Abstract
我们建立了一个内胚层上皮细胞培养模型（EEC）用于研究开发过程中由禽胚胎调解养分利用某些酶和蛋白质的功能。受精日本鹌鹑蛋在37℃下培养5天，然后卵黄囊膜（YSM）收集来建立欧洲经济共同体培养系统。我们从YSM分离胚胎内胚层层，和切片膜进入2 - 3毫米件和在24孔培养板播种前用胶原酶部分消化。该EECS繁殖出来的组织和准备好细胞培养研究。我们发现，EECS有体内 YSM的典型特征，例如，脂滴的累积，固醇O-酰基转移酶和脂蛋白脂肪酶的表达。部分消化处理显著上升EEC文化的成功率。利用EECS，我们证明了SOAT1的表达受cAMP的调节Ðependent蛋白激酶相关途径。这主要日本鹌鹑EEC培养体系是研究胚胎脂质运输和澄清参与禽流感在胚胎发育过程中的调解YSM养分的利用基因的作用的有用工具。
Introduction
禽流胚胎的主要营养资源是蛋黄，33％脂质，17％的蛋白质组成，和1％的灰分。1在胚胎发育期间，卵黄囊膜（YSM）从胚胎腹腔内生长并逐渐覆盖蛋黄表面。在2天胚胎开始，与脂质代谢和血管发生相关的基因的表达在YSM逐渐增加，并且YSM发展缓慢绒毛状突起。-8,9-这些突起增加蛋黄营养的吸收，以支持胚胎发育。该YSM是包含三个胚层，内胚层，中胚层和外胚层的胚外组织。14卵黄囊外胚层面临的蛋白和链接与卵黄膜轻轻地覆盖卵黄囊。内胚层上皮细胞直接面对朝蛋黄作为养分利用率的门户网站。6作为绝经年限的扩大，内胚层上皮细胞（EECS）可以通过十八分e和功能分为两组，区卵黄和面积vasculosa 7
区卵黄是由内胚层细胞是从胚胎遥远;区域vasculosa是由胚层细胞，并覆盖有血管和结缔组织有区别的EECS。通过5天的胚胎，蛋黄完全由YSM的外胚层和内胚层覆盖，血管面积增长迅速。在YSM吸收，重新组成并释放脂质（如蛋黄衍生的极低密度脂蛋白）和蛋白质进入胚胎循环系统9中，2。因此，我们建立了主日本鹌鹑胚胎内胚层上皮细胞培养系统，来研究脂质的机制利用率YSM禽流胚胎发育过程中。
脂质如甘油三酯，磷脂，磷脂和胆固醇酯（CE）是禽类胚胎的主要能源。在开发的早期阶段，蛋黄脂类是Composed只有1.3％，CE和它上升到10-15％的鸟类胚胎发育的3期中，11胆固醇酯是由胆固醇在鸡胚YSM固醇O-酰基转移酶1（SOAT1）合成。4
胆固醇的存储形式是CE，CE是脂蛋白携带和脂蛋白被循环输送到组织中。13一个星期前舱门有鸟类胚胎的快速增长。大约在蛋黄中剩余的脂肪含量68％，在这一阶段被吸收。10由蛋黄脂质利用可通过EEC研究模型加以澄清机制。阿鸡欧洲经济共同体培养协议的建立是为了实现这一研究的目标。2,9然而，由于组织外植体的成功率很低，需要一种改进的欧洲经济共同体的细胞培养过程来研究某些酶和蛋白质的功能在通过介导养分的利用在开发过程中禽流感的胚胎。
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Protocol
注：此步骤是Bauer 等人 2013年和中泽等人 ，2011年2,9制定了鸡模型文化协议的修改。
1.准备健康胚胎第5天的胚胎从日本鹌鹑
- 将1男3女性成熟的日本鹌鹑在同一个笼子里。供应饲料自由采食和饮水 。调整的光在动物室的光的14小时和黑暗10小时。
- 每天收集在塑料袋受精卵在下午和保存在16℃的冰箱延缓胚胎的生长速度。
- 两个星期的时间内收集足够数量的鸡蛋后，孵化受精卵在37℃培养箱具有良好的透气五天。
2.准备基础培养基和冲洗溶液
- 使用DMEM / F-12培养基（调节至pH 7.2）作为生长培养基，并补充它用10％新生小牛血清（NBCS）和1％青霉素 - 链霉素Ampho。溶液（PSA;青霉素，10 5单位/ L，链霉素，100毫克/升;两性霉素B，0.25毫克/升）。
- 制备在10倍浓度为存储磷酸盐缓冲盐水（PBS）溶液;用1×PBS溶液（含NaCl，137.93毫;氯化钾，2.667毫; KH 2 PO 4，1.471毫; 的 Na 2 HPO 4 -7H 2 O，8.06毫摩尔;调整至pH 7.2）洗和滋润卵黄囊膜而分离蛋黄和白蛋白的内胚层。
- 使用DMEM培养基（调节至pH 7.2）重新悬浮内胚层粒料。
3.从日本鹌鹑YSMs主要EECS集
- 孵育所收集的鸡蛋5天（步骤1.3）。检查由禽蛋蛋，确认胚胎正常发育。
注：在5天的胚胎，YSM中胚层的边界非常清晰，3胚胎层不太紧密联在一起，所以很容易OB泰恩内胚层。仅使用显示了YSM集合正常微血管循环发育的蛋。 - 仔细清洁利用淡水和75％乙醇的蛋壳。打开由一对剪刀的空气电池的位置的蛋壳，轻轻剥离并通过在充满37℃1×PBS中在10cm培养皿镊子和地点收集整个YSM。
- 用剪刀取出胚，蛋黄和蛋清，轻轻用1×PBS洗涤YSM三次，并放置YSM在10cm的培养皿PBS溶液。
- 使用镊子和剪刀从YSM删除外胚层。使用2镊子，一个紧紧握住内胚层细胞层，而其他持有毛细管中胚层。
- 在解剖显微镜下，拉开和内胚层从沿朝向胚胎的方向上的中胚层的边缘分开。收集用在15毫升生长培养基的一个滴管和地点在50ml离心管中的浅黄色内胚层在37℃笏呃洗澡，直到所有组织的集合完毕。
4.内胚层片胶原酶消化消化
- 新鲜溶解6.5单位IV型胶原酶的10ml DMEM中。
- 离心在130 xg离心50毫升管（3.4），在室温3分钟。吸出中，用吸管把所有的内胚层在将6cm培养皿。加入1 ml胶原酶解决这个培养皿。
- 切片来自2鹌鹑胚胎有一对弯曲的剪刀，直到每个片的大小收集的内胚层是大约2至3毫米。使用滴管，收集所有切片到50毫升离心管用9ml新鲜胶原酶溶液一起。
- 消化胶原酶的组织30分钟在37℃振荡水浴中于175转。用胶原酶此部分消化用于提高外植体的细胞增殖。
- 离心在130×g离心3分钟，在RT，轻轻用移液管除去上清液部分。通过悬浮于20毫升的DMEM洗涤沉淀并除去后130 XG离心上清液部分3分钟。
- 重悬用12ml生长培养基（含10％NBCS和1％的PSA的DMEM / F12）的沉淀，轻轻地，同样接种到24孔板（每孔用500μl细胞溶液）。
- 孵育组织外植体在37℃在5％CO 2的空气中2天，使细胞增殖出组织。
- 孵育细胞另外2天，并通过细胞生存力测定法协议表征为细胞活力。15
注：活细胞保持细胞质内的还原环境。刃天青，活性成分，是无毒的，细胞透过性化合物是在蓝色和实质上非荧光。当加入到细胞培养物，刃天青是减少在由线粒体酶的胞质溶胶向试卤灵。试卤灵是红色和高荧光。活细胞不断转化为刃天青试卤灵，increASING周围细胞的培养基中的总荧光和颜色。 - 执行内胚层上皮细胞总RNA分离，如所描述逆转录和实时定量标记基因mRNA表达的PCR。16,17
- 使用逆转录PCR检测SOAT1的mRNA（有义：5'-GAAGGGGCCTATCTGGAACG-3';反义：5'-ATCTGCACGTGACATGACCA-3'; PCR产物= 168碱基对）作为欧洲经济共同体细胞的特异性标记物。使用β肌动蛋白的mRNA（有义：5'-TGGTGAAGCTGTAGCCTCTC-3';反义：5'-GTGATGGACTCTGGTGATGG-3'; PCR产物= 151碱基对），为管家基因和内部对照。
- 用凝胶电泳检测，RT-qPCR的的产品尺寸。制备的1％琼脂糖凝胶上，并用2微升样染料混合10微升的qPCR产物。负载10微升混合物倒入每个孔中的1％琼脂糖凝胶，并运行由100V的凝胶30分钟。
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Representative Results
为了实现建立一个一致的和有用的细胞模型的目标，我们需要扩大和稳定增殖率和禽流EECS的性能。我们比较了没有酶消化与内胚层与蛋白水解酶，如胶原酶或胶原酶加分散酶的0.6单位部分消化的内胚层的直接温育。分散酶是一种氨基肽酶是水解的非极性氨基酸残基的N-末端肽键。而没有消化（ 图1）相比，蛋白酶消化处理增加的细胞增殖，细胞生长不五天后孵育（ 图2）这两个酶处理之间明显不同。然而，胶原酶处理导致更好的生长曲线，并表明EECS为6-9天（ 图2）不断增殖。因此，部分胶原酶消化改进EECS增长前体内外植体，并建议以获取充分，功能EEC。
后4天孵化，EECS有福尔马林固定，油红O染色（ 图3）后检测到脂肪细胞样外观，这表明该培养细胞的正确生理特性。
我们假设，环磷酸腺苷（cAMP）是转录调节剂，所述的cAMP磷酸二酯酶抑制剂，3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX;要降低cAMP降解）和腺苷酸环化酶活化剂，福斯高林（以增加的cAMP合成）两个24小时后处理（ 图4）刺激SOAT1 mRNA的表达。这些治疗也增加SREBP2，胆固醇合成转录调控因子的表达，和毛喉素增强脂素-2（PLIN2）的表达，表面蛋白质标记ö˚F脂滴（ 图5）。欧洲经济共同体的mRNA型材通过实时PCR定量生脂基因是类似于脂肪细胞（ 图5）。
图1.偏胶原酶消化的上内胚上皮细胞的影响。组织外植体培养2天，以允许细胞增殖出组织。我们观察到与所计算的成功地生长EECS的编号。号分别计算无消化和细胞用胶原酶部分消化细胞;无论是在24孔板中生长。 Y轴是在24孔细胞培养板成功增殖EECS的井数。数据以平均值±SEM。分析由配对t检验来确定。 P <0.0001。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2. EECS细胞生长性能部分酶消化后 。增殖率通过细胞存活力测定法检测。该测定包含刃天青，具有微弱的荧光和刃天青蓝色化合物还原在进入细胞试卤灵。活细胞连续转换刃天青到试卤灵，增加周围细胞的介质的总荧光和颜色。在含有在600nm正常化570nm处吸光度检测活细胞。数据以平均值±SEM。分析通过双向ANOVA和Bonferroni后检验（;胶原酶+分散酶组n = 11胶原酶组n = 10）来确定。 * P <0.05，** P <0.01，*** P <0.001。 请CLI这里完蛋查看此图的放大版本。
图3.培养EECS的形态。经过4天的潜伏期，EECS有福尔马林固定和油红O染色后检测到脂肪细胞样外观。从左至右依次为：EEC在明场与放大100倍，在200倍明场和200倍与油红O和苏木染色后。在最左边图中左边的黑点是部分消化的内胚层（膜）。比例尺代表200微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4. SOAT1横贯与环磷酸腺苷活化处理EECS的cription，我们处理与EECS 5天24小时增加IBMX浓度或毛喉素。我们从提取处理的细胞的mRNA并通过逆转录聚合酶链反应转换的RNA成cDNA。我们分析了通过实时定量PCR的转录水平。 β肌动蛋白被用来作为管家基因。数据以平均值±SEM。分析是通过单向ANOVA和Tukey的后测试（6）（*P≤0.05，**P≤0.01）。 IBMX是有竞争力的非选择性磷酸二酯酶抑制剂，其引起细胞内cAMP，激活PKA，抑制TNF-α和白三烯的合成，减少炎症和先天免疫和是一种非选择性的腺苷受体拮抗剂。毛喉素是真核腺苷酸环化酶的激活剂无处不在，常用来提高cAMP的水平。 请点击此处查看该figu的放大版本回覆。
图5.欧洲经济共同体的生长的五天的mRNA表达，然后与cAMP的活化剂治疗24小时。将cDNA的在图4中，使用由实时分析基因表达水平定量PCR。 β-actin作为管家基因，并担任内部控制。数据以平均值±SEM。分析是通过单向ANOVA和Tukey的后测试（n≤6）治疗比较的控制。 SREBP2，固醇调节元件结合蛋白2; LPL，脂蛋白脂酶; PLIN2，脂素-2。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
因为以前的培养系统只有有限的成功，需要一个更好的培养系统。日本鹌鹑YSM内胚层需要与蛋白水解酶如胶原酶松开细胞 - 细胞连接以实现在离体的外植体更好的生长性能的治疗。我们的数据显示，从局部消化处理的细胞数接种2天（ 图1）后，比从未消化的组织培养更大。因此，部分水解消化是改善从YSM细胞产量的关键步骤。
在当前的文化协议的关键修改是部分水解消化。这种治疗方法大大提高了电池的产量并获得现场EECS的成功率。消化时间是非常关键的，因为过度消化将从组织分离细胞和细胞不会附着到板，而下消化导致从较少细胞产量组织块。我们发现，30〜40分钟的消化使用上述的条件是最佳的。
目前的协议要求高的技术培训，以获得EECS。收集EECS的时间点的限制，例如，我们只在5天胚胎收集EECS的原因是，如禽胚胎生长，在卵黄囊薄膜层之间的连接更为复杂，它减少收集的成功率EECS。该协议可以用于获得早期胚胎EECS但不晚阶段的胚胎。它限制对晚期EECS直接研究的可能性。
SOAT1和脂蛋白脂肪酶，和脂质蓄积的表达是YSM 4,5,11，尤其是EECS的本质特征。在目前的研究中，SOAT1，LPL和脂素2（PLN2）mRNA表达在EECS高度表达，这表明该培养系统可以产生与正确的生理CHARACT细胞eristics。目前的技术生产的主要EECS量大。当我们使用了先前描述的过程9中 ，EEC文化的成功率在24孔，而当前的协议生成EECS在成功率接近100％细胞培养板约60％。
卵黄囊膜是吸收蛋白质，脂质，和从蛋黄胆固醇，从而作用在开发过程中从蛋黄转移营养素胚主要组织。胆固醇酯形成的主要的酶是SOAT1 11由于SOAT1当大量胆固醇酯化发生4在禽胚胎发育的后期阶段显着增加，我们使用SOAT1 mRNA表达作为标记基因用于评价培养的EECS的特性。我们证明了这个主要EEC文化系统产生预期的生理特点。因此，EEC培养系统可以是一个有价值的工具来研究胎集成电路脂质运输和澄清涉及禽胚胎发育过程中介在YSM养分利用基因的作用。
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Acknowledgments
资金目前的协议的发展特别是“目标为一流大学计划”国立台湾大学，台湾（授权ID-104R350144），以及台湾科学技术部（授权ID的支持：科技部104 -2313-B-002-039-MY3）。我们特别感谢中心国立台湾大学生物技术用于提供动物房和实验室空间，目前的研究。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco by Life technologies | 12800-017 10 X 1 L | For wash the EECs pellets |
| D-MEM/F-12 | Gibco by Life technologies | 12400-024 10 X 1 L | As the basal medium in culturing EECs |
| NBCS | Gibco by Life technologies | 16010-159 | As the supplyment serum in culturing EECs |
| Pen-Strep Ampho. Solution | BI (Biological Industries) | 03-033-1B 100 ml | For attenuating the possible infection |
| Collagenase Type IV | Gibco by Life technologies | 17104-019 1 g | Collagenase is a protease with specificity for the bond between a neutral amino acid (X) and glycine in the sequence Pro-XGly-Pro. As the protease for dissociation of cells from primary tissue. |
| 24-well plate | FALCON® | REF-353047 | For EECs to attach and extension |
| 50 ml PP centrifuge tubes | Corning® CentriStarTM | 430829 | For transportion of membranes and enzyme digestion |
| 50 ml Conical bottomed Tube with Cap | PRO TECH | CT-50-PL-TW | For transportion of membranes and enzyme digestion |
| Reciprocal shaking bath | DEAGLE | SB302 | For better enzymatic digestion on membranes |
References
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