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Chemistry

CN-GELFrEE - Clear natif Gel-élué Fraction liquide Entrapment Electrophoresis

doi: 10.3791/53597 Published: February 29, 2016
* These authors contributed equally

Abstract

complexes de protéines jouent un éventail de fonctions cruciales cellulaires. Élucider leurs interactions et la dynamique non-covalentes est primordiale pour comprendre le rôle des complexes dans les systèmes biologiques. Alors que la caractérisation directe des assemblages biomoléculaires est devenu de plus en plus importante au cours des dernières années, les techniques de fractionnement indigènes qui sont compatibles avec les techniques d'analyse en aval, y compris la spectrométrie de masse, sont nécessaires pour étendre ces études. Néanmoins, le champ n'a pas de haut débit, une large gamme, méthode de séparation à haute récupération pour les assemblages de protéines natives. Ici, nous présentons fraction liquide de gel-élué électrophorèse native claire piégeage (CN-GELFrEE), qui est une nouvelle modalité de séparation pour les assemblages de protéines non-covalentes. performance de séparation CN-GELFrEE a été démontrée par des complexes de fractionnement extraits de coeur de la souris. Les fractions ont été recueillies sur 2 heures et affichées bandes discrètes allant de ~ 30 à 500 kDa. Un conmotif cohérents d'augmenter les largeurs de bande de poids moléculaire a été observée, allant chacun ~ 100 kDa. En outre, une nouvelle analyse subséquente des fractions natives par SDS-PAGE a montré poids moléculaire se déplace en accord avec la dénaturation des complexes protéiques. Par conséquent, le CN-GELFrEE a été prouvé à offrir la possibilité d'effectuer à haute résolution et à haute récupération des séparations indigènes sur des complexes de protéines à partir d'une large gamme de poids moléculaire, en fournissant des fractions qui sont compatibles avec les analyses de protéines en aval.

Introduction

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La plupart des processus biologiques qui se déroulent à l' intérieur d' une cellule sont considérées comme étant réalisées par des assemblages de protéines plutôt que des protéines individuelles 1. Par conséquent, afin d'élucider le rôle biologique spécifique d'une sous - unité de la protéine dans une cellule , il est nécessaire de comprendre ses interactions avec d' autres protéines structurales ou des ligands dans les complexes 2. Cependant, l'étude des protéines nativement, le maintien de leurs interactions et de l'activité non-covalentes, reste difficile. L'un des défauts des études de la protéine native est une technique de séparation natif approprié qui est compatible avec les différentes techniques d'analyse des protéines en aval. Par conséquent, l' intérêt récent des techniques de séparation permettant de caractériser des ensembles non-covalentes de biomolécules a fortement augmenté 3.

Les techniques de séparation des protéines sont indispensables à la biochimie, la biophysique et de diverses autres études. Les techniques de séparation natives actuelles ont intrinsidéficiences c qui réduisent la compatibilité avec les analyses en aval, tels que la faible résolution, un faible débit, la perte de la précipitation, et l'exigence de grandes quantités d'échantillon initial. Tandem purification d'affinité est couramment utilisé pour les études d'interaction des protéines, mais il doit être effectué séparément pour chaque protéine cible, l' amenant à être incompatible avec l' analyse à haut débit 4. Chromatographie d'exclusion de taille 5, la précipitation sélective avec une Chromatographie d'affinité d'ions et 5 gradient de densité de séparation 6 ont tous fourni des séparations natives, mais sont en soi des techniques à basse résolution et nécessitent des quantités initiales élevées de l' échantillon.

En variante, des techniques à base de gel, comme le bleu natif (BN) et Clear natif (CN) PAGE (soit 1-D ou 2-D), écran haute résolution séparation. En outre, ce qui contraste avec les autres techniques mentionnées, les deux séparations PAGE indigènes maintiennent la solubilité et conformation native d'un large range d'espèces macromoléculaires, y compris des protéines hydrophobes. Cette capacité élargit encore la couverture du protéome atteint par ces méthodes 7,8 et est réalisée grâce à la chimie différente entre le CN et BN-PAGE. CN-PAGE repose généralement sur les détergents doux chargés comme des molécules porteuses, en remplaçant le colorant bleu de Coomassie dans BN-PAGE. BN-PAGE, mais associée à une résolution plus élevée, telles que des mises en garde a une activité enzymatique réduite dans les protéines séparées 8 et formation d' un produit d' addition d' une molécule de Coomassie, ce dernier étant fortement préjudiciable à l' aval des analyses MS 9. Ces deux méthodes, cependant, sont traditionnellement associés à une faible récupération et de la couverture du protéome étroite en raison de la coloration et les limites d'extraction de gel 7.

Pour l'étude des protéines dénaturées, il existe plusieurs techniques qui maintiennent macromolécule solubilité dans l'exercice de haute résolution fractionnement avec récupération riche en protéines et qui sont compatibles avec diVerse techniques d'analyse de protéines post-séparation. Gel-éluée Fraction liquide Entrapment Electrophoresis (GELFrEE) est l'une des techniques de fractionnement qui correspondent à toutes ces caractéristiques. Cette méthode est largement appliquée dans les études à haut débit protéomique haut de bas, ce qui indique qu'il est rapide et polyvalent. En GELFrEE, les protéines sont dénaturées et séparés en fonction du poids moléculaire à travers une matrice de gel tubulaire, dont la porosité peut varier en fonction des exigences de l'échantillon et les résultats de fractionnement souhaités. Les fractions sont éluées en phase liquide, en réduisant ainsi les limitations de récupération associés à la SDS-PAGE, tout en conservant une grande résolution. Aliquotes de fractions peuvent ensuite être analysés par 1-D PAGE pour poids moléculaire sélection de bande passante 11. Il y a une forte demande pour les avantages associés à GELFrEE dans les techniques de séparation indigènes. Le procédé décrit ici, Effacer natif GELFrEE (CN-GELFrEE), est une adaptation native de GELFrEE. Afin d'être compatible avec une large spectrum des macromolécules dans leur état ​​natif, ce procédé repose non seulement sur ​​la NC-PAGE chimie douce, mais également une séparation par gradient de porosité, ce qui réduit la précipitation des protéines en éliminant la transition dure entre les porosités présentes dans les systèmes de gels discontinus 9. Lorsqu'il est appliqué à fractionner les complexes de protéines extraites du coeur de la souris, les fractions éluées affichent une récupération élevée et une séparation à haute résolution d'une large gamme de poids moléculaires a été obtenue. En outre, les fractions obtenues sont compatibles avec la plupart des analyses de protéines biochimique et biophysique en aval.

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Protocol

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Remarque: Ce protocole vidéo est basé sur une publication associée à 9. réactifs spécifiques, le matériel et l'équipement nécessaire pour effectuer toutes les étapes décrites dans ce protocole sont énumérés dans la section des matériaux. Les recettes et des informations pour la préparation de toutes les solutions requises sont détaillées dans le tableau 1.

1. Verser de Gels Tube Gradient

  1. Montage du système de coulée
    1. En utilisant une lame de rasoir ou un scalpel de flamme chauffé, couper une pipette 20 ml sérologique le long d'une section orthogonale 10 cm du haut de la pointe de distribution. Assurez-vous que la surface de coupe est lisse. Gardez la pièce de fond (avec la pointe) et jeter la pièce supérieure. Fixer la pièce de pipette en bas verticalement (pointe conique vers le bas) à une position de soutien.
      ATTENTION: Ne pas toucher le métal de la lame chauffée, utiliser les poignées appropriées ou une pince pour éviter les brûlures.
    2. Coupez 3 cm de tube souple et le connecter à la pipette de coupe en l'étirant surla pointe de distribution. Raccorder la vanne de régulation de débit à l'autre extrémité du tube.
    3. Relier la partie inférieure de la vanne à l'extrémité de distribution du mélangeur à gradient en utilisant un morceau de tube. Maintenir le robinet ouvert.
    4. Réglez le mélangeur de gradient sur le dessus d'un agitateur magnétique. Placez les barres magnétiques à l'intérieur des chambres de mélange.
    5. Positionner la pointe de distribution du mélangeur à gradient 5-10 cm plus haut que la partie supérieure de la pièce de pipette pour permettre le gel à couler par gravité.
    6. Testez le système d'étanchéité à l'eau déminéralisée. Si aucune fuite, sécher le système par soufflage d'air à l'intérieur avant de continuer.
    7. Couvrez le dessus de la pièce de pipette avec deux ou plusieurs couches de ruban. Percer un trou à travers les couches de bande dans le centre de l'ouverture circulaire. Assurez-vous que la ponction est assez grand pour le tube de verre pour passer d'une manière étanche.
    8. Faites glisser le tube de verre, où le gel sera jeté, à travers le trou percé, l'étirement de la bande de sorte que le verre est bien serrée. jensert le tube en verre de sorte que le fond du tube est de 2 mm au-dessus du fond de la pipette.
    9. Vérifiez si le tube de verre est maintenu et centralisé et ne touche pas la paroi de la pipette une fois que le système est préparé. Le système est maintenant prêt pour la coulée.
  2. Gel de coulée
    1. Préparer un tampon de gel, APS et solutions Coomassie (solutions 1-3, tableau 1).
    2. Préparer 12% de T (solution à 4, tableau 1) et 1% T (solution à 5, tableau 1) la séparation des solutions de gel. Ajouter 10 pi de solution de Coomassie dans la solution de 12% de gel de séparation T. Ajouter APS et TEMED dans les deux solutions immédiatement avant de verser dans le mélangeur gradient.
      ATTENTION: polyacrylamide est très neurotoxique et des gants doivent être portés.
    3. Assurez-vous que la vanne de distribution du mélangeur à gradient est fermé. Ajouter la séparation solution de gel à la chambre la plus éloignée de mélange de la pointe de distribution de 12% T. Ouvrez la valve entre les deux chambres et laisser couler la solution into la chambre suivante.
    4. Fermer le robinet et la pipette la solution de 12% de gel T de séparation disloquée de retour à la chambre précédente. Ceci est fait pour éviter les bulles d'air entre les chambres.
    5. Ajouter la séparation solution de gel à la chambre la plus proche de la pointe de distribution de mélange 1% T. Allumez l'agitateur magnétique.
    6. robinets mélangeurs ouverts à la fois à gradient en même temps pour permettre à la solution de gel de séparation à mélanger et à l'écoulement dans le tube de pipette et le verre.
    7. Une fois que les solutions de gel de séparation dans le mélangeur à gradient sont épuisées, désaccoupler le tuyau du mélangeur et le coupler à une seringue de 10 ml. Assurez-vous que l'extrémité du tube reste au-dessus du niveau de liquide dans la pipette jusqu'à ce que la seringue est fermement attaché.
    8. Utilisez la seringue pour pousser doucement la solution de séparation restante de gel du tuyau dans le tube de la pipette et le verre. Fermer le robinet de la pipette avant de permettre à des bulles d'air en elle.
    9. Ajouter délicatement une couche d'environ 0,25 ml de butano saturé d'eaul (solution à 6, tableau 1) au - dessus de la solution de gel à l' intérieur du tube de verre pour sceller la réaction de polymérisation de l' oxygène dans l' air et d'aplatir le ménisque supérieur.
    10. Nettoyez l'appareil de coulée immédiatement avec de l'eau déminéralisée (ne pas utiliser de détergent).
    11. Attendez le lendemain pour la polymérisation complète du gel à la température ambiante.
  3. Détacher Gel Tube à partir du périphérique et Stockage
    1. Le lendemain, détachez soigneusement la bande du haut de l'appareil.
    2. Déconnecter la vanne de la tuyauterie sous la pipette. Relâchez la pipette de la pince et effectuer les étapes 1.3.3. et 1.3.4. dessus d'un évier.
    3. Coupler une seringue de 10 ml remplie d'eau déminéralisée pour le tube flexible. Pousser l'eau à travers le tube dans la pipette, glisser lentement le gel polymérisé de la pipette.
    4. Tenir la pipette horizontalement et fixez soigneusement le gel glissant hors de l'extrémité ouverte.
    5. Coupez l'excédent de polyacrylamide en dessous et around le tube de verre en utilisant une lame de rasoir. Assurez-vous de créer une extrémité lisse sur le gel dans le tube, en le rendant au ras de l'extrémité du tube de verre.
    6. Distribuer tout butanol restant de la partie supérieure du gel et régler le tube de gel dans un tube de 15 ml de centrifugeuse non plafonné. Mélanger 0,5 ml de tampon de gel (solution 1, tableau 1) avec 4,5 ml d' eau ultra-pure et ajouter environ 2 ml de la solution à la fois le côté supérieur (dans le tube en verre) et le côté inférieur (dans un tube de centrifugation) du tube de gel.
    7. Recouvrir la partie supérieure complète du tube de centrifugeuse, y compris l'ouverture du tube de verre, avec du parafilm pour éviter toute évaporation du tampon. Les gels peuvent être stockés à 4 ° C pendant environ 2 semaines.

Préparation 2. Sample

  1. Peser deux cœurs de souris et hachez-les dans une boîte de Pétri en utilisant une lame de rasoir.
  2. Ajouter le tissu traité dans un mortier et d'ajouter de l'azote liquide suffisante pour couvrir l'échantillon. Pulvériser le tissu avec un pilon, en ajoutantazote liquide quand il évapore.
  3. Une fois que le tissu est complètement broyé, laisser évaporer de l' azote et ajouter 1 ml de tampon de lyse (solution à 7, tableau 1) à 4 ° C pour 100 mg de tissu. Passer la solution dans un tube de centrifugeuse.
  4. Centrifugeuse à 2000 xg pendant 5 min à 4 ° C. Recueillir soigneusement le surnageant dans un nouveau tube et jeter le culot. Quantifier la concentration en protéine dans le surnageant en utilisant le procédé à l'acide bicinchoninique 12, ou comme préféré. Nota: Les lysats cellulaires natifs ou des fractions sous-cellulaires peuvent être préparés comme préférés. CN-GELFrEE est compatible avec divers différentes préparations d'échantillons natifs.
  5. Préparer la solution de tampon de solubilisation et d'une solution de chargement (solutions 8 et 9, tableau 1).
  6. Si l'échantillon est une pastille remise en suspension dans 50 à 150 pi de tampon de solubilisation. Gardez l'échantillon sur la glace pendant 15 min.
  7. Échanger le tampon de l'échantillon remis en suspension ou le lysat cellulaire avec solubilizattampon ion en utilisant un filtre centrifuge ultra-30 kDa MWCO.
  8. Centrifuger l'échantillon de protéines à 4 ° C et 10 000 x g pendant 5 à 10 minutes, ou jusqu'à ce que le volume de la fraction retenue est jusqu'à environ 20 ul. Jeter l'écoulement.
  9. Ajouter 400 pi de tampon de solubilisation de la fraction retenue et mélanger par pipetage. Centrifuger à 4 ° C et 10 000 x g pendant 5 à 10 minutes, ou jusqu'à ce que la fraction retenue est jusqu'à environ 20 ul. Jeter l'écoulement.
  10. Répétez l'étape 2.9 deux fois supplémentaires.
  11. Diluer l'échantillon filtré (environ 20 ul) dans 100 ul de tampon de solubilisation.
  12. Ajouter 20 pi de solution de chargement à échantillonner.

3. CN-GELFrEE Dispositif

  1. Pour effectuer CN-GELFrEE fractionnement, la fabrication des pièces de l'appareil en se référant à un atelier d'usinage. Fabrication des pièces de l'appareil en Teflon. S'il vous plaît se référer à la figure 1 pour toutes les informations nécessaires pour fabriquer les pièces et to Tableau 2 pour le nombre de pièces nécessaires pour un seul appareil.
    Considérations de sécurité: Porter un équipement de protection individuelle approprié. Il faut prendre soin autour des blocs d'alimentation à haute tension, et toutes les jonctions doit être monté correctement. Ne touchez pas l'appareil ou une zone humide adjacente tandis que la tension est en marche et maintenir la zone de banc entourant sec pendant l'électrophorèse. En outre, l'alimentation doit être complètement éteint lors de la manipulation de l'appareil et / ou en recueillant des fractions.
  2. Préparer le tampon d'anode et la cathode tampon (solutions 10-11, tableau 1) et les maintenir à 4 ° C ou dans de la glace.
  3. Monter l'extrémité supérieure du tube de gel (fin sans gel) par une entretoise, un joint torique et une seconde entretoise, d'une manière «sandwich».
  4. Ajouter la chambre tampon (cathode) après la seconde entretoise, passer les vis complètement à travers les trous latéraux, ajouter et serrer les écrous des deux côtés. Veiller à ce que l'extrémité supérieure du verres tube est fixé avant l'ouverture supérieure de la chambre tampon, non pas directement en dessous ou devant elle.
  5. Monter l'extrémité inférieure du tube de gel à travers une entretoise, un joint torique, la chambre de collecte, et une seconde entretoise.
  6. Ajouter la chambre tampon (anode) après la seconde entretoise, passer les vis complètement à travers les trous latéraux, ajouter et serrer les écrous des deux côtés. Assurez-vous que l'extrémité inférieure du tube de gel est fixé devant l'ouverture supérieure de la chambre de tampon, à proximité mais sans toucher le mur du fond.
  7. Réglez l'appareil CN-GELFrEE verticalement avec la chambre tampon de cathode vers le haut en utilisant un support de support avec des pinces.
  8. Ajouter un tampon d'anode à la chambre de tampon d'anode (en bas) et un tampon cathodique à la chambre tampon de cathode (en haut). Gardez tous les tampons à 4 ° C.
  9. Retirer les bulles d'air à l'intérieur du tube de verre en tapotant doucement le tube de verre et vérifier le système de fuite.
  10. Assurez-vous que les électrodes de platine sont en contact avec les tampons dans les chambres et que les deuxles extrémités du tube de gel sont immergés dans le tampon à l'intérieur de chaque chambre.
  11. Branchez les cordons d'alimentation de l'alimentation des fiches bananes respectives: négatif sur la chambre tampon de cathode (en haut) et positif sur la chambre tampon d'anode (en bas).
  12. Chargez l'échantillon à l'aide d'une pointe de charge de gel sur la surface supérieure du gel, à l'intérieur du tube de gel.
  13. Exécuter le gel à 1 W constante, afin d'éviter une surchauffe, jusqu'à ce que le front du colorant rouge est au fond du tube de gel.
    ATTENTION: Coupez l'alimentation avant de poursuivre.
  14. Jeter anode et cathode tampons.
  15. Desserrer les écrous de la chambre tampon d'anode et démonter l'entretoise inférieure et la chambre, le maintien d'une entretoise et le joint torique. Placer l'extrémité inférieure du tube de gel à l'intérieur de la chambre de collecte, avant l'ouverture supérieure, pas au-delà ou directement en dessous. Poussez l'entretoise et le joint torique à proximité de la chambre de collecte.
  16. Coupez un morceau de membrane de dialyse de cellulose et la réhydrater par immergeant dans un tampon d'anode. Couvrir le aperture entre la chambre collectrice et l'entretoise inférieure en utilisant la membrane de dialyse.
  17. Assembler la chambre tampon d'anode après la seconde entretoise, ajouter et serrer les vis et les boulons.
  18. Poser l'appareil horizontalement sur un seau à glace. Ajouter anode et cathode tampons frais aux chambres tampons et vérifier le système de fuite.
  19. Ajouter 150 ul de tampon d'anode dans la chambre de collecte. Rebranchez les cordons d'alimentation aux fiches bananes respectives.
  20. Allumez l'alimentation à 3 mA de courant constant. Le front de colorant devrait alors commencer à éluer dans la mémoire tampon dans la chambre de collecte.
  21. Lorsque l'ensemble du front de colorant est élue, coupez l'alimentation électrique et de recueillir la première fraction (0 min), le transférer dans un tube à centrifuger de liaison faible teneur en protéines.
  22. Remplir à nouveau la chambre de collecte avec 150 ul de tampon d'anode. Gardez toutes les fractions recueillies sur la glace.
  23. Recueillir des fractions après les intervalles de temps suivants de la collection de lapremière fraction: 2 min, 4 min, 6 min, 8 min, 10 min, 15 min, 20 min, 25 min, 30 min, 45 min et 60 min. Ne pas tenir compte du temps lorsque l'alimentation est coupée. Ne pas oublier de couper l'alimentation électrique avant de recueillir les fractions et pour remplir la chambre de collecte avec 150 pi de tampon d'anode entre les échantillons. Couper l'alimentation électrique à nouveau après la collecte pour commencer l'élution de la fraction suivante.
  24. Distribuer l'anode et la cathode des tampons et des solutions fraîches ajouter aux chambres tampons après 60 min. Collecter des fractions à 90 min et 120 min.
  25. Changer anode et cathode tampons toutes les heures.
  26. Exécuter un natif clair ou PAGE natif bleu avec les fractions et tacher comme préféré. Suivez les instructions du fabricant ou le protocole préféré.
  27. Exécuter une réduction de SDS-PAGE et tacher comme préféré. Suivez les instructions du fabricant ou le protocole préféré.
  28. Nettoyer les fractions de GELFrEE et soumettre à la spectrométrie de masse native analyses que pr décriteviously 9.

Figure 1
Figure 1:. CN-GELFrEE dispositif (A) dispositif de GELFrEE pièces dessins et (B) photographie de pièces fabriquées; (C) CN-GELFrEE schéma de montage de l' appareil: (1) chambre tampon, (2) d' espacement, (3) O-ring, (4) tube de gel, (5) chambre de collecte, et (6) membrane de dialyse.

Tableau 1
Tableau 1: Tableau des solutions.

Tableau 2
Tableau 2: Tableau des parties du dispositif GELFrEE.

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Representative Results

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200 pg de protéines extraites des cœurs de souris cryogéniquement au sol ont été fractionnées de manière native en 14 fractions de 150 pl chacune, en utilisant la méthode CN GELFrEE dans un tube de 1 à 12% de gel T. Une aliquote de 10 ul de chaque fraction a été exécutée sur une plaque de gel CN-PAGE et colorés à l'argent. Une description claire du fractionnement et de la résolution obtenue avec le CN-GELFrEE fractionnement est représenté sur la figure 2A. Les fractions ont été collectées pendant deux heures et le dosage sur gel montre une tendance constante d'augmentation des poids moléculaires allant de ~ 30 et 500 kDa. Chaque fraction contient des espèces allant de la masse sur ~ 100 kDa. Fractions affichent un faible chevauchement de poids moléculaire gammes qui est de plus en plus réduites que plusieurs collections se produisent entre les fractions. La plaque de gel PAGE-CN représentée ici représente seulement 6% de la protéine récupérée à partir de chaque fraction de 150 pi.

Chacun des fractions élué natif du CN-GELFrEE ont ensuite été réduit et dénaturé avant de les exécuter sur une plaque de gel SDS-PAGE. Dans le gel réducteur de SDS-PAGE à la dalle (figure 2B), il est possible d'avoir des décalages de masse dans toutes les fractions, par rapport aux fractions natives respectives (figure 2A), ce qui indique que des complexes de protéines intactes ont été démontées et les ponts disulfure ont été réduits.

Figure 2
Figure 2:. Séparation CN-de GELFrEE du cœur de souris extrait de broyage cryogénique (A) Effacer natif PAGE des fractions CN-GELFrEE recueillies à des intervalles de temps 0 à 120 min. Gauche: échelle native poids moléculaire. (B) Réduction de SDS-PAGE des mêmes fractions que A. Gauche: réduite et dénaturée échelle de poids moléculaire.

Fractions peuvent ensuite être nettoyés et submitted à la spectrométrie de masse native analyse 9. Spectre de la malate déshydrogénase homodimère, identifié dans certains des fractions de GELFrEE MS Native, montre une répartition de charge entre 16+ et 20+ et une masse moléculaire de 72.843 Da (figure 3A). L'état 18+ de charge a été isolé et par collision-activé, ce qui entraîne l'éjection de monomère malate déshydrogénase avec une masse moléculaire de 36,421.7 (figure 3B). l'activation de la source a été appliquée sur le complexe intact afin d'induire l'éjection de monomère, ce qui permet l'isolement et la fragmentation supplémentaire des monomères. La carte de fragmentation du monomère 11+ peut être observé sur la figure 3C. CN-GELFrEE a été prouvé pour être compatible avec des analyses par spectrométrie de masse, ne montrant aucune perturbation des non covalentes interactions protéine-protéine d'assemblages macromoléculaires.

Figure 3 Figure 3: Les spectres de masse et de fragmentation plan de l'homodimère malate déshydrogénase (A) du spectre MS1 du complexe intact, (B) MS2 spectre monomère présentant éjectées à partir du complexe, et (C) une carte de fragmentation obtenu à partir de la fragmentation du monomère. . Le N rouge indique que l'extrémité N-terminale est acétylée.

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Discussion

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CN GELFrEE est dérivé du natif clair (CN) du système de mémoire tampon de page qui utilise un mélange de détergents anioniques et neutres, des molécules de support 9 , pour le fractionnement des protéines à base de masse moléculaire à travers une matrice de gel. L'application du CN GELFrEE à un extrait de protéine de cœur de souris natif généré des fractions de faible complexité avec des bandes passantes distinctes, tout en conservant des interactions non covalentes des assemblages biomoléculaires. La comparaison des fractions entre le CN-PAGE et SDS-PAGE réductrice des gels en plaque de masse a montré des changements qui démontrent la perte d'interactions non covalentes entre les macromolécules dans les fractions et la rupture des liaisons disulfure entre les chaînes protéiques. Les résultats confirment le caractère natif de la séparation CN-GELFrEE.

Certaines étapes de ce protocole sont critiques et donc méritent plus d'attention. Tout d'abord, après la coulée, le tube de gel doit être détaché du dispositif lentement et le polyacrylamide externe découpez soigneusement. Le non-respectpeut endommager le gel, provoquant des bulles d'air à l'intérieur de la maille ou du retrait du gel à partir du tube de verre. Ces dommages altèrent la résolution de séparation et doivent être soigneusement évitées. En second lieu, au cours de l'électrophorèse, la résistance électrique du système augmentera les heures supplémentaires, la production de chaleur, il est donc très important de soit exécuter la procédure dans une chambre froide ou pour déplacer l'appareil à un seau à glace après que l'échantillon a été chargé dans le un gel, afin de ne pas dénaturer les protéines chargées par la chaleur. Par ailleurs, il est important d'occuper certaines limitations principales de cette technique lors de l'exécution du protocole décrit. Des charges élevées de protéines peuvent réduire la résolution CN-GELFrEE. La surcharge, en particulier des échantillons dans lesquels quelques espèces sont plus abondantes, provoque des espèces protéiques à éluer par un certain nombre de fractions consécutives. Pour les échantillons de cryobroyé de souris, les meilleurs résultats ont été observés avec des quantités comprises entre 200 et 400 ug, mais ce problème est d'échantillonnage dépendant. En outre, hniveaux IGH de sel dans l'échantillon va modifier les propriétés électrophorétiques des protéines, la modification du motif de bande et de réduire la résolution de fractionnement. Ces étapes critiques et les limites doivent être prises en compte lors de l'exécution de ce protocole pour obtenir de meilleurs résultats.

En outre, le CN-GELFrEE a été démontré que plusieurs caractéristiques très demandées en chromatographie native. Ce procédé de séparation simple, permet d'obtenir un fractionnement à haute résolution de complexes de protéines, d'accepter des quantités élevées de la charge protéique et de fractionnement à travers une large gamme de poids moléculaires. CN-GELFrEE a également été prouvé pour être très polyvalent, étant capable de fractionner des échantillons biologiques à partir d' une grande variété d'organismes et différentes préparations 9.

De plus, l'élution de la fraction liquide dans cette technique permet une récupération élevée en protéines qui ne sont pas observés dans d'autres séparations natives à base de gel. En outre, contrairement aux autres procédés que l'eensembles luth en phase liquide, CN-GELFrEE ne réduit pas la concentration de l'échantillon. En effet, le protocole décrit ici augmente la concentration de chaque assemblage de protéine de ~ 2 fois à partir de l'échantillon en fractions. Enfin, les échantillons liquides cette méthode génère sont aisément compatibles avec divers biochimique aval et-protéine native biophysique analyse, y compris la spectrométrie de masse. Après une seule étape de nettoyage, nous avons pu identifier et de caractériser, par spectrométrie de masse native, des complexes de protéines inconnues dans les fractions CN-GELFrEE, démontrant le mode natif et la compatibilité entre ces techniques.

De même à dénaturant GELFrEE, cette technique de fractionnement natif roman est également très adaptable. Les concentrations de solutions de coulée peuvent être ajustées pour créer différents gels de gradient, afin de faire varier la gamme de poids moléculaire qui est résolu pendant une course. L'augmentation du% T du gel de séparation solutions résultats en haute resolutions de masse des espèces inférieures tout en diminuant il améliore la séparation des espèces de poids moléculaire élevé. Les temps de recouvrement à travers lequel l'expérience est réalisée peuvent également être adaptés afin d'optimiser les largeurs de bande de poids moléculaire obtenus dans chaque fraction en fonction des besoins. le temps de l'expérience étendue supérieure à 120 min va générer des gammes moléculaire de poids encore plus élevés que décrits dans ce protocole. En outre, en réduisant le temps entre le prélèvement de fractions peut réduire la complexité de chaque fraction. Par conséquent, plusieurs paramètres peuvent être facilement affiné, en optimisant l'utilisation de la technique de différentes études.

En conclusion, les avantages CN-GELFrEE occupent une lacune dans le domaine des techniques de séparation natives présentant à haute résolution de séparation dans une large gamme de poids moléculaires, la récupération haute teneur en protéines, et d'accepter des quantités élevées de charge protéique. Enfin, les fractions obtenues sont compatibles avec la plupart des natifs en aval et en dénaturant les techniques d'analyse de protéines.

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Acknowledgments

La Fondation WM Keck a généreusement fourni le financement pour ce travail. Ce matériel est basé sur des travaux appuyés par la recherche FAPERJ subvention 100,039 / 2014 du gouvernement de État de Rio de Janeiro - Brésil RDM, Science sans frontières bourse 88,888,075416 / 2013-00 de la coordination pour l'amélioration de l'enseignement supérieur du personnel, sous le gouvernement du Brésil, pour HSS, la national science Foundation Graduate Research Fellowship sous le numéro de bourses 2014171659 pour OSS, et par le CNPq subvention de recherche 202011 / 2012-7 du gouvernement du Brésil pour LHFDVPCH est un destinataire de chimie de l'Université du Nord-Ouest de la vie Procédés Institut postdoctorales Bourse.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
30% acrylamide/bis solution, 37.5:1 Bio-Rad 161-0158 This solution is neurotoxic.
6-aminohexanoic acid (ε-aminocaproic acid) Sigma-Aldrich A2504 This chemical is an irritant.
Ammonium persulfate (APS) Fisher Scientific 7727-54-0 This chemical is flammable, toxic, and corrosive.
Coomassie blue G250 Bio-Rad 161-0406
Dodecylmaltoside Sigma-Aldrich D4641 This chemical is an irritant.
Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA) FLUKA 3777 This chemical is toxic.
Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) Fisher Scientific BP120 This chemical is toxic.
Glycerol Fisher Scientific 56-81-5
Imidazole Sigma-Aldrich I2399
Liquid nitrogen Any supplier n/a Store liquid nitrogen in containers
designed for low-temperature
liquids
Mouse heart Bioreclamation LLC MSE-HEART
n-butanol Fisher Scientific 71-36-3 This chemical is flammable and toxic.
Ponceau S Sigma-Aldrich BP103
Protease Inhibitor Cocktail Thermo Fisher Scientific 78430 This chemical is toxic.
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich 30970 This chemical is an irritant.
Sucrose JTBaker 4097
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Bio-Rad 161-0800 This chemical flammable and irritant.
Tris-HCl Amresco M151
Trycine Bio-Rad 161-071
Equipment
Gradient mixer Hoefer SG15
Magnetic stir  Any supplier n/a
Magnetic bars  Any supplier n/a Small enough to fit inside the gradiet mixer chambers.
Power supply Bio-Rad 164-5056 Voltage up to 1,500 V
Refrigerated centrifugue Eppendorf 022622552 Up to 15,000 x g
Materials
15 ml conical tube Any supplier n/a
30 kDa-MWCO ultra centrifugal filter Millipore UFC503096
Flexible tubing Saint-Gobain B000FOV1J0 Approximately 1 m length
Ice bucket Any supplier n/a
Liquid/air metallic or plastic valve. (e.g. aquarium air/water flow control lever valve) Any supplier  n/a Aquarium valves are compatible.
Mortar and pestle Any supplier n/a
Native PAGE 3-12% T slab gel Invitrogen BN1003
Parafilm Bemis PM-996
Petri dish Fisher Scientific 08-757-13
Protein low bind tube 1.5 ml Eppendorf 022431081
Razor blade IDL Tools TE05-091C
Regenerated cellulose dialysis tubing 3,500 MWCO Fisher Scientific 21-152-9
SDS-PAGE slab gel for any kDa Bio-Rad 456-9036
Serological pipets (25 ml) VWR 89130-900
Syringe (10 ml) Any supplier n/a

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References

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  4. Puig, O., Caspary, F., et al. The Tandem Affinity Purification (TAP) Method: A General Procedure of Protein Complex Purification. Methods. 24, (3), 218-229 (2001).
  5. Cremer, K. D., Hulle, M. V., et al. Fractionation of vanadium complexes in serum, packed cells and tissues of Wistar rats by means of gel filtration and anion-exchange chromatography. JBIC J. Biol. Inorg. Chem. 7, (7-8), 884-890 (2002).
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CN-GELFrEE - Clear natif Gel-élué Fraction liquide Entrapment Electrophoresis
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Melani, R. D., Seckler, H. S., Skinner, O. S., Do Vale, L. H. F., Catherman, A. D., Havugimana, P. C., Valle de Sousa, M., Domont, G. B., Kelleher, N. L., Compton, P. D. CN-GELFrEE - Clear Native Gel-eluted Liquid Fraction Entrapment Electrophoresis. J. Vis. Exp. (108), e53597, doi:10.3791/53597 (2016).More

Melani, R. D., Seckler, H. S., Skinner, O. S., Do Vale, L. H. F., Catherman, A. D., Havugimana, P. C., Valle de Sousa, M., Domont, G. B., Kelleher, N. L., Compton, P. D. CN-GELFrEE - Clear Native Gel-eluted Liquid Fraction Entrapment Electrophoresis. J. Vis. Exp. (108), e53597, doi:10.3791/53597 (2016).

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