Abstract
Abbiamo stabilito un endodermico epiteliale modello di coltura cellulare (CEE) per studiare la funzione di alcuni enzimi e proteine nel mediare l'utilizzo dei nutrienti da embrioni aviaria durante lo sviluppo. Fecondate uova di quaglia giapponesi sono state incubate a 37 ° C per 5 giorni e poi tuorlo membrane SAC (YSM) sono stati raccolti per stabilire il sistema di coltura CEE. Abbiamo isolato lo strato endoderma embrionale da YSM, e affettato la membrana in 2 - 3 pezzi mm e parzialmente digerito con collagenasi prima della semina in piastre di coltura da 24 pozzetti. Il TEE proliferano fuori del tessuto e sono pronti per studi su colture cellulari. Abbiamo trovato che il TEE aveva caratteristiche tipiche di YSM in vivo, per esempio, l'accumulo di gocce lipidiche, espressione di steroli O-aciltransferasi e lipoproteina lipasi. Il trattamento di digestione parziale significativamente aumentato il tasso di successo della cultura CEE. Utilizzando il TEE, abbiamo dimostrato che l'espressione di SOAT1 è stata regolata dal cAMP dla proteina chinasi A ependent percorso relativo. Questo sistema di coltura quaglia CEE giapponese primario è uno strumento utile per lo studio embrionale trasporto dei lipidi e di chiarire il ruolo dei geni coinvolti nella mediazione di utilizzo dei nutrienti nel YSM durante lo sviluppo embrionale aviaria.
Introduction
La principale risorsa alimentare dell'embrione aviaria è tuorlo, composto da 33% di lipidi, proteine 17% e 1% di ceneri. 1 Durante lo sviluppo embrionale, la membrana sacco vitellino (YSM) cresce all'interno della cavità addominale embrionale e copre gradualmente il tuorlo superficie. Con inizio alle embrionali giorno 2, l'espressione del gene associato con il metabolismo dei lipidi e l'angiogenesi è gradualmente aumentata in YSM, e il YSM sviluppa lentamente proiezioni villi-like. 8,9 Queste proiezioni aumentano l'assorbimento delle sostanze nutritive tuorlo per sostenere lo sviluppo embrionale. Il YSM è un tessuto extraembryonic che contiene tre strati germinali, endoderma, mesoderma ed ectoderma. 14 Il ectoderma sacco vitellino si trova di fronte l'albume e collegamenti con la membrana vitellina per coprire delicatamente il sacco vitellino. Le cellule epiteliali endodermico si trovano ad affrontare direttamente verso il tuorlo d'uovo e servono come portali di utilizzo di nutrienti. 6 Come si espande il YSM, endodermico cellule epiteliali (TEE) può essere diviso per ShapE e funzionalità in due gruppi, zona vitellina e zona vasculosa. 7
Area vitellina è composto da cellule endodermico ed è distante dalla dell'embrione; zona vasculosa è composto da cellule mesodermiche e copre TEE differenziati con i vasi sanguigni e dei tessuti connettivi. Di embrionali giorno 5, il tuorlo è totalmente coperto da ectoderma e endoderma di YSM e l'area vascolare è cresciuto rapidamente. Il YSM assorbe, ricompone e rilascia i lipidi (come il tuorlo di derivazione molto lipoproteine a bassa densità) e le proteine nel sistema circolatorio embrionale. 9, 2 Pertanto, abbiamo stabilito un embrionale sistema di coltura cellulare primaria giapponese quaglie endodermico epiteliale, per studiare i meccanismi di lipidi utilizzo in YSM durante lo sviluppo embrionale aviaria.
I lipidi quali trigliceridi, lecitina, fosfolipidi e colesterolo estere (CE) sono le fonti di energia primaria per gli embrioni aviaria. Nelle prime fasi di sviluppo, lipidi tuorlo sono composed di solo l'1,3% del CE e sale al 10-15% a medio termine della aviaria sviluppo embrionale 3, 11. estere Il colesterolo è sintetizzato dal colesterolo da steroli O-aciltransferasi 1 (SOAT1) in aviario YSM embrionale. 4
La forma di colesterolo stoccaggio è CE, CE viene effettuata in lipoproteine, e lipoproteine vengono trasportati dalla circolazione ai tessuti. 13 Una settimana prima portello c'è una rapida crescita degli embrioni aviaria. Circa il 68% delle restanti contenuti di lipidi nel tuorlo vengono assorbiti durante questa fase. 10 Il meccanismo con cui tuorlo lipidi vengono utilizzati possono essere chiarita da un modello di ricerca CEE. Un protocollo cultura pollo CEE è stato creato per raggiungere questo obiettivo di ricerca. 2, 9 Tuttavia, a causa del basso tasso di successo di espianti di tessuto, è necessario un procedimento di coltura cellulare CEE per studiare la funzione di alcuni enzimi e proteine nel mediare utilizzazione nutriente embrioni aviaria durante lo sviluppo.
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Protocol
NOTA: Questa procedura è una modifica di un modello di pollo protocollo di cultura sviluppato da Bauer et al 2013 e Nakazawa et al, 2011. 2,9..
1. Preparare sano embrionale Giorno 5 embrioni da Quail giapponese
- Mettere 1 maschio e 3 femmine sessualmente maturi quaglia giapponese insieme nella stessa gabbia. Portare l'alimentazione e acqua ad libitum. Regolare la luce nella stanza animale 14 ore di luce e 10 ore di buio.
- Raccogliere le uova fecondate in sacchetti di plastica ogni giorno nel pomeriggio e tenerli in un frigorifero C 16 ° per ritardare il tasso di crescita degli embrioni.
- Dopo aver raccolto un numero sufficiente di uova in un periodo di due settimane, incubare le uova fecondate in un incubatore a 37 ° con una buona ventilazione per cinque giorni.
2. Preparare basale medio e Wash Solutions
- Utilizzare DMEM / F-12 di media (regolata a pH 7.2) come mezzo di crescita, e integrarlacon il 10% nuovo siero vitello nato (siero bovino neonatale) e l'1% Pen-Strep Ampho. Soluzione (PSA, penicillina, 10 5 unità / l; streptomicina, 100 mg / l; amfotericina B, 0,25 mg / L).
- Preparare la soluzione tampone fosfato (PBS) ad una concentrazione 10 volte per lo stoccaggio; usare una soluzione di PBS 1x (contenente NaCl, 137.93 mm, KCl, 2.667 mm, KH 2 PO 4, 1.471 mm, Na 2 HPO 4 -7h 2 O, 8,06 mm, regolare a pH 7,2) per lavare e inumidire il sacco vitellino membrana mentre che separa il endoderma dal tuorlo d'uovo e l'albumina.
- Utilizzare terreno DMEM (regolata a pH 7,2) per risospendere pellet endoderma.
3. Raccolta di primaria TEE da Quail YSMs giapponesi
- Incubare le uova raccolte per 5 giorni (passo 1,3). Esaminare le uova da parte di un Candler uovo per confermare il normale sviluppo embrionale.
NOTA: Il embrionali giorno 5, il confine del YSM mesoderma è molto chiara e le 3 strati embrionali sono meno strettamente collegati tra loro, per cui è facile da obTain endoderma. Utilizzare solo le uova che mostrano lo sviluppo normale circolazione capillare per le collezioni YSM. - Pulire il guscio d'uovo accuratamente con acqua fresca e il 75% di etanolo. Aprire il guscio d'uovo dalla posizione di cella d'aria per un paio di forbici, delicatamente sbucciare e raccogliere tutta la YSM da pinze e posto in un piatto della cultura 10 centimetri pieno di 37 ° C 1x PBS.
- Utilizzando un paio di forbici rimuovere l'embrione, tuorlo e albume d'uovo, e delicatamente lavare la YSM con 1x PBS tre volte e posizionare YSM in soluzione PBS in un piatto della cultura 10 cm.
- Utilizzare pinze e un paio di forbici per rimuovere il ectoderma da YSM. Utilizzare 2 pinze, una per tenere saldamente lo strato di cellule endodermico, e l'altro per tenere il mesoderma capillare.
- Sotto un microscopio da dissezione, separare e separare l'endoderma dal bordo del mesoderma nella direzione verso l'embrione. Raccogliere il endoderma giallo chiaro in 50 ml provette da centrifuga con un contagocce e posto in 15 ml di mezzo di coltura in un C wat 37 °er bagno fino a tutte le collezioni di tessuti sono stati completati.
4. La digestione del Endoderma fette da digestione collagenasi
- Appena sciogliere 6,5 unità di tipo IV collagenasi in 10 ml di DMEM.
- Centrifugare le provette da 50 ml (3.4) a 130 xg per 3 min a RT. Aspirare il terreno e mettere tutto il endoderma in un piatto di cultura 6 centimetri con una pipetta. Aggiungere la soluzione collagenasi 1 ml di questo piatto della cultura.
- Tagliare il endoderma raccolto da 2 embrioni quaglia con un paio di forbici curve finché le dimensioni di ogni fetta è di circa 2 a 3 mm. Utilizzare un contagocce, raccogliere tutte le fette in un tubo da 50 ml centrifuga insieme a 9 ml di soluzione di collagenasi fresca.
- Digerire il tessuto con collagenasi per 30 min a 37 ° C agitando bagnomaria a 175 rpm. Questo parziale digestione con collagenasi viene utilizzato per migliorare la proliferazione cellulare espianto.
- Centrifugare a 130 xg per 3 minuti a temperatura ambiente e rimuovere delicatamente la frazione surnatante con una pipetta. Lavare il pellet mediante sospensione in 20 ml di DMEM e rimuovere il surnatante dopo 130 xg centrifugazione per 3 min.
- Risospendere il pellet con 12 ml di terreno di coltura (DMEM / F12 con il 10% e l'1% NBCS PSA) e seminare con delicatezza e altrettanto in un 24-pozzetti (ogni soluzione cella bene con 500 microlitri).
- Incubare espianti di tessuto a 37 ° C in 5% CO 2 in aria per 2 giorni per consentire cellule a proliferare dai tessuti.
- Incubare le cellule per altri 2 giorni e si caratterizza per la vitalità cellulare da un protocollo di test di vitalità cellulare. 15
NOTA: Living cellule mantengono un ambiente riducente all'interno del citoplasma. Resazurina, l'ingrediente attivo, è non tossico, cellule composto permeabile che è di colore blu e praticamente non fluorescente. Una volta aggiunto al colture cellulari, resazurina si riduce a resorufina nel citosol dagli enzimi mitocondriali. Resorufina è di colore rosso e altamente fluorescente. cellule vitali continuamente convertire resazurina a resorufina, increAsing la fluorescenza complessiva e il colore del mezzo di coltura delle cellule circostanti. - Eseguire endoderma cellule epiteliali isolamento RNA totale, trascrizione e quantitativa real-time PCR dell'espressione dell'mRNA gene marcatore invertire come descritto. 16,17
- Utilizzare PCR trascrittasi inversa per rilevare SOAT1 mRNA (senso: 5'-GAAGGGGCCTATCTGGAACG-3 '; antisenso: 5'-ATCTGCACGTGACATGACCA-3'; PCR prodotto = 168 bp) come marcatore specifico per le cellule CEE. Utilizzare β-actina mRNA (senso: 5'- TGGTGAAGCTGTAGCCTCTC-3 '; antisenso: 5'-GTGATGGACTCTGGTGATGG-3'; prodotto di PCR = 151 bp) come gene housekeeping e di controllo interno.
- Utilizzare elettroforesi su gel per rilevare la dimensione del prodotto di RT-qPCR. Preparare 1% gel, e mescolare 10 ml di prodotto qPCR con la tintura di carico 2 ml. Carico 10 microlitri miscela in ciascun pozzetto nel gel di agarosio 1%, ed eseguire il gel mediante 100V per 30 min.
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Representative Results
Al fine di raggiungere l'obiettivo di stabilire un modello cellulare coerente e utile, abbiamo bisogno di estendere e stabilizzare il tasso di proliferazione e le prestazioni dei TEE aviaria. Abbiamo confrontato incubazione diretta del endoderma senza digestione enzimatica con endoderma parzialmente digerito con gli enzimi proteolitici, come la collagenasi o collagenasi più 0,6 U di dispasi. Dispasi è un ammino-endopeptidasi che idrolizza i legami peptidici N-terminale di residui di aminoacidi non polari. Considerando trattamenti digestione proteasi aumentata proliferazione cellulare rispetto a nessun digestione (figura 1), la crescita delle cellule non era marcatamente differente tra i due trattamenti enzimatici dopo cinque giorni di incubazione (Figura 2). Tuttavia, il trattamento collagenasi determinato una curva di crescita migliore e ha mostrato che TEE proliferavano costantemente per 6-9 giorni (Figura 2). Così, parziale collagenasi digestione migliorato la crescita del TEE dalespianti ex-vivo e si raccomanda di ottenere sufficienti e funzionale CEE.
Dopo 4 giorni di incubazione, TEE aveva un aspetto adipociti simile rilevata dopo fissazione in formalina e Oil-Red O colorazione (figura 3), suggerendo corrette caratteristiche fisiologiche delle cellule coltivate.
Abbiamo ipotizzato che adenosina monofosfato ciclico (cAMP) è un agente di trascrizione regolamentare, l'inibitore della fosfodiesterasi cAMP, 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX, per ridurre la degradazione del cAMP) e l'attivatore ciclasi, forskolina (per aumentare la sintesi di cAMP) sia stimolato l'espressione di mRNA SOAT1 dopo 24 ore di trattamento (Figura 4). Questi trattamenti anche aumentato l'espressione di SREBP2, un fattore di trascrizione regolamentazione sintesi del colesterolo, e forskolin migliorato l'espressione di perilipin-2 (PLIN2), la superficie proteina marker ogoccioline lipidiche f (Figura 5). I profili CEE mRNA per i geni lipogenici quantificati mediante real-time PCR sono simili a adipociti (Figura 5).
Figura 1. Effetto parziale digestione collagenasi su cellule endodermico dell'epitelio. Espianti di tessuto sono state incubate per 2 giorni per consentire cellule a proliferare fuori del tessuto. Abbiamo osservato e calcolato il numero dei TEE coltivate con successo. I numeri sono stati calcolati per le cellule senza la digestione e le cellule parzialmente digerito con collagenasi; entrambe sono state coltivate in piastre da 24 pozzetti. L'asse Y è il numero di ben TEE proliferato con successo in lamiera di coltura cellulare di 24 pozzetti. I dati sono stati presentati come media ± SEM. L'analisi è stata determinata con il test t accoppiato. P <0,0001. Cliccate quiper visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2. La prestazione delle cellule crescita di TEE Dopo parziale Digestione enzimatica. Il tasso di proliferazione è stato rilevato dal test di vitalità cellulare. Il saggio conteneva resazurin, un composto blu che è debole fluorescenza e resazurin si riduce a resorufina entrando cellule. Le cellule vitali convertono continuamente resazurin al resorufina, aumentando la fluorescenza complessiva e il colore del supporto cellule circostanti. Le cellule vitali sono stati rilevati da assorbanza a 570 nm con normalizzazione a 600 nm. I dati sono stati presentati come media ± SEM. Analisi sono stati determinati da ANOVA a due vie con Bonferroni post-test (gruppo collagenasi n = 10; collagenasi + dispasi gruppo n = 11). * P <0.05, ** P <0,01, *** p <0.001. Si prega di CLIck qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. La Morfologia della Colta TEE. Dopo 4 giorni di incubazione, TEE aveva un aspetto adipociti simile rilevata dopo fissazione in formalina e Oil-Red O colorazione. Da sinistra a destra: CEE del in campo chiaro con ingrandimento 100X, in campo chiaro con 200X di ingrandimento e 200X ingrandimento dopo colorazione con O-olio rosso e ematossilina. La macchia scura sulla sinistra della figura all'estrema sinistra rappresenta l'endoderma parzialmente digerito (membrana). Barra della scala rappresenta 200 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Il SOAT1 Transcription di TEE trattati con il campo attivatori. Abbiamo trattato TEE con concentrazioni crescenti di IBMX o forskolina al giorno 5 per 24 ore. Abbiamo estratto mRNA da cellule trattate e trasformato l'RNA in cDNA mediante trascrizione inversa PCR. Abbiamo analizzato i livelli di trascrizione di real-time PCR quantitativa. β-actina è stato utilizzato come gene housekeeping. I dati sono stati presentati come media ± SEM. Le analisi erano di ANOVA con post-test di Tukey (n = 6) (* P≤ 0,05, ** P≤ 0.01). IBMX è un inibitore della fosfodiesterasi non selettivo competitivo che solleva cAMP intracellulare, attiva PKA, inibisce il TNF-alfa e la sintesi dei leucotrieni, riduce l'infiammazione e l'immunità innata ed è un antagonista del recettore dell'adenosina non selettivo. Forskolin è un attivatore onnipresente di eucariotica ciclasi ciclasi, comunemente usato per aumentare i livelli di cAMP. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figuri.
Figura 5. L'mRNA espressioni di Grown della CEE, per cinque giorni, poi trattato con cAMP attivatori per 24 ore. Il cDNA di in figura 4 sono stati utilizzati per analizzare i livelli di espressione genica mediante real-time PCR quantitativa. β-actina è stato utilizzato come gene housekeeping e servito come il controllo interno. I dati sono stati presentati come media ± SEM. Le analisi erano di ANOVA con il post-test di Tukey (n≤ 6) per confrontare i trattamenti al controllo. SREBP2, steroli normativo elemento-binding protein 2; LPL, lipoproteina lipasi; PLIN2, perilipin-2. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Poiché il sistema di coltura precedente ha solo un successo limitato, è necessario un sistema di coltura migliore. L'endoderma quaglie YSM giapponese richiede un trattamento con enzimi proteolitici, come collagenasi per allentare le giunzioni cellula-cellula per ottenere una migliore performance di crescita negli espianti ex-vivo. I nostri dati mostrano che il numero di cellule derivanti dal trattamento di digestione parziale sono stati superiori dalla coltura tissutale non digerito dopo la semina per 2 giorni (Figura 1). Pertanto, la digestione proteolitica parziale è un passo fondamentale per migliorare la resa delle cellule dal YSM.
La modifica critico nel protocollo cultura correnti è la digestione proteolitica parziale. Questo trattamento notevolmente migliorato il rendimento delle cellule e il tasso di successo di ottenere TEE dal vivo. Il tempo di digestione è molto critica, perché un eccesso di digestione separerà le cellule dal tessuto e le cellule non collegare alla piastra, mentre sotto-digestione portato a meno rendimenti cella dalespianti di tessuto. Abbiamo trovato che 30 a 40 min digestione base alle condizioni sopra descritte è ottimale.
Il protocollo attuale richiede alta formazione tecnica per ottenere TEE. Il punto di tempo di raccolta TEE è limitato, per esempio, raccogliamo solo TEE al giorno embrionale 5. La ragione è che, come gli embrioni aviaria crescono, i collegamenti fra strati della membrana sacco vitellino sono più complesse e diminuisce il tasso di successo della raccolta TEE. Il protocollo può essere utilizzato per ottenere TEE di embrioni dello stadio precoce, ma non gli embrioni in fase avanzata. Esso limita la possibilità di ricerca diretta sui TEE in fase avanzata.
L'espressione di SOAT1 e lipoproteina lipasi, e accumulo di lipidi sono caratteristiche essenziali della YSM 4,5,11, in particolare il TEE. Nel corso di studio, SOAT1, LPL, e perilipin 2 (PLN2) mRNA sono stati espressi altamente nel TEE, suggerendo il sistema di coltura in grado di generare cellule con il corretto charact fisiologicoeristics. La tecnica corrente prodotta una grande quantità di TEE primari. Quando abbiamo usato il procedimento descritto precedente 9, il tasso di successo della cultura CEE è stato di circa il 60% in piastre di coltura cellulare di 24 pozzetti, considerando che il protocollo corrente generata TEE al tasso di successo quasi il 100%.
Tuorlo membrana sac è il tessuto principale di assorbire le proteine, lipidi e colesterolo dal tuorlo, fungendo così da trasferire sostanze nutritive dal tuorlo di embrioni durante lo sviluppo. L'enzima principale per la formazione del colesterolo estere è SOAT1. 11 A causa SOAT1 aumenta notevolmente nelle ultime fasi dello sviluppo embrionale aviaria quando si verifica massiccia colesterolo esterificazione 4, abbiamo usato l'espressione dell'mRNA SOAT1 come il gene marcatore per la valutazione delle caratteristiche dei TEE in coltura. Abbiamo dimostrato che questo sistema di coltura CEE primaria prodotta prevede caratteristiche fisiologiche. Pertanto, il sistema di coltura CEE può essere uno strumento prezioso per studiare embryonic trasporto dei lipidi e di chiarire il ruolo dei geni coinvolti nella mediazione di utilizzo dei nutrienti nel YSM durante lo sviluppo embrionale aviaria.
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Acknowledgments
Il finanziamento per lo sviluppo del protocollo attuale è sostenuta in particolare da "Obiettivo per il Piano Top Università" della National Taiwan University, Taiwan (grant ID-104R350144), così come il Ministero della Scienza e della Tecnologia di Taiwan (grant ID: PIU '104 -2313-B-002-039-MY3). Ringraziamo in modo particolare il Centro di Biotecnologie della National Taiwan University per fornire un ambiente animale e spazio laboratorio per lo studio corrente.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco by Life technologies | 12800-017 10 X 1 L | For wash the EECs pellets |
| D-MEM/F-12 | Gibco by Life technologies | 12400-024 10 X 1 L | As the basal medium in culturing EECs |
| NBCS | Gibco by Life technologies | 16010-159 | As the supplyment serum in culturing EECs |
| Pen-Strep Ampho. Solution | BI (Biological Industries) | 03-033-1B 100 ml | For attenuating the possible infection |
| Collagenase Type IV | Gibco by Life technologies | 17104-019 1 g | Collagenase is a protease with specificity for the bond between a neutral amino acid (X) and glycine in the sequence Pro-XGly-Pro. As the protease for dissociation of cells from primary tissue. |
| 24-well plate | FALCON® | REF-353047 | For EECs to attach and extension |
| 50 ml PP centrifuge tubes | Corning® CentriStarTM | 430829 | For transportion of membranes and enzyme digestion |
| 50 ml Conical bottomed Tube with Cap | PRO TECH | CT-50-PL-TW | For transportion of membranes and enzyme digestion |
| Reciprocal shaking bath | DEAGLE | SB302 | For better enzymatic digestion on membranes |
References
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