Protocol
1. Geavanceerde Voorbereiding
- Het voorbereiden van dextran G10 deeltjes.
- Bereid G10 suspensie door toevoeging van 50 ml 1 x PBS tot 10 g G10 deeltjes. Meng door omkeren en laat G10 om zich te vestigen van fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) bij 4 ° CO / N.
- De dag van de G10 scheidingskolom, aspireren PBS vaste G10 deeltjes en voeg 50 ml vers PBS. Meng door inversie. Tweemaal herhalen, toevoegen van 50 ml verse PBS vaste deeltjes G10 en bewaar bij 4 ° C tot gebruik.
- Het kweken van BMSC en OB.
- Handhaven zowel BMSC of OB bij 37 ° C in 6% CO 2 en gekweekt op 10 cm weefselkweekplaten tot 90% confluentie bereikt.
- Trypsinize BMSC of OB cellen en split 1: 2 op nieuwe cm platen 10. De cellen worden gekweekt tot deze normen tot leukemische nodig voor co-kweken.
2. het opzetten en onderhouden Co-cultuur
- Voeg 5-20 x 10 6 leukemische cellen in 10 ml van tumorspecifieke voedingsbodems op een 80% -90% confluent BMSC of OB plaat.
OPMERKING: Ons laboratorium stelt co-kweken bij 37 ° C in 5% O 2 beter herinnerd aan beenmergmicromilieu waarvan is aangetoond dat varieert van 1% tot 7% 16-18. Echter, het handhaven co-culturen in deze zuurstofspanning is niet kritisch voor het vaststellen van de drie leukemische subpopulaties en is ter beoordeling van het lab. - Elke 4 e dag verwijder alle maar 1 ml van de media (inclusief leukemische cellen in suspensie) en te vervangen door 9 ml verse leukemische kweekmedium. Bij het verwijderen van 9 ml van media van de plaat, wees niet naar de BMSC of OB hechtende laag verstoren.
- Verwijder media door het kantelen plaat aan de zijkant en zuig media in de hoek van de plaat. Bovendien, wanneer het toevoegen van verse media, zorg ervoor dat druppelsgewijs in de hoek van de plaat tegen de zijwand toe te voegen aan een minimale verstoring van de BMSC of OB hechtende laag te verzekeren.
- Na de 12e dag van co-cultuur spoel leukemische cellen van BMSC of OB laag pipetteren kweekmedia van schotel en neer zachtjes over de schotel ongeveer 5 tot 10 maal en verzamel in 15 ml conische buis. Reseed op nieuwe 80% -90% confluent BMSC of OB plaat zoals beschreven in stap 2.1.
OPMERKING: De zachte spoelen van de co-kweek zoals beschreven in stap 2.3 en PB S zal leukemische cellen te verwijderen zonder verstoring van de BMSC of OB monolaag. Dit laat alleen tumorcellen worden overgebracht naar de eerste co-kweekplaat. Deze 12 daagse cyclus kan zo vaak worden herhaald als nodig is gebaseerd op de gebruikersbehoeften.
3. Voorbereiding G10 Bead Columns
LET OP: Als steriele downstream analyse of het kweken is vereist volgende G10 kolom voor de scheiding van de volgende stappen met behulp van steriele techniek moet worden uitgevoerd en G10 kolommen worden ingesteld in een steriele biologische kap.
- Pre-warm celkweekmedium tot 37 ° C in een waterbad (~ 30 ml per kolom). Met behulp van een 10 ml wegwerpspuit, te verwijderen en gooi zuiger. Voeg glaswol aan spuit.
- Met behulp van een pincet, uit elkaar te trekken glaswol in dunne losse strengen. Voeg meerdere lagen licht verpakt glaswol aan de spuit totdat 2/3 van de spuit is gevuld met glaswol.
NB: De glaswol is van cruciaal belang om te voorkomen dat losse G10 deeltjes van besmetting van de leukemische cellen collectie. Zorg ervoor dat glaswol is genoeg om de G10 deeltjes ondersteunen gepakt, maar niet te dicht op elkaar gepakt in de media stroming door de kolom te blokkeren. - Attach 1-weg kraan aan de bovenzijde van de spuit in de gesloten stand.
- Klem spuit kolom ringstandaard hoog genoeg om een 50 ml conische buis (verzamelbuis) onder kraan kan worden geplaatst. Plaats collectie buis onder spuit kolom.
- Met behulp van een 10 ml pipet toe te voegen, drop-wise, G10 deeltjes opnieuw gesuspendeerd in PBS om de kolom op de top vande glaswol. Voeg meer G10 deeltjes tot een ~ 2 ml pellet (gemeten graduaties op spuit) van G10 deeltjes vormen bovenop de glaswol.
- Evenwicht van de G10-kolom met voorverwarmde media.
- Voeg 2 ml van voorverwarmde media kolom. Open kraan afsluiter langzaam zodat media stroomt uit de kolom druppelsgewijs.
- Herhaal stap 3.6.1 tot in totaal 10 ml van voorverwarmde media zijn liep over de kolom.
OPMERKING: Indien G10 deeltjes worden waargenomen in de stroom door de verzamelbuis, hetzij 1) voeg meer G10 deeltjes behouden ~ 2 ml pellet ervoor te zorgen dat er geen extra G10 deeltjes ontsnappen aan de kolom of 2) vervangen kolom met andere af en herhaal stappen 3.4-3.6.1. - Na de voorverwarmde media afvoerleidingen van de kolom, sluit het kraantje en gooi collectie buis met doorstroming. Voeg een nieuwe collectie buis onder de kolom. Kolom kan nu worden gevuld met medium + celmengsel.
LET OP: Columnsmoet onmiddellijk worden gebruikt en niet toegestaan om te drogen.
4. Scheiden 3 subpopulaties binnen Co-cultuur
- Het verzamelen van suspensie (S) tumor subpopulatie.
- Aspireren media van co-cultuur plaat met pipet en voorzichtig dezelfde media opnieuw van toepassing op de plaat te spoelen en het verzamelen van media met leukemische cellen in een 15 ml conische buis. De leukemische cellen verzameld zijn de S subpopulatie.
- Het verzamelen van Phase Bright (PB) tumor subpopulatie.
- Voeg 10 ml vers medium terug op co-cultuur plaat. Spoel krachtig door pipetteren toegevoegd media en neer ongeveer 5 keer aan hechtende leukemische cellen, maar niet hard genoeg om aanhangend BMSC / OB component los te verwijderen.
- Aspireren met een pipet en het verzamelen van media in een 15 ml conische buis. De verzamelde cellen zijn de PB subpopulatie.
- Het verzamelen van Phase Dim (PD) tumor subpopulatie.
- Spoel de plaat met 1 ml PBS om remove overige media. Trypsinize co-kweekplaat met 3 ml trypsine en omgeving naar 37 ° C incubator gedurende 5 min.
- Verwijder plaat uit de incubator en zachtjes tikken zijden van de plaat hechtende BMSC / OB verjagen.
- Voeg 1 ml foetaal runderserum (FBS) en de pipet op en neer 3-5 keer uiteen grote celaggregaten breken.
- Verzamel media met cellen in een 15 ml conische buis. Deze cellen zijn de ongezuiverde PD subpopulatie met BMSC / OB ook.
- Centrifuge 3 geïsoleerde subpopulaties bij 400 xg gedurende 7 min. Zuig en gooi supernatant vervolgens afzonderlijk mengen pellets in 1 ml voorverwarmde media. Cellen aanpassen op een G10 kolom worden geladen.
5. Laden Co-cultuur cellen op G10 Column
LET OP: Zorg ervoor dat kraan is volledig afgesloten voor het toevoegen van media met cellen aan G10 kolom. Ook moet elke subpopulatie worden liep over een aparte G10 column dus niet te Inleidinge eventuele afwijking tussen de bevolkingsgroepen in downstream-analyse.
- Met een 1000 ui pipet 1 ml van elke cel subpopulatie in voorverwarmde media een aparte G10 kolom druppelsgewijs. Zorg ervoor dat de media die de cellen blijft aan de top of binnen G10 pellet. Sta cellen incuberen op G10 pellet gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
LET OP: Afsluiter blijft gesloten voor de duur van incubatie.
6. Verzamelen leukemische cellen van G10 kolom
- Voeg 1-3 ml voorverwarmd medium elke G10 kolom. Open kraan kraan en laat de media langzaam verlaat de kolom druppelsgewijs.
LET OP: Het is cruciaal om een langzame stroomsnelheid van de kolom of de G10 pellet met BMSC / OB kan wassen van de kolom en vervuilen de geïsoleerde leukemische cellen te handhaven. - Doorgaan met voorverwarmde media in kleine stappen (1-2 ml) naar G10 kolom toe te voegen tot een totaal van 15 tot 20 ml heeft doorlopen kolom en is verzameld. Sluiten kraan valve en cap collectie buis.
LET OP: Als een G10 deeltje pellet wordt gezien op de bodem van de collectie buis, media verwijder voorzichtig uit de buis verlaten G10 deeltje pellet ongestoord en transfer naar nieuwe buis. - Centrifugeer media verzameld bij 400 xg gedurende 7 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder supernatant en resuspendeer celpellet in buffer die geschikt is voor downstream-applicatie.
- De cellen zijn nu een zuivere populatie van leukemische cellen vrij van BMSC of OB besmetting en zijn klaar om te worden toegepast op de downstream-applicaties op gebruikersniveau discretie.
LET OP: leukemie levensvatbaarheid van de cellen dienen ongewijzigd te blijven bij het passeren van cellen via G10 kolommen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Succesvolle opzet en cultuur van deze co-kweek zal resulteren in de inrichting van 3 subpopulaties van leukemische cellen opzichte van de hechtende BMSC of OB monolaag. Figuur 1 laat zien hoe alle cellen gezaaid in een BMSC monolaag eerste gezicht aangezien slechts enkele populatie van zwevende leukemische cellen. Gedurende 4 dagen leukemische cellen interageren met de BMSC tot 3 ruimtelijke subpopulaties van leukemische cellen vormen (onderbroken (S) fase helder (PB), en fase dim (PD)). Terwijl de 3 subpopulaties van tumorcellen gewoonlijk kunnen optreden na 24 uur co-kweek met BMSC of OB co-kweek we de cellen gedurende 4 dagen om de volledige dynamiek en interacties tussen de leukemische cellen en BMSC / OB cellen plaatsvinden voor manipulatie of experiment plaatsvindt (figuur 1). Merk ook op dat we handhaven van de co-kweken bij een zuurstof spanning van 5% tot recapituleren beenmerg fysiologie, die bijen heeftn gemeld aan variëren van 1% -7% 16-18.
Een grote meerderheid van de downstream analyse vereist de scheiding van de leukemische cellen van de BMSC of OB. Om dit te bereiken gebruiken we G10 kolommen aan een zuivere populatie van leukemische cellen (Figuur 2A) oogsten. Na behandeling met trypsine van BMSC en PD REH cellen een gemengde populatie wordt gezien door twee verschillende forward / side populatie door flowcytometrie (Figuur 2B, bovenste paneel). Na G10 scheiding een zuivere bevolking van slechts REH ALL cellen wordt teruggewonnen, hetgeen werd bevestigd door de vooruit / zijwaartse verstrooiing flowcytometrie (Figuur 2B, onderste paneel).
Het gebruik van deze co-cultuurmodel en de mogelijkheid om leukemische cellen te isoleren uit 3 subpopulaties als in co-kweek met BMSC of OB maakt ondervraging van leukemische cellen fenotype met betrekking tot de ruimtelijke ligging ten opzichte van de hechtende BMSC of OBmonolaag. Van bijzonder belang is dat alle gewonnen uit de PD populatie van een BMSC of OB co-kweekcellen weinig tot geen celdood na blootstelling aan cytotoxische chemotherapie (figuur 3A, B).
Figuur 1. alle cellen in co-cultuur met BMSC of OB vorm drie ruimtelijke populaties. Ons laboratorium maakt gebruik van een in vitro co-cultuur systeem om leukemische cel interacties met beenmergmicromilieu afgeleide stromacellen (BMSC of OB) te modelleren. Co-cultuur te creëren, zijn leukemische cellen (rood) gezaaid op een 80% -90% confluente monolaag van BMSC of OB (blauw), die wordt aangeduid als "Tijd 0". Co-kweken worden gehandhaafd op 37 ° C in 5% zuurstof voorwaarden van de beenmergmicromilieu benaderen. Leukemische cellen beginnen te 3 subpopulaties al 24 uur vorm, maar voor volledige interacties FOrm laten we co-culturen 4 dagen vast te stellen voor het gebruik van leukemische cellen voor experimenten. Overdag 4 (rechter panelen) worden drie subpopulaties van leukemische cellen vormen ten opzichte van de hechtende monolaag. Het schema (rechtsboven) en de fase contrast microscopie (rechtsonder) tonen de onderbroken (S) leukemische cellen vrij zwevend in de media; heldere fase (PB) leukemische cellen die aan het oppervlak van de BMSC of OB monolaag; en de fase dim (PD) leukemische cellen die gemigreerd onder de BMSC of OB monolaag. Schaal balk vertegenwoordigt 10 micron. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Het gebruik van G10 kolom maakt scheiding van alle cellen van BMSC / OB. (A) Demonstratie van het verbruik van een G10 colUMN Alle elementen scheiden van BMSC / OB co-cultuur een zuivere populatie van tumorcellen voor analyse downstream bereiken. Van links naar rechts, is een mengsel van alle cellen en BMSC / OB cellen toegevoegd aan de top van de kolom G10; (Center) celmengsel zal vestigen in de G10 suspensie en worden geïncubeerd bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten (NB: Afsluiter in de gesloten positie tijdens de eerste twee stappen); (rechts) leukemische cellen teruggewonnen door het openen van de kraan en spoelen kolom met voorverwarmde media. (B) Bovenste paneel toont vóór G10 scheiding die er een gemengde populatie van cellen die BMSC (blauwe poort) en REH ALL-cellen (rood gate ) door het evalueren van forward (FSC) en zijwaartse verstrooiing (SSC) analyse. Onderste paneel, volgende G10 scheiding alleen de zuivere populatie van REH ALL cellen (rode poort) blijven met minder dan 1% stromale cel contaminatie (blauwe poort). Klik hier om een grotere versie van thi bekijken s figuur.
Figuur 3. PD leukemische cellen zijn verhoogde weerstand tegen blootstelling aan chemotherapie. SD-1 leukemische cellen hersteld van de PD bevolking van een BMSC co-cultuur (A) niet verlaagd levensvatbaarheid na een 4 dagen blootstelling aan Ara-C niet weer te geven [1 uM] MTX [50 uM] of videorecorder [25 uM], vergelijkbaar met onbehandelde controles (merk op dat een tweede dosis Ara-C toegevoegd in 48 uur om eventuele verliesdrug omwille van stabiliteits-). Leukemische cellen van alleen de media, zijn S en PB populaties significant verminderde levensvatbaarheid bepaald door trypan blue exclusion.SD-1 leukemische cellen samen gekweekt met OB cellen vertonen soortgelijke trends in levensvatbaarheid (B). Resultaten worden uitgedrukt als gemiddelde ± SEM. (*) Geeft p <0,05, ongepaarde t-test ten opzichte van onbehandelde controles.5fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Minimal residual disease (MRD) die bijdraagt aan terugval van de ziekte blijft een belangrijke klinische uitdaging bij de behandeling van agressieve refractaire ALL, evenals een groot aantal andere hematologische maligniteiten zijn. De beenmerg micro-omgeving is de meest voorkomende plaats van de terugval in ALL 3,8. Als zodanig, modellen die het beenmerg micro-omgeving te modelleren zijn belangrijke instrumenten om hypotheses in verband met leukemie tumorcel overleving en het onderhoud van MRD tijdens blootstelling aan chemotherapie te testen. Terwijl muismodellen hier de gouden standaard voor het testen van vragen met betrekking tot de werkzaamheid van geneesmiddelen, 2D gezamenlijke kweek blijft een rendabele methode voor het testen hypotheses en drugsstrategieën naar botgroei morgen micro staving van leukemische celoverleving zijn. Veel groepen hebben aangetoond dat de gelijktijdige kweek van leukemiecellen met BMSC of OB verschaft een overlevingsvoordeel bij provocatie met chemotherapie 9,10,12-14,19-21. Werk modeling normale onvolwassen CD34 + hematopoietic cellen in co-cultuur met mesenchymale stamcellen (MSC) onthulde dat hematopoietische cellen interageren met de hechtende monolaag van MSCs tot drie verschillende ruimtelijke populaties van hematopoëtische cellen 22,23 vormen. Proliferatie en differentiatie van CD34 + cellen werd uitgevoerd ten opzichte van hun locatie binnen de gezamenlijke kweek 22. We hebben uitgebreid op die dag en vragen met betrekking tot beenmergmicromilieu stromale cellen steun van een resistente populatie van tumorcellen binnen een 2D co-cultuur en de isolatie voor downstream-analyse te testen.
In tegenstelling tot standaard 2D gezamenlijke kweek modellen die typisch monster leukemische cellen door verwijdering van de gesuspendeerde tumor, ons model toont dat co-kweek vertegenwoordigt een dynamische interactie waarbij leukemische cellen in co-kweek met BMSC of OB vormen drie subpopulaties opzichte van de BMSC of OB monolaag (figuur 1). De tumor subpopulaties die vorm zijn opgehangen (S) tumor, whilech is vrij zwevend in de media; fase licht (PB), dat wordt gehecht aan het oppervlak van de BMSC of OB; en de fase dim (PD), die zijn begraven onder de BMSC of OB monolaag (figuur 1). In dit model, vonden we dat een strikte voeding en inzaaiing schema belangrijk is dat de resultaten in een co-cultuurmodel bereiken en daarom voeren we het co-kweken bij 4 dagen gebeuren en overbrengen tumor nieuwe BMSC of OB monolagen elke 12 dagen. Deze modificatie kunnen vereisen om alternatieve tumor nodig. Het aantal tumorcellen die migreren onder de BMSC of OB vormen de PD populatie kunnen variëren tussen de verschillende leukemische cellen. Dit kan een beperking van het model, wanneer het aantal PD tumorcellen laag waardoor het moeilijk om voldoende cellen te verzamelen voor downstream analyse. In sommige gevallen kan dit probleem worden ondervangen door het bewijs repliceren coculturen om voor samenvoegen van de drie afzonderlijke subpopulaties.
Aangezien dit model religt aan tumorcellen interactie met de BMSC of OB is het belangrijk om een effectieve methode om stromale cellen besmet verwijderen specifieke biologie van de leukemische cellen pakken hebben. Om deze scheiding van tumorcellen uit stroma we gebruiken G10 kolommen bereiken. Juiste instelling en het gebruik van deze kolommen is cruciaal voor het isoleren van tumor pure populaties voor downstream analyse. Zoals aangegeven in figuur 2B, goede uitvoering van de G10 scheidingskolom resultaten in het herstel van tumorcellen bij meer dan 99% zuiverheid. Dit maakt stroomafwaarts analyse van de leukemische cellen zonder complicatie van de interpretatie van de resultaten die zouden voortvloeien uit stromale cellen besmet. Het is belangrijk op te merken dat alle leukemische celtypen of cellijnen of primaire monsters van patiënten zal enigszins variëren in hun vermogen door middel van de G10 kolommen te passen. Voor gebruik in grootschalige experimenten gebruikers het aantal leukemische cellen moeten invoeren om de gewenste hoeveelheid benodigde f belasting moet bepalenof hun specifieke behoeften downstream. Bovendien, de hoeveelheid spoelmedia liep via G10 kolom na incubatie kan worden verhoogd om te proberen en het aantal cellen teruggewonnen. Zorg moet worden genomen om te verzekeren dat de extra wasbeurten niet stromale cel vervuiling die kan worden vastgesteld na de wasbeurt door celtellingen of flowcytometrie analyse van de doorstroming veroorzaken.
Bij de vaststelling model namen wij waar dat leukemische cellen gewonnen uit de PD populatie toegenomen levensvatbaarheid vergeleken met leukemische cellen gekweekt in medium alleen, en die teruggewonnen uit de S of PB populaties in dezelfde co-kweek bij blootstelling aan cytotoxische chemotherapie (Figuur 3 AB). Dit is belangrijk omdat het een populatie van leukemische cellen in vitro die uitgesproken bescherming tegen chemotherapie ontlenen vertegenwoordigt. Dit verschaft een nuttig instrument behandelingsstrategieën doel om de meest resistente tumor populatie, die wordt ondersteund door testenhet beenmerg micro-omgeving. Bovendien omdat deze leukemische cellen zo goed beschermd door de BMSC of OB gezamenlijke kweek is ontvankelijk voor in vitro combinatie behandelingsstrategieën, die in media alleen of standaard co-kweekmodellen lijkt of zouden de tumor volledig doden die niet altijd representatief voor effecten waargenomen in resistente micro-omgeving ondersteund leukemische populatie.
Tenslotte zijn wij van mening dat het gebruik van dit model waardevol inzicht in de interacties tussen BMSC / OB en leukemische cellen die verantwoordelijk zijn voor resistentie tegen chemotherapie behandeling kan bieden, leiden tot MRD, en vervolgens terugval. Dit model biedt een in vitro platform voor experimenten die beter downstream pre-klinische modellen zullen op de hoogte te ontwerpen. Hoewel we zien het gebruik van dit model om interacties tussen stromale beenmergcellen en alle afgeleide leukemische cellen te testen, we hebben goede hoop dat de toekomstige richting en toepassingen van dit model ons zal zijneful in verschillende maligne aandoeningen waarbij het beenmerg micro verschaft een plaats van toevluchtsoord voor tumoren tijdens chemotherapeutische interventie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| G10 sephadex beads | Sigma | G10120 | Referred to in manuscript as gel type 10 cross-linked dextran particles |
| 10 ml sterile syringe | BD | 309604 | |
| Glass wool | Pyrex | 3950 | |
| 1-way stopcocks | World Precision Instruments, Inc. | 14054-10 | |
| 50 ml conical centrifuge tubes | World Wide Medical Products | 41021039 | Used as collection tubes |
| 15 ml conical centrifuge tubes | World Wide Medical Products | 41021037 | Used for cell collection |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F6178 | |
| 0.05% Trypsin | Mediatech, Inc. | 25-053-CI | |
| 100 x 20 mm Cell Culture Dishes | Greiner Bio-One | 664160 | |
| Culture media | |||
| Osteoblast culture media | PromoCell | C-27001 | For human osteoblast media |
| RPMI 1640 media | Mediatech, Inc. | 15-040 | For tumor media prepation |
| Cell lines | |||
| Adherent Cells: | |||
| Human Osteoblasts | PromoCell | C-12720 | Human osteoblast were cultured according to the supplier’s recommendations. |
| Human Bone Morrow Stromal Cells | WVU Biospecimen Core | De-identified primary human leukemia and bone marrow stromal cells (BMSC) were provided by the Mary Babb Randolph Cancer Center (MBRCC) Biospecimen Processing Core and the West Virginia University Department of Pathology Tissue Bank. BMSC cultures were established as previously described (*) | |
| Leukemic Cells: | |||
| REH | ATCC | ATCC-CRL-8286 | REH cells were cultured according to the supplier’s recommendations and recommended media. |
| SD-1 | DSMZ | ACC 366 | SD-1 were cultured according to the supplier’s recommendations and recommended media. |
| (*) Gibson LF, Fortney J, Landreth KS, Piktel D, Ericson SG, Lynch JP. Disruption of bone marrow stromal cell function by etoposide. Biol Blood Marrow Transplant J Am Soc Blood Marrow Transplant. 1997 Aug;3(3):122–32. | |||
References
- Ayala, F., Dewar, R., Kieran, M., Kalluri, R. Contribution of bone microenvironment to leukemogenesis and leukemia progression. Leukemia. 23 (12), 2233-2241 (2009).
- Coustan-Smith, E., Sancho, J., et al. Clinical importance of minimal residual disease in childhood acute lymphoblastic leukemia. Blood. 96 (8), 2691-2696 (2000).
- Gaynon, P. S., Qu, R. P., et al. Survival after relapse in childhood acute lymphoblastic leukemia. Cancer. 82 (7), 1387-1395 (1998).
- Kikuchi, M., Tanaka, J., et al. Clinical significance of minimal residual disease in adult acute lymphoblastic leukemia. Int. J. Hematol. 92 (3), 481-489 (2010).
- Krause, D. S., Scadden, D. T., Preffer, F. I. The hematopoietic stem cell niche-home for friend and foe? Cytometry B Clin. Cytom. 84 (1), 7-20 (2013).
- Meads, M. B., Hazlehurst, L. A., Dalton, W. S. The Bone Marrow Microenvironment as a Tumor Sanctuary and Contributor to Drug Resistance. Clin. Cancer Res. 14 (9), 2519-2526 (2008).
- Nguyen, K., Devidas, M., et al. Factors Influencing Survival After Relapse From Acute Lymphoblastic Leukemia: A Children's Oncology Group Study. Leuk. Off. J. Leuk. Soc. Am. Leuk. Res. Fund UK. 22 (12), 2142-2150 (2008).
- Szczepanek, J., Styczyński, J., Haus, O., Tretyn, A., Wysocki, M. Relapse of Acute Lymphoblastic Leukemia in Children in the Context of Microarray Analyses. Arch. Immunol. Ther. Exp. (Warsz.). 59 (1), 61-68 (2011).
- Boyerinas, B., Zafrir, M., Yesilkanal, A. E., Price, T. T., Hyjek, E. M., Sipkins, D. A. Adhesion to osteopontin in the bone marrow niche regulates lymphoblastic leukemia cell dormancy. Blood. 121 (24), 4821-4831 (2013).
- Bradstock, K., Bianchi, A., Makrynikola, V., Filshie, R., Gottlieb, D. Long-term survival and proliferation of precursor-B acute lymphoblastic leukemia cells on human bone marrow stroma. Leukemia. 10 (5), 813-820 (1996).
- Clutter, S. D., Fortney, J., Gibson, L. F. MMP-2 is required for bone marrow stromal cell support of pro-B-cell chemotaxis. Exp. Hematol. 33 (10), 1192-1200 (2005).
- Manabe, A., Murti, K. G., et al. Adhesion-dependent survival of normal and leukemic human B lymphoblasts on bone marrow stromal cells. Blood. 83 (3), 758-766 (1994).
- Mudry, R. E., Fortney, J. E., York, T., Hall, B. M., Gibson, L. F. Stromal cells regulate survival of B-lineage leukemic cells during chemotherapy. Blood. 96 (5), 1926-1932 (2000).
- Tesfai, Y., Ford, J., et al. Interactions between acute lymphoblastic leukemia and bone marrow stromal cells influence response to therapy. Leuk. Res. 36 (3), 299-306 (2012).
- Hathcock, K. S. Depletion of Accessory Cells by Adherence to Sephadex G-10. Curr. Protoc. , (2001).
- Berniakovich, I., Giorgio, M. Low oxygen tension maintains multipotency, whereas normoxia increases differentiation of mouse bone marrow stromal cells. Int. J. Mol. Sci. 14 (1), 2119-2134 (2013).
- Chow, D. C., Wenning, L. A., Miller, W. M., Papoutsakis, E. T. Modeling pO(2) distributions in the bone marrow hematopoietic compartment. II. Modified Kroghian models. Biophys. J. 81 (2), 685-696 (2001).
- Holzwarth, C., Vaegler, M., et al. Low physiologic oxygen tensions reduce proliferation and differentiation of human multipotent mesenchymal stromal cells. BMC Cell Biol. 11, (2010).
- O'Leary, H., Akers, S. M., et al. VE-cadherin Regulates Philadelphia Chromosome Positive Acute Lymphoblastic Leukemia Sensitivity to Apoptosis. Cancer Microenviron. Off. J. Int. Cancer Microenviron. Soc. 3 (1), 67-81 (2010).
- Wang, L., Chen, L., Benincosa, J., Fortney, J., Gibson, L. F. VEGF-induced phosphorylation of Bcl-2 influences B lineage leukemic cell response to apoptotic stimuli. Leukemia. 19 (3), 344-353 (2005).
- Wang, L., Coad, J. E., Fortney, J. M., Gibson, L. F. VEGF-induced survival of chronic lymphocytic leukemia is independent of Bcl-2 phosphorylation. Leukemia. 19 (8), 1486-1487 (2005).
- Jing, D., Fonseca, A. V., et al. Hematopoietic stem cells in co-culture with mesenchymal stromal cells--modeling the niche compartments in vitro. Haematologica. 95 (4), 542-550 (2010).
- Jing, D., Wobus, M., Poitz, D. M., Bornhäuser, M., Ehninger, G., Ordemann, R. Oxygen tension plays a critical role in the hematopoietic microenvironment in vitro. Haematologica. 97 (3), 331-339 (2012).
