Summary
Denne protokollen skisserer fabrikasjon av en storstilt, multiplekset todimensjonal DNA eller antistoff array, med potensielle bruksområder i cellesignale studier og biomarkør gjenkjenning.
Introduction
Antistoff mikromatriser har blitt mye brukt i proteomikk studier i flere tiår for å undersøke tilstedeværelse av målrettede proteiner, inkludert protein biomarkører 1-3. Selv om dette feltet er i dag overfor store utfordringer fra andre high-throughput teknologier som massespektrometri (MS), er det fortsatt god plass for nytten av antistoff mikromatriser, hovedsakelig fordi disse enhetene råd enkel tolking og enkelt grensesnitt med andre analyser. I de senere årene har integreringen av mikromatriser inn microchip stillaser gitt antistoffet microarray en ny mulighet til å trives 4-7. For eksempel har strekkode microarray integrert i en encellet mikrobrikke blitt brukt i celle kommunikasjon studier 8,9. Denne teknologien har særegne fordeler fremfor andre tilgjengelige microarray teknologi. Det har array elementer på 10-100 mikrometer, mye mindre enn den typiske 150 mikrometer størrelsen som brukes i konvensjonelle microarray elets. Konstruksjonen av mindre oppstillingselementene oppnås ved hjelp av systematiske strømningsmønster nærmer seg, og dette gir opphav til kompakte mikromatriser som kan oppdage encellet utskilte proteiner og intracellulære proteiner. En annen fordel er bruken av en enkel, instrument-fri oppsett. Dette er spesielt viktig, fordi de fleste laboratorier og små selskaper ikke kan være i stand til å få tilgang microarray kjernefasiliteter. En slik strek antistoff mikromatriser funksjonen forbedret assay gjennomstrømming, og kan brukes til å utføre analyser på multipleksede meget enkle celler samtidig oppnå høy sensitivitet og spesifisitet sammenlignes med den for konvensjonell sandwich-enzymbundet immunosorbent assay (ELISA 8). Denne teknologien har funnet en rekke programmer for å påvise proteiner fra glioblastom 9-11, T-celler 12, og sirkulerende tumorceller 13. Alternativt strekkode DNA-mikromatriser alene er blitt anvendt i nøyaktig posisjonering av neuroner og astrocytter for mimicking in vivo sammenstillingen av hjernevev 14.
Denne protokollen fokuserer bare på de eksperimentelle skritt og bygge opp blokker av to-dimensjonale (2D) strekkode antistoff microarray som har potensielle bruksområder i påvisning av biomarkører i fluidic prøver og i enkeltceller. Teknologien er basert på et adresserenkeltrådet, endimensjonale (1-D) DNA microarray konstruert ved hjelp av ortogonale oligonukleotider som er mønstret romlig på glass underlag. Den 1-D mønsteret er dannet når parallelle strømningskanaler blir brukt i strømningsmønstertrinn, og et slikt mønster fremstår som adskilte bånd visuelt ligner på en D-Universal Product Code (UPC) strekkoder. Konstruksjonen av et 2-D (n x m) antistoff-gruppe - som minner om en 2-D Rask respons (QR) matrise-kode - behov for mer kompliserte mønster strategier, men gjør det mulig for immobilisering av antistoffer på en høyere tetthet 8,15. Fabrikasjonkrever to DNA mønstringstrinn, med det første mønsteret vinkelrett på den andre. Krysningspunkt mellom disse to mønstrene danner de n x m elementene i matrisen. Ved strategisk å velge sekvensene av enkelt-trådet DNA (ssDNA) anvendes i flow-mønster, blir hvert element i en gitt matrise tilordnes en bestemt adresse. Denne romlige referanse er nødvendig å skille mellom fluorescenssignaler på microarray lysbildet. SsDNA matrisen omdannes til et antistoff matrise gjennom inkorporering av komplementære DNA-antistoff-konjugater, som danner en plattform som kalles DNA-kodede antistoff-bibliotek (DEAL 16).
Denne videoen protokollen beskriver de viktigste trinnene i å skape NxM antistoff arrays som inkluderer forbereder polydimethylsiloxane (PDMS) strekkode muggsopp, flow-mønster ssDNA i to retninger, forbereder antistoff-oligonukleotid DEAL konjugater, og konvertere den 3 x 3 DNA array i et trex 3 antistoff array.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Forsiktig: Flere kjemikalier som brukes i denne protokollen er irriterende og er farlig ved ved hudkontakt. Konsultere sikkerhetsdatablad (MSDS) og bruke egnet verneutstyr før du utfører denne protokollen. Piraja oppløsning som anvendes i trinn (1.1.1) er sterkt etsende, og må fremstilles ved tilsetning av peroksyd sakte til syren under omrøring. Håndtere denne løsningen med ekstrem forsiktighet hos en avtrekkshette. Bruk egnet øyebeskyttelse og syrefaste hansker. Trimetylklorsilan (TMCS) er et etsende, brannfarlig kjemikalie som brukes i et valgfritt trinn etter (1.1.6). Håndtere dette stoffet i en avtrekkshette.
Merk: Utfør strekkode lysbilde fabrikasjon og kritiske flow-mønstrings prosedyrer i et rent rom for å redusere forurensning av svevestøv. Støvpartikler kan blokkere porter og microchannels av PDMS muggsopp og forstyrre flyten-mønster.
1. Bygging av One-dimensional DNA Barcode Slide
- Klargjøring av SU-8 master for strekkode strømningsmønstrene
Merk: Tegningene for de vinkelrette strømningsmønster (figur 1A-B) er opprettet ved hjelp av en dataassistert konstruksjon (CAD) programvare. Disse mønstrene er gjengitt på en krom fotomaske. Gjennomsiktige områder av masken tilsvarer funksjonene i SU-8 mester.- Rengjøre en silisiumskive (100 mm diameter) grundig i en blanding av 3 H SO 2 4: 1 30% H 2O 2 (piraja løsning) oppvarmet til 96 ° C. Vask skiven med deionisert vann og isopropylalkohol, etterfulgt av tørking med en nitrogenblåsepistol.
- Hell ca 4 ml av SU-8 2025 fotoresist på wafer. Bruk en programmerbar spin coater for jevnt å spre fotoresist på silikonskiven for 10 sekunder ved 500 rpm, og deretter 30 sekunder ved 3000 rpm. Dette skaper et fotoresist-lag med en tykkelse på ~ 25 pm. Gradvis lar spinner å bremse ned før du stopper - dette er til Maintain et jevnt belegg på skivens overflate.
- Bake den belagte platen på en kokeplate i 1 min ved 65 ° C, deretter i 5 minutter ved 95 ° C. I dette trinnet kan belegget stivne. Avkjøl til RT i 5 min.
- Plasser krom maske (figur 1C) på fotoresist strøk. Expose masken funksjoner til nær-UV lys (350-400 nm, eksponering energi 150-160 mJ / cm 2) i 20 sekunder.
Merk: design på krom masken inneholder 20 kanaler, som hver er 20 mikrometer brede med 50 mikrometer banen. Kanalene er viklingen fra den ene ende av mønsteret til den motsatte enden. Alt i alt har de 20 kanaler omfatter et rektangulært område med en lengde på ~ 40 mm og en bredde på ~ 20 mm. Hver kanal er flankert av to sirkulære egenskaper som tilsvarer et innløp og et utløp. Innløp og utløp er utskiftbare. - Bake den eksponerte platen på en kokeplate i 5 minutter ved 95 ° C. Kult å RT gradvis.
- Senk wafer i SU-8 utvikler med agitasjoni 5 min. Vask skiven med en liten porsjon av frisk SU-8-utvikler, etterfulgt av isopropylalkohol. Tørk wafer ved hjelp av en nitrogen blåserør. Hard-bake skiven på en 200 ° C varmeplate i 30 minutter, og la skiven avkjøles gradvis til romtemperatur.
Note: Utvikling kan utføres i lengre tid hvis en hvit film observeres etter vasking i dette trinnet.
Valgfritt: Silanize SU-8 herre ved å utsette den for trimetylklorsilan damp i en lukket petriskål for 10 min.
- Klargjøring av PDMS strekkode mold
- Kombiner 40,0 g silikon basen med 4,0 g herder. Rør prepolymerblandingen kraftig i 10 min. Degas for 20 min under vakuum.
Merk: Som en generell regel bør du bruke en 10: 1 (base: herder) masseforhold. - Hell prepolymeren i en petriskål inneholdende en silisiumskive med SU-8 herre over strekkodemønsteret. Høyden av PDMS blandingen bør være omtrent 7,5 mm eller mer. Avgasse blandingen i Petri fatet for en andre gang for å fjerne eventuelle gjenværende bobler, deretter bake blandingen i 1 time ved 75 ° C for å tillate PDMS å herde.
Merk: Det er viktig å opprettholde nok tykkelsen på PDMS skive på ~ 7,5 mm eller høyere for å unngå å legge for mye spenning til PDMS-glass obligasjon ved innføring av pins / slange gjennom hull i PDMS mold i trinn (1.3.3.1) - Ved hjelp av en skalpell, må du kutte rundt området av PDMS skive som inneholder strekkode mold funksjoner og skrelle skive fra wafer.
- Trimme kantene av platen for å oppnå den ønskede formen av PDMS strekkoden formen. Punch 20 hull (1,0 mm diameter) gjennom formen ved hjelp av en biopsi punsj med stempelet. Sørg for at hullene er på linje med de sirkulære funksjoner i strekkoden mønster. Disse hullene tjene som innløp og utløp.
- Kombiner 40,0 g silikon basen med 4,0 g herder. Rør prepolymerblandingen kraftig i 10 min. Degas for 20 min under vakuum.
- En-dimensjonal fordelingen av poly-L-lysin (PLL)
- Fjerne støv på overflaten av et poly-L-lysin-belagt glassplate ved hjelp av en nitrogen blåserør. Attach PDMS mold til rent glass lysbilde. Pass på at kantene på formen og raset er justert.
- Stek i 1,5 timer ved 75 ° C for å styrke bindingen mellom PDMS formen og PLL-belagte objektglasset. I mellomtiden fremstille 20 stykker av fleksibelt polyetylen-rør (3 til 4 tommer stykker, med en indre diameter på 0,5 mm og en ytre diameter på 1,5 mm).
Merk: Antallet biter av rør svarer til antallet av innløpene i PDMS strekkoden formen. Slangen tjener til å koble de kanaler på PDMS strekkode formen til en nitrogengasstank er utstyrt med en trykkregulator. - Til den ene ende av hver slange, feste en rustfri stål hul tapp (1-mm diameter). Aspirer sterilfiltrert poly-L-lysin løsning gjennom tappen, inntil minst 1 cm av slangen er fylt med oppløsningen.
- Fest pinnene (koblet til løsning fylte rør) til inntakene av PDMS strekkode mold (figur 1E). Feste den andre enden av rørene for åen trykkregulert tank nitrogen satt opp. Tillat oppløsningen å strømme inn i støpeformen ved hjelp av et trykkområde fra 0,5 til 1 MPa i minst 6 timer.
Merk: Se trinn (1.3.3) for alle flow-mønstrings prosedyrer.
- Fest pinnene (koblet til løsning fylte rør) til inntakene av PDMS strekkode mold (figur 1E). Feste den andre enden av rørene for åen trykkregulert tank nitrogen satt opp. Tillat oppløsningen å strømme inn i støpeformen ved hjelp av et trykkområde fra 0,5 til 1 MPa i minst 6 timer.
- Endimensjonal fordelingen av ssDNA 14
Merk: fosfatbufret saltvann (PBS) som benyttes i etterfølgende trinn fremstilles fra 137 mM NaCl, 10 mM Na HPO 2 til 4, og 2 mM KH 2PO 4. pH av bufferen er 7,4.- Forbered 2mM bis (sulfosuccinimidyl) suberat (BS3) løsning i PBS. Forbered 300 uM oppløsninger av A, B, C og ssDNA (5'-amin-modifisert, 80 nukleotider) i PBS eller i ultrarent vann.
Merk: Bruk BS3 løsning innen ca 30 min etter tilberedning fordi N hydroksysuccinimid ester lett gjennomgår hydrolyse. - Kombiner 2,5 pl av 300 pM A, B, C eller ssDNA med 2,5 ul 2 mM bis (sulfosuccinimidyl) suberat i PBS i hver kanal. A, B og C er betegnet DNA til kanaler 1, 2, og 3, henholdsvis. Denne ordren er også brukt til gjenværende sett på 3 kanaler (Figur 2A).
- Utfør trinn (1.3.3). Denne gangen, bortsuging av 5-pl BS3 / DNA oppløsningene gjennom rustfrie stålbolter og inn i polyetylenrør, og deretter kople PDMS formen til nitrogenkilden. Tillat den BS3 / DNA-oppløsning til å strømme gjennom strekkoden formen i ca 40 minutter eller inntil i kanalene er fylt.
- Stoppe strømmen når alle kanalene er fylt, så inkuber BS3 / DNA-oppløsning i strekkoden ved RT i 2 timer. Ikke la oppløsningen tørke opp. Bake PDMS mold med vedlagt strekkode sklie for en time ved 75 ° C.
Merk: For å lette reguleringen i de etterfølgende strømningsmønstringstrinn, kan kantene av kanalmønsteret på strekkoden glide bli beskrevet. Dette blir gjort ved forsiktig skraping av glassoverflaten ved hjelp av en diamant SCRIBe til å generere justeringsmerker på bunnen av glass-slide. Justering i senere stadier av protokollen kan kontrolleres under et mikroskop. - Fjern PDMS mold fra strekkoden lysbildet. Vask raset forsiktig med 0,01% SDS gang og tre ganger med ultrarent vann.
- Tørk strekkode lysbildet bruker et objektglass spinner. Oppbevar strekkoden lysbilde i en ren 50-ml sentrifugerør for senere bruk.
- Forbered 2mM bis (sulfosuccinimidyl) suberat (BS3) løsning i PBS. Forbered 300 uM oppløsninger av A, B, C og ssDNA (5'-amin-modifisert, 80 nukleotider) i PBS eller i ultrarent vann.
2. Validering av den endimensjonale Mønster på Barcode Slide
Merk: Denne validering protokollen kan også tilpasses for bruk i å vurdere kvaliteten på de påfølgende flyt mønster trinn.
- Blokkering av raset
- Forbered 1% bovint serumalbumin (BSA) i PBS. Filtrer løsningen gjennom et 0,45 um sprøytefilter før bruk. Ved hjelp av en gel-lasting spiss, anvende 50 ul 1% BSA-oppløsning til en kant av strekkoden lysbildet.
- Inkuber 1% BSA solution i 1 time ved RT.
- Inkubasjon med cyanine 3 (Cy3) -konjugert komplementær DNA
- Forbered en cocktail av A ', B' og C 'oligonukleotider konjugert til Cy3 i den ene enden. Sekvensene til A ', B' og C 'er komplementære til de av A, B og C, henholdsvis. Arbeids Konsentrasjonen av Cy3-DNA er 0,05 uM i 0,1% BSA.
- Fjern BSA løsning fra raset ved pipettering, deretter bruker 30 mL av DNA cocktail løsning på samme kanten av rasgropa. Inkuber Cy3-DNA cocktail på sleiden ved RT i 1 time. Utfør denne innkuberingstrinn i mørket for å beskytte Cy3 del fra fotobleking.
- Analyse av fluorescensintensitet
- Pipette ut Cy3-DNA cocktail og vaske raset i 1% BSA, PBS, og til slutt i fortynnet PBS (1 part PBS med 50 deler ultrarent vann). Tørk lysbildet ved å bruke en spinner.
- Observer fluorescens (figur 2B) med en fluorescens mikroskop eller en microarray scanner. Når du bruker en microarray scanner, sett laseremisjonsbølgelengden til 532 nm, pikselstørrelse på 5 mikron, fotomultiplikatorrør (PMT) gevinst på 450 og kraft på 15%.
3. Fremstilling av den to-dimensjonale (3x3) DNA Array 14
- Klargjøring av PDMS strekkode mold
- Utfør prosedyren (1,1) for å konstruere en annen SU-8 master, men denne gang å bruke en krom maske med et strømningsmønster vinkelrett på den til den første utforming. Utfør prosedyren (1,2) for å konstruere en ny PDMS formen med den vinkelrette mønsteret.
- To-dimensjonal strømning fordelingen av ssDNA
- For en 3 x 3 matrise, forberede 150 mikrometer stamløsninger av A'-i, B'-ii, c'-III, A'-IV, B'-V, C'-vi, A'-vii, B'-viii, og C'-ix DNA i 3% BSA / PBS. Disse oligonukleotider tjene som "bridging sekvenser" (Figur 2A). Kombiner de oligonukleotid-løsninger og løsninger (1 til 3), slik at arbeidskonsentrasjonen er 50 um for hvert oligonukleotid. Bruk guiden gitt i tabell 1.
- Strømnings 3% BSA / PBS-blokkeringsløsning i alle 20 kanalene i 1 time ved 0,5-1 psi.
- Flow Solutions 1, 2, 3 og inn i kanaler 1, 2, og 3, henholdsvis. Følg denne rekkefølgen for de påfølgende settene med 3 kanaler. Flow blir gjort i rundt 40 min. Inkuber DNA-løsninger ved RT i 2 timer for å tillate DNA for å hybridisere.
- Strømnings 3% BSA / PBS-blokkeringsløsning i alle 20 kanalene i 1 time ved 0,5-1 psi for å fjerne ikke-hybridisert DNA. Trekk av PDMS skive, og vaske den resulterende DNA microarray lysbildet ved å dyppe glass gli inn 3% BSA / PBS gang og PBS to ganger, etterfulgt av fortynnet PBS (1 del PBS og 50 deler ultrarent vann). Dry lysbildet bruker et objektglass spinner.
- Utfør en andre validerings trinn (Figur 2C) tilsvarende som i § 2. Bruk oligonukleotider i 'til IX "som er Cy3-konjugert. Oppbevar 3 x 3 matrise lysbilde i et 50 ml sentrifugerør for senere bruk.
Merk: DNA mikroarray kan oppbevares ved romtemperatur i en eksikator i flere måneder.
4. Omdannelsen av 3 x 3 matrise DNA inn i en antistoff Array
- Utarbeidelse av antistoff-oligonukleotid (DEAL) konjugater
- Fremstille oppløsninger av 200 mM succinimidyl-4-formylbenzoat (S-4FB) og 40 mM succinimidyl-6-hydrazinonicotinamide (S-HyNic) i vannfritt N, N-dimetylformamid (DMF).
- Forbered deg opp til 7 separate løsninger av fangst antistoffer (1 mg / ml) i PBS.
Merk: Hvis antistoff stamløsninger inneholder natriumazid bakteriostat, utføre buffer utveksling med PBS bruker spin avsalting columns med 7 kDa molekylvekt cut-off (MWCO). - Utarbeide egne 400 mikrometer løsninger for jeg ', ii', iii ', iv', v ', vi ", og vii' DNA. Gi hver fangst antistoff mot én oligonukleotidsekvens. Kombiner 40 ul 400 mikrometer DNA med 12,25 mL av DMF i Mikrosentrifugerør og spinne ned til bland godt.
- Til hver DNA / DMF løsning, tilsett 2,3 mL 200 mM S-4FB i DMF. For hver 100 mikrogram av fangst antistoff, tilsett 2,25 mL av 40 mM S-HyNic i DMF.
- Inkuber antistoff / S-HyNic og DNA / S-4FB løsninger i 4 timer ved RT.
- I forberedelse til antistoff-DNA-koblingsreaksjon, fremstille nye spinnavsaltings kolonner (en for hver DNA-løsning og en for hvert antistoff) ved å vaske dem med citrat-buffer ved pH 6.
- Etter 4 timers inkubering, utfører bufferbytte for hvert antistoff / S-HyNic og DNA / S-4FB løsning. Kombinere S-4FB-konjugert
- Inkuber reaksjonen O / N ved 4 ° C.
- Rensing av antistoff-oligonukleotid (DEAL) konjugater
Merk: For å rense antistoff-oligonukleotid konjugater, utføre rask protein væskekromatografi (FPLC) på en standard FPLC system utstyrt med en Superose 6 10/300 GL kolonne.- Still bølgelengde UV-detektor av FPLC-systemet til 280 nm. Bruk isokratisk strøm av PBS (pH 7,4) ved 0,3 ml / min for å separere antistoff-oligonukleotid-konjugater fra overskuddet av S-4FB-DNA.
- Pool fraksjonene inneholdende konjugatet og konsentrer fraksjonene til et volum på 150 ul ved bruk av ringfiltre med en 10 kDa MWCO.
- To-dimensjonale mønster av antistoffer
- Forberede en ny PDMS mold med microchambers eller mikrobrønner ossing fremstillingsfremgangsmåtene i trinn (1.2). PDMS mold kan inneholde mikroliter til nanoliter brønner for immunoassays.
Merk: For generell biomarkør deteksjon i fluidprøver, er en PDMS mold med flere brønner parret med array lysbilde. Funksjonene i PDMS mold avhenger av systemet som studeres. For eksempel kan deteksjon av proteiner fra enkeltcelleforsøk utføres med en PDMS form inneholdende microchambers med 0,15-nl volumer. - (Valgfritt) Utsette PDMS mold til plasma rengjøring (18 W) for 1,5 min å treffe sin mønstret overflate hydrofil. Før plasma rengjøring, bruke teip for å blokkere alle andre overflater som vil bli direkte bundet til 3 x 3 matrise lysbilde.
Note: Trinn (4.3.2) er valgfritt, men er vanligvis utført når PDMS formen er beregnet for bruk i enkeltcelleforsøk. - Mate PDMS mold med 3 x 3 matrise sklie, deretter blokkere lysbilde med 1% BSA i PBS. Inkuber i 1 time ved RT. Meanwhile, utarbeide en cocktail (200 mL endelig volum) av antistoff-oligonukleotid konjugater. Arbeids konsentrasjonen av hvert konjugat er 10 ug / ml i 1% BSA / PBS.
- Tilsett antistoff-oligonukleotid-cocktail, deretter inkuberes i 1 time ved 37 ° C for å tillate oligonukleotid-delen av konjugatene for å hybridisere med spesifikke steder på 3 x 3 oppstillinger, for derved å omdanne DNA matrisen for et antistoff matrise.
- Gjenta trinn (3.2.4) for å rengjøre og tørke raset. Den høyeste følsomhet kan oppnås hvis antistoffet matrisen blir brukt umiddelbart. Langvarig lagring kan føre til tap av sensitivitet.
- Forberede en ny PDMS mold med microchambers eller mikrobrønner ossing fremstillingsfremgangsmåtene i trinn (1.2). PDMS mold kan inneholde mikroliter til nanoliter brønner for immunoassays.
- Påvisning av proteiner
- Rekonstituere rekombinante proteiner eller forberede en filtrert celleprøve.
- Mate microarray med en spesialdesignet chip, og blokkere overflaten med 3% BSA i PBS i 1 time. Deretter fjerner BSA løsning, og gjelder prøver og inkuberes i 2 timer.
- Vask av prøvene ved å bruke 3% BSA i PBS tre ganger, end deretter legge deteksjons antistoffer i en konsentrasjon levert av produkt datablad. Inkuber i 2 timer.
- Vask av deteksjons antistoffer med 3% BSA i PBS tre ganger, og deretter legge cyanine 5 (Cy5) -streptavidin 1 mikrogram / ml, etterfulgt av inkubasjon i 1 time.
- Gjenta trinn (3.2.4) for å rengjøre og tørke lysbildet for skanning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Motivene for PDMS muggsopp (figur 1A-1B) ble trukket ved hjelp av et CAD-program (AutoCAD). To design vist har kanaler for flyt mønster, en horisontal og en vertikal. Til venstre og høyre del av hver design er symmetrisk; noen av dem kan være innløp eller utløp. Hver av kanalene 20 er viklingen fra den ene ende helt til den andre enden. Hvert design er trykt på en krom fotomaske (figur 1C). Den fremstilte SU-8 Hoved på en skive er vist i figur 1D. For å lette flyten-fordelingen av PLL eller DNA, ble PDMS formen koplet til en nitrogengasstrøm satt opp (figur 1E).
Det er tre strømningsmønstringstrinn som benyttes i denne protokollen. Det første trinnet immobiliserer PLL på glassubstratet, mens de etterfølgende trinnene begge innføre oligonukleotid-løsninger. I tabell 1 er oligonucleotide sammensetninger av Solutions 1-3 er gitt. Arbeids konsentrasjonen av hvert oligonukleotid er 50 uM, og det totale volum av hver løsning er 39 pl. Disse oppløsninger fremstilles ved å kombinere 13 ul av hver oligonukleotid-stamløsning (150 uM).
De mønstrede DNA microarray enheter er repeterende og tilstøtende over hele glass lysbilde. For 3 x 3 mikromatriser er maksimal tetthet rundt 400.000 flekker på ett glass lysbilde. Side-by-side-sammenligning med kommersiell DNA microarray avslører at vår teknologi er ca 5 ganger mer følsom når binding til Cy3 tagget komplementære DNA. De mønstrede DNA er relativt ensartet med ~ 5% variasjon på tvers av flere repetisjoner. Disse funksjonene lover høy kvantifisering evne til vår teknologi ved måling proteininnhold fra biologiske prøver. I tillegg ortogonaliteten av DNA i kombinasjon med strømningskanalen utformingen gir den flexibility av mønster i en rekke forskjellige geometrier (figur 2D).
Etter omdannelse av DNA matrisen inn i et antistoff matrise gjennom hybridisering med DNA-antistoff-konjugater (figur 3B), er det resulterende antistoff Platen for multiplekset deteksjons, hovedsakelig gjennom sandwich-ELISA-plattform som vist i figur 3C. I sandwich-ELISA, biotinylerte gjenkjenning (sekundære) antistoffer binde seg til de fangede proteiner, og påfølgende merking med fluorophore-konjugert streptavidin åpner for fluorescens-basert gjenkjenning (Figur 3C-E). Påvisning av proteiner viser <10% variasjon fra den ene enden til den andre enden av glass-slide (figur 3D). Med 3 x 3 matrise, er vi i stand til å registrere opptil 7-proteiner, mens tilordne en gruppeelement som referanse (Cy3 merket) og et annet element som negativ kontroll. For eksempel, i en enkelt-celle eksperiment utført fortumorstudier, proteinene interleukin-6 (IL-6), matrise metallopeptidase 9 (MMP9), hepatocytt-vekstfaktor (HGF), vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF), interleukin-8 (IL-8), og makrofag migrerings inhiberende faktor (MIF) fra en enkelt celle kan detekteres samtidig (figur 3E).
Vi har også kalibreres systemet ved hjelp av rekombinante proteiner i forskjellige konsentrasjoner. I figur 3F, kalibreringskurver for rekombinante proteiner interferon-γ (IFN-y), tumornekrosefaktor α (TNF-a), interleukin-13 (IL-13), tumornekrosefaktor β (TNF p), granzyme B, interleukin 4 (IL-4) og interleukin-8 (IL-8) er vist. Følsomheten for deteksjon er ganske lik den for konvensjonelle sandwich-ELISA på brønnplater, selv med høyere innhold av DNA, og muligens antistoffer på substratet.
Strekkoden antibody microarray kan brukes til å detektere biomarkører i fluidic prøvene så vel som i enkeltceller. Siden encellede analyse er ikke fokus for denne protokollen, vi bare eksemplifisert anvendelsen av 3 x 3 antistoff microarray i deteksjon av cytokiner. Ved antistoff-interaksjoner overflatemarkør, klynge av differensiering 8 (CD8) -positive celler ble fanget opp på en av de mikromatriseelementene (figur 3G, en PDMS brikke på toppen), og resten av elementene ble brukt til å påvise utskilt cytokiner ( Figur 3 H). Med denne celle capture metoden, "cellearrangementer" kan dannes. Denne rekken fange teknikken tillater også kontroll over antall celler som er utsatt for ELISA hvert eksperiment. Cellene ble fysisk isolert i microchambers, slik at de detekterte proteinene gjaldt bestemte enkeltceller. I figur 3 H, er det vist at hver mikrokammeret er utstyrt med 16 mikroarray elementer for å sikre innkapsling aven komplett 3 x 3 microarray sett.
Figur 1. Design og fabrikasjon av PDMS strekkode former for flyt-basert DNA mønster. Panel (A) viser AutoCAD tegninger for horisontale og vertikale endimensjonale strekmønstre. Panel (B) viser de overlagrede horisontale og vertikale strekmønstre fra (A). Grønne bokser vedlegge områder mønstret med diskrete 3 x 3 arrays. (C) Chrome maske for å fabrikkere SU-8 mester. (D) SU-8 Hoved fremstilt på en silisiumskive. (E) Oppsett for flyt mønster. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Konstruksjon og validering av en 3 x 3 DNA array. Dette tallet har blitt forandret fra "quantitating Cell-Cell Interaksjons funksjoner med Søknader til glioblastoma multiforme kreft celler," av Wang, J. et al., 2012, Nano Lett 12 . Copyright 2012 av American Chemical Society. Tilpasset med tillatelse. (A) Scheme for DNA-flow-mønstrings trinn. (B) Fluorescens intensitet profilen til 20 kanaler i et valgt område (spores av en vertikal linje) av 1D strekkode. Cy3-konjugert oligonukleotider ble hybridisert med DNA arrays for validering. (C) Fluorescens intensitet profilen til arrays validerte med Cy3-konjugert DNA etter fullført andre DNA mønster trinn. (D) Alternative fluorescerende mønstre fra forskjellige flow-mønstrings strategier. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Anvendelser av 3 x 3 microarray. (A) Skjema for syntese av antistoff-oligonukleotid DEAL konjugater. (B) Reaksjonsskjema for omdannelsen av DNA matrisen inn i et antistoff matrise gjennom hybridisering med antistoff-oligonukleotid-konjugater. (C) Reaksjonsskjema for anvendelse av 3 x 3 microarray i en sandwich-ELISA-plattform. Dette tallet har blitt forandret fra "quantitating Cell-Cell Interaksjons funksjoner med Søknader til glioblastoma multiforme kreft celler," av Wang, J. et al., 2012, Nano Lett 12. Copyright 2012 av American Chemical Society. Tilpasset med tillatelse. Panel (D) viser en fluorescens avlesning generert under en Cy5 kanal. Dette tilsvarer en sandwich ELISA eksperiment som detekteres 6 proteiner. Panel (E) er en zoomet inn profilen til en 3 x 3 matrise avlesning henhold Cy3 og Cy5 kanaler. Panel (F) viser de sandwich-ELISA-kalibreringskurver for rekombinante proteiner. Panel (G) viser en "celle array" dannes ved å fange celler ved binding til antistoffer på matrisen. Panel (H) viser deteksjonsresultatet lagret med microchambers i en mikrochip. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Løsning | Oligonukleotid Sammensetning | A'-i, B'-ii, C'-iii |
| 2 | A'-iv, B'-v, C'-vi |
| 3 | A'-vii, B'-viii, C'-ix |
Tabell 1. Sammensetning av Solutions 1-3 for DNA-Flow Mønstring.
| Forankrings sekvenser | |
| EN | ATCCTGGAGCTAAGTCCGTA-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-ATCCTGGAGCTAAGTCCGTA-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA |
| B | GCCTCATTGAATCATGCCTA-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-GCCTCATTGAATCATGCCTA- |
| AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA | |
| C | GCACTCGTCTACTATCGCTA-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-GCACTCGTCTACTATCGCTA-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA |
| Bridging sekvenser | |
| A'-i | TACGGACTTAGCTCCAGGAT-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-ATGGTCGAGATGTCAGAGTA |
| B'-ii | TAGGCATGATTCAATGAGGC-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-ATGTGAAGTGGCAGTATCTA |
| C'-iii | TAGCGATAGTAGACGAGTGC-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-ATCAGGTAAGGTTCACGGTA |
| A'-iv | TACGGACTTAGCTCCAGGAT-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-GAGTAGCCTTCCCGAGCATT |
| B'-v | TAGGCATGATTCAATGAGGC-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-ATTGACCAAACTGCGGTGCG |
| C'-vi | TAGCGATAGTAGACGAGTGC-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-TGCCCTATTGTTGCGTCGGA |
| A'-vii | TACGGACTTAGCTCCAGGAT-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-TCTTCTAGTTGTCGAGCAGG |
| B'-viii | TAGGCATGATTCAATGAGGC-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-TAATCTAATTCTGGTCGCGG |
| C'-ix | TAGCGATAGTAGACGAGTGC-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-GTGATT AAGTCTGCTTCGGC |
| Cy3-konjugert oligonukleotider for validering | |
| EN' | TACGGACTTAGCTCCAGGAT |
| B ' | TAGGCATGATTCAATGAGGC |
| C ' | TAGCGATAGTAGACGAGTGC |
| jeg' | TACTCTGACATCTCGACCAT |
| ii ' | TAGATACTGCCACTTCACAT |
| iii ' | TACCGTGAACCTTACCTGAT |
| iv ' | AATGCTGGGGAAGGCTACTC |
| v ' | CGCACCGCAGTTTGGTCAAT |
| VI ' | TCCGACGCAACAATAGGGCA |
| vii ' | CCTGCTCGACAACTAGAAGA |
| viii ' | CCGCGACCAGAATTAGATTA |
| ix ' | GCCGAAGCAGACTTAATCAC |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Strømningsmønsteret utforming er den første kritiske trinn i fremstilling av 2-D microarray. For å generere to overlappende DNA-mønster på et glass-substrat, bør kanal trekk ved den første konstruksjon være vinkelrett på de i den andre (Figur 1A-B). Designene også vurdere nedstrøms anvendelser av microarray. I tilfelle av enkeltcelleanalyse, blir brukt til å detektere mikromatriseproteiner fra enkeltceller innesluttet i microchambers derfor dimensjonene kanal gjøres forenlig med de microchambers som samsvarer med de to-D-matriser. Hver utforming er gjengitt på en fotomaske og standard fotolitografisk teknikker er brukt for å fremstille kanalfunksjoner i SU-8 på en silisiumskive (figur 1C-D). Dette fungerer som master for støping PDMS. Når formen er blitt fremstilt, blir den bundet til et PLL-belagte lysbilde og deretter kombinert med en nitrogengasstrøm satt opp (figur 1E). Opplegget vibruken er enkel og har den fordel av å være lett tas med i ethvert laboratorium med en trykkregulert nitrogengasskilde. Vi bruker en forsamling av billige flere 3-veis ventiler koblet til en nitrogengass tank. Luftstrømmen for mønstring må opprettholdes på lave trykk (0,5-1 psi) for å unngå delaminering av glass-slide fra formen. Lekkasjer innen PDMS mold kan kompromittere integriteten av mønstrene.
DNA strømningsmønstrings trinnene i denne protokollen utnytte ssDNA med nøye utvalgte ortogonale sekvenser (Figur 2A). Før flyte-mønster, bør de unike sekvenser på disse oligonukleotider testes for fravær av krysstale. En enkel test for krysstale er gjort ved å modifisere valideringsprosedyren introduserer vi i våre protokollen (trinn 2). I stedet for å bruke en blanding av Cy3-merket komplementært DNA, er bare én type av komplementære sekvens som ble brukt ved en tid for et valgt område av lysbildet på hvilken multipleDNA-sekvenser er immobilisert. I fravær av DNA krysstale, bør kun en stripe (for 1-D-DNA array) eller en base (for den 2-D matrise DNA) bli Lysrør i henhold til et Cy3 filter. Eksempler på grundig validerte ortogonale sekvenser kan finnes i tabell av materialer og utstyr. Den første DNA mønster skritt introduserer tre typer "anker" oligonukleotider. Disse 80-nt-sekvenser består av to 20-mer poly-A-områder som veksler med to unike 20-mer sekvenser. 5'-amin modifikasjon på følgende ankersekvenser som er nødvendig for amin-til-amin-tverrbindings 17 med PLL mediert av BS3. Den andre DNA-mønster trinn krever ikke et tverrbindingsmiddel. Dette trinnet introduserer "bygge bro" oligonukleotider som delvis hybridiserer med anker sekvenser. Hver 60-nt brodannende sekvens består av en 20-mer som er komplementær til en region ankersekvens, en 20-mer poly-A avstandsstykke, og en unik 20-mer-sekvensen. Validering av DNA arrays (Figure 2B-C) blir utført etter hver DNA-flow-mønster trinn for å vurdere kvaliteten av mønstringstrinn, og for å sikre at ingen kryss-forurensning 14. Dette utføres ved å innføre Cy3-konjugert oligonukleotid-prober som hybridiserer med DNA-mønstrene. Med parametrene som er angitt i trinn (2.3.2) for analyse av fluorescensintensitet, bør DNA-mønster oppviser fluorescens intensitet på minst 40000 au for å maksimalisere sensitiviteten til nedstrøms immunoanalyser utføres ved bruk av microarray. Strategisk bruk av forskjellige Cy3-DNA sett under valideringen gir opphav til alternative mønstre (figur 2D), noe som viser fleksibiliteten av DNA-mønster trinn 8. Unnlatelse av å oppnå ensartede mønstre kan oppstå ved lekkasjer eller mekaniske hindringer (for eksempel støvpartikler) oppstått i flow-mønstrings trinn.
Utarbeidelse av antistoff-oligonukleotid DEAL konjugater er et annet viktig skritt i ther protokollen. Valget av antistoffer er diktert av det biologiske system som studeres. De oligonukleotider som brukes i konjugering skal ha sekvenser komplementære til de som er forankret på DNA matrisen. Lager løsninger av S-4FB og S-HyNic linkere skal tilberedes og holdt unna fuktighet for å unngå hydrolyse. Inkubasjonstidene som brukes i vår konjugering protokoll er lange nok til å introdusere de ønskede funksjonaliteter på antistoffene og DNA. Det endelige koblingsreaksjonen blir bare avbrutt ved å fjerne de uomsatte S-4FB-konjugerte oligonukleotider via FPLC. Derfor bør FPLC rensing utføres umiddelbart etter endt konjugering. Ved utføring FPLC med systemet beskrevet i vår protokollen, lavere strømningshastigheter (0,2-0,25 ml / min) kan også brukes til å forbedre oppløsningen. Konjugatene elueres som en bred topp (elueringsvolum på rundt 9-15 ml) som vises før en smalere og høyere DNA topp (17-20 ml elueringsvolum). Vi anbefaler ikke å lagre løsningerav konjugater med overskudd av S-4FB-DNA, fordi dette kan føre til tap av antigen-bindingsseter på antistoffet ved konjugering med overskudd av funksjonalisert DNA. Følsomhet, nøyaktighet og reproduserbarhet av sandwich-ELISA ved bruk av DEAL konjugater er blitt vist i tidligere studier. 8,9,11,12,16 For å vurdere kvaliteten av antistoff-DNA-konjugater, kan konjugatene bli inkubert på DNA arrays for å generere antistoff matrise, som deretter anvendes i sandwich-ELISA-eksperimenter for å generere kalibreringskurver for protein deteksjon (figur 3F). For å generere disse kalibreringskurver, kan rekombinante proteiner som finnes i en konvensjonell sandwich-ELISA-sett benyttes. Bruken av høy-kvalitets-konjugater bør gi opphav til lineære områder og nedre grense for påvisning sammenlignbare med de av settet. Som et eksempel er de nedre grenser for INFγ og TNFa for sandwich-ELISA med vår antistoff matrise (figur 3F) er ~ 50 til 100 pg / ml, og er jevn høyt med den lineære rekkevidden av ~ 15-1,000 pg / ml angitt i produktdatabladet for den konvensjonelle sandwich-ELISA kit. Dårlig signal avlesning oppnådd i nedstrøms-sandwich-ELISA-eksperimenter kunne tilskrives den lave kvalitet av DNA matrisen, forstyrrelser av overskudd av DNA i konjugatfibrene oppløsninger, eller alternativt, konjugering av ufullstendig ssDNAs med antistoffer.
Store bekymringer for å utføre sandwich-ELISA på antistoff utvalg inkluderer krysstale mellom reagenser og om signalet reflekterer de reelle biologiske hendelser. De ortogonale DNA vi bruker i denne protokollen har blitt grundig validert å ha mindre enn 0,1% krysstale. Derfor er en hvilken som helst krysstale observert ved immunoanalyse trinn er hovedsakelig fra antistoffene og ELISA-reagenser. Testing for krysstale mellom antistoffer i rekken bør utføres før gjennomfører analyser på reelle prøver. Når et antistoff panelet er konstruert, bør en få sandwich-ELISA kontrollforsøk være performed med følgende betingelser: 1. Uten antigener, 2. Uten gjenkjenning antistoffer, og 3. Detection antistoffer og merking reagenser bare. Hvis krysstale er observert ved immunoassay stadiet bør antistoff parene og / eller ELISA-reagenser bli erstattet. Det skal bemerkes at bruken av kommersielt tilgjengelige antistoffer fra konvensjonelle ELISA-sett ikke er noen garanti for anvendelse til matrisen basert sandwich-ELISA-teknikk.
Fortjeneste av denne teknologien inkluderer billig produksjon, miniatyrstørrelse, og fleksibilitet av design. Vår fabrikasjon protokollen ikke trenger en microarray spotter som kanskje ikke er tilgjengelig for mange brukere av antistoff arrays. Strømnings mønster set-up kan enkelt monteres i enkle laboratorier. For laboratorier som ikke er utstyrt med instrumenter for fotolitografi, kan CAD design vi tilbyr i vår protokoll sendes videre til selskaper som tilbyr microfabrication tjenester. Nedbemanning den konvensjonelle microarray innden kompakte matrise fabrikkert med vår protokollen åpner for kompatibilitet med mikrobrikker som brukes i encellede eksperimenter. Vår protokoll inneholder fremstilling av matrisen som en ssDNA matrise før konvertering til et antistoff matrise. Foreløpige mønster med ssDNAs har en rekke fordeler. Først ssDNAs er kjemisk mer stabile sammenlignet med antistoffer, og dermed ssDNA-mønstrede slides kan lagres i en eksikator i minst 6 måneder uten signifikant nedbrytning 8,16. For det andre har vår tilnærming en sluttbruker fleksibilitet til å velge de analyser som trengs, ved ganske enkelt å blande de selektive konjugater sammen i en løsning uten modifisering av microarray; Tvert imot, konvensjonelle protein / antistoff-arrays er forhånds utformet og festet på et underlag, slik at endringen av metoder ville kreve mønstringen / trykking av proteiner / antistoffer fra begynnelsen. Representative studier illustrere bruken av strekkoden antistoff microarray i high-throughput deteksjon av flere signal proteiner fra enkeltceller. Ved å variere strømningsmønsteret design og / eller oligonukleotidet mønstrings løsninger som brukes, kan et mangfold av array-oppsett bli utforsket. Som et eksempel på denne anvendelse, kan funksjonelle proteiner fra enkle celler bli undersøkt. Chip for encellet analyse omfatter så mange som ~ 8700 microchambers, hver linje med en komplett 3 x 3 antistoff array (figur 3 H). Et slikt oppsett kan for high-throughput deteksjon. Proteiner utskilt av celler dyrket i microchambers kan detekteres av denne matrisen. Den allsidige microarray design gjør også for multiplexed påvisning av proteiner fra serum, cellelysater, og enkeltceller etter å kombinere microarray med andre generiske komponenter 8,15. I tillegg til proteinpåvisning, er 3 x 3 matrise antistoff også nyttig i å fange celler (figur 3G).
Den største ulempen med denne tilnærmingen er det ekstra komplexity sammenlignet med produksjon av konvensjonelle mikromatriser. Strategier for mønstring og for utvalg design må være nøye begrepsfestet mens vurderer de konkrete anvendelser av fabrikkerte array. Denne tilnærmingen krever også en rekke kritiske trinn inkludert valideringsprosedyrer og tester for cross-talk. 3 x 3 matrise konstruert ved anvendelse av vårt protokoll er begrenset til deteksjon av 7-proteiner på en gang. Imidlertid kan denne grensen være overgått ved å skape større arrays. Protokollen omtalt her er ikke begrenset til fabrikasjon av 3 x 3 mikromatriser. Vi har vært i stand til å dikte 5 x 5 mikromatriser og andre dimensjoner av array-elementer. I prinsippet kan andre n x m matriser fremstilles ved bruk av lignende teknikker så lenge oligonukleotid sett brukes for å skape den foreløpige DNA-mønstrede matrise er ortogonale for å unngå krysstale mellom matriseelementer. Opprettelsen av utvidede arrays oppnås ved flyt patterning n typer av ssDNA ankere for den første DNA-mønster trinn, etterfulgt av n x m brodannende ssDNA-sekvenser for det andre mønster trinnet. For eksempel, for å lage en 5 x 5 matrise, kan anker sekvenser A til E bli brukt, mens bridging sekvenser A'-i til E'-xxv blir utnyttet. Å automatisere flyten mønster prosessen har en robotplattform er utviklet 18 men dette har bare brukt én DNA flyt mønster trinn. I prinsippet kan samme plattform bli utvidet til andre trinn i loddrett strømning mønster, mens bryter mellom to trinn kan kreve manuelt å trekke av den første PDMS formen etter den første mønstertrinn, etterfulgt av vasking og tørking av sleiden (dette trinnet vil tar ca 10 min), før parring raset med en annen PDMS mold å lette loddrett orientert andre mønster trinn.
Vi har diskutert detaljerte prosedyrer for å fabrikkere en NxM rekke mønstredemed antistoffer ved høy tetthet, som har store løftet for fremtidige anvendelser i proteomikk studier og cellesignalering. Protokollen som presenteres her kan også tjene som en guide for bygging av mer forseggjort DNA / antistoff arrays for andre formål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard 184 silicone elastomer base | Dow Corning | 3097366-1004 | |
| Sylgard 184 silicone elastomer curing agent | Dow Corning | 3097358-1004 | |
| SU-8 2025 photoresist | MicroChem | Y111069 | |
| Silicon wafers | University Wafers | 452 | |
| Poly-L-lysine coated glass slides | Thermo Scientific | C40-5257-M20 | |
| Oligonucleotides | Integrated DNA Technologies | *Custom-ordered from Integrated DNA Technologies, see Table 2. | |
| Poly-L-lysine adhesive stock solution | Newcomer Supply | 1339 | |
| Bis (sulfosuccinimidyl) suberate (BS3) | Thermo Scientific | 21585 | |
| 1x Phosphate buffered saline, pH 7.4 | Quality Biological | 114-058-101 | |
| Äkta Explorer 100 Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) System | GE (Amersham Pharmacia) | 18-1112-41 | |
| Superose 6 10/300 GL column | GE Healthcare Life Sciences | 17-5172-01 | |
| Capture antibodies | various | various | *Antibody selection depends on application |
| Succinimidyl-6-hydrazino-nicotinamide (S-HyNic) | Solulink | S-1002 | |
| Succinimidyl-4-formylbenzamide (S-4FB) | Solulink | S-1004 | |
| N,N-dimethylformamide | Sigma-Aldrich | 227056 | |
| Citric acid, anhydrous | Acros | 42356 | |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | S318 | |
| Amicon Ultra spin filter 10 kDa MWCO | EMD Millipore | UFC201024 | |
| Spin coater | Laurell Technologies | WS-650-MZ | |
| Biopsy punch with plunger (1.0 mm diameter) | Ted Pella, Inc. | 15110-10 | |
| Diamond scribe (Style 60) | SPI supplies | 6004 | |
| Trimethylchlorosilane | Sigma Aldrich | 92361 |
References
- Alhamdani, M. S. S., Schroder, C., Hoheisel, J. D. Oncoproteomic profiling with antibody microarrays. Genome Med. 1 (7), (2009).
- Angenendt, P. Progress in protein and antibody microarray technology. Drug Discov Today. 10 (7), 503-511 (2005).
- Sun, H. Y., Chen, G. Y. J., Yao, S. Q. Recent advances in microarray technologies for proteomics. Chem Biol. 20 (5), 685-699 (2013).
- Fan, R., et al. Integrated barcode chips for rapid, multiplexed analysis of proteins in microliter quantities of blood. Nat Biotechnol. 26 (12), 1373-1378 (2008).
- Chattopadhyay, P. K., Gierahn, T. M., Roederer, M., Love, J. C. Single-cell technologies for monitoring immune systems. Nat Immunol. 15 (2), 128-135 (2014).
- Varadarajan, N., et al. Rapid, efficient functional characterization and recovery of HIV-specific human CD8(+) T cells using microengraving. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (10), 3885-3890 (2012).
- Ma, S., et al. Electroporation-based delivery of cell-penetrating peptide conjugates of peptide nucleic acids for antisense inhibition of intracellular bacteria. Integr Biol-Uk. 6 (10), 973-978 (2014).
- Wang, J., et al. Quantitating cell-cell interaction functions with applications to glioblastoma multiforme cancer cells. Nano Lett. 12 (12), 6101-6106 (2012).
- Kravchenko-Balasha, N., Wang, J., Remacle, F., Levine, R. D., Heath, J. R. Glioblastoma cellular architectures are predicted through the characterization of two-cell interactions. Proc Natl Acad Sci USA. 111 (17), 6521-6526 (2014).
- Xue, M., et al. Chemical methods for the simultaneous quantitation of metabolites and proteins from single cells. J Am Chem Soc. 137 (12), 4066-4069 (2015).
- Shi, Q. H., et al. Single-cell proteomic chip for profiling intracellular signaling pathways in single tumor cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (2), 419-424 (2012).
- Ma, C., et al. A clinical microchip for evaluation of single immune cells reveals high functional heterogeneity in phenotypically similar T cells. Nat Med. 17 (6), 738-743 (2011).
- Deng, Y., et al. An integrated microfluidic chip system for single-cell secretion profiling of rare circulating tumor cells. Sci Rep. 4, 7499 (2014).
- Vermesh, U., et al. High-density, multiplexed patterning of cells at single-cell resolution for tissue engineering and other applications. Angew Chem Int Ed. 50 (32), 7378-7380 (2011).
- Yu, J., et al. Microfluidics-based single-cell functional proteomics for fundamental and applied biomedical applications. Annu Rev Anal Chem. 7, 275-295 (2014).
- Bailey, R. C., Kwong, G. A., Radu, C. G., Witte, O. N., Heath, J. R. DNA-encoded antibody libraries: A unified platform for multiplexed cell sorting and detection of genes and proteins. J Am Chem Soc. 129, 1959-1967 (2007).
- Alegria-Schaffer, A. General protein-protein cross-linking. Methods Enzymol. 539, 81-87 (2014).
- Ahmad, H., et al. A robotics platform for automated batch fabrication of high density, microfluidics-based DNA microarrays, with applications to single cell, multiplex assays of secreted proteins. Rev Sci Instrum. 82, 094301 (2011).
