Introduction
Missionen for National Institute of Allergy og smitsomme sygdomme (NIAID) Integreret Research Facility ved Fort Detrick i Frederick MD (IRF-Frederick) er at udføre nye smitsomme sygdomme forskning for at forstå de kliniske sygdomsprocesser, der korrelerer med sværhedsgraden af mikrobielle-induceret sygdom. IRF-Frederik har en unik evne til at udføre medicinsk billedbehandling i dyremodeller af høj konsekvens patogener i en ABSL-4 laboratorium 1. De billeddannende modaliteter til rådighed for forskere omfatter: computertomografi (CT), magnetisk resonans billeddannelse (MRI), positron emission tomografi (PET), enkelt foton computertomografi (SPECT), ultralyd, røntgen, og fluoroskopi. Forskere bruger tilgængelige billeddiagnostiske kapacitet til at overvåge sygdomsprogression og evaluere effekten af interventioner, såsom narkotika behandling og vaccination, i longitudinelle studier.
De billeddiagnostiske metoder på IRF-Frederick var specifiktdesignet til at holde de centrale dele af udstyret uden for høj inddæmning 2,3 og tilgængelige for vedligeholdelse og reparation. Dette design adskiller imaging suite til "hot" (indeholdende patogen) og "kolde side". For at opnå denne adskillelse blev specielt konstruerede rør konstrueret til at udvide høj indeslutning plads i boringerne af hver afbildningsmodalitet (figur 1). Ud over at give biologisk indeslutning, disse rør beskytter billedudstyr fra gasser og kemikalier, der anvendes til at rense den høje inddæmning laboratorium. Imaging forskere og teknologer betjene scannere fra "kolde side", mens Comparative Medicine (CM) personale håndtag og overvåge dyr på den "varme side". Da CM personale skal arbejde tæt sammen med imaging forskere til at koordinere disse eksperimenter, kan denne adskillelse resultere i kommunikations udfordringer.
Efter at have vurderet muligheder, CM personale var udeudstyret med Bluetooth øre stykker, der sender korte bølgelængde ultra-højfrekvente radiobølger til telefoner, der anvendes til at kalde den billeddannende personale uden for inddæmning. På grund af udformningen af anlægget, skulle installeres i hvert af værelserne til at overvinde interferens forårsaget af de lag af cement og stål mellem "hot" og "kolde sider" trådløse adgangspunkter. Således kommunikation mellem CM personale iført støjende positiv-trykdragter og billedbehandling personale uden høj indeslutning er nu pålidelige. Kameraer er også blevet installeret på den varme side af de billeddannende værelser til afbildning personale til at se aktiviteten på den "varme side". Med kameraerne, kan den billeddannende personale guide CM teknikere med animalske positionering eller eventuelle ændringer i sidste øjeblik til det billeddannende protokollen.
Alt arbejde i IRF-Frederick ABSL-4 suit laboratorium kræver medarbejdere til at bære positivt tryk indkapsler jakkesæt 4. Iført disse dragter reducerer mobiliteten, og den tunge sentx handsker knyttet til kulør plus op til tre yderligere lag af handsker kompromiser fingerfærdighed. Resultatet er, at procedurerne tager længere tid at gennemføre og opgaver, der kræver finmotorisk færdighed er meget vanskeligere. Som biosikkerhed niveau stiger, håndtering af dyr og manipulationer bliver mere udfordrende og tidskrævende, især med små dyr. Procedurer i en ABSL-4 laboratorium kan tage op til 2-3 gange længere end en ABSL-2 laboratorium.
Formålet med denne artikel er at visuelt demonstrere de udfordringer forbundet med billedbehandling dyremodeller i en ABSL-4 miljøet ved hjælp CT-scanning procedure af et marsvin som et eksempel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokol overholder følgende retningslinjer dyr pleje. Dyrene blev anbragt i et anlæg godkendt af Association for Vurdering og akkreditering af Laboratory Animal Care International. Alle eksperimentelle procedurer blev godkendt af National Institute of Allergy og smitsomme sygdomme, Afdelingen for Klinisk Forskning, Animal Care og brug Udvalg og var i overensstemmelse med dyreværnsloven forordninger, Public Health Service politik, og vejledningen for den pasning og anvendelse af forsøgsdyr anbefalinger.
1. Klargør CT scanner (på "kolde side")
- Betingelse X-Ray Tube
- Kontroller, at ingen medarbejdere medlem er i scanningen rum og motivet tabellen er tom.
- Kør rør condition procedure i overensstemmelse med scanneren producentens specifikationer.
- Udfør Air kalibrering
- Sørg for, at ingen genstande er i scanning feltet. Udfør luftkalibrering procedure i overensstemmelse med scanneren producentens specifikationer. På mange platforme, denne kalibrering er auto- eller halvautomatisk.
- Udfør Kvalitetskontrol Scan (på "varme side")
- Fuldfør procedurerne for ABSL-4 suit laboratorium indrejse (skitseret i detaljer i henvisning 5) med tilføjelse af et ekstra trin. Hvis procedurer indebærer udsættelse for radioaktive materialer, klip en dosimeter til scrubs under beskyttelsesdragt. Drej i dosimeter hver 2 måneder for beregning af stråling.
- Placer CT hoved og krop fantomtegning, som er lavet af luft, vand og Teflon i passende holder på scanning bordet.
- Udfør Kvalitetskontrol Scan (på "Cold Side")
- Fra den kolde side, forhånd fantomet i midten af boringen 6.
- Anskaf en scanning ved hjælp laboratorium standardiseret kvalitetskontrol (QC) parametre til ENSure scanneren er inden producentens specifikationer.
- Udfør QC edb analyse af billeder, til at beregne gennemsnitlige og standardafvigelser af signal intensitet inden for regioner af interesse centreret over hver materialetype (luft, vand eller Teflon) i henhold til producentens protokol.
- Informer CM personale, at CT-scanner er klar til brug.
- Kontroller oplysningerne dyr (identifikationsnummer, vægt, fødselsdato) med CM personale.
- Registrer Emne oplysninger i Patient Databasen.
- Ved CT-scanner-konsollen (på den "kolde side"), adgang til scannerens Radiologi Information System (RIS). Kontroller, at RIS er befolket med detaljerne i scanning tidsplan.
- Vælg den aktuelle emne og demografi såsom identifikationsnummer, alder, fødselsdato, og eksamen; så bør undersøgelsestype automatisk udfylde.
- indtaste emne vægt manuelt.
- Vælg korrekt subject orientering i CT gantry (fx med hovedet først, fødder første, tilbøjelige, liggende).
2. Forbered Arbejdsområder i ABSL-4 Suit Laboratory
- Forbered klasse II biosikkerhed kabinet (BSC) eller Downdraft Table i Animal Procedure Room. Tænd BSC (eller Downdraft Table) i mindst 10 min før brug.
- Ren og desinficere indvendige overflader af BSC eller den øverste overflade af downdraft tabellen med godkendt desinfektionsmiddel, såsom 5% dual kvaternær ammonium (n-alkyl-dimethyl benzyl ammoniumchlorid, N-alkyl dimethyl ethyl benzyl ammoniumchlorid) desinficerende opløsning. Spray indre overflader af BSC eller den øverste overflade af downdraft bordet og tørre overflader tørre efter 10 min kontakttid. Spray og tør overflader med 70% ethanol for at fjerne resterende desinfektionsmiddel.
- Placer udstyr og forsyninger, der er nødvendige i BSC eller bordemfang bord, herunder håndtering handsker anæstesi induktion kasse og dyr. ol>
- Forbered CT Scanner seng.
- Opsætning dyret holdeanordningen på CT seng.
- Opsætning de vitale tegn overvåge at opdage puls og iltmætning. Hvis scanning session er længere end 10 min, overvåge temperatur.
- Forbered Anæstesi Machine.
- Kontroller isofluran volumen i fordamperen og tilføje flere isofluran hvis nødvendigt.
- Udfør en tæthedsprøve ved tryk bedøvelsesmiddel åndedrætskredsløbet med ilt, kontrol for undsluppet gas, og visuelt inspicere anæstesi maskine for lækager 1.
- Hvis der registreres en lækage, fastslå kilden, løse problemet, og udføre en opfølgende tæthedsprøvning at kontrollere korrektioner korrekt gennemført.
- Afvej den disponible fjernende beholder, der fanger affald bedøvende gas. Hvis beholderen er ≥50 g over den indledende beholderens vægt, udskift beholderen 7.
- Overfør Cage Boliger marsvin fra en af de gnaver Holding Rooms Tilstødende til Imaging Suite ind i klasse II BSC.
- Kontroller dyret id.
- Fjern burkort og holde med dyret.
- Åbn låget til buret og don dyr beskyttende læderhandsker over positive tryk trop handsker. afhente forsigtigt op marsvin, placere dyr i anæstesi induktion boksen, og dække kassen med låget.
- Fjern anæstesi induktion kassen med dyret fra klasse II BSC og placere den på en transport vogn.
- Brug af vognen, tage dyret for CT-scanner værelse.
- I CT-scanner rum straks sluttes den oxygenbindende beholder og anæstesiapparat til induktion kassen. Tænd for oxygengas til induktion boksen og indstille fordamperen til DelivER 4% isofluran til indledende induktion af anæstesi 8.
- Overvåg dyret under anæstesi induktion til tilstrækkelig dybde af anæstesi (fx ikke reagerer på eksterne stimuli, muskuløs tone, stabil respiratoriske og hjertefrekvens) 8.
- Sluk for anæstesi til induktion boksen når marsvin er fuldt bedøvet.
4. Arranger forbehold på Imaging Bed i CT scanner (på "Hot side")
- Fjern den bedøvede marsvin fra induktion Box og Placer på Imaging seng.
- Placer marsvin på bedriften pude i en udsat position.
- Påfør oftalmisk salve i begge øjne til at beskytte hornhindens epitel tørrer ud.
- Administrer Vedligeholdelse Isofluran anæstesi.
- Placer næse kegle på marsvin og tænd gas til at levere 1 L / min oxygen til næsekeglen 8.
- Indstil vaporizer at levere 2-3% afisofluran til marsvinet via næsen kegle.
- Når emnet har nået den ønskede plan af anæstesi (ingen bevægelse, ~ 60 åndedrag per min), reducere fordamperen indstilling at levere 1,0-1,5% af isofluran til vedligeholdelse af anæstesi.
- Overvåg vitale tegn, herunder kropstemperatur, puls, og respirationsfrekvens. Hvis respirationsfrekvens begynder at accelerere eller bremse, øge eller mindske procent af isofluran, henholdsvis 9.
- Give en ekstra varmekilde til at opretholde marsvine kropstemperatur mellem 37 og 39 ° C, om nødvendigt, afhængigt af den forventede varighed dataindsamlings- og dybden af bedøvelse opretholdes 8,9.
- Fastgør et plastdæksel over toppen af bedriften pude.
- Advance imaging seng i indeslutning rør.
5. Indstilling af billedstabilisering Synsfelt
- Aktiver lasersystemet (billeddannelse personale) på den "kolde side" af CT scAnner plads til at placere forsøgskanin for CT-scanning. Brug tabellen "i" og "out" for at dække anatomi interesse under laser trådkors.
- For at indstille synsfeltet, bruge laser-knappen for at indstille startpunktet over anatomi af interesse.
- Kontakt CM personale på "varme side" for at placere en ledende skjold mellem sig selv og CT-scanner.
6. hente billeder
- Anskaf undersøgelse scanning for skive placering for CT undersøgelse billeder efter fabrikantens protokol.
- Ordiner skive placering for CT undersøgelse billeder på undersøgelsens billeder.
- Koordinere med "hot-side" personale, hvis kontrast injektion skal anvendes.
- Erhverve undersøgelse scan ifølge producentens protokol.
- Rekonstruere CT billeder på scanneren konsollen ifølge producentens protokol.
- Send billeder til et billede arkivering og kommunikationssystem. Udfør yderligere kvalitative og quantitative analyser fra denne arkivering ifølge producentens protokol.
7. Post-scan Recovery
- Overfør marsvin fra scanner seng til en ren microisolator bur med mad og godbidder.
- Ved hjælp af vognen, transportere buret med dyret tilbage til sin bolig område.
- Overvåg dyret indtil fuldt tilbagebetalt fra anæstesi.
- Når fuldt tilbagebetalt, returnere buret til højeffektiv partikler luft (HEPA) -filtered ventilerede stativer.
8. Desinfektion af Scanner Bay og udstyr
- Desinficer scanneren bay område (f.eks, overflader, der var i direkte kontakt med dyret, scanner seng, scanner gulvet, dørhåndtag) med en 5% dobbelt kvaternære ammonium- løsning til en kontakttid på 10 minutter.
- Skyl overflader med en 70% ethanolopløsning efter en 10 min eksponering for dual kvaternære ammonium- opløsning.
- Tør elementer, der ikke kan sprøjtes direktemed dobbelt kvaternær ammonium-opløsning (følsomt elektronisk udstyr) med en dual-kvaternært-ammonium-mættet klud efterfulgt af en ethanol-mættet klud.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Streng overholdelse af alle sikkerhedsprocedurer og standardprocedurer for håndtering af dyr er afgørende for at arbejde sikkert i en ABSL-4 laboratorium. Overførsel af inficerede dyr i induktion feltet dyr procedure plads til den billeddannende suite minimerer risikoen for forurening af fælles korridorer. Ved at følge krævede procedurer, har ingen laboratorie-infektioner eller krydskontaminering af animalske emner blevet registreret, når der udføres ABSL-4 forskning på IRF-Frederick.
ABSL-4 virale patogener kan fremkalde lunge-relaterede patologier 10,11, og CT er et værdifuldt værktøj til overvågning af sygdomsprogression i dyremodeller for infektion. CT-billeder er skabt ud fra absorptionen af røntgen- stråling i væv, og kan udføres billeddannelse eksperimenter relativt hurtigt, minimere mængden af anæstesi er påkrævet. I CT, jo større Density af objektet afbildes, såsom knogle, jo lysere objektet vises (figur 2). Tæthed af organvæv tendens til at være af mellemprodukt intensitet (grå), mens luftfyldte væv, såsom sunde lunger, synes sort. CT erhverver flere røntgenbilleder over en 360 ° udsigt, der er rekonstrueret i en 3-dimensionel visning af kroppen. For større afgrænsning mellem organer og smitsomme sygdomsrelaterede patologier, kan intravenøse kontrastmidler anvendes.
Figur 1:. Høj inddæmning design af billeddiagnostiske metoder på IRF-Frederick Dette design adskiller imaging suite til "hot" og "kolde" sider. Specielt konstrueret rør udvide den høje inddæmning rum af "varme side" i boringerne af hver scanneren på den "kolde side". Imaging forskere og teknologer betjene scannere fra4;. Kolde side ", mens Comparative Medicine (CM) personale håndtag og overvåge dyr på den" varme side " Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2:. CT billede af overkroppen af et marsvin X-ray absorption er større i knogler, derfor knogle (A) vises lyseste i billedet, og luft (B, lungevæv) vises mørkeste og blødt væv (C: hjerte, D: lever). vises mellemprodukt i kontrast (a) BSL-4 virale patogener fremkalder lunge-relaterede patologi, hvilket gør CT et værdifuldt værktøj til overvågning sygdomsprogression i dyremodeller for infektion klik hendee for et større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tidligere artikler i denne serie har understreget omfattende uddannelse, sans for detaljer, sikkerhedsprocedurer, og yderligere teknisk kontrol, der kræves for at arbejde sikkert i en maksimal inddæmning laboratorium 12,13. Udførelse arbejde sikkert er den højeste prioritet i disse laboratorier. Denne filosofi er endnu vigtigere, når man arbejder med levende dyr på grund af yderligere farer såsom muligheden for smittede dyr at påføre bid eller ridser eller aerosoldannelse 7. Disse procedurer understrege sikker håndtering og transport af dyr fra bedriften plads til de billeddannende værelser. Animal manipulationer og overvågning under anæstesi er påvist at give beskueren en realistisk skildring af den opmærksomhed for detaljer og sikkerhedsmæssige overvejelser, der kræves, mens du arbejder i en ABSL-4 laboratorium.
Vi beskriver en protokol til at udføre ikke-invasiv medicinsk billedbehandling i en ABSL-4 laboratorium ved hjælp af en CT-scanning af et marsvinsom et eksempel. Flere trin er afgørende for en vellykket billeddannelse i BSL-4 laboratorium. Det første afgørende skridt omfatter kontrol af, at sikkerheds- checklister er afsluttet for at sikre, at alle sikkerhedssystemer fungerer korrekt før overgangen til laboratoriet fem. Personalet skal følge procedurer ordentlig ind- og udrejse for at sikre, at de arbejder sikkert i BSL-4 laboratorium. Det andet afgørende skridt er at kontrollere, at personalet enten ikke til stede i scanningen værelse eller de er bag en bærbar blyafskærmning under konditionering af røntgen rør og eventuelle senere scanninger. Det er vigtigt at fastslå, at CT-scanneren er klar og fungerer korrekt, før bedøve og forberede dyr til billeddannelse. Det næste afgørende skridt er at udføre en kvalitetskontrol scanning med en passende fantom og anmelde dyreteknikere når CT-scanner er operationel og klar til brug. Klar og effektiv kommunikation er også vigtigt at udføre billedbehandling protokoller som håndtering af dyr personale er fysisk separated fra imaging teknologer der driver scannere på den "kolde side".
Medicinsk billedbehandling i en BSL-4 laboratorium er en udfordrende procedure som alle procedurer dyr håndtering skal ske mens du bærer positivt tryk jakkesæt og flere par handsker, herunder tunge kulør handsker. Grundlæggende dyr håndtering procedurer ændres til at passe de sikkerhedsmæssige overvejelser BSL-4 laboratorium. Håndtering af vågne dyr minimeres og modificeret til at reducere risikoen for bid eller ridser. For eksempel, læder arbejde-handsker er slidt til at beskytte passer handsker, når picking up vågen marsvin og andre større gnavere. Mus kun håndteres med pincet og skal bedøves først, før scruffing dem for intraperitoneale injektioner. Injektionsteknik skal måske ændres for at sikre en højere grad af sikkerhed. Tang og / eller fastholdelsesanordninger enheder bruges til at udføre injektioner i gnavere snarere end at bruge hånden tilbageholdenhed alene. Kompleksiteten og nødvendige tid til perform imaging afhænger af flere faktorer, herunder den valgte modalitet og de arter, der anvendes. Begrænsninger for udfører CT-scanninger omfatter vanskeligheden ved indgivelse kontrastmidler til visse art laboratoriedyr. Marsvin, især ikke har let tilgængelige vener til administration af et kontrastmiddel intravenøst. Vanskeligheder med denne administration forværres af vanskeligheden ved finmotorisk manipulation, mens iført personlige værnemidler. Desuden skal timingen af kontrastmidlet injektioner koordineres med personalet på den "kolde side", der opererer scanneren.
Det unikke design af den billeddannende facilitet skaber udfordringer, der kræver ændringer af billeddannende teknikker. En af udfordringerne var problemer med kommunikationen på grund af den fysiske adskillelse af imaging teknologer, der kører udstyr til scanning og dyreteknikere håndtering og overvågning af dyrene. Bluetooth telefoner med headset bæres inde ikulør bruges til at kommunikere med billedbehandling teknologer at koordinere og udføre scanninger. Hvis denne kommunikationsmetode mislykkes, kan håndskrevne besked på white boards blive vist gennem laboratorie vinduer. Udformningen af hver billeddannelsesmodalitet omfatter en særlig rør, som udvider høje inddæmning facilitet i boringen af hvert scanner. Efter hver imaging emne er placeret på en imaging seng, emnerne er en større afstand fra og mindre synligt for teknikere, der overvåger dem, mens under anæstesi. Længere anæstesi kredsløb, overvågning kabler og infusionsslanger er påkrævet i dette design.
IRF-Frederick har kapacitet til at udføre biomedicinsk billeddannelse i en række af laboratoriedyr fra mus til ikke-humane primater. CT kan anvendes til at overvåge sygdomsprogression i en række dyremodeller for infektionssygdomme. Evaluering af effekten af potentielle terapeutiske interventioner, herunder vacciner, og identificere biomarkører for diseaSE processer er fremtidige anvendelser af denne teknik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micro-Chem Plus | National Chemical Laboratories | 255 | |
| CT scanner | Philips Healthcare | ||
| CT phantom | Philips Healthcare | ||
| Isovue-300 (CT contrast reagent) | Bracco Diagnostics | NDC 0270-1315-30 | |
| Ventilated rack | Lab Products | ||
| Micro-isolator cage | Lab Products | ||
| Biosafety cabinet | Nuaire | ||
| Anesthesia machine | SurgiVet | WWV9000 | |
| Anesthesia induction box | VetEquip | ||
| Anesthesia mask | Henry Schein | ||
| Isoflurane | Henry Schein | ||
| Waste gas scavenging canister | Fisher | F/AIR | |
| Holding cushion | |||
| Ophthalmic ointment | |||
| Vital signs monitor | Bionet | BM3Vet | |
| Mobile phone | Spectralink | 8440 | |
| Blue Tooth ear piece | |||
| Wireless access points | |||
| Sperian positive-pressure suit | Honeywell Safety Products | BSL 4-2 | |
| Outer suit gloves (latex, Ansell Canners and Handlers) | Fisher | 19-019-601 | |
| Outer suit gloves (nitrile/rubber, MAPA) | Fisher | 2MYU1 | |
| Scrubs | Cintas | 60975/60976 | |
| Socks | Cintas | 944 | |
| Duct tape | Pack-N-Tape | 51131069695 | |
| Towels | Cintas | 2720 | |
| Zip lube | Amazon | B000GKBEJA |
References
- Jahrling, P. B., et al. The NIAID Integrated Research Facility at Frederick, Maryland: a unique international resource to facilitate medical countermeasure development for BSL-4 pathogens. Pathog Dis. , (2014).
- de Kok-Mercado, F., Kutlak, F. M., Jahrling, P. B. The NIAID Integrated Research Facility at Fort Detrick. Appl Biosafety. 16, 58-66 (2011).
- Keith, L., et al. Preclinical imaging in BSL-3 and BSL-4 envrionments: imaging pathophysiology of highly pathogenic infectious diseases. Moyer, B. R., Cheruvu, N. P. S., Hu, T. , Springer-Verlag. New York, NY. (2014).
- Chosewood, L. C., Wilson, D. E. Biosafety in microbiological and biomedical laboratories. , 5th, U.S. Dept. of Health and Human Services. Washington, D.C. . Accessed Sept. 4, 2014 (2009) http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/. (2009).
- Janosko, K., et al. Safety precautions and operating procedures in an (A)BSL-4 laboratory: 1. Laboratory suite entry and exit procedures. J Vis Exp. , (2016).
- Diagnostic Radiology Committee Task Force on CT Scanner Phantoms. Phantoms for evaluation and quality assurance of CT scanners. , American Association of Physicists in Medicine. Chicago, IL. (1977).
- Collins, B. ACUP 712.01 Waste anesthetic gas scavenging systems. Institutional Animal Care and Use Committee. , Cornell University. Ithaca, NY. Available from: http://www.research.cornell.edu/care/documents/ACUPs/ACUP712.pdf (2013).
- Gargiulo, S., et al. Mice anesthesia, analgesia, and care, Part I: anesthetic considerations in preclinical research. ILAR J. 53, E55-E69 (2012).
- Office of the Press Secretary. Executive order 13546. Optimizing the security of Biological Select Agents and Toxins in the United States. The White House. , Washington, DC. Available from: http://www.whitehouse.gov/the-press-office/executive-order-optimizing-security-biological-select-agents-and-toxins-united-stat (2010).
- Escaffre, O., Borisevich, V., Rockx, B. Pathogenesis of Hendra and Nipah virus infection in humans. J Infect Dev Ctries. 7, 308-311 (2013).
- Sueblinvong, V., et al. Critical care for multiple organ failure secondary to Ebola virus disease in the United States. Crit Care Med. , (2015).
- Mazur, S., et al. Safety precautions and operating procedures in an (A)BSL-4 laboratory: 2. General practices. J Vis Exp. , (2016).
- Bohannon, J. K., et al. Safety precautions and operating procedures in an (A)BSL-4 laboratory: 3. Aerobiology. J Vis Exp. , (2016).
