Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

زراعة الخلايا الأولية الأديم الباطن طلائي من الكيس المحي غشاء اليابانية السمان الأجنة

doi: 10.3791/53624 Published: March 10, 2016

Abstract

أنشأنا الظهارية نموذج خلية ثقافة الأديم الباطن (EEC) لدراسة وظيفة بعض الأنزيمات والبروتينات في التوسط في استخدام المواد الغذائية التي أجنة الطيور خلال التنمية. وحضنت المخصبة بيض السمان اليابانية عند 37 درجة مئوية لمدة 5 أيام ثم صفار جمعت أغشية الكيس (YSM) لإنشاء نظام ثقافة الجماعة الاقتصادية الأوروبية. نحن عزل طبقة الأديم الجنينية من YSM، وشرائح الغشاء إلى 2-3 قطع ملم ويهضم جزئيا مع كولاجيناز قبل البذر في لوحات ثقافة 24-جيدا. وEECS تتكاثر من النسيج ونحن على استعداد للدراسات ثقافة الخلية. وجدنا أن EECS كان الخصائص المميزة للYSM في الجسم الحي، على سبيل المثال، وتراكم قطرات الدهون، تعبيرا عن ستيرول O-ناقلة الأسيل والليباز البروتين الدهني. علاج الهضم جزئية زيادة كبيرة في معدل نجاح ثقافة السوق الأوروبية المشتركة. الاستفادة من EECS، أثبتنا أن التعبير عن SOAT1 ينظمها المخيم دبروتين كيناز ependent مسارا ذات الصلة. هذا النظام الثقافة السمان EEC الياباني الأساسي هو أداة مفيدة لدراسة نقل الدهون الجنينية وتوضيح دور الجينات المسؤولة في التوسط في استخدام المواد الغذائية في YSM أثناء التطور الجنيني الطيور.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

المورد الغذائي الرئيسي للجنين الطيور هو صفار البيض، ويتألف من 33٪ والدهون، والبروتين 17٪، و 1٪ رماد. 1 أثناء التطور الجنيني، غشاء الكيس المحي (YSM) ينمو من داخل تجويف البطن الجنينية ويغطي تدريجيا صفار البيض سطح. ابتداء من اليوم الجنينية 2، يتم زيادة التعبير الجيني المرتبط التمثيل الغذائي للدهون والأوعية الدموية تدريجيا في YSM، وYSM يتطور ببطء التوقعات مثل الزغب. 8،9 هذه التوقعات زيادة امتصاص المواد الغذائية صفار البيض لدعم التطور الجنيني. وYSM هو الأنسجة خارج الجنين الذي يحتوي على ثلاث طبقات جرثومية، الأديم، الأديم المتوسط ​​والأديم الظاهر 14 في الأديم الظاهر الكيس المحي يواجه زلال والروابط مع الغشاء المحي لتغطية بلطف الكيس المحي. وتواجه الخلايا الظهارية الأديم الباطن مباشرة نحو صفار البيض وتكون بمثابة بوابات استخدام المغذيات. 6 ويوسع YSM، الخلايا الظهارية الأديم الباطن (EECS) يمكن تقسيمها من حالات العسر الشديده وظيفة إلى مجموعتين، منطقة المحي والوعائية للمنطقة. 7

وتتكون منطقة المحي من خلايا الأديم الباطن وغير بعيد من الجنين. وتتكون منطقة وعائية من خلايا أرومية متوسطة ويغطي EECS متباينة مع الأوعية الدموية والأنسجة الضامة. بعد يوم الجنينية 5، وتغطي صفار البيض تماما من الأديم الظاهر والأديم الباطن من YSM ومنطقة الأوعية الدموية قد نمت بسرعة. وYSM تمتص، recomposes والنشرات الدهون (كما الصفار المستمدة منخفضة جدا كثافة البروتين الدهني) والبروتينات في نظام الدورة الدموية الجنينية. 9، 2 لذلك، أنشأنا السمان الجنينية النظام الياباني الأساسي الأديم الباطن الظهارية زراعة الخلايا، لدراسة آليات الدهون استخدام في YSM أثناء التطور الجنيني الطيور.

الدهون مثل الدهون الثلاثية، ليستين، فوسفورية واستر الكولسترول (CE) هي مصادر الطاقة الأولية للأجنة الطيور. في المراحل المبكرة من التطور، والدهون صفار هي جomposed من 1.3٪ فقط م، وترتفع إلى 10-15٪ في منتصف المدة من التطور الجنيني الطيور ويتم تصنيع 11. استر الكولسترول من الكولسترول بنسبة ستيرول O-ناقلة الأسيل 1 (SOAT1) في YSM جنين الطيور. 4

شكل تخزين الكوليسترول هو CE، ويتم CE في البروتينات الدهنية، ويتم نقل البروتينات الدهنية بواسطة الدورة الدموية إلى الأنسجة. 13 وقبل أسبوع يفقس هناك نمو السريع للأجنة الطيور. تقريبا يتم امتصاص 68٪ من محتويات الدهون المتبقية في صفار خلال هذه المرحلة. 10 الآلية التي صفار وتستخدم الدهون يمكن توضيحها من خلال نموذج البحث EEC. وتم إنشاء بروتوكول ثقافة EEC الدجاج لتحقيق هذا الهدف البحوث. 2، 9 ومع ذلك، ويرجع ذلك إلى انخفاض معدل النجاح من إإكسبلنتس الأنسجة، هناك حاجة إلى تحسين إجراءات زراعة الخلايا الجماعة الاقتصادية الأوروبية لدراسة وظيفة بعض الأنزيمات والبروتينات في التوسط في استخدام المواد الغذائية من قبل أجنة الطيور خلال التنمية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ملاحظة: هذا الإجراء هو تعديل لبروتوكول ثقافة نموذج الدجاج التي وضعتها باور وآخرون عام 2013 وناكازاوا وآخرون، 2011. 2،9.

1. إعداد صحي الجنينية يوم 5 أجنة من السمان الياباني

  1. ضع 1 ذكر و 3 إناث ناضجة جنسيا السمان الياباني معا في نفس القفص. تغذية العرض والمياه libitum الإعلانية. ضبط الضوء في الغرفة الحيوان إلى 14 ساعة من الضوء و 10 ساعة من الظلام.
  2. جمع البويضات المخصبة في أكياس بلاستيكية كل يوم في فترة ما بعد الظهر والاحتفاظ بها في 16 درجة مئوية الثلاجة على تأخير معدل نمو الأجنة.
  3. بعد جمع عدد كاف من البيض خلال فترة أسبوعين، واحتضان البويضة الملقحة في الحاضنة 37 درجة مئوية مع التهوية الجيدة لمدة خمسة أيام.

2. إعداد متوسطة بصل وغسل حلول

  1. استخدام DMEM / F-12 متوسطة (معدلة لدرجة الحموضة 7.2) باعتبارها وسيلة النمو، ومكملا لهمع 10٪ جديد مصل العجل المولود ([نبكس])، و 1٪ القلم بكتيريا Ampho. الحل (PSA، البنسلين، 10 5 وحدات / L، ستربتومايسين، و 100 ملغم / لتر، الامفوتريسين، 0.25 ملغ / لتر).
  2. إعداد الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) حل في تركيز 10X لأغراض التخزين؛ استخدام الحل برنامج تلفزيوني 1X (التي تحتوي على كلوريد الصوديوم، 137.93 ملي، بوكل، 2.667 مم، KH 2 PO 1،471 ملم، نا 2 هبو 4 -7H 2 O، 8.06 مم، ضبط لدرجة الحموضة 7.2) لغسل وترطيب غشاء الكيس المحي في حين فصل الأديم من صفار البيض والزلال.
  3. استخدام DMEM المتوسطة (معدلة لدرجة الحموضة 7.2) لاعادة تعليق الكريات الأديم.

3. جمع من EECS الابتدائية من YSMs السمان اليابانية

  1. احتضان البيض التي تم جمعها لمدة 5 أيام (الخطوة 1.3). فحص البيض من قبل كاندلر البيض لتأكيد التطور الجنيني الطبيعي.
    ملاحظة: في يوم الجنينية 5، حدود YSM الأديم المتوسط ​​واضح جدا و3 طبقات الجنينية هي أقل مرتبطة بإحكام معا، لذلك فمن السهل أن أوبتين الأديم. فقط استخدام البيض تظهر تطوير الدورة الدموية الشعرية العادية للمجموعات YSM.
  2. تنظيف قشر البيض بعناية باستخدام المياه العذبة و 75٪ من الإيثانول. فتح قشر البيض من موقع خلية الهواء عن طريق زوج من مقص، بلطف قشر خارج وجمع YSM كله بواسطة ملقط ومكان في صحن الثقافة 10 سم مملوءة 37 ° C برنامج تلفزيوني 1X.
  3. باستخدام زوج من مقص إزالة الجنين، صفار وبياض البيض، وبلطف غسل YSM مع برنامج تلفزيوني 1X ثلاث مرات ووضع YSM في حل برنامج تلفزيوني في طبق ثقافة 10 سم.
  4. استخدام ملقط ومقص لإزالة الأديم الظاهر من YSM. 2 استخدام ملقط، واحدة لاعتقادا راسخا طبقة الخلايا الأديم الباطن، والآخر لعقد الأديم المتوسط ​​الشعرية.
  5. تحت المجهر تشريح، مزق وفصل الأديم من حافة الأديم المتوسط ​​في الاتجاه نحو الجنين. جمع الأديم ضوء أصفر في 50 مل أنابيب الطرد المركزي باستخدام قطارة والمكان في 15 مل من متوسط ​​النمو في 37 درجة مئوية واتحمام إيه حتى يتم الانتهاء من جميع المجموعات الأنسجة.

4. الهضم من الأديم شرائح من كولاجيناز الهضم

  1. الطازج حل 6.5 وحدة من النوع الرابع كولاجيناز في 10 مل من DMEM.
  2. أجهزة الطرد المركزي ال 50 مل أنابيب (3.4) في 130 x ج لمدة 3 دقائق على RT. نضح المتوسطة ووضع كل الأديم في طبق ثقافة 6 سم باستخدام ماصة. إضافة 1 مل من محلول كولاجيناز إلى هذا الطبق الثقافة.
  3. شريحة الأديم تم جمعها من 2 الأجنة السمان مع زوج من مقص منحني حتى حجم كل شريحة حوالي 2-3 ملم. استخدام قطارة، وجمع كل شرائح في أنبوب 50 مل الطرد المركزي جنبا إلى جنب مع 9 مل من محلول كولاجيناز جديدة.
  4. هضم الأنسجة مع كولاجيناز لمدة 30 دقيقة في 37 ° C حمام الماء تهتز في 175 دورة في الدقيقة. وتستخدم هذه الهضم الجزئي مع كولاجيناز لتحسين تكاثر الخلايا يزدرع.
  5. أجهزة الطرد المركزي في 130 x ج لمدة 3 دقائق على RT وإزالة بلطف الكسر طاف باستخدام ماصة. غسل بيليه معلق في 20 مل DMEM وإزالة جزء طاف بعد الطرد المركزي 130 x ج لمدة 3 دقائق.
  6. إعادة تعليق بيليه مع 12 مل من متوسط ​​النمو (DMEM / F12 مع 10٪ [نبكس] و 1٪ PSA) والبذور بلطف وعلى قدم المساواة في لوحة 24-جيدا (كل حل الخلية جيدا مع 500 ميكرولتر).
  7. احتضان إإكسبلنتس الأنسجة عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 في الهواء لمدة 2 أيام للسماح للخلايا لتتكاثر من الأنسجة.
  8. احتضان الخلايا لمدة 2 أيام أخرى وتميز لبقاء الخلية عن طريق بروتوكول الفحص بقاء الخلية 15
    ملاحظة: الخلايا الحية الحفاظ على البيئة والحد داخل العصارة الخلوية. ريسازورين، العنصر النشط، هو غير سامة، وخلية مجمع نفاذية هذا هو الازرق في اللون وتقريبا غير الفلورسنت. عندما تضاف إلى مزارع الخلايا، ريسازورين هو انخفاض لresorufin في العصارة الخلوية بواسطة الإنزيمات الميتوكوندريا. Resorufin هو أحمر اللون والفلورية للغاية. تحويل خلايا قابلة للحياة باستمرار ريسازورين إلى resorufin، increasing مضان العام واللون من مستنبت الخلايا المحيطة.
  9. أداء الأديم الباطن الخلايا الظهارية الحمض النووي الريبي مجموع العزلة، عكس النسخ والكمي في الوقت الحقيقي PCR التعبير مرنا علامة الجين كما هو موضح. 16،17
    1. استخدام عكس PCR الناسخ للكشف عن SOAT1 مرنا (بمعنى: 5'-GAAGGGGCCTATCTGGAACG-3 '؛ العقاقير: 5'-ATCTGCACGTGACATGACCA-3'؛ PCR المنتج = 168 سنة مضت) كعلامة محددة لخلايا الجماعة الاقتصادية الأوروبية. استخدام بيتا أكتين مرنا (بمعنى: 5'- TGGTGAAGCTGTAGCCTCTC-3 '؛ العقاقير: 5'- GTGATGGACTCTGGTGATGG-3'؛ المنتج PCR = 151 سنة مضت) باسم الجينات التدبير المنزلي والرقابة الداخلية.
    2. استخدام هلام الكهربائي للكشف عن حجم المنتج من RT-QPCR. إعداد 1٪ agarose هلام، ومزيج 10 ميكرولتر QPCR المنتج مع 2 ميكرولتر صبغة تحميل. تحميل 10 ميكرولتر الخليط في كل بئر في هلام الاغاروز 1٪، وتشغيل الجل وذلك 100V لمدة 30 دقيقة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

من أجل تحقيق هدف إقامة نموذج خلية متسقة ومفيدة، ونحن بحاجة إلى توسيع واستقرار معدل انتشار وأداء EECS الطيور. قارنا حضانة مباشرة من الأديم الباطن مع عدم وجود انزيم الهضم مع الأديم هضمها جزئيا مع الإنزيمات المحللة للبروتين، مثل كولاجيناز أو كولاجيناز زائد 0.6 U من dispase. Dispase هو وسيلة ببتيداز داخلية الأمينية التي hydrolyzes السندات الببتيد N- محطة من بقايا الأحماض الأمينية غير القطبية. في حين أن العلاجات الهضم البروتيني زيادة تكاثر الخلايا مقارنة مع عدم هضم (الشكل 1)، وكان نمو الخلايا لا تختلف بشكل ملحوظ بين العلاجات الانزيم اثنين بعد خمسة أيام الحضانة (الشكل 2). ومع ذلك، أدت العلاج كولاجيناز في منحنى نمو أفضل وأظهرت أن EECS انتشرت بشكل مطرد ل6-9 أيام (الشكل 2). وبالتالي، تحسن جزئي كولاجيناز الهضم نمو EECS منينصح إإكسبلنتس السابقين فيفو والحصول على EEC كافية والوظيفية.

بعد 4 أيام الحضانة، كان EECS ظهور مثل خلية شحمية الكشف عن بعد تثبيت الفورمالين والنفط الأحمر يا تلطيخ (الشكل 3)، مما يشير إلى الخصائص الفسيولوجية الصحيحة للخلايا المستزرعة.

ونحن افترضنا أن أحادي فسفات الأدينوزين الحلقي (المخيم) هو عامل النسخ التنظيمي، والفوسفو المانع المخيم، 3-إيسوبوتيل-1-الميثيل (IBMX؛ لتقليل تدهور المخيم) والمنشط محلقة الأدينيل، forskolin (لزيادة تخليق المخيم) كلا حفز التعبير SOAT1 مرنا بعد 24 ساعة العلاج (الشكل 4). كما زادت هذه العلاجات التعبير عن SREBP2، تركيب الكولسترول عامل النسخ التنظيمي، وforskolin تعزيز التعبير عن perilipin-2 (PLIN2)، على سطح البروتين علامة سقطرات و الدهون (الشكل 5). لمحات EEC مرنا للجينات اكتناز الشحم كميا بواسطة الوقت الحقيقي PCR مشابهة لالخلايا الشحمية (الشكل 5).

الشكل 1
الشكل 1. تأثير جزئي كولاجيناز الهضم على خلايا الأديم الباطن الظهارة. حضنت إإكسبلنتس الأنسجة لمدة 2 أيام للسماح للخلايا لتتكاثر من الأنسجة. لاحظنا وحساب الأرقام من EECS نمت بنجاح. حسبت الأرقام للخلايا بلا الهضم وخلايا هضمها جزئيا مع كولاجيناز. سواء كانت تزرع في 24 لوحات جيدا. المحور Y هو عدد جيد من EECS انتشرت بنجاح في لوحة الثقافة خلية من 24 جيدا. قدمت البيانات كما يعني ± SEM. تم تحديد تحليل بواسطة اختبار ر المقترنة. P <0.0001. الرجاء انقر هنالعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2. أداء نمو الخلايا من EECS بعد الجزئي انزيم الهضم. تم الكشف عن معدل انتشار عن طريق فحص بقاء الخلية. يتم تقليل الفحص الواردة ريسازورين، مجمع الزرقاء التي لديها مضان ضعيفة وريسازورين إلى resorufin عند دخول الخلايا. تحويل خلايا قابلة للحياة باستمرار ريسازورين إلى resorufin، مما يزيد من مضان العام واللون وسائل الإعلام المحيطة الخلايا. تم الكشف عن خلايا قابلة للحياة من قبل الامتصاصية في 570 نانومتر مع التطبيع في 600 نانومتر. قدمت البيانات كما يعني ± SEM. تم تحديد التحليل من قبل اتجاهين أنوفا مع بونفيروني بعد اختبار (مجموعة كولاجيناز ن = 10؛ كولاجيناز + dispase مجموعة ن = 11). * P <0.05، ** P <0.01، *** P <0.001. الرجاء المبادرة القطريةCK هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3. مورفولوجية مثقف EECS بعد 4 أيام الحضانة، كان EECS ظهور مثل خلية شحمية الكشف عن بعد تثبيت الفورمالين والنفط الأحمر يا تلطيخ. من اليسار إلى اليمين: في الجماعة الاقتصادية الأوروبية في مجال مشرق مع التكبير 100X، في مشرق الميدان مع 200X التكبير وفي 200X التكبير بعد تلطيخ مع O-النفط الأحمر والهيماتوكسيلين. بقعة داكنة على يسار الرقم من اليسار المتطرف هي الأديم الباطن هضمها جزئيا (غشاء). يمثل شريط مقياس 200 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الرقم 4. SOAT1 ترانستسجيل الأسماء من EECS المعالجة مع مخيم المنشطات. كنا نعامل EECS مع زيادة تركيزات IBMX أو forskolin في يوم 5 لمدة 24 ساعة. استخرجنا من mRNAs من الخلايا المعالجة وتحويل الحمض النووي الريبي إلى [كدنا التي كتبها عكس النسخ PCR. قمنا بتحليل مستويات النسخ بواسطة الوقت الحقيقي الكمي PCR. وقد استخدم β-الأكتين كما الجينات التدبير المنزلي. قدمت البيانات كما يعني ± SEM. كانت التحليلات من قبل في اتجاه واحد أنوفا مع مرحلة ما بعد اختبار توكي في (ن = 6) (* P≤ 0.05، ** P≤ 0.01). IBMX غير تنافسية غير الانتقائية المانع phosphodiesterase الأمر الذي يثير مخيم داخل الخلايا، وينشط PKA، يمنع TNF-ألفا والتوليف الليكوترين، ويقلل من الالتهاب والمناعة الفطرية وهو غير الانتقائية لمستقبلات الأدينوزين. Forskolin هو المنشط في كل مكان من سيكلاز أدينيليل حقيقية النواة، وتستخدم عادة لرفع مستويات المخيم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا فيقوإعادة.

الرقم 5
الشكل 5. مرنا التعبير عن نمت EEC لخمسة أيام، ثم المعالجة مع مخيم المنشط لمدة 24 ساعة. واستخدمت في كدنا] في الشكل (4) لتحليل مستويات التعبير الجيني في الوقت الحقيقي الكمي PCR. β-الأكتين كان يستخدم الجينات التدبير المنزلي وشغل منصب الرقابة الداخلية. قدمت البيانات كما يعني ± SEM. كانت التحليلات من قبل في اتجاه واحد أنوفا مع مرحلة ما بعد اختبار توكي في (n≤ 6) لمقارنة العلاجات لعنصر التحكم. SREBP2، ستيرول التنظيمية بروتين 2 ملزم العنصر؛ LPL، والليباز البروتين الدهني. PLIN2، perilipin-2. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

لأن النظام الثقافة السابق سوى نجاح محدود، هناك حاجة إلى نظام ثقافة أفضل. اليابانية الأديم السمان YSM يتطلب العلاج مع الإنزيمات المحللة للبروتين مثل كولاجيناز لتخفيف تقاطعات خلية خلية لتحقيق أداء أفضل نمو في إإكسبلنتس فيفو السابقين. وتشير البيانات المتوفرة لدينا أن أعداد الخلايا من العلاج الهضم جزئية كانت أكبر من من زراعة الأنسجة عسر الهضم بعد البذر لمدة 2 أيام (الشكل 1). ولذلك، فإن عملية الهضم بروتين الجزئي هو خطوة حاسمة لتحسين العائد خلية من YSM.

التعديل حاسما في بروتوكول الثقافة الحالي هو هضم بروتين الجزئي. هذا العلاج تتعزز بشكل كبير العائد الخلية ومعدل نجاح الحصول على EECS الحية. الوقت الهضم حرج للغاية بسبب الإفراط في الهضم وفصل الخلايا من الأنسجة والخلايا سوف لا نعلق على لوحة، في حين أدى نقص الهضم في أقل عائد خلية منإإكسبلنتس الأنسجة. وجدنا أن 30 إلى 40 دقيقة الهضم باستخدام الشروط الموضحة أعلاه هو الأمثل.

يتطلب البروتوكول الحالي تدريب التقني العالي للحصول على EECS. ويقتصر نقطة زمنية لجمع EECS، على سبيل المثال، نقوم بجمع فقط EECS في اليوم الجنينية 5. والسبب هو أن مع نمو الأجنة الطيور، والاتصالات بين الطبقات في غشاء الكيس المحي هي أكثر تعقيدا وأنه يقلل من معدل النجاح في جمع EECS. بروتوكول يمكن استخدامها للحصول على EECS الأجنة مرحلة مبكرة ولكن ليس في وقت متأخر الأجنة المرحلة. أنه يحد من إمكانية البحث المباشر على EECS مرحلة متأخرة.

التعبير عن SOAT1 والليباز البروتين الدهني، وتراكم الدهون هي الخصائص الأساسية للYSM 4،5،11، خاصة EECS. في الدراسة الحالية، SOAT1، LPL، وperilipin 2 (PLN2) مرنا وأعرب غاية في EECS، مما يدل على أن نظام الثقافة يمكن أن تولد خلايا مع charact الفسيولوجية الصحيحeristics. أنتجت هذه التقنية الحالية كمية كبيرة من EECS الأولية. عندما كنا الإجراء الموضح السابق كان معدل النجاح للثقافة EEC ما يقرب من 60٪ في لوحات ثقافة خلية من 24 جيدا، في حين أن البروتوكول الحالي إنشاء EECS معدل نجاح ما يقرب من 100٪ في.

صفار غشاء الكيس هو نسيج الرئيسية لامتصاص البروتينات، والدهون، والكولسترول من صفار البيض، وبالتالي تعمل على نقل المواد الغذائية من صفار البيض إلى الأجنة خلال التنمية. الانزيم الرئيسي لتشكيل الكوليسترول استر هو SOAT1. 11 لأن SOAT1 يزيد بشكل كبير في المراحل المتأخرة من التطور الجنيني الطيور عند حدوث ضخمة الكولسترول الأسترة استخدمنا التعبير SOAT1 مرنا كما الجين علامة لتقييم خصائص EECS مثقف. أثبتنا أن هذا النظام الثقافة EEC الأساسي المنتجة المتوقع الخصائص الفسيولوجية. لذلك، يمكن للنظام الثقافة EEC يكون أداة قيمة لدراسة embryonنقل الدهون جيم وتوضيح دور الجينات المسؤولة في التوسط في استخدام المواد الغذائية في YSM أثناء التطور الجنيني الطيور.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

ويدعم التمويل لتطوير البروتوكول الحالي بشكل خاص "الهدف لخطة جامعة أعلى" من جامعة تايوان الوطنية، تايوان (منحة ID-104R350144)، وكذلك وزارة العلوم والتكنولوجيا في تايوان (ID المنحة: MOST 104 -2313-B-002-039-MY3). نخص بالشكر مركز للتكنولوجيا الحيوية من جامعة تايوان الوطنية لتوفير غرفة الحيوان والفضاء مختبر لدراسة الحالية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium Gibco by Life technologies 12800-017 10 X 1 L For wash the EECs pellets
D-MEM/F-12 Gibco by Life technologies 12400-024 10 X 1 L As the basal medium in culturing EECs
NBCS Gibco by Life technologies 16010-159 As the supplyment serum in culturing EECs
Pen-Strep Ampho. Solution BI (Biological Industries) 03-033-1B 100 ml For attenuating the possible infection 
Collagenase Type IV Gibco by Life technologies 17104-019 1 g  Collagenase is a protease with specificity for the bond between a neutral amino acid (X) and glycine in the sequence Pro-XGly-Pro. As the protease for dissociation of cells from primary tissue.
24-well plate FALCON® REF-353047 For EECs to attach and extension
50 ml PP centrifuge tubes Corning® CentriStarTM 430829 For transportion of membranes and enzyme digestion
50 ml Conical bottomed Tube with Cap PRO TECH CT-50-PL-TW For transportion of membranes and enzyme digestion
Reciprocal shaking bath DEAGLE SB302 For better enzymatic digestion on membranes

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Abeyrathne, E. D., Lee, H. Y., Ahn, D. U. Egg white proteins and their potential use in food processing or as nutraceutical and pharmaceutical agents--a review. Poult Sci. 92, (12), 3292-3299 (2013).
  2. Bauer, R., Plieschnig, J. A., Finkes, T., Riegler, B., Hermann, M., Schneider, W. J. The developing chicken yolk sac acquires nutrient transport competence by an orchestrated differentiation process of its endodermal epithelial cells. J Biol Chem. 288, (2), 1088-1098 (2013).
  3. Ding, S. T., Nestor, K. E., Lilburn, M. S. The concentration of different lipid classes during late embryonic development in a randombred turkey population and a subline selected for increased body weight at sixteen weeks of age. Poult Sci. 74, (2), 374-382 (1995).
  4. Ding, S. T., Lilburn, M. S. The developmental expression of acyl-coenzyme A: cholesterol acyltransferase in the yolk sac membrane, liver, and intestine of developing embryos and posthatch turkeys. Poult Sci. 79, (10), 1460-1464 (2000).
  5. Ding, S. T., Lilburn, M. S. The ontogeny of fatty acid-binding protein in turkey (Meleagridis gallopavo) intestine and yolk sac membrane during embryonic and early posthatch development. Poult Sci. 81, (7), 1065-1070 (2002).
  6. Kanai, M., Soji, T., Sugawara, E., Watari, N., Oguchi, H., Matsubara, M., Herbert, D. C. Participation of endodermal epithelial cells on the synthesis of plasma LDL and HDL in the chick yolk sac. Microsc Res Tech. 35, (4), 340-348 (1996).
  7. Mobbs, I. G., McMillan, D. B. Structure of the endodermal epithelium of the chick yolk sac during early stages of development. Am J Anat. 155, (3), 287-309 (1979).
  8. Mobbs, I. G., McMillan, D. B. Transport across endodermal cells of the chick yolk sac during early stages of development. Am J Anat. 160, (3), 285-308 (1981).
  9. Nakazawa, F., Alev, C., Jakt, L. M., Sheng, G. Yolk sac endoderm is the major source of serum proteins and lipids and is involved in the regulation of vascular integrity in early chick development. Dev Dyn. 240, (8), 2002-2010 (2011).
  10. Noble, R. C., Cocchi, M. Lipid metabolism and the neonatal chicken. Prog Lipid Res. 29, (2), 107-140 (1990).
  11. Shand, J. H., West, D. W., McCartney, R. J., Noble, R. C., Speake, B. K. The esterification of cholesterol in the yolk sac membrane of the chick embryo. Lipids. 28, (7), 621-625 (1993).
  12. Speier, J. S., Yadgary, L., Uni, Z., Wong, E. A. Gene expression of nutrient transporters and digestive enzymes in the yolk sac membrane and small intestine of the developing embryonic chick. Poult Sci. 91, (8), 1941-1949 (2012).
  13. Walzem, R. L., Hansen, R. J., Williams, D. L., Hamilton, R. L. Estrogen Induction of VLDLy Assembly in Egg-Laying Hens. J Nutr. 129, (2), 467S-472S (1999).
  14. Yoshizaki, N., Soga, M., Ito, Y., Mao, K. M., Sultana, F., Yonezawa, S. Two-step consumption of yolk granules during the development of quail embryos. Dev Growth Differ. 46, (3), 229-238 (2004).
  15. alamarBlue Cell Viability Assay Protocol. Source: https://www.lifetechnologies.com/us/en/home/references/protocols/cell-and-tissue-analysis/cell-profilteration-assay-protocols/cell-viability-with-alamarblue.html#4 (2008).
  16. Lin, H. Y., Chen, C. C., Chen, Y. J., Lin, Y. Y., Mersmann, H. J., Ding, S. T. Enhanced Amelioration of High-Fat Diet-Induced Fatty Liver by Docosahexaenoic Acid and Lysine Supplementations. Biomed Res Int. 2014, (1), 310981 (2014).
  17. Lin, Y. Y., et al. Adiponectin receptor 1 regulates bone formation and osteoblast differentiation by GSK-3β/β-Catenin signaling in mice. Bone. 64, 147-154 (2014).
زراعة الخلايا الأولية الأديم الباطن طلائي من الكيس المحي غشاء اليابانية السمان الأجنة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lin, H. J., Wang, S. H., Pan, Y. H., Ding, S. T. Primary Endodermal Epithelial Cell Culture from the Yolk Sac Membrane of Japanese Quail Embryos. J. Vis. Exp. (109), e53624, doi:10.3791/53624 (2016).More

Lin, H. J., Wang, S. H., Pan, Y. H., Ding, S. T. Primary Endodermal Epithelial Cell Culture from the Yolk Sac Membrane of Japanese Quail Embryos. J. Vis. Exp. (109), e53624, doi:10.3791/53624 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter