Summary
Här ger vi en reproducerbar metod för att undersöka vuxen neurogenes med hjälp av en neurosphere analys härrör från hela hjärnan eller från antingen telencephalic, tectal eller cerebellära regioner i vuxen zebrafisk hjärnan. Dessutom beskriver vi proceduren för att manipulera genuttrycket i zebrafisk neurosfärer.
Introduction
Däggdjurs neurala stamceller (NSCs) har präglats in vitro genom deras förmåga att växa i fritt flytande kulturer kluster av delande celler benämns neuro 1. I närvaro av epidermal tillväxtfaktor (EGF) och fibroblast-tillväxtfaktor (FGF), NSCs dela antingen symmetriskt för att alstra självförnyande NSCs, eller asymmetriskt för att generera två olika dotterceller, dvs., En differentierings progenitorcell och en roman NSC. Neurosfärkulturer är därför en blandning av neurala stam / progenitorceller och mer differentierade neurala celler 2-4 NSCs kan dock skiljas från andra neurocelltyper genom två specifika egenskaper. De visar långsiktigt självförnyelse i gratis- flytande kulturer och de kan differentiera till alla neurala cellinjer (dvs neuroner, astrocyter och oligodendrocyter) efter indragning av tillväxtfaktorer och vidhäftning till extracellulära matrixsubstrat. i Mammals, neurosphere odlingssystemet var först in vitro-system som används för att visa närvaron av NSCs i den vuxna hjärnan och är fortfarande den mest använda verktyg för att analysera spridning, självförnyelse kapacitet och multipotens av neurala stamceller och progenitorceller. Även om sfärbildande analyser lider vissa nackdelar och begränsningar 4, är detta odlingssystem värdefullt för att utvärdera potentialen hos en cell att bete sig som en stamcell när den avlägsnas från sin in vivo nisch fyra och har varit avgörande för att identifiera viktiga regulatorer av NSC självförnyelse och determinering 5-7.
Till skillnad från däggdjur som har begränsad vuxen neurogenes, zebrafisk konstitutivt producera nya nervceller längs hela hjärnan axeln under hela sitt liv. Zebrafisk vuxna hjärnan visar flera neurogena nischer hyser neurala stamceller / progenitorceller gör zebrafisk en kraftfull modellorganism för att förstå than stamcellsaktivitet i hjärnan liksom de molekylära program som krävs för centrala nervsystemet förnyelse. Under de senaste 17 åren har flera forskargrupper utvecklade metoder för att isolera och odla zebrafisk neurala celler 8,9. Dessa studier syftade till att producera embryonala neuronala och gliaceller in vitro, men inte till att upprätthålla NSCs och undersöka deras egenskaper. Även om neurosfärer har genererats i den vuxna apteronotus leptorhynchus (Brown Ghost Knifefish) 10, en neurosfär bildande analys i zebrafisk återstod som skall upprättas.
Här beskriver vi en neurosphere bildande analys för att visa betydelsen av MIR-107 under zebrafisk neurogenesis 11. Protokollet gör det möjligt: 1) insamling av vuxna neurala stam / progenitorceller antingen från zebrafisk hela hjärnan eller från flera dissekerade hjärnregioner såsom telencephalon, den tectum och lillhjärnan; 2) generering av floating och självförnyande neuro från vuxna neurala stamceller / progenitorceller; 3) ned- och uppreglering av uttrycket av kodande gener eller små icke-kodande RNA 11 i neuro, för att undersöka deras roll i proliferation och differentiering av neurala stam / progenitorceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Zebrafisk av WT CF stammen höjdes och underhålls i enlighet med protokoll som godkänts av Yale University Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC protokoll nummer 2012 till 11.473). Alla experiment bör först godkännas av alla relevanta statliga och institutionella etik reglerande organ när det gäller användning av djur för forskningsändamål.
1. Förberedelser
- Förbered 10 ml dissektion medium, tillsätt 200 pl 100x penicillin-streptomycin i 9,8 ml DMEM / F12.
- Förbered L-cystein lösning: 10 ml vatten för vävnadsodling, tillsätt 120 mg L-cystein. Lagra L-cystein-lösning vid 4 ° C i upp till 2 veckor, eller i alikvoter vid -20 ° C i upp till 1 år.
- Bered DNas I lösning: till 1 ml vatten för vävnadsodling, tillsätt 10 mg DNas I. Förvara DNas I-lösningen vid 4 ° C i upp till två månader.
- Förbered papain lösning: att förbereda papain solution, tillsätt 100 pl papain (cirka 140 enheter), 100 | il DNas I (1%) och 200 pl L-cystein (12 mg / ml) i 5 ml DMEM / F12. Färskt förbereda papain lösning varje gång och sterilisera med en 0,22 um porstorlek före användning.
- Bered tvättlösning: att bereda 100 ml tvättlösning, tillsätt 650 pl glukos 45%, 500 mikroliter HEPES 1 M och 5 ml FBS i 93,85 ml DPBS 1x. Sterilisera tvättlösning med en 0,22 ^ m porstorlek filter före användning. Lagra tvättlösningen vid 4 ° C i upp till 2 månader.
- Förbered insulinlösning: att förbereda 2 ml insulinlösning, tillsätt en 25 l droppe av 10 N NaOH och 100 mg insulin i 2 ml vatten för vävnadsodling.
- Förbered EGF och FGF lösningar: Lös båda mitogener i DMEM / F12 på 100 mikrogram / ml koncentration. Store som 10 il alikvoter vid -20 ° C.
- Förbered B-27 och N-2 media: lagra B-27 och N-2-tillskott vid -20 ° C som 500 l och 1 ml portioner, respektivEly.
- Förbered Z-differentiering skick medium: att bereda 100 ml Z-differentieringstillstånd medium, tillsätt 40 l insulin (50 mg / ml), 500 ^ B-27, en ml N-2, 650 pl glukos 45% och 1 ml 100 x penicillin-streptomycin i 97,81 ml DMEM / F12. Sterilisera Z-differentieringstillstånd medium med en 0,22 ^ m porstorlek filter före användning. Lagra Z-differentieringstillstånd medium vid 4 ° C i upp till en vecka.
- Förbered Z-tillstånd medium: att förbereda 50 ml Z-tillstånd media, tillsätt 10 pl EGF och 10 pl FGF i 50 ml steril Z-differentieringstillstånd medium (20 ng / ml). Lagra Z-condition medium vid 4 ° C i upp till en vecka.
- Förbereda beläggningslösning för differentiering kultur: i 5 ml extracellulärt beläggningslösning, tillsätt 100 | il av den extracellulära matrisen lösningen i 4,9 ml DMEM / F12 (t.ex. Matrigel.). Tö extracellulär matrislösning vid 4 ° C på is. När tinas, hålla vid 4 ° C för up till 2 veckor.
2. Dissekering av den vuxna zebrafisk hjärnan
- Förbered en dissektion säng genom att fylla en 100 mm x 15 mm petriskål med gel is förpackningar. Placera sedan locket på petriskål och inkubera vid -20 ° C tills gelén fryser. På toppen av locket plats en kvadrat med rent filterpapper och linda både filterpappret och petriskål med plastfilm.
- Ren och sterilisera alla microdissection instrument med 70% etanol eller värme före varje användning. Placera alla steriliserade dissektion instrument nära dissekera mikroskop och precis innan dödshjälp, placera dissektion sängen under mikroskop med optisk fiber belysning.
- Samla två vuxna zebrafisk för en hel hjärna neurosphere förberedelse; och tre till fyra zebrafisk att generera neuro från dissekerade hjärnregioner.
- Euthanize vuxna zebrafisk (8-12 månader gamla) med hjälp av ett protokoll som godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén. Därefter doppa fisken i 75% etanol under 5-10 sek och snabbt placera i dissektion bädden följt av dekapitering vid nivån för gälarna med hjälp av en kirurgisk kniv.
- Att avliva djur, administrera en överdos (300 mg / L) av tricaine metansulfonat tills djurets hjärtslag saktar gradvis ner och cirkulation stannar sedan doppa i iskallt vatten.
- Vrid huvudet ryggsidan nedåt, och med användning av sax göra ett längsgående snitt från den skurna sidan till munnen. Med användning av pincett exponera basen och ta bort alla närliggande vävnad. Skär sidoväggarna av skallen från början av ryggmärgen mot tectum.
- Med användning av saxen, klippa och avlägsna de optiska nerverna och därefter avlägsna båda sidor av den mest laterala delen av skallen vid nivån för den tectum. Vrid huvudet ventrala sidan uppåt. Använd pincett, dra av resten av de mest apikala delen av skallen.
- Överföra hjärnan tillsammans med den återstående delen av skallen till en ny skål with dissektion medium (1,1). Rengör hjärnvävnaden i dissektion mediet med hjälp av mikro knivens plasthandtag, hålla alla hjärnstrukturer intakta.
- Från denna punkt fortsätter protokollet med hela zebrafisk hjärnan.
- Alternativt anpassa detta protokoll till specifika hjärnregioner för att generera neuro från hela zebrafisk hjärnan eller från telencephalon, tectum / diencephalon eller cerebellum dissekeras med en ny skalpell. Använd en neural specifik fluorescerande zebrafisk neurala transgen linje att dissekera hjärnan regionen av intresse enligt figur 3 och referens 11.
3. Single Cell Dissociation av vuxna hjärnan
- Utför allt efterföljande arbete i ett biologiskt säkerhetsskåp. Överföra hjärnvävnaden i en 1,5 ml rör innehållande 800 | j, l av dissektion medium (framställd i steg 1,1). Avlägsna dissektion mediet genom pipettering, utan att röra vid hjärnvävnad.
- Tillsätt 500 | il av papain-lösning (steg 1,4) och smälta den hjärnvävnad vid 37 ° C under 10 min. Inte inkubera längre än 15 minuter eftersom det kan minska cellviabiliteten.
- Efter inkubation, överföra hjärnvävnaden med 500 ^ il av papain lösningen i en 15 ml koniska rör med användning av en 1000 | j, l pipettspets skärning vid ~ 0,25 inches från botten. dissociera försiktigt hjärnvävnad genom att långsamt pipettera upp och ned 10 gånger med samma spets. Inte pipettera upp och ner mer än 15 gånger och inte genererar luftbubblor under detta steg, eftersom det kan förändra cellernas livskraft.
- Inkubera hjärnvävnaden igen vid 37 ° C under 10 min, följt av pipettering upp och ned 10-13 gånger med en oklippt 1000 pl vanlig spets. Do not pipettera upp och ner mer än 15 gånger, för att undvika celldöd.
- Stoppa den enzymatiska digestion genom tillsats av 2 ml av tvättlösning (steg 1,5), och centrifugera cellsuspensionen vid 800 xg under 5 min vid rumstemperatur (RT). Dekantera försiktigt supernatant och suspendera pelleten i den återstående lösningen genom att knacka på röret kraftigt med ett finger och sedan genom att pipettera upp och ned med en 1000 l vanlig spets. Nästa, tillsätt 2 ml tvättlösning.
- I detta skede, ta i mikroskop som en enkelcellsuspension har erhållits. Centrifugera cellsuspensionen igen vid 800 xg under 5 min vid RT. Avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten med användning av 1 ml av färsk Z-condition-medium (steg 1,10).
- Fläck celler genom att använda trypan blå 12 och räkna levande celler med hjälp av en hemocytometer genom att utesluta blå döda celler. Bered en 24-brunnsplatta med 200 | il av cellsuspensionen och 300 pl av färsk Z-condition-medium i varje brunn. Utsädes celler vid en densitet av ~ 500 celler / | il. Upprätthålla odlade celler i en inkubator vid 30 ° C i 5% CO2, eftersom zebrafisk hjärnhärledda neurosfärer inte växer väl vid 37 ° C.
4. Framställning av primär Neuro </ P>
- Efter en dag in vitro (DIV1), observera en enda cell suspension som erhölls från vuxna hela hjärnan under mikroskop och observera om skräp har samlats i centrum av brunnen. Försiktigt bort eventuellt skräp genom att pipettera ungefär 100 | j, l av medium (mindre om möjligt). Nästa tillsätt 100 pl färsk Z-tillstånd medium. Enkelcellsuspensioner bör observeras vid denna tid (Figur 2A DIV1).
- Efter 2 dagar in vitro (div2), expandera de odlade cellerna. Med hjälp av en 1000 l pipett med spetsen skär, samla in och överföra 250 ul cellsuspension från varje brunn i en ny brunn. Lägg 250 pl färsk Z-tillstånd medium i alla brunnar. Innan de expanderar de odlade cellerna, homogenisera suspensionen mycket försiktigt genom att pipettera upp och ner under hela brunnen.
- Upprepa steg 4,1 och 4,2 för de följande 4 dagar in vitro (DiV4). En successiv ökning av storleken på neuro bör viligt vid mitten och kanterna av den brunn vid DIV3 och DiV4 (figur 2B och C).
Obs: Primära neuro kan bearbetas för passage eller differentiering för att bedöma multipotens. Alternativt kan de behandlas för nucleofection eller lipo-transfektion 11 för att karakterisera rollen av specifika gener under differentieringsprocessen.
5. Aging av primära Neuro
- Avlägsna 250 pl vävnadskultur från varje brunn och mekaniskt dissociera DiV4 neurosfärer med en 1 ml pipett. Inte pipettera upp och ner alltför snabbt som luftbubbelbildning kan ökad celldöd.
- Räkna cellerna med en hemocytometer och distribuera 800 celler / | il i 250 | il av primär kultur supernatanten i varje brunn på en 24-brunnar.
- Tillsätt 250 | il av Z-condition-medium till varje brunn.
- Efter 2 dagar in vitro (div2), expandera de odlade cellerna som rapporterats i steg 4,2 end 4,3.
6. Differentiering av primär Neuro
- Sterilisera täckglas genom nedsänkning i 70% etanol under 10 min, därefter torra täckglas vid RT genom att placera dem i varje brunn i en 12-brunnars platta.
- Tillsätt 300 ul av extracellulär beläggningslösningen (steg 1,11) vid centrum av täckglaset på ett sådant sätt att den kan expandera i stor utsträckning och omfatta hela täckglaset. Då, inkubera vid 37 ° C under 1 timme (med användning av den fuktade cellodlingsinkubator).
- Avlägsna den extracellulära beläggningslösningen efter inkubation, och torka täckglaset under 2 h vid 37 ° C.
- Avlägsna 250 pl vävnadskultur från varje brunn. Mekaniskt dissociera alla DiV4 primära neuro per brunn med en 1 ml pipett (med bredare slutet spets) genom att pipettera upp och ned.
- Utsäde dissocierade neurosfär cellsuspensioner vid en celldensitet av 4 x 10 3 celler / ml på tidigare framställda extracellulära matrisbelagda täckglas (steg 6,1-6.3) och under minst 30 min, vid 30 ° C i 5% CO2, tills fäst till substratet. Ta sedan bort odlingsmedium och snabbt tillsätt 1 ml förvärmd färsk Z-differentieringstillstånd medium (steg 1,9) innan odling av cellerna under 24 timmar vid 30 ° C i 5% CO2.
- Varannan dag, ersätta hälften av Z-differentieringstillstånd mediet under tidpunkten för cell differentiering.
7. Gene Manipulation of Primary Neurosfärer
- Samla DiV3-4 primära neurosfärer (steg 4,3) genom centrifugering under 8 minuter vid 80 x g vid 4 ° C. Förbered för liposom transfektion av kommersiella oligonucleoatides som previouly beskrivits 11 eller Nucleo-transfektion av DNA plasmidvektorer.
- Resuspendera neurosphere pellet vid en celldensitet av 4 x 10 3 celler / | il i 100 pl av en reaktionsblandning (82 | il nucleofactor lösning och 18 | il av tillägg).
- Blanda neurosfären suspensipå med 5 pl av DNA-plasmidvektorer val (plasmid lager på ett mikrogram / l). Överföra neurosphere / DNA-blandningen i en Nucleofector kyvett för nucleotransfection och välj Nucleofector program i enlighet med tillverkarens instruktioner som tillhandahålls av Nucleofector kit.
- Omedelbart efter nucleofection, lägga till en volym av 500 ml förvärmda Z-tillstånd media (1,10) till cellerna och plattan transfekterade neurospheres för att studera deras cellförnyelse och / eller differentiering egenskaper, såsom beskrivits ovan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
General Scheme of Adult Zebrafish neurosphere kultur
Här beskriver vi alla steg i protokollet av en neurosphere bildande analys utförd av den vuxna zebrafisk hjärnan. För det första har vuxna neurala stamceller / progenitorceller samlats antingen från zebrafisk hela hjärnan eller från flera dissekerade hjärnregioner såsom telencephalon, den tectum och lillhjärnan (figurerna 1A-C). Enda cell suspension av vuxna neurala stam / progenitorceller har sedan använts för att generera flytande och självförnyande neuro (figurerna 1D, E). Slutligen har neuro varit avgörande för att studera ned- och uppreglering av uttrycket av kodande gener eller små icke-kodande RNA 11 för att undersöka deras roll i proliferation och differentiering av zebrafisk neurala stam / progenitorceller.
Zebrafisk primära neuro kan själv förnya efter flera passager. För att generera neuro vid passage 1 och 2, steg 5,1-5,4 upprepades två gånger, i sammanlagt 6-8 dagar. Från DiV2-4, storleken på neurosfärerna ökas upp till omkring 50 | j, m i diameter. Sekundära och tertiära neurosfärer erhölls också efter Passage 1 och 2, respektive (figur 2D). Vid passage 3, zebrafisk neuro var dock oförmögna att växa upp på den kritiska storleken 50 um diameter och misslyckades med att själv förnya, vilket tyder på att vår kultur tillstånd väljer snarare en pool av stam / progenitorceller än en ren population av neurala stamceller 4 .
neurosfären Differentiering
Primära, sekundära eller tertiära neuro härrör från antingen groe hjärnan eller från telencephalic, cerebellär och tectal område av vuxna zebrafisk testades med avseende på deras differentierings möjligheter. Mellan 1 och 3 dagar in vitro i differentieringsförhållanden (DiVd1-DiVd3), var ett monoskikt av vidhäftande celler observerades (figurerna 3A, B). Som visas i figur 3C på DiVd4, axonal liknande utsprång samt gliaceller var synliga och urskiljbara genom immunhistologisk eller genuttryck analyser 11, bedömer att neurala stamceller / progenitorceller hade differentierade. På samma sätt, neuroner och gliaceller skiljer sig från neurala stamceller / progenitorceller isolerade från olika hjärn områden (figurerna 3D, E).
Gene Expression Manipulation i Zebrafish Neuro
Vi har testat den roll miR-107 på neuronala och gliaceller differentiering av hela zebrafisk hjärnan-de rived neurala stam / progenitorceller (Figur 4). Vi visade att nedreglering av MIR-107 av anti-MIR-107 inte påverkar neurosphere formation men förändrad neuronal differentiering, vilket framgår av onormal tillväxt av axonal processer (Figurerna 4A, B). RT-PCR-genuttryck analyser bekräftade att hämning av MIR-107 leder till en ökad expression av både neuroblast markör neurogenin-1 (NGN-1) och axon specifika molekyler, såsom Map-2 och α-tubulin, utan att påverka glial cellmarkör uttryck (S-100, GFAP, Olig2) (Figur 4C). I enlighet därmed, förstärkningen hos MIR-107-expression genom miR-107-mimic inducerade en minskning med neuroblast- och axon-specifik markör uttryck (Figur 4D), bedöma att, in vitro, MIR-107 fungerar som en neuronal differentiering regulator under zebrafisk neurogenes 11.
/53617/53617fig1.jpg "/>
Figur 1:. Schematisk representation av protokollsteg De förfaranden och tillhörande tids inkluderar dissektion av antingen hela hjärnan eller telencephalic, tectal och cerebellära regioner i vuxen zebrafisk hjärnan (A, B), erhållandet av en enda cell suspension (C ), generering av flytande neurosfärer (D) och differentieringen av neurosfärer (E).
Figur 2: Bilda Zebrafish Brain-derived Neuro. (A - C) representant fas kontrastrika bilder av hela hjärnan härrörande primära flytande neurosfärer observerades vid dag 1 (DIV1, A), dag 3 (DIV3, B) och dag 4 (DiV4, C). (D) diagram som representerar det relativa antalet neurospheres på passager 1 och 2 jämfört med neurosphere nummer vid passage 0. Efter Passage 2, neurobildningen drastiskt minskat. Skala bar: 25 pm.
. Figur 3: Differentiering av Zebrafish Brain-derived Neurosfärer (A - C, E) Fas kontrastbilder av hela hjärnhärledda neurosfärer odlade i Z-differentieringsmedium under 1 (A, DiVd1), 3 (B, DiVd3) och 4 (C och D, DiVd4) dagar. (E) Rygg utsikt över hela hjärnan hos en 12 månader gammal Tg (GFAP: DsRed) zebrafisk. Telencephalon (Tel), tectum (TEC) och lillhjärnan (CER) dissekerades och samlas upp som visas. (D) Bilder från DiVd4 neuro härrör från tectum, telencephalon och lillhjärnan vid Passage 0 (P0), en (P1) Och 2 (P2). Skala bar: 25 pm.
Figur 4:. Analys av Neuro bildades efter MiR107 Manipulation (A) faskontrast bilder som visar Div4d neuro behandlades vid Div4 med de angivna oligonukleotiderna. Svarta lådor i ovanpanelema ange området förstorat i bottenpanelema. (B) Toppdiagram representerar kvantifieringen av antalet neurosfärer som bildas med, eller utan, miR107. Neurosfärer subgrouped genom sin storlek (20 till 30 ^ m, 31-50 | j, m,> 51 | j, m i diameter). Botten diagrammet visar kvantifieringen av axonal prognoser från neuro behandlade och under grupperade enligt ovan. (C, D) QRT-PCR expressionsanalys av indikerade gener genom Div4d neurosfärer som tidigare behandlats med indikerade oligonukleotider på Div4. Data representerarmedelvärde ± SEM, * p <0,05, n = 3. Scr: scramble. Skala bar: 25 pm.
| Problem | möjlig orsak | Lösning |
| Återvinning av alltför många döda celler | Fördröjning vid framställning av hjärnan före enzymbehandling | Se till att dissektion inrättas och media är redo innan offra fisk (se även sterilitet, temperatur) |
| Stringent papain behandling | Mekanisk dissociation måste vara känslig nog för att generera en levande enda cell fjädring, men stark nog för att undvika lämnar efter alltför många klumpar av vävnad. Respektera rekommenderade tider och temperaturer för inkubation / centrifuge perioder | |
| Neuro inte visas eller växer dåligt | felaktig temperatur | Kontrollera att inkubator inställd på 30 ° C tillhandahåller den correct temperatur. |
| Växande sfärer bort med skräp | För varje brunn, har aspiration av skräp som skall utföras väl på toppen av mediet. Undvika att i mediet med pipett | |
| Integriteten av vissa reagens (B27 tillägg, EGF, FGF) är försvagad | Denna integritet utgör begränsande faktorer i celltillväxt. Kontrollera batchnummer, och hur proverna bevaras. Undvik tina / refreeze cykler av alla samplade reagens som används i odling | |
| Närvaron av enstaka celler | Verk överföring / utbyggnad av neuro är för hård | Detta steg är en utvidgning / utspädningssteg eftersom alltför många sfärer bildas i brunnen. Undvik hårda sfär samling under överföringen för att förhindra neurosfären dissociation i enskilda celler |
| Avsaknad av celler på Matrigel | Matrigel var inte korrekt tinas / utspädd | Matrigel från -20 ° C behöver minst 30 min vid 4 ° C för att tina och förblir visköst Pipettera försiktigt |
| Ingen vidhäftning på Matrigel | Volymen av cellsuspension måste vara tillräckligt liten för att tillåta cellavsättning på matrigel coat | |
| Ge mer tid för cellavsättning (upp till 2 h, om större volymer används) | ||
| Färska differentieringsmedium för kallt | Vid byte av cellfäst medium måste värmas upp vid 30 ° C differentieringsmedium för att förhindra termisk chock på de deponerade cellerna | |
| dålig nucleofection | döda celler | Se till att du inte genererar luftbubblor när de utför nucleofection. Använd hög kvalitet DNA-vektorer med hjälp av Maxi-preparat. Minst 1-2 timmar efter nucleofection, byt odlingsmedium med antingen färsk Z-differentiering tillstånd medium eller Z-tillstånd medium. |
| Några positiva neuro | Neurosfärer av varierande storlek kan leda till dålig nucleofection. Använda neuro på div2 och DIV3 är idealiska för nucleofection. Densitet av celler bör inte överstiga 4 x 10 3 neuro ml -1 i en 100 ml reaktions. |
Tabell 1: Felsökning Råd Listing, för varje steg i protokollet möjliga problem och lösningar för att övervinna dem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det främsta syftet med detta protokoll är att isolera och kultur vuxna zebrafisk hjärnan härledd neuro för att studera de cellulära och molekylära funktioner i neurala stam / progenitorceller. Här rapporterar vi hur man väljer multipotenta neurala celler och generera de tre neurala celltyper, det vill säga, astrocyter, nervceller och oligodendrocyter, från den vuxna zebrafisk hjärnan. Protokollet är mycket betydelsefullt eftersom ett reproducerbart neurosphere bildande analysen inte hade fastställts i zebrafisk hittills.
Några kritiska stegen i protokollet måste respekteras och har recapitutaled i felsöknings råd (tabell 1). Först sker celldöd både under dissekering av den vuxna zebrafisk hjärnan och enda cellsuspensionen förfarande. För att begränsa omfattningen av celldöd, är det viktigt att använda rena och vassa verktyg samt att strikt respektera tidpunkten och inkubationstemperaturen rekommenderas i detta proprotokoll. För det andra bör neurosphere kultur utföras med nylagade media och med en noggrann pipetteringsteknik. Tredje, rekommendationer celltätheten bör följas för att få tillförlitlig förnyelse eller differentiering av neurosfärceller. Med detta i åtanke bör en fackman inom cellodlingsteknik kunna använda protokollet och genomföra isolering, kultur och genmanipulation av vuxna zebrafisk hjärnan härrörande neuro.
Klotet bildande analyser i zebrafisk lider av samma begränsningar som tidigare beskrivits i däggdjursarter 4: 1) beteendet hos neurala stam / progenitorceller ändras efter deras isolering från deras naturliga hjärn nisch; 2) neuro inte en homogen population av stamceller, men innefattar stamceller, progenitorceller samt efter mitotiska differentierade celler. Det är dessutom värt att notera att våra protokoll genererar aclonal neurosfärkulturer. Celldensiteten av kulturer ären kritisk parameter i sfärbildande analyser eftersom den bestämmer clonality, det vill säga, om kulturen är klonala, halv klonal eller aclonal. Klonala förhållandena tillåter att exakt karakterisera och kvantifiera de olika pooler av stamceller och progenitorceller som finns i kulturen. Vi har inte kunnat utföra cell clonality analyser hittills och våra odlingsbetingelser fortfarande behöver mer optimering innan vi kan skilja neurala stamceller från andra progenitorceller pooler.
Zebrafisk neurosfärkulturer kan användas för ett stort område av experiment. De tillåter genuttryck analys samt manipulering av genuttryck under neurogenes som illustreras av vår studie utvärdera miR-107 funktion i den vävnadsspecifika bestämningen av neural cell öde (Figur 4 och 11). Ytterligare applikationer är genomredigerings strategier, såsom crispr / Cas9-systemet, för att testa rollen av neurala stam / progenitorceller gener i neurogeNesis och hjärna reparation 13. Slutligen visar våra protokoll som zebrafisk neuro kan härledas från olika områden i hjärnan öppnar möjligheten att studera regionspecifika egenskaper hos neuroner och gliaceller och att undersöka den cellulära och molekylära grunden för nervcell heterogenitet i olika kammar domäner hos zebrafisk hjärnan 14 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DPBS 1x | Life Technologies | 14190-144 | |
| DMEM/F12 1x | Life Technologies | 11330-032 | |
| L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma | C6852-25g | |
| B-27 | Life Technologies | 17504-044 | |
| N-2 | Life Technologies | 17502-048 | N-2 supplement (100x) liquid |
| HEPES | Life Technologies | 15630 | 1 M |
| D-(+)-Glucose 45% | Sigma | G8769 | |
| Penicillin-streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 16000044 | |
| Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | |
| Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Insulin | Sigma | I5500-50 mg | |
| DNAse | Sigma | DN25-10mg | |
| Papain | Worthington Biochemical Corporation | LS003126 | |
| Matrigel | Becton Dickinson | 356234 | |
| PFA | TCI | P0018 | |
| PBS | AmericanBio | AB11072-04000 | |
| Tricaine MS-222 | Sigma | A5040 | stock solution of 4 mg/ml. |
| Trycold gel | Sigma | TGP8 | gel pack |
| Amaxa Basic Nucleofector Kit | Lonza | VPI-1004 | |
| Trypan blue stain | Life Technologies | 15250061 |
References
- Rietze, R. L., Reynolds, B. A. Neural stem cell isolation and characterization. Methods Enzymol. 419, 3-23 (2006).
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R. Isolation and culture of adult neurons and neurospheres. Nat Protoc. 2, 1490-1498 (2007).
- Guo, W., Patzlaff, N. E., Jobe, E. M., Zhao, X. Isolation of multipotent neural stem or progenitor cells from both the dentate gyrus and subventricular zone of a single adult mouse. Nat Protoc. 7, 2005-2012 (2012).
- Pastrana, E., Silva-Vargas, V., Doetsch, F. Eyes wide open: a critical review of sphere-formation as an assay for stem cells. Cell Stem Cell. 8, 486-498 (2011).
- Winter, M., et al. Vertebrate neural stem cell segmentation, tracking and lineaging with validation and editing. Nat Protoc. 6, 1942-1952 (2011).
- Gage, F. H.
- Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres--re-evaluating the relationship. Nat Methods. 2, 333-336 (2005).
- Ghosh, C., Liu, Y., Ma, C., Collodi, P. Cell cultures derived from early zebrafish embryos differentiate in vitro into neurons and astrocytes. Cytotechnology. 23, 221-230 (1997).
- Chen, Z., et al. Primary neuron culture for nerve growth and axon guidance studies in zebrafish (Danio rerio). PloS one. 8, e57539 (2013).
- Hinsch, K., Zupanc, G. K. Generation and long-term persistence of new neurons in the adult zebrafish brain: a quantitative analysis. Neuroscience. 146, 679-696 (2007).
- Ristori, E., et al. A dicer-miR-107 interaction regulates biogenesis of specific miRNAs crucial for neurogenesis. Dev Cell. 32, 546-560 (2015).
- Louis, S. K., SIegel, A. C. Cell Viability Analysis Using Trypan Blue: Manual and Automated Methods. Methods Mol Bio. 740, (2011).
- Harrison, M. M., Jenkins, B. V., O'Connor-Giles, K. M., Wildonger, J.
- Marz, M., et al. Heterogeneity in progenitor cell subtypes in the ventricular zone of the zebrafish adult telencephalon. Glia. 58, 870-888 (2010).
