir  Any supplier n/a
Magnetic bars  Any supplier n/a Small enough to fit inside the gradiet mixer chambers.
Power supply Bio-Rad 164-5056 Voltage up to 1,500 V
Refrigerated centrifugue Eppendorf 022622552 Up to 15,000 x g
Materials
15 ml conical tube Any supplier n/a
30 kDa-MWCO ultra centrifugal filter Millipore UFC503096
Flexible tubing Saint-Gobain B000FOV1J0 Approximately 1 m length
Ice bucket Any supplier n/a
Liquid/air metallic or plastic valve. (e.g. aquarium air/water flow control lever valve) Any supplier  n/a Aquarium valves are compatible.
Mortar and pestle Any supplier n/a
Native PAGE 3-12% T slab gel Invitrogen BN1003
Parafilm Bemis PM-996
Petri dish Fisher Scientific 08-757-13
Protein low bind tube 1.5 ml Eppendorf 022431081
Razor blade IDL Tools TE05-091C
Regenerated cellulose dialysis tubing 3,500 MWCO Fisher Scientific 21-152-9
SDS-PAGE slab gel for any kDa Bio-Rad 456-9036
Serological pipets (25 ml) VWR 89130-900
Syringe (10 ml) Any supplier n/a

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alberts, B. The Cell as a Collection of Protein Machines: Preparing the Next Generation of Molecular Biologists. Cell. 92, (3), 291-294 (1998).
  2. Gingras, A. C., Gstaiger, M., Raught, B., Aebersold, R. Analysis of protein complexes using mass spectrometry. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, (8), 645-654 (2007).
  3. Gavin, A. C., Bösche, M., et al. Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes. Nature. 415, (6868), 141-147 (2002).
  4. Puig, O., Caspary, F., et al. The Tandem Affinity Purification (TAP) Method: A General Procedure of Protein Complex Purification. Methods. 24, (3), 218-229 (2001).
  5. Cremer, K. D., Hulle, M. V., et al. Fractionation of vanadium complexes in serum, packed cells and tissues of Wistar rats by means of gel filtration and anion-exchange chromatography. JBIC J. Biol. Inorg. Chem. 7, (7-8), 884-890 (2002).
  6. Tanese, N. Small-Scale Density Gradient Sedimentation to Separate and Analyze Multiprotein Complexes. Methods. 12, (3), 224-234 (1997).
  7. Bunai, K., Yamane, K. Effectiveness and limitation of two-dimensional gel electrophoresis in bacterial membrane protein proteomics and perspectives. J. Chromatogr. B. 815, (1-2), 227-236 (2005).
  8. Wittig, I., Schägger, H. Advantages and limitations of clear-native PAGE. PROTEOMICS. 5, (17), 4338-4346 (2005).
  9. Skinner, O. S., Do Vale, L. H. F., et al. Native GELFrEE: A New Separation Technique for Biomolecular Assemblies. Anal. Chem. 87, (5), 3032-3038 (2015).
  10. Nijtmans, L. G. J., Henderson, N. S., Holt, I. J. Blue Native electrophoresis to study mitochondrial and other protein complexes. Methods. 26, (4), 327-334 (2002).
  11. Tran, J. C., Doucette, A. A. Gel-Eluted Liquid Fraction Entrapment Electrophoresis: An Electrophoretic Method for Broad Molecular Weight Range Proteome Separation. Anal. Chem. 80, (5), 1568-1573 (2008).
  12. Smith, P. K., Krohn, R. I., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150, (1), 76-85 (1985).
CN-GELFrEE - net yerli jel-elüt sıvı kısmı Tuzak Elektroforez
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Melani, R. D., Seckler, H. S., Skinner, O. S., Do Vale, L. H. F., Catherman, A. D., Havugimana, P. C., Valle de Sousa, M., Domont, G. B., Kelleher, N. L., Compton, P. D. CN-GELFrEE - Clear Native Gel-eluted Liquid Fraction Entrapment Electrophoresis. J. Vis. Exp. (108), e53597, doi:10.3791/53597 (2016).More

Melani, R. D., Seckler, H. S., Skinner, O. S., Do Vale, L. H. F., Catherman, A. D., Havugimana, P. C., Valle de Sousa, M., Domont, G. B., Kelleher, N. L., Compton, P. D. CN-GELFrEE - Clear Native Gel-eluted Liquid Fraction Entrapment Electrophoresis. J. Vis. Exp. (108), e53597, doi:10.3791/53597 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter