Abstract
Hemos establecido un modelo de cultivo de células epiteliales endodérmico (CEE) para el estudio de la función de ciertas enzimas y proteínas en la mediación de la utilización de nutrientes por los embriones de aves durante el desarrollo. Fertilizados huevos de codorniz japonesa se incubaron a 37 ° C durante 5 días y luego la yema se recogieron membranas de la bolsa (YSM) para establecer el sistema de cultivo CEE. Se aislaron la capa endodermo embrionario de YSM, y en rodajas la membrana en 2 - 3 mm piezas y se digirió parcialmente con colagenasa antes de la siembra en placas de cultivo de 24 pocillos. El EECs proliferan fuera del tejido y están listos para estudios de cultivo celular. Hemos encontrado que la EECs tenía características típicas de YSM in vivo, por ejemplo, la acumulación de gotitas de lípidos, esteroles expresión de O-aciltransferasa y la lipoproteína lipasa. El tratamiento de digestión parcial aumentó significativamente la tasa de éxito de la cultura CEE. Utilizando el EECs, hemos demostrado que la expresión de SOAT1 estaba regulado por el cAMP dependent proteína quinasa A vía relacionada. Este sistema de cultivo de codorniz japonesa CEE primaria es una herramienta útil para estudiar el transporte de lípidos embrionario y para aclarar el papel de los genes implicados en la mediación de la utilización de nutrientes en los ADM durante el desarrollo embrionario aviar.
Introduction
El principal recurso alimenticio del embrión aviar es yema de huevo, compuesta de 33% de lípidos, 17% de proteína, y 1% de cenizas. 1 Durante el desarrollo embrionario, la membrana del saco vitelino (YSM) crece de dentro de la cavidad abdominal embrionario y cubre gradualmente la yema superficie. Comenzando en el día embrionario 2, la expresión de genes asociados con el metabolismo de los lípidos y la angiogénesis se incrementa gradualmente en YSM, y el YSM se desarrolla lentamente proyecciones vellosidades como 8,9. Estas proyecciones aumentan la absorción de los nutrientes de la yema para apoyar el desarrollo embrionario. El YSM es un tejido extraembrionario que contiene tres capas germinales, el endodermo, mesodermo y ectodermo. 14 del ectodermo del saco vitelino se enfrenta a la albúmina y enlaces con la membrana vitelina para cubrir suavemente el saco vitelino. Las células epiteliales del endodermo se enfrentan directamente hacia la yema de huevo y sirven como portales de utilización de nutrientes. 6 A medida que se expande la YSM, células epiteliales endodérmico (EEC) puede ser dividido por Shapcorreo y funcionalidad en dos grupos, el área de vitelina y vascular del área. 7
vitelina Area se compone de células endodérmicas y está distante del embrión; área vasculosa se compone de células mesodérmicas y cubre EECs diferenciados con vasos sanguíneos y tejidos conectivos. Por el día embrionario 5, la yema está totalmente cubierto por el ectodermo y el endodermo de YSM y el área vascular ha crecido rápidamente. El YSM absorbe, recompone y libera lípidos (como yema de derivados de lipoproteínas de muy baja densidad) y las proteínas en el sistema circulatorio embrionario. 9, 2 Por lo tanto, se estableció una codorniz sistema de cultivo celular primario japonés embrionario endodérmico epitelial, para estudiar los mecanismos de lípidos utilización en YSM durante el desarrollo embrionario aviar.
Lípidos tales como triacilglicerol, lecitina, fosfolípidos y ésteres de colesterol (CE) son las fuentes primarias de energía para los embriones de aves. En las primeras etapas de desarrollo, lípidos de la yema son composed de sólo el 1,3% del CE y se eleva al 10-15% a medio plazo del desarrollo embrionario aviar 3, 11 éster de colesterol. Se sintetiza a partir del colesterol por esterol O-aciltransferasa 1 (SOAT1) en YSM embrión aviar. 4
La forma de almacenamiento de colesterol es CE, CE se realiza en las lipoproteínas, y lipoproteínas son transportados por la circulación a los tejidos. 13 Una semana antes de la eclosión hay un rápido crecimiento de los embriones de aves. Aproximadamente el 68% de los contenidos de lípidos restantes en la yema son absorbidos durante esta etapa. 10 El mecanismo por el cual la yema de los lípidos se utilizan pueden ser aclaradas por un modelo de investigación CEE. Un protocolo de cultivo CEE pollo se estableció para lograr este objetivo de investigación. 2, 9 Sin embargo, debido a la baja tasa de éxito de explantes de tejido, se necesita un procedimiento de cultivo celular CEE mejorada para estudiar la función de ciertas enzimas y proteínas en la mediación de la utilización de nutrientes por embriones de aves durante el desarrollo.
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Protocol
NOTA: Este procedimiento es una modificación de un protocolo de cultivo de pollo modelo desarrollado por Bauer et al 2013 y Nakazawa et al, 2011. 2.9..
1. Preparar saludable embrionarias Día 5 Los embriones de codorniz japonesa
- Coloca 1 hombres y 3 mujeres sexualmente maduras codorniz japonesa juntos en la misma jaula. Suministro de alimento y agua ad libitum. Ajustar la luz en la sala de los animales a 14 horas de luz y 10 horas de oscuridad.
- Recoger los huevos fertilizados en bolsas de plástico cada día por la tarde y mantenerlos en un 16 ° C refrigerador para retardar la tasa de crecimiento de los embriones.
- Después de recoger un número suficiente de huevos dentro de un período de dos semanas, se incuban los huevos fertilizados en una incubadora a 37 ° con una buena ventilación durante cinco días.
2. Preparar medio basal y soluciones de lavado
- Utilice DMEM / F-12 medio (ajustado a pH 7,2) como el medio de crecimiento, y la completarácon el nuevo 10% de suero de ternero recién nacido (NBCS) y 1% de Pen-Strep Ampho. Solución (PSA; penicilina, 10 5 unidades / L; estreptomicina, 100 mg / l; anfotericina B, 0,25 mg / L).
- Preparar la solución salina tamponada con fosfato (PBS) a una concentración 10 veces para el almacenamiento; utilizar la solución de PBS 1x (que contiene NaCl, 137.93 mM; KCl, 2.667 mM; KH 2 PO 4, 1.471 mM; Na 2 HPO 4 7H 2 O, 8,06 mM; ajustar el pH a 7,2) para lavar y humedecer la membrana del saco vitelino, mientras separar el endodermo de yema de huevo y albúmina.
- Utilice medio DMEM (ajustado a pH 7,2) para volver a suspender gránulos endodermo.
3. Recogida de EECs primaria de YSMs codorniz japonesa
- Incubar los huevos recogidos durante 5 días (paso 1.3). Examinar los huevos por un candler huevo para confirmar el desarrollo embrionario normal.
NOTA: En el día embrionario 5, el límite de YSM mesodermo es muy clara y las 3 capas embrionarias son menos ligada estrechamente juntos, por lo que es fácil de obendodermo Tain. Utilice sólo los huevos que presentan un desarrollo normal circulación capilar para las colecciones YSM. - Limpiar la cáscara de los huevos con cuidado con el agua dulce y el 75% de etanol. Abrir la cáscara de huevo de la posición de la cámara de aire por un par de tijeras, pelar suavemente y recoger toda la YSM con fórceps y colocar en una placa de cultivo de 10 cm llena de 37 ° C 1x PBS.
- El uso de un par de tijeras eliminar el embrión, yema y clara de huevo, y suavemente lavar el YSM con 1x PBS tres veces y coloque YSM en solución PBS en una placa de cultivo de 10 cm.
- El uso de fórceps y un par de tijeras para quitar el ectodermo de YSM. Utilice 2 pinzas, una para sujetar firmemente la capa de células endodérmico, y el otro para sujetar el mesodermo capilar.
- Bajo un microscopio de disección, separar y separar el endodermo del borde del mesodermo en la dirección hacia el embrión. Recoger el endodermo de color amarillo claro en 50 ml tubos de centrifugación mediante un gotero y colocar en 15 ml de medio de cultivo en un wat 37 ° Cer baño hasta que se completen todas las colecciones de tejidos.
4. La digestión del endodermo rebanadas por digestión con colagenasa
- Recién disolver 6,5 unidades de colagenasa tipo IV en 10 ml de DMEM.
- Centrifugar los tubos de 50 ml (3.4) a 130 xg durante 3 min a TA. Aspirar el medio y lugar todo el endodermo en una placa de cultivo de 6 cm con una pipeta. Añadir 1 ml de solución de colagenasa a esta placa de cultivo.
- Cortar el endodermo recogido de 2 embriones de codorniz con un par de tijeras curvas hasta que el tamaño de cada rebanada es de aproximadamente 2 a 3 mm. Use un gotero, recoger todas las rodajas en un tubo de centrífuga de 50 ml a lo largo con 9 ml de solución de colagenasa fresco.
- Digerir el tejido con colagenasa durante 30 min en un baño de agua agitando 37 ° C a 175 rpm. Esta digestión parcial con colagenasa se utiliza para mejorar la proliferación de las células del explante.
- Centrifugar a 130 xg durante 3 min a temperatura ambiente y eliminar suavemente la fracción sobrenadante usando una pipeta. Lavar el pellet mediante suspensión en 20 ml de DMEM y eliminar la fracción de sobrenadante después de la centrifugación 130 x g durante 3 min.
- Vuelva a suspender el sedimento con 12 ml de medio de cultivo (DMEM / F12 con 10% NBCS y 1% PSA) y sembrar con cuidado e igualmente en una placa de 24 pocillos (de cada solución de células bien con 500 l).
- Incubar explantes de tejido a 37 ° C en 5% de CO2 en aire durante 2 días para permitir que las células proliferan de los tejidos.
- Se incuban las células durante otros 2 días y caracterizar para la viabilidad celular por un protocolo de ensayo de viabilidad celular. 15
NOTA: Living células mantienen un ambiente reductor en el citosol. La resazurina, el ingrediente activo, es un compuesto permeable no tóxico, célula que es de color azul y virtualmente no fluorescente. Cuando se añade a los cultivos celulares, resazurina a resorufina es reducida en el citosol por las enzimas mitocondriales. Resorufina es de color rojo y altamente fluorescente. Las células viables se convierten continuamente la resazurina a resorufina, increAsing la fluorescencia general y el color del medio de cultivo células de los alrededores. - Realizar endodermo células epiteliales RNA total aislamiento, transcripción inversa y cuantitativa en tiempo real PCR de la expresión de ARNm del gen marcador tal como se describe. 16,17
- Utilice PCR transcriptasa inversa para detectar SOAT1 mRNA (sentido: 5'-GAAGGGGCCTATCTGGAACG-3 '; antisentido: 5'-ATCTGCACGTGACATGACCA-3'; producto de PCR = 168 pb) como un marcador específico de las células de la CEE. Utilice β-actina mRNA (sentido: 5'-TGGTGAAGCTGTAGCCTCTC-3 '; antisentido: 5' GTGATGGACTCTGGTGATGG-3 '; producto de PCR = 151 pb) como un gen de mantenimiento y control interno.
- Utilice electroforesis en gel para detectar el tamaño del producto de RT-qPCR. Preparar 1% gel de agarosa, y mezclar 10 l producto qPCR con 2 l de colorante de carga. Cargar 10 mezcla l en cada pocillo en el gel de agarosa al 1%, y ejecutar el gel por 100 V durante 30 min.
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Representative Results
Con el fin de lograr el objetivo de establecer un modelo celular consistente y útil, necesitamos ampliar y estabilizar la tasa de proliferación y el rendimiento de EECs aviar. Se comparó la incubación directa de la endodermo sin digestión con enzimas con endodermo parcialmente digerido con enzimas proteolíticas, tales como la colagenasa o colagenasa plus 0,6 U de dispasa. Dispasa es un amino-endopeptidasa que hidroliza los enlaces peptídicos N-terminal de los residuos de aminoácidos no polares. Mientras que los tratamientos de digestión de la proteasa aumento de la proliferación celular en comparación con ninguna digestión (Figura 1), el crecimiento celular no fue marcadamente diferente entre los dos tratamientos enzimáticos después de cinco días de incubación (Figura 2). Sin embargo, el tratamiento con colagenasa dio como resultado una curva de crecimiento mejor y mostró que EECs proliferó de manera constante durante 6-9 días (Figura 2). Por lo tanto, la digestión con colagenasa parcial mejoró el crecimiento de EECs de laexplantes ex vivo y se recomienda para obtener suficiente y funcional CEE.
Después de 4 días de incubación, EECs tenía una apariencia similar a los adipocitos detectada después de la fijación en formol y Aceite-Red O tinción (Figura 3), lo que sugiere características fisiológicas correctas de las células cultivadas.
La hipótesis de que adenosín monofosfato cíclico (cAMP) es un agente de transcripción regulador, el inhibidor de la fosfodiesterasa cAMP, 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX; para disminuir la degradación de cAMP) y el activador de adenil ciclasa, forskolina (para aumentar la síntesis de cAMP) estimulado tanto la expresión de ARNm SOAT1 después de 24 h de tratamiento (Figura 4). Estos tratamientos también aumentó la expresión de SREBP2, un factor de transcripción regulador de síntesis de colesterol, y la forskolina mejoran la expresión de perilipin-2 (PLIN2), la superficie marcador de proteína of gotitas de lípidos (Figura 5). Los perfiles de mRNA de los genes CEE lipogénesis cuantificados por PCR en tiempo real son similares a los adipocitos (Figura 5).
Figura 1. Efecto de la digestión parcial de colagenasa en células endodérmicas epitelio. Explantes de tejido se incubaron durante 2 días para permitir que las células proliferan fuera del tejido. Hemos observado y se calcularon los números de los EECs crecido con éxito. Los números se calculan para las células sin la digestión y las células parcialmente digerido con colagenasa; ambos fueron cultivadas en placas de 24 pocillos. El eje Y es el número así de EECs proliferado con éxito en placa de cultivo celular de 24 pocillos. Los datos se presentan como media ± SEM. Los análisis se determinó mediante la prueba de t pareada. P <0,0001. Por favor, haga clic aquípara ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. La evolución del crecimiento de la célula de EECs Después parcial Digestión enzimática. La tasa de proliferación se detectó por ensayo de viabilidad celular. El ensayo de la resazurina contenida, un compuesto azul que tiene fluorescencia débil y resazurina a resorufina se reduce al entrar en las células. Las células viables se convierten continuamente la resazurina a resorufina, el aumento de la fluorescencia en general y el color de los medios de comunicación células circundantes. Las células viables se detectaron por absorbancia a 570 nm con la normalización a 600 nm. Los datos se presentan como media ± SEM. El análisis se determinaron mediante ANOVA de dos vías con Bonferroni post-test (grupo colagenasa n = 10; grupo colagenasa + dispasa n = 11). * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001. Por favor click aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. La morfología de EECs cultivadas. Después de 4 días de incubación, EECs tenía una apariencia similar a los adipocitos detectada después de la fijación en formol y Aceite-Red O tinción. De izquierda a derecha: CEE del campo en el luminoso con un aumento de 100X, en el campo brillante con aumento de 200X y 200X aumentos en después de la tinción con hematoxilina O y aceite rojo. El punto oscuro en la izquierda de la figura de la izquierda es el endodermo parcialmente digerido (membrana). La barra de escala representa 200 micras. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. El SOAT1 Transcripción de EECs tratadas con cAMP Activadores. Hemos tratado EECs con concentraciones crecientes de forskolina IBMX o en el día 5 durante 24 horas. Se extrajeron los ARNm a partir de células tratadas y convirtió el ARN en ADNc mediante transcripción inversa PCR. Se analizaron los niveles de transcripción por PCR en tiempo real cuantitativa. β-actina se utilizó como gen de mantenimiento. Los datos se presentan como media ± SEM. Los análisis fueron hechos por ANOVA de una vía con el post-test de Tukey (n = 6) (* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01). IBMX es un inhibidor de la fosfodiesterasa no selectivo competitivo que plantea cAMP intracelular, activa PKA, inhibe TNF-alfa y la síntesis de leucotrienos, reduce la inflamación y la inmunidad innata y es un antagonista del receptor de adenosina no selectivo. Forskolina es un activador de la adenilato ciclasa ubicua eucariota, comúnmente utilizado para elevar los niveles de cAMP. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figure.
Figura 5. El ARNm expresiones de los adultos del CEE durante cinco días, después se trató con cAMP Activadores durante 24 horas. Los del ADNc de la Figura 4 se utilizaron para analizar los niveles de expresión génica mediante PCR en tiempo real cuantitativa. β-actina se utilizó como gen de mantenimiento y sirvió como control interno. Los datos se presentan como media ± SEM. Los análisis fueron hechos por ANOVA de una vía con el post-test de Tukey (n≤ 6) para comparar los tratamientos con el control. SREBP2, esterol regulador elemento de la proteína de unión 2; LPL, la lipoproteína lipasa; PLIN2, perilipina-2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Debido a que el sistema de cultivo anterior tiene un éxito limitado, se necesita un mejor sistema de cultivo. El endodermo codorniz japonesa YSM requiere tratamiento con enzimas proteolíticas tales como la colagenasa para aflojar las uniones célula-célula para lograr un mayor crecimiento en los explantes ex-vivo. Nuestros datos muestran que el número de células del tratamiento de digestión parcial fueron mayores que a partir del cultivo de tejido no digerido después de la siembra durante 2 días (Figura 1). Por lo tanto, la digestión proteolítica parcial es un paso crítico para mejorar el rendimiento de células de la YSM.
La modificación fundamental en el protocolo de cultivo actual es la digestión proteolítica parcial. Este tratamiento mejora en gran medida el rendimiento de células y la tasa de éxito de obtener EECs vivo. El tiempo de digestión es muy crítica debido a sobre-digestión será separar las células de los tejidos y las células no se adhieren a la placa, mientras que en la digestión como resultado un menor rendimiento de células de laexplantes de tejido. Se encontró que de 30 a 40 min digestión usando las condiciones descritas anteriormente es óptima.
El protocolo actual requiere una formación técnica de alto obtener EECs. El punto de recogida de EECs tiempo se limita, por ejemplo, sólo recogemos EECs en el día embrionario 5. La razón es que a medida que crecen los embriones de aves, las conexiones entre las capas de la membrana del saco vitelino son más complejos y disminuye la tasa de éxito de la recogida de EECs. El protocolo puede ser utilizado para obtener EECs de embriones en etapa temprana, pero no embriones en etapa tardía. Se limita la posibilidad de dirigir la investigación sobre los EECs etapa tardía.
La expresión de SOAT1 y la lipoproteína lipasa, y la acumulación de lípidos son características esenciales de la YSM 4,5,11, especialmente el EECs. En el estudio actual, SOAT1, LPL, y Perilipin 2 (PLN2) mRNA se expresaron altamente en el EEC, lo que sugiere el sistema de cultivo puede generar células con el charact fisiológica correctaerística. La técnica actual produce una gran cantidad de EECs primarios. Cuando se utilizó el procedimiento descrito anterior 9, la tasa de éxito de la cultura CEE fue de aproximadamente 60% en placas de cultivo celular de 24 pocillos, mientras que el actual protocolo genera EECs tasa de éxito de casi el 100%.
Yema de membrana sac es el tejido principal para absorber las proteínas, los lípidos y el colesterol de la yema, por lo que funciona para transferir los nutrientes de la yema a los embriones durante el desarrollo. La enzima principal para la formación de éster de colesterol es SOAT1. 11 Debido SOAT1 aumenta dramáticamente en las últimas etapas del desarrollo embrionario aviar cuando se produce la esterificación de colesterol masiva 4, se utilizó la expresión de mRNA SOAT1 como el gen marcador para la evaluación de las características de EECs cultivadas. Hemos demostrado que este sistema de cultivo primario producido CEE prevé que las características fisiológicas. Por lo tanto, el sistema de cultivo CEE puede ser una herramienta valiosa para estudiar embryonel transporte de lípidos ic y aclarar el papel de los genes implicados en la mediación de la utilización de nutrientes en los ADM durante el desarrollo embrionario aviar.
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Acknowledgments
Los fondos para el desarrollo del protocolo actual se apoya particularmente "Objetivo para el Plan Universitario Top" de la Universidad Nacional de Taiwán, Taiwán (donación ID-104R350144), así como el Ministerio de Ciencia y Tecnología de Taiwán (Identificación subvención: MAS 104 -2313-B-002-039-MY3). Agradecemos especialmente el Centro de Biotecnología de la Universidad Nacional de Taiwán para proporcionar una sala de los animales y el espacio de laboratorio para el estudio actual.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco by Life technologies | 12800-017 10 X 1 L | For wash the EECs pellets |
| D-MEM/F-12 | Gibco by Life technologies | 12400-024 10 X 1 L | As the basal medium in culturing EECs |
| NBCS | Gibco by Life technologies | 16010-159 | As the supplyment serum in culturing EECs |
| Pen-Strep Ampho. Solution | BI (Biological Industries) | 03-033-1B 100 ml | For attenuating the possible infection |
| Collagenase Type IV | Gibco by Life technologies | 17104-019 1 g | Collagenase is a protease with specificity for the bond between a neutral amino acid (X) and glycine in the sequence Pro-XGly-Pro. As the protease for dissociation of cells from primary tissue. |
| 24-well plate | FALCON® | REF-353047 | For EECs to attach and extension |
| 50 ml PP centrifuge tubes | Corning® CentriStarTM | 430829 | For transportion of membranes and enzyme digestion |
| 50 ml Conical bottomed Tube with Cap | PRO TECH | CT-50-PL-TW | For transportion of membranes and enzyme digestion |
| Reciprocal shaking bath | DEAGLE | SB302 | For better enzymatic digestion on membranes |
References
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