Endodérmico primario de células epiteliales Cultura de la membrana del saco vitelino de embriones de codorniz japonesa
Summary
To study the mechanism of lipid utilization in yolk sac membranes during the late stages of avian embryonic development, we established a primary Japanese quail embryonic endodermal epithelial cell culture system.
Abstract
Hemos establecido un modelo de cultivo de células epiteliales endodérmico (CEE) para el estudio de la función de ciertas enzimas y proteínas en la mediación de la utilización de nutrientes por los embriones de aves durante el desarrollo. Fertilizados huevos de codorniz japonesa se incubaron a 37 ° C durante 5 días y luego la yema se recogieron membranas de la bolsa (YSM) para establecer el sistema de cultivo CEE. Se aislaron la capa endodermo embrionario de YSM, y en rodajas la membrana en 2 – 3 mm piezas y se digirió parcialmente con colagenasa antes de la siembra en placas de cultivo de 24 pocillos. El EECs proliferan fuera del tejido y están listos para estudios de cultivo celular. Hemos encontrado que la EECs tenía características típicas de YSM in vivo, por ejemplo, la acumulación de gotitas de lípidos, esteroles expresión de O-aciltransferasa y la lipoproteína lipasa. El tratamiento de digestión parcial aumentó significativamente la tasa de éxito de la cultura CEE. Utilizando el EECs, hemos demostrado que la expresión de SOAT1 estaba regulado por el cAMP dependent proteína quinasa A vía relacionada. Este sistema de cultivo de codorniz japonesa CEE primaria es una herramienta útil para estudiar el transporte de lípidos embrionario y para aclarar el papel de los genes implicados en la mediación de la utilización de nutrientes en los ADM durante el desarrollo embrionario aviar.
Introduction
El principal recurso alimenticio del embrión aviar es yema de huevo, compuesta de 33% de lípidos, 17% de proteína, y 1% de cenizas. 1 Durante el desarrollo embrionario, la membrana del saco vitelino (YSM) crece de dentro de la cavidad abdominal embrionario y cubre gradualmente la yema superficie. Comenzando en el día embrionario 2, la expresión de genes asociados con el metabolismo de los lípidos y la angiogénesis se incrementa gradualmente en YSM, y el YSM se desarrolla lentamente proyecciones vellosidades como 8,9. Estas proyecciones aumentan la absorción de los nutrientes de la yema para apoyar el desarrollo embrionario. El YSM es un tejido extraembrionario que contiene tres capas germinales, el endodermo, mesodermo y ectodermo. 14 del ectodermo del saco vitelino se enfrenta a la albúmina y enlaces con la membrana vitelina para cubrir suavemente el saco vitelino. Las células epiteliales del endodermo se enfrentan directamente hacia la yema de huevo y sirven como portales de utilización de nutrientes. 6 A medida que se expande la YSM, células epiteliales endodérmico (EEC) puede ser dividido por Shapcorreo y funcionalidad en dos grupos, el área de vitelina y vascular del área. 7
vitelina Area se compone de células endodérmicas y está distante del embrión; área vasculosa se compone de células mesodérmicas y cubre EECs diferenciados con vasos sanguíneos y tejidos conectivos. Por el día embrionario 5, la yema está totalmente cubierto por el ectodermo y el endodermo de YSM y el área vascular ha crecido rápidamente. El YSM absorbe, recompone y libera lípidos (como yema de derivados de lipoproteínas de muy baja densidad) y las proteínas en el sistema circulatorio embrionario. 9, 2 Por lo tanto, se estableció una codorniz sistema de cultivo celular primario japonés embrionario endodérmico epitelial, para estudiar los mecanismos de lípidos utilización en YSM durante el desarrollo embrionario aviar.
Lípidos tales como triacilglicerol, lecitina, fosfolípidos y ésteres de colesterol (CE) son las fuentes primarias de energía para los embriones de aves. En las primeras etapas de desarrollo, lípidos de la yema son composed de sólo el 1,3% del CE y se eleva al 10-15% a medio plazo del desarrollo embrionario aviar 3, 11 éster de colesterol. Se sintetiza a partir del colesterol por esterol O-aciltransferasa 1 (SOAT1) en YSM embrión aviar. 4
La forma de almacenamiento de colesterol es CE, CE se realiza en las lipoproteínas, y lipoproteínas son transportados por la circulación a los tejidos. 13 Una semana antes de la eclosión hay un rápido crecimiento de los embriones de aves. Aproximadamente el 68% de los contenidos de lípidos restantes en la yema son absorbidos durante esta etapa. 10 El mecanismo por el cual la yema de los lípidos se utilizan pueden ser aclaradas por un modelo de investigación CEE. Un protocolo de cultivo CEE pollo se estableció para lograr este objetivo de investigación. 2, 9 Sin embargo, debido a la baja tasa de éxito de explantes de tejido, se necesita un procedimiento de cultivo celular CEE mejorada para estudiar la función de ciertas enzimas y proteínas en la mediación de la utilización de nutrientes por embriones de aves durante el desarrollo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Debido a que el sistema de cultivo anterior tiene un éxito limitado, se necesita un mejor sistema de cultivo. El endodermo codorniz japonesa YSM requiere tratamiento con enzimas proteolíticas tales como la colagenasa para aflojar las uniones célula-célula para lograr un mayor crecimiento en los explantes ex-vivo. Nuestros datos muestran que el número de células del tratamiento de digestión parcial fueron mayores que a partir del cultivo de tejido no digerido después de la siembra durante 2 días (Figura …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los fondos para el desarrollo del protocolo actual se apoya particularmente "Objetivo para el Plan Universitario Top" de la Universidad Nacional de Taiwán, Taiwán (donación ID-104R350144), así como el Ministerio de Ciencia y Tecnología de Taiwán (Identificación subvención: MAS 104 -2313-B-002-039-MY3). Agradecemos especialmente el Centro de Biotecnología de la Universidad Nacional de Taiwán para proporcionar una sala de los animales y el espacio de laboratorio para el estudio actual.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco by Life technologies | 12800-017 10 X 1 L | For wash the EECs pellets |
| D-MEM/F-12 | Gibco by Life technologies | 12400-024 10 X 1 L | As the basal medium in culturing EECs |
| NBCS | Gibco by Life technologies | 16010-159 | As the supplyment serum in culturing EECs |
| Pen-Strep Ampho. Solution | BI (Biological Industries) | 03-033-1B 100ml | For attenuating the possible infection |
| Collagenase Type IV | Gibco by Life technologies | 17104-019 1g | Collagenase is a protease with specificity for the bond between a neutral amino acid (X) and glycine in the sequence Pro-XGly-Pro. As the protease for dissociation of cells from primary tissue. |
| 24 well plate | FALCON® | REF-353047 | For EECs to attach and extension |
| 50 ML PP centrifuge tubes | Corning® CentriStarTM | 430829 | For transportion of membranes and enzyme digestion |
| 50ML Conical bottomed Tube with Cap | PRO TECH | CT-50-PL-TW | For transportion of membranes and enzyme digestion |
| Reciprocal shaking bath | DEAGLE | SB302 | For better enzymatic digestion on membranes |
References
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