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Abstract
एक जैव सुरक्षा स्तर 4 (बीएसएल 4) रोकथाम प्रयोगशाला में काम के समय और विस्तार करने के लिए महान ध्यान की आवश्यकता है। एक ही काम है कि गैर-उच्च परिणाम रोगजनकों के साथ एक बीएसएल -2 प्रयोगशाला में किया जाता है काफी लंबे समय तक एक बीएसएल 4 में स्थापित करने में समय लगेगा। इस वृद्धि समय की आवश्यकता कारकों की एक भीड़ है कि प्रयोगशाला का अधिग्रहण संक्रमण, संभावित संक्रमण से काम के माहौल और उच्च परिणाम रोगाणुओं की संभावित रिलीज से स्थानीय समुदाय से शोधकर्ता की रक्षा करने के उद्देश्य से कर रहे हैं के कारण है। प्रयोगशाला के अंदर, आंदोलन हवा अनिवार्य पूरे शरीर की सुरक्षा सूट से जुड़ी hoses के कारण प्रतिबंधित है। इसके अलावा, हर आइटम की कीटाणुशोधन कि द्वितीय श्रेणी जैव सुरक्षा अलमारियाँ (BSCs) से निकाल दिया जाता है की आवश्यकता है। प्रयोगशाला के विशेषज्ञों बीएसएल 4 प्रयोगशाला के तरीकों में प्रशिक्षित किया जाना चाहिए और कौशल वे प्रदर्शन कर रहे हैं में उच्च प्रवीणता दिखाना चाहिए। इस लेख का ध्यान केंद्रित उचित प्रक्रिया और सुनिश्चित करने के लिए प्रयोगशाला ख तकनीक की रूपरेखा तैयार करने के लिए हैiosafety और प्रयोगात्मक सटीकता एक उदाहरण प्रक्रिया के रूप में एक मानक वायरल पट्टिका परख का उपयोग कर। विशेष रूप से, उचित तकनीक एक बीएसएल 4 वातावरण में सुरक्षित रूप से काम करने के लिए जब एक प्रयोग के प्रदर्शन नेत्रहीन जोर दिया जाएगा। इन तकनीकों में शामिल हैं: प्रयोगों, द्वितीय श्रेणी बीएससी की समुचित सफाई जब काम खत्म हो गया, अपशिष्ट प्रबंधन और एक बीएसएल 4 प्रयोगशाला के अंदर उत्पन्न कचरे के सुरक्षित निपटान, और एक BSL- अंदर से निष्क्रिय नमूनों को हटाने के लिए एक द्वितीय श्रेणी के बीएससी की स्थापना बीएसएल -2 प्रयोगशाला के लिए 4 प्रयोगशाला।
Introduction
के रूप में उच्च परिणाम रोगजनकों से निपटने प्रयोगशाला कर्मियों की सुरक्षा (कोई संक्रमण prophylaxes है और न ही उपचार के विकल्प मौजूद हैं) सर्वोपरि है, स्वास्थ्य और मानव सेवा विभाग के अमेरिका के जैव चिकित्सा में रोगज़नक़ों और के साथ काम के सुरक्षित संचालन के लिए सुविधा के निर्माण के लिए दिशा निर्देशों और सर्वोत्तम प्रथाओं की स्थापना की है एक जैव सुरक्षा के नजरिए से 1 नैदानिक प्रयोगशालाओं। कानून और विनियमन के माध्यम से, प्रथाओं और प्रक्रियाओं के कई अनिवार्य आवश्यकताओं कि इन रोगज़नक़ों के साथ काम करने के लिए पीछा किया जाना चाहिए बन गए हैं। अमेरिका, रोगज़नक़ों कि आसानी से हर व्यक्ति में से प्रेषित कर रहे हैं, में उच्च मामला-मृत्यु दर में परिणाम है, और / या प्रमुख सार्वजनिक स्वास्थ्य प्रभाव और bioterrorism के लिए क्षमता है, एलर्जी और संक्रामक के स्वास्थ्य / राष्ट्रीय संस्थान के राष्ट्रीय संस्थान के रूप में वर्गीकृत कर रहे हैं रोग (एनआईएच / NIAID) प्राथमिकता एक रोगज़नक़ों और या रोग नियंत्रण और रोकथाम (सीडीसी) Bioterrorism श्रेणी के लिए केंद्र एक एजेंटों 2। इसके अलावा, जigh-परिणाम रोगजनकों टीयर 1 एजेंटों का चयन के रूप में वर्गीकृत अगर इन रोगजनकों संभावित bioterrorism एजेंट हैं, जन हताहत या अर्थव्यवस्था, महत्वपूर्ण बुनियादी ढांचे, या जनता के विश्वास से 3 विनाशकारी प्रभाव के लिए क्षमता है कर रहे हैं।
बीएसएल 4 प्रयोगशालाओं के साथ संस्थानों के लिए उपयोग सहित बीएसएल 4 संचालन, और अधिक अत्यधिक बीएसएल 2/3 के संचालन से नियंत्रित कर रहे हैं। उदाहरण के लिए, यह पर्याप्त सूट प्रशिक्षण आवश्यकताओं, व्यापक सदस्यता की आवश्यकताओं, और अतिरिक्त चिकित्सा जैव सुरक्षा आवश्यक शर्तें के कारण एक बीएसएल -2 या बीएसएल 3 प्रयोगशाला की तुलना में एक बीएसएल 4 प्रयोगशाला के लिए पहुँच प्राप्त करने के लिए काफी मुश्किल है। इसके अलावा, वहाँ आम तौर पर बनाम एक बीएसएल 2 या 3 बीएसएल सुविधा 4-6 एक बीएसएल 4 सुविधा में अधिक शारीरिक सुरक्षा अवरोध कर रहे हैं। के रूप में बीएसएल 4 प्रवेश और निकास प्रक्रियाओं पर हमारा पहला लेख में उल्लिखित, प्रयोगशाला स्टाफ व्यापक प्रशिक्षण और मनोवैज्ञानिक स्क्रीनिंग बीएसएल 4 प्रयोगशाला 7 में प्रवेश के लिए अर्हता प्राप्त करने के गुज़रना पड़ता है। डब्ल्यूIthin बीएसएल 4 प्रयोगशाला, संक्रमण और गलतियों के जोखिम से बचा या स्थापित प्रक्रियाओं का पालन करके कम कर रहे हैं। अनुसंधान न्यूनतम मल्टीटास्किंग या distractions के साथ, ध्यान से और जानबूझ कर आगे बढ़ना चाहिए। सकारात्मक दबाव सूट में झुकने मुश्किल है, और चेहरा शील्ड ऐसे माइक्रोस्कोपी के रूप में प्रक्रियाओं को प्रतिबंधित कर सकता है। भारी दस्ताने ऐसी छोटी वस्तुओं को संभालने या ट्यूब लेबलिंग के रूप में ठीक मोटर कार्यों के प्रदर्शन में बाधा। बीएसएल 4 प्रयोगशालाओं में बिताए समय को कम करने, प्रयोगशाला विशेषज्ञों काम प्रक्रियाओं की समीक्षा कार्य (एस) के पूरा होने के लिए बीएसएल 4 प्रयोगशाला में कदम है कि एक प्रयोगशाला बीएसएल -2 में आगे किया जा सकता है की पहचान करने और उसके परिवहन के लिए इन सामग्रियों चाहिए। जब बीएसएल -2 प्रयोगशाला में आगे की प्रक्रिया के लिए सामग्री को हटाने, सामग्री तय की और एक मोहरबंद माध्यमिक कंटेनर में बीएसएल 4 प्रयोगशाला से हटा रहे हैं। नमूने है कि हटाया जा करना पड़ सकता है के उदाहरण हैं: तय प्लेटों या संक्रमित सामग्री की नलियों कि एंजाइम से जुड़ी immunosorbe द्वारा विश्लेषण किया जाएगाNT परख (एलिसा), immunofluorescence परख (आइएफए), या पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर)।
व्यक्तिगत सुरक्षा बीएसएल 4 प्रयोगशालाओं में आवश्यक उपकरण द्वारा लगाए अधिक से अधिक भौतिक सीमाओं बीएसएल -2 प्रयोगशालाओं में उन लोगों की तुलना करने के अलावा, सेल संस्कृति प्लेटों और अपशिष्ट निपटान में उच्च परिणाम रोगाणुओं की निष्क्रियता के लिए प्रक्रियाओं कम रोगजनक वायरस के लिए जरूरत से अधिक सख्त हैं एक प्रयोगशाला बीएसएल -2 में अध्ययन किया। कम से कम, इन तरीकों सीडीसी की आवश्यकता को पूरा करना चाहिए। उदाहरण के लिए, दूषित सेल संस्कृति प्लेट और अन्य सामग्री ऐसी तटस्थ बफर formalin के रूप में रासायनिक अभिकर्मकों, साथ निष्क्रिय किया जा सकता है। इलाज किया सेल संस्कृति प्लेटों या ट्यूबों एक डुबोना एक तरल कीटाणुनाशक से भरे टैंक के माध्यम से गर्मी मुहर formalin युक्त पाउच में रखा है और हटाया जा करने के लिए प्रयोगशाला से कर रहे हैं। बर्बाद बाल्टी कीटाणुनाशक के समाधान के साथ भरा और स्प्रे कीटाणुनाशक अस्थायी रूप से प्रयोग के दौरान और Disi के लिए उत्पन्न कचरे को प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैंदस्ताने nfecting, क्रमशः, सफाई जैव सुरक्षा कैबिनेट सतहों और उपकरणों। सूचीबद्ध एकाग्रता में चतुर्धातुक अमोनियम कीटाणुनाशक समाधान सभी अमेरिकी बीएसएल 4 लेबोरेटरीज (बर्र जम्मू, निजी संचार, 2015) के लिए स्वर्ण मानक माना जाता है। बर्बादी बाल्टी से ठोस अपशिष्ट प्रदूषण के लिए संभावित समाप्त करने के लिए autoclaved है।
करने के प्रयास में नेत्रहीन कार्यप्रवाह और सामान्य बीएसएल 4 प्रक्रियाओं की सीमाओं का प्रदर्शन, हम आमतौर पर इस्तेमाल किया वायरल प्रक्रिया का एक उदाहरण के रूप में एक मानक वायरल पट्टिका परख इस्तेमाल किया। वायरल परख प्रक्रिया सामान्य रूप में वर्णन किया गया है, वहीं हम इस प्रोटोकॉल में प्रयोगशाला कर्मियों की सुरक्षा सुनिश्चित करने के लिए इस्तेमाल जैव सुरक्षा प्रक्रियाओं तनाव। पट्टिका परख तकनीक 8,9 पर अतिरिक्त पृष्ठभूमि के लिए पिछले शास्त्रीय पट्टिका परख दृश्यावलोकन को देखें।
यहाँ प्रस्तुत प्रक्रियाओं BMBL विनिर्देशों सीडीसी 1 द्वारा उल्लिखित का पालन करें। हालांकि, प्रस्तुत प्रोटोकॉल रहे हैंआईआरएफ-फ्रेडरिक के लिए विशिष्ट। प्रत्येक बीएसएल 4 सुविधा अलग मानक संचालन प्रक्रिया (एसओपी) और ऑपरेशन के तरीकों कि बीएसएल 4 प्रयोगशाला के भीतर प्रयोगों के निष्पादन के प्रभाव पड़ता है। अपशिष्ट धारा प्रबंधन और पट्टिका assays के निष्पादन के लिए वैकल्पिक प्रक्रियाओं के प्रबंधन और इन प्रयोगशालाओं के संचालन के आधार पर अलग हो सकता। फिर भी, एक बीएसएल 4 सूट प्रयोगशाला और बीएसएल 4 पर्यावरण के अंदर द्वितीय अलमारियाँ कक्षा के साथ कार्य करने के लिए प्रक्रियाओं की स्थापना के एक सामान्य समझ में मदद मिलेगी वैज्ञानिकों की कमी और सुरक्षा निहितार्थ समझ में जब उच्च जोखिम वाले रोगाणुओं की पढ़ाई के विचार। एक बीएसएल 4 प्रयोगशाला में काम आसपास कठिनाइयों के बाहर सहयोगियों के बारे में जागरूकता बढ़ने समायोजित उम्मीदों और अनुसंधान समुदाय में चिकित्सा countermeasures के विकास में अधिक से अधिक आराम करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं।
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Protocol
1. प्रयोगशाला एंट्री
- प्रयोग (जैसे, कोशिकाओं, मीडिया, और उपभोग्य) बीएसएल 4 प्रयोगशाला में प्रवेश करने से पहले के लिए एक प्रयोगशाला बीएसएल -2 से सभी आपूर्ति को इकट्ठा।
- बीएसएल 4 प्रवेश प्रक्रिया (संदर्भ 7 में विस्तार से रेखांकित) को पूरा करें।
बीएसएल 4 प्रयोगशाला में एक द्वितीय श्रेणी जैव सुरक्षा कैबिनेट की 2. तैयारी
- एक बार बीएसएल 4 प्रयोगशाला के अंदर, दैनिक आंतरिक चेक लिस्ट (चित्रा 1) पूरा हो चुका है सुनिश्चित करते हैं। जांच सूची को पूरा करते हैं चेकलिस्ट के पहले बाहर भरा नहीं किया गया है और संकेत मिलता है जो वायरस का इस्तेमाल किया जाएगा। चेकलिस्ट के पहले ही पूरा हो चुका है, तो नाम जोड़ सकते हैं और जो वायरस की सूची पर इस्तेमाल किया जाएगा।
- साफ (5% दोहरी चतुर्धातुक अमोनियम कीटाणुनाशक समाधान के साथ पूरे (सैश सहित) बीएससी के अंदर नीचे छिड़काव जैसे, एन डाइमिथाइल alkyl लोबान अमोनियम क्लोराइड, एन डाइमिथाइल alkyl एथिल लोबान अमोनियम द्वारा द्वितीय श्रेणी बीएससीक्लोराइड या एजेंट के लिए अन्य कीटाणुनाशक उचित इस्तेमाल किया जा रहा है) और कागज तौलिए 10,11 के साथ नीचे पोंछे। 70% इथेनॉल समाधान कैबिनेट और सैश के अंदर स्प्रे चिपचिपा कीटाणुनाशक समाधान निकालने के लिए।
- अगर बैठा है, यह सुनिश्चित करें कि कैबिनेट के पीछे पहुंचा जा सकता है एक आरामदायक ऊंचाई पर द्वितीय श्रेणी बीएससी के सामने कुर्सी सेट और प्रयोगशाला विशेषज्ञ का चेहरा सामने खोलने से ऊपर (चित्रा 2) 11 पर स्थित है कि।
- जैव सुरक्षा कैबिनेट के लिए बर्बादी कंटेनर तैयार करें। सुनिश्चित करें कि अपशिष्ट कंटेनर में दोहरी चतुर्धातुक अमोनियम कीटाणुनाशक समाधान के अंतिम एकाग्रता कोई 5% से कम है। तदनुसार योजना और एक 10% समाधान है जो अपशिष्ट को जोड़ दिया जाएगा कि कीटाणुनाशक को कमजोर करना होगा। इसके अलावा, के दौरान और परख के पूरा होने के बाद हटाने और दस्ताने हाथ करने से पहले किसी भी आइटम स्प्रे करने के लिए द्वितीय श्रेणी बीएससी के अंदर 5% दोहरी चतुर्धातुक अमोनियम कीटाणुनाशक समाधान के साथ एक स्प्रे बोतल जगह है। <li> उपयुक्त सामग्री के रूप में दूर संभव के रूप में कैबिनेट में वापस द्वितीय श्रेणी बीएससी में पूरे प्रयोग के लिए आवश्यक कक्षा द्वितीय बीएससी और हवा का प्रवाह 11 के विघटन में दोहराया सामग्री परिचय से बचने के लिए रखें।
3. उदाहरण: पट्टिका परख
- वायरस युक्त नमूने निकालते हैं और हाथ से भंडारण स्थान से वायरस को नियंत्रित करने और 37 डिग्री सेल्सियस पर एक मशीन में सामग्री पिघलना।
- 6 अच्छी तरह से प्लेटों के कुओं की योजना बनाई वायरस dilutions के अनुसार किया जा करने के लिए लेबल। पलकों और प्लेटों के शरीर मार्क सफल मिलान सुनिश्चित करने के लिए है, तो पलकों और शरीर अलग हो रहे हैं।
- द्वितीय श्रेणी बीएससी में कदम 3.1-3.2 से सामग्री ले आओ। सभी आइटम दूसरे पक्ष ( "गंदे पक्ष") पर ( "स्वच्छ पक्ष") और बर्बादी नहीं है या एक तरफ वायरस के संपर्क में नहीं आएगा रखें। यदि संभव हो तो, एयरोसोल सृजन गतिविधियों के दौरान 1 "साफ-सुथरा आइटम" के अलावा "गंदा आइटम" कम से कम 30 सेमी रखने1।
- संभव के रूप में द्वितीय श्रेणी के बीएससी के अंदर केंद्र के रूप में बंद के काम करते हैं, के रूप में अंदर केंद्र के लिए अपने आप को बचाने के लिए 11 सबसे प्रभावी स्थिति होने के लिए बनाया गया है।
- वायरस का नमूना और नियंत्रण वायरस के 50 μl निकालें और 2% भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम के 450 μl में जगह है। के रूप में दूर की जरूरत है (चित्रा 3) के रूप में बाहर धारावाहिक dilutions बनाने के साथ आगे बढ़ें।
- dilutions के दौरान, एक विंदुक टिप के साथ वायरस के नमूने कम से कम 5 बार मिश्रण धीरे धीरे और सावधानी के नमूनों में एयर बबल पीढ़ी को कम करने की कोशिश कर रहा है। अच्छी तरह से अगले कमजोर पड़ने के बाद इसके अलावा विंदुक युक्तियाँ बदलें।
- पिछले कमजोर पड़ने में, नमूना मिश्रण में 5 बार के बाद, अपशिष्ट कंटेनर में वायरस के नमूने की 50 μl त्यागने dilutions की बराबर मात्रा सुनिश्चित करने के लिए।
- जब सुझावों के निपटान, अपशिष्ट बाल्टी से कीटाणुनाशक समाधान के साथ प्रत्येक नोक कुल्ला expell से पहले अंदर और टिप के बाहर शुद्ध करनाअपशिष्ट बाल्टी में टिप हैैं।
- एक बार जब dilutions बना रहे हैं, कमजोर पड़ने कुओं अलग सेट और सेल संस्कृति प्लेटों के कुओं से मीडिया aspirating शुरू, 6 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक कुएं में मीडिया के 500 μl छोड़ने।
- जब एक मैनुअल, समायोज्य मात्रा का उपयोग विंदुक टिप, महाप्राण कीटाणुनाशक पिपेट के शीर्ष करने के अपशिष्ट बाल्टी से समाधान के साथ समाप्त हो गया, पुश बटन pipettor, पिपेट के अंदर की उचित परिशोधन सुनिश्चित करने के लिए। प्रयोग के अंत तक अपशिष्ट बाल्टी में टिप छोड़ दें।
- एक बार जब मीडिया प्लेटों से हटा दिया गया है, सही नमूने के 100 μl उचित अच्छी तरह से में पूर्व लेबल प्लेटों में दो प्रतियों में जोड़ने के लिए, प्रत्येक नमूना के लिए सुझाव दिए गए प्रत्येक बदल रहा है।
- पट्टिका परख inoculations के पूरा होने पर, कीटाणुनाशक समाधान के साथ दस्ताने हाथ बंद स्प्रे और हाथ से इनक्यूबेटर में वापस प्लेटों रखने से पहले सभी प्लेटों के बाहर मिटा करने के लिए एक कागज तौलिया कीटाणुनाशक समाधान से लथपथ का उपयोग करें। फिर सेइस प्रक्रिया को पीट जब तक सभी प्लेटों इनक्यूबेटर में वापस आ रहे हैं।
- एक आंकड़ा -8 प्रस्ताव में प्लेटों Rock 1 घंटे के लिए हर 15 मिनट कोशिकाओं पर नमूना के समुचित प्रसार सुनिश्चित करने के लिए।
- कमाल की प्लेटों के पूरा होने पर, 2x ईगल न्यूनतम आवश्यक माध्यम का एक मिश्रण है और 1.6% tragacanth, एक अर्द्ध ठोस ओवरले agarose से हेरफेर करने के लिए आसान है कि, पट्टिका परख के ओवरले के लिए इस्तेमाल के साथ-साथ द्वितीय श्रेणी बीएससी में प्लेटें लौटें।
- ओवरले मिश्रण के 2 मिलीलीटर अच्छी तरह से की सतह भर ओवरले के समान वितरण के लिए एक आंकड़ा -8 प्रस्ताव में एक बार फिर से एक 6 अच्छी तरह से थाली और रॉक में एक अच्छी तरह से जोड़ें। इस प्रक्रिया को दोहराएं जब तक हर अच्छी तरह से इस्तेमाल ओवरले मिश्रण के साथ मढ़ा है।
- सुनिश्चित करें कि सीरम वैज्ञानिक पिपेट की नोक कुओं में किसी भी तरल स्पर्श नहीं करता पार संक्रमण से बचने के लिए जब ओवरले प्रक्रिया का प्रदर्शन।
4. अपशिष्ट निपटान और उपकरण और जैव सुरक्षा कैबिनेट की सफाई
<राजभाषा>- बीएससी से micropipettes हटाने के बाद, उन्हें 70% इथेनॉल समाधान के साथ एक अलग कागज तौलिए से पोंछ उपकरणों पर चिपचिपा buildup से बचने के लिए। प्रभावी ढंग से 5% कीटाणुनाशक के साथ नीचे साफ नहीं किया जा सकता है कि किसी भी साधनों स्प्रे और 10 मिनट के लिए बीएससी में समाधान के साथ संपर्क में छोड़ दें।
5. autoclaving अपशिष्ट
- एक गाड़ी पर एक आटोक्लेव ट्रे में Biohazard अपशिष्ट कंटेनर और जगह से Biohazard बैग निकालें।
- Biohazard बैग खुला छोड़ दें और बैग के बाहर पर आटोक्लेव टेप का एक टुकड़ा जगह, आटोक्लेव ट्रे के पक्षों को जोड़ने बैग ट्रे में सुरक्षित रखने के लिए।
- आटोक्लेव टेप के दो टुकड़े सीरम वैज्ञानिक विंदुक टिप ट्रे पर रखें और किसी के नाम के पहले अक्षर और तारीख के साथ लेबल। आटोक्लेव ट्रे के साथ गाड़ी पर सीरम वैज्ञानिक पिपेट ट्रे रखें।
- आटोक्लेव खोलें। प्रदान की आटोक्लेव लोडिंग / अनलोडिंग CA कनेक्टआटोक्लेव करने और आरटी वापस लेने योग्य आटोक्लेव मंच बाहर लाने गाड़ी पर आराम करने के लिए।
- आटोक्लेव से धातु की छड़ निकालें और ऊपर खुला। धातु की छड़ में Geobacillus stearothermophilus के बीजाणुओं से युक्त एक जैविक सूचक शीशी जाँच करने के लिए है कि आटोक्लेव नसबंदी चक्र को सफलतापूर्वक पूरा कर लिया गया रखें।
- धातु की छड़ आटोक्लेव ट्रे में कचरे की थैली के केंद्र में रखें, लेकिन यह सुनिश्चित करें कि धातु की छड़ अभी भी आसानी से सुलभ है।
- बेकार और सीरम वैज्ञानिक पिपेट ट्रे के साथ भरा आटोक्लेव ट्रे वापस लेने योग्य आटोक्लेव मंच पर रखें और यह आटोक्लेव में वापस धक्का।
- आटोक्लेव से आटोक्लेव लोडिंग / अनलोडिंग गाड़ी को अलग करें और आटोक्लेव दरवाजा बंद करो।
- आटोक्लेव शुरू करो।
- जब तक चक्र शुरू हो गया है आटोक्लेव मत छोड़ो। आटोक्लेव के ऑपरेटिंग स्क्रीन समय से संकेत मिलता है कि रन के लिए शेष जाएगा।
- आटोक्लेव रन पूरा हो गया है के बाद, जैविक इंडस्ट्रीज़ को दूरicator और एक निर्दिष्ट इनक्यूबेटर में हीटिंग द्वारा विकास के लिए मूल्यांकन। विकास जैविक सूचक पर पता चला है, आटोक्लेव में कचरा फिर से चलाने के लिए, और नए सिरे से सूचक का आकलन करें। कोई विकास का पता चला है, सुविधा से कचरा हटा दें।
6. उदाहरण: फिक्सिंग और पट्टिका assays का धुंधला
- दिनों की उपयुक्त संख्या में पारित कर दिया गया है (जो इस्तेमाल वायरस पर निर्भर है) के बाद, प्रयोगशाला में वापस लौट सकते हैं और एक बार फिर वर्गों 1 और 2 से कदम प्रदर्शन करते हैं।
- ध्यान से कदम 3.1.2 में पूरा इनक्यूबेटर से पट्टिका परख प्लेटों को हटाने, और हाथ से द्वितीय श्रेणी बीएससी में जगह है।
- मीडिया और ओवरले सामग्री के सभी बंद पिपेट और कीटाणुनाशक समाधान कंटेनर में बांटना और 10% तटस्थ बफर formalin और 0.8% क्रिस्टल बैंगनी 12,13 का एक मिश्रण के साथ बदलें। मिश्रण प्लेटों पर वायरस को निष्क्रिय करने के लिए 30 मिनट के लिए प्लेटों पर रहते हैं।
- निष्क्रियता के बाद, ध्यान हटाने तटस्थबफर formalin / क्रिस्टल बैंगनी मिश्रण और एक अलग अपशिष्ट कंटेनर में जगह निपटान से पहले निष्प्रभावी किया जाना है।
- कीटाणुनाशक के साथ दस्ताने हाथ स्प्रे और जैसा कि ऊपर वर्णित उन्हें द्वितीय श्रेणी बीएससी की पासिंग आउट होने से पहले प्लेटों के बाहर साफ कर लें।
- सिंक करने के लिए आगे बढ़ें, प्लेटों कुल्ला अतिरिक्त दाग हटाने के लिए, और फिर एक गाड़ी को सुखाने के लिए पर प्लेटें जगह है।
- एक बार जब प्लेटों पूरी तरह से सूख रहे हैं, सजीले टुकड़े गिनती करने के लिए एक प्रकाश बॉक्स का उपयोग करें। सभी मामलों रिकॉर्ड और मानक समीकरण (3B चित्रा) से वायरस titers की गणना।
7. बीएसएल 4 प्रयोगशाला से नमूने निकाल रहा है
- किसी भी नमूने है कि बीएसएल -2 प्रयोगशाला परिस्थितियों में हेरफेर किया जाएगा निष्क्रिय। का पालन करें 10% तटस्थ बफर formalin (NBF) या Trizol रास (फिनोल, guanidine आइसोथियोसाइनेट, अमोनियम thiocyanate, सोडियम एसीटेट, ग्लिसरॉल) 1,14 का उपयोग कर आईआरएफ-फ्रेडरिक में आंतरिक जैव सुरक्षा कार्यालय द्वारा अनुमोदित दो तरीकों में से एक। स्थानांतरण SAएक नया स्वच्छ ट्यूब या पूर्व बीएसएल 4 प्रयोगशाला से हटाने के लिए पैकेजिंग के लिए बीएससी के बाहर थाली करने के लिए mples।
- एक गर्मी सील पर्याप्त 5% कीटाणुनाशक या लगानेवाला समाधान युक्त बैग के अंदर और बीएसएल 4 प्रयोगशाला से बाहर हस्तांतरण के दौर से गुजर नमूना ट्यूबों के बाहर कीटाणुरहित थैली में ट्यूब या प्लेट में गर्मी सील निष्क्रिय नमूने हैं। उसी प्रक्रिया का पालन एक और थैली में इस थैली में रखें।
- दूसरी थैली को सील करने और कम से कम 10 मिनट के लिए 5% कीटाणुनाशक समाधान युक्त एक डुबोना टैंक में गर्मी से सील थैली जगह गर्मी से सील थैली के बाहर कीटाणुरहित।
- , एजेंट का इस्तेमाल किया, संख्या और ट्यूबों के आकार, ट्यूबों में मात्रा की रूपरेखा द्वारा प्रयोगशाला के अंदर एक डुबोना टैंक लॉग बुक को भरें निष्क्रियता विधि का इस्तेमाल किया है, और जहां नमूने स्थानांतरित कर दिया जाएगा करने के लिए कमरे।
- बीएसएल 4 प्रयोगशाला के बाहर पर एक सहयोगी के साथ समन्वय डुबोना टैंक से थैली निकालते हैं और बीएसएल -2 प्रयोगशाला के लिए नमूने लेने के लिए।
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Representative Results
बीएसएल 4 प्रयोगशाला के भीतर उचित प्रक्रियाओं के बाद assays के सुरक्षित और प्रभावी पूरा होने सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण हैं। पूरा दैनिक आंतरिक चेक लिस्ट (चित्रा 1) का हवाला देते हुए, प्रयोगशाला कर्मचारियों को सुनिश्चित है कि उपकरणों को पूरी तरह से कार्य कर रही है। बीएससी के केंद्र में उचित शरीर स्थिति यह सुनिश्चित करता है कि प्रयोग इष्टतम वायु प्रवाह की स्थिति (चित्रा 2) के तहत किया जाता है। वायरस नमूना क्रमानुसार प्लेटें है कि प्रति प्लेट 30-300 सजीले टुकड़े (चित्रा 3 ए) और निर्धारित करने के लिए वायरस अनुमापांक (चित्रा 3 बी) प्राप्त करने के लिए पतला है। कारकों की एक संख्या सजीले टुकड़े के गठन, मेजबान सेल लाइनों के लिए वायरस tropism, टीका तकनीक, वायरस विकास, उचित कमजोर पड़ने रेंज, और ओवरले चयन 8 के लिए शर्तों सहित प्रभावित करते हैं। प्रक्रिया के दौरान बीएससी में उत्पन्न कचरे को ठीक से करने से पहले autoclaving द्वारा बीएससी और फिर से हटाने से पहले कीटाणुरहित हैबीएसएल 4 पर्यावरण को छोड़कर। इन प्रक्रियाओं का पालन करके, कोई प्रयोगशाला प्राप्त संक्रमण आईआरएफ-फ्रेडरिक पर बीएसएल 4 शोध के दौरान दर्ज किया गया है।
चित्रा 1:। नमूना दैनिक आंतरिक व्यवस्था चेकलिस्ट के इस सूची की दैनिक पूरा होने सुनिश्चित करता है कि प्रयोगशाला कर्मचारियों को काम की शुरुआत करने से पहले प्रयोगशाला (सबसे महत्वपूर्ण बीएससी) के भीतर उपकरण की जाँच की गई है। बीएससी calibrated सीमा के बाहर हो पाया है, तो यह बीएससी इस्तेमाल किया जाना चाहिए नहीं किया, और रखरखाव अधिसूचित किया जाना चाहिए। सभी BSCs ठीक से calibrated किया जाना चाहिए और कामकाज। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
आकृति 2:। पीले कीटाणुनाशक समाधान और खेतों में pipettes युक्त एक द्वितीय श्रेणी जैव सुरक्षा कैबिनेट में वापस और एक प्रयोगशाला विशेषज्ञ pipetting नमूनों की ओर देखने (ए) अपशिष्ट बाल्टी अच्छी तरह प्लेटें (बी) के अधिकार के लिए कर रहे हैं, और कीटाणुनाशक स्प्रे बोतल करने के लिए है अपशिष्ट बाल्टी (ए) का अधिकार है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3: नमूना के वायरल अनुमापांक की गणना वायरल अनुमापांक मिलीलीटर प्रति पट्टिका गठन इकाइयों (pfu) के रूप में व्यक्त किया जाता है।। वायरल अनुमापांक की गणना करने के लिए, कमजोर पड़ने कारक (घ) गुना पतला वायरस की मात्रा अच्छी तरह से (वी) को जोड़ा गया के उत्पाद द्वारा स्पष्ट रूप से परिभाषित सजीले टुकड़े (pfu) और विभाजन की संख्या गिनती।डी / 53600 / 53600fig3large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
एक बीएसएल 4 प्रयोगशाला में काम काफी समय और विस्तार करने के लिए अतिरिक्त ध्यान देने की आवश्यकता है। इस माहौल में काम करने की किसी भी प्रकार की अच्छी तरह से प्रशिक्षित करने की आवश्यकता है, पूरी तरह से, और ईमानदार व्यक्तियों। मानक वायरल पट्टिका परख के रूप में परख कई प्रमुख अवधारणाओं जिसमें प्रयोगशाला कार्यकर्ताओं को प्रशिक्षित किया जाना चाहिए शामिल है, बीएसएल 4 प्रयोगशाला में उच्च परिणाम रोगजनकों के साथ काम करने के लिए एक सामान्य प्रक्रिया का सही मॉडल उपलब्ध कराता है।
पहली बड़ी अवधारणा समुचित उपयोग और द्वितीय श्रेणी बीएससी, जो उच्च परिणाम रोगजनकों के लिए प्राथमिक रोकथाम के रूप में कार्य में सुरक्षित प्रथाओं के आवेदन पत्र है। कैसे एक द्वितीय श्रेणी के बीएससी कार्यों प्रथाओं है कि बहुत से व्यक्तियों के लिए जोखिम जोखिम सीमा तय करेंगे की समझ। एक साफ क्षेत्र से काम प्रवाह ( "स्वच्छ पक्ष") एक दूषित क्षेत्र के लिए ( "गंदे पक्ष") कार्य क्षेत्र भर में द्वितीय श्रेणी में बीएससी भी पार संक्रमण 11 से बचने के लिए मदद करता है। स्वच्छ और दूषित सामग्री और supplएँ साफ वस्तुओं पर दूषित आइटम के आंदोलन को सीमित करने के लिए अलग-अलग किया जाना चाहिए।
दूसरे प्रमुख अवधारणा शारीरिक और जैविक अपशिष्ट प्रबंधन है। कचरे के दोनों प्रकार के निपटान में उचित कदम सुनिश्चित करना है कि प्रयोगशाला विशेषज्ञों सुरक्षित रहता है और पर्यावरण दूषित नहीं है में जरूरी है। एक प्रयोग के दौरान कदम निष्क्रिय और रोगाणुओं को नष्ट करने से पहले नमूने बीएसएल 4 प्रयोगशाला से बाहर लाया जाता है करने के लिए तैयार कर रहे हैं। इस तरह के महत्वपूर्ण कदम के उदाहरण हैं: प्रत्येक टिप में कीटाणुनाशक pipetting, कम से कम एक कीटाणुनाशक, autoclaving कचरे के साथ संभावित दूषित सामग्री के 10 मिनट के संपर्क समय की इजाजत दी, और आटोक्लेव चक्र के दौरान बाँझपन मान्य। ये कदम उच्च परिणाम रोगाणुओं की विनाश सुनिश्चित करने के लिए निरर्थक तैयार हो रहे हैं।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micro-Chem Plus | National Chemical Laboratories | 255 | |
| Ethanol | Fisher | BP2818500 | |
| 2 ml 96-Deep Well Plates | Fisher | 278743 | |
| 10 ml Serological Pipette | Fisher | 13-678-11E | |
| 25 ml Serological Pipette | Fisher | 13-678-11 | |
| 6-well plates | Fisher | 140675 | |
| Crystal Violet | Sigma | HT90132-1L | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Fisher | 22-050-105 | |
| Tragacanth | Fisher | 50-702-2000 | |
| 20 μl Pipette Tips | Fisher | 21-402-550 | |
| 200 μl Pipette Tips | Fisher | 21-402-561 | |
| 1,000 μl Pipette Tips | Fisher | 21-402-581 | |
| DMEM | Lonza | 12-604Q | |
| FBS | Sigma | F2442-500mL | |
| Penicillin/Streptomycin | Lonza | 17-602E | |
| 2x EMEM | Quality Biological | 115-073-101 | |
| Pipettor | Drummond | 4-000-101 | |
| 1,000 μl Pipette | Rainin | L-1000XLS+ | |
| 200 μl Pipette | Rainin | L-200XLS+ | |
| 12-Well, Multichannel 200 μl Pipettor | Rainin | L12-200XLS+ | |
| 8-Well, Multichannel 1,000 μl Pipettor | Rainin | LA8-1200XLS | |
| Attest | Express Medical Supplies | MMM12192 | |
| Autoclave | Getinge | GEB 2404 AMB-2 | |
| Autoclave Bag | Fisher | 01-828E | |
| 2,000 ml Beaker | Fisher | 02-591-10H | |
| Autoclave Tray | Fisher | 13-359-20B | |
| Pipette Tray | Fisher | 13-361-5 | |
| 37 °C Incubator | Fisher | WU-39321-00 | |
| Biohazard Can | Rubbermaid Commercial | FG614500 RED | |
| Autoclave Tape | Fisher | 15-903 | |
| Autoclave Rod | Made by IRF Facility | N/A | |
| Light Box | Fisher | S11552 | |
| Heat Sealer | Fisher | NC9793612 | |
| Heat Seal Pouches | Fisher | 01-812-25H | |
| Biohazard Bag | Fisher | 01-828E |
References
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- Executive order 13546 -- Optimizing the security of Biological Select Agents and Toxins in the United States. , The White House, Office of the Press Secretary. Washington, DC. Available from: http://www.whitehouse.gov/the-press-office/executive-order-optimizing-security-biological-select-agents-and-toxins-united-stat (2010).
- Shurtleff, A. C., et al. The impact of regulations, safety considerations and physical limitations on research progress at maximum biocontainment. Viruses. 4, 3932-3951 (2012).
- de Kok-Mercado, F., Kutlak, F. M., Jahrling, P. B. The NIAID Integrated Research Facility at Fort Detrick. Appl Biosafety. 16, 58-66 (2011).
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संक्रमण अंक 116 जैव सुरक्षा जैव सुरक्षा स्तर 4 BSL4 बीएसएल 4 कक्षा द्वितीय जैव सुरक्षा कैबिनेट कक्षा द्वितीय बीएससी उच्च रोकथाम अधिकतम रोकथाम व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पीपीई बुनियादी प्रोटोकॉलErratum
Formal Correction: Erratum: Safety Precautions and Operating Procedures in an (A)BSL-4 Laboratory: 2. General Practices
Posted by JoVE Editors on 12/05/2016.
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Nicole Joselyn
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Nicole Josleyn
