Protocol
1. הכנה מתקדמת
- הכנת חלקיקי G10 dextran.
- הכן סלארי G10 על ידי הוספת 50 מ"ל 1x PBS על 10 חלקיקים G10 גרם. מערבבים על ידי היפוך ולאפשר G10 להגיע להסדר מחוץ בופר פוספט (PBS) בשעה 4 ° CO / N.
- היום של ההפרדה עמודה G10, לשאוב PBS מחלקיקים G10 התיישבו ולהוסיף 50 מ"ל PBS טרי. מערבבים על ידי היפוך. חזור פעמיים, הוספת 50 מ"ל PBS טרי לחלקיקים G10 התיישבו ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס עד מוכן לשימוש.
- Culturing BMSC ו OB.
- לשמור הן BMSC או OB ב 37 ° C ב 6% CO 2 ו גדל על צלחות בתרבית רקמה 10 ס"מ עד 90% confluency הוא הגיע.
- Trypsinize BMSC או תאי OB ולפצל 1: 2 על 10 צלחות סנטימטר חדשות. התאים גדלים סטנדרטים אלה עד הדרושים leukemic שיתוף culturing.
2. לקביעתם ולקיומם Co-תרבות
- להוסיף 5-20 x 10 6 תאים leukemic in 10 מ"ל של התקשורת בתרבות גידולים ספציפיים על גבי ומחוברות 80% -90% BMSC או צלחת OB.
הערה: המעבדה שלנו שומרת שיתוף תרבויות על 37 מעלות צלזיוס ב 5% O 2 לשחזר במיקרו-סביבה של מח עצם טובה יותר אשר הוכח נע בין 1% ל -7% 16-18. עם זאת, שמירה על שיתוף תרבויות על מתח החמצן זו אינה קריטית להקמת שלוש תת-אוכלוסיות leukemic והוא על פי שיקול דעתו של המעבדה. - כל יום 4 th להסיר את כל אבל 1 מיליליטר של תקשורת (כולל תאי leukemic השעיה) ולהחליפו 9 מיליליטר תקשורת ותרבות leukemic טריה. כשמוציאים 9 מ"ל של התקשורת מהצלחת, להיזהר לא להפריע את השכבה חסיד BMSC או OB.
- סר מדיה ידי הטיית הצליחה אל תקשורת הלוואי לשאוב בפינת הצלחת. בנוסף, בעת הוספת תקשורת טריה, הקפד להוסיף טיפה חכמה בפינת הצלחת נגד הדפנות כדי להבטיח הפרעה מזערית של שכבת חסיד BMSC או OB.
- לאחר 12 יום ה של תרבות משותפת, לשטוף תאי leukemic מ BMSC או שכבת OB ידי pipetting תקשורת ותרבות ממרחק של עד מנה ולמטה בעדינות על הצלחת כ 5 עד 10 פעמים ולאחר מכן לאסוף ב 15 מיליליטר צינור חרוטים. Reseed על BMSC ומחוברות 80% -90% חדשות או צלחת OB כמתואר בשלב 2.1.
הערה: שטיפה עדינה של שיתוף תרבות כמתואר בשלב 2.3 תסיר S ו- PB תאים leukemic מבלי לשבש את monolayer BMSC או OB. זה מאפשר לתאים סרטניים בלבד שיועבר הצלחה שיתוף התרבות הבא. ניתן לחזור מחזור 12 ביום זה פעמים רבות ככל הצורך בהתבסס על צרכי המשתמש.
3. עמודות הכנת חרוז G10
הערה: אם ניתוח במורד זרם סטרילי או culturing נדרש בעקבות פירוד עמודת G10 את השלבים הבאים צריך להתבצע באמצעות טכניקה סטרילית ועמודות G10 צריכות להיות התקנה במנדף הביולוגי סטרילי.
- טרום ווהתרבית תאים rm התקשורת ל -37 מעלות צלזיוס באמבט מים (~ 30 מ"ל לכל טור). באמצעות מזרק חד פעמי 10 מ"ל, להסיר ולסלק הבוכנה. להוסיף צמר זכוכית כדי מזרק.
- בעזרת פינצטה, לפרק צמר זכוכית לחוטים רופפים דקים. להוסיף מספר שכבות של צמר זכוכית ארוז קלות על המזרק עד 2/3 מזרק מלא צמר זכוכית.
הערה: צמר הזכוכית היא חיונית כדי למנוע חלקיקי G10 רופפים מ מזהמים את אוסף תאי leukemic. הפוך צמר זכוכית בטוחה הוא ארוז מספיק כדי לתמוך חלקיקי G10, אבל לא צפופה מדי בצפיפות לחסום זרימת מדיה דרך עמודה. - צרף ברזלי 1-דרך אל קצה המזרק במצב סגור.
- טור מזרק קלאמפ לצלצל לעמוד גבוה מספיק כדי צינור חרוטי 50 מ"ל (צינור איסוף) ניתן למקם מתחת ברזלים. מניח צינור איסוף תחת עמודת מזרק.
- בעזרת פיפטה 10 מ"ל להוסיף, טיפה חכם, חלקיקים G10 resuspended ב PBS לעמודה על גביצמר הזכוכית. ממשיכים להוסיף חלקיקים G10 עד גלולה מ"ל ~ 2 (כפי שנמדד על ידי סיום לימודים על המזרק) של צורות חלקיקים G10 על גבי צמר זכוכית.
- לאזן את עמודת G10 עם תקשורת מחוממת מראש.
- הוסף 2 מ"ל של התקשורת מחומם מראש לעמודה. שסתומים ברזלים להרחיב לאט כך בתקשורת זורמת מתוך הטור נפתח חכם.
- חזור על שלב 3.6.1 עד סך של 10 מ"ל של התקשורת מחומם מראש כבר חצה את הטור.
הערה: אם חלקיקי G10 נראה את הזרימה דרך בצינור האוסף, או 1) להוסיף עוד חלקיקי G10 לשמור ~ 2 גלולת מיליליטר מוודא שאף חלקיקי G10 נוספים לברוח מהעמודה או 2) להחליף עמודה עם אחד בשימוש וחזרו צעדים 3.4-3.6.1. - לאחר מנקז התקשורת מחומם מראש מהעמודה, לסגור את שסתום וזורקים צינור איסוף עם הזרימה דרך. להוסיף צינור אוסף חדש תחת העמודה. הטור הוא מוכן להיות טעון עם תערובת תאי מדיה +.
הערה: עמודותיש להשתמש מיד ולא להתייבש.
4. הפרדה 3 תת-אוכלוסיות בתוך משותף תרבות
- אוסף של השעיה (S) תת-אוכלוסיית גידול.
- לשאוב התקשורת מהצלחת שיתוף תרבות עם פיפטה בעדינות מחדש להחיל את אותה התקשורת לשטוף את הצלחת לאסוף מדיה המכילה תאים leukemic צינור חרוטי 15 מ"ל. תאי leukemic שנאספו הם תת-אוכלוסיית S.
- אוסף של השלב ברייט-אוכלוסיית גידול (PB).
- הוסף 10 מ"ל התקשורת טרי חזרה לצלחת שיתוף תרבות. לשטוף נמרצות על ידי pipetting תקשורת הוסיפה למעלה ולמטה כ 5 פעמים כדי להסיר תאי leukemic חסידים אבל לא מספיק חזק כדי לסלק רכיב חסיד BMSC / OB.
- לשאוב עם פיפטה ולאסוף התקשורת צינור חרוטי 15 מ"ל. התאים שנאספו הם תת-אוכלוסיית PB.
- אוסף של שלב דים (PD) תת-אוכלוסיית גידול.
- צלחת לשטוף עם 1 מ"ל PBS כדי remתקשורת נותרת אובה. Trypsinize צלחת שיתוף תרבות עם 3 מ"ל טריפסין ומקום לתוך 37 ° C חממה במשך 5 דקות.
- הסר את צלחת מתוך החממה לטפוח בעדינות צידי הצלחת לנשל BMSC / OB חסיד.
- הוסף 1 מ"ל בסרום שור העובר (FBS) ו פיפטה מעלה ומטה 3-5 פעמים להתפרק אגרגטים תא גדול.
- אסוף התקשורת עם תאים צינור חרוטי 15 מ"ל. תאים אלה הם תת-אוכלוסייה PD unpurified עם BMSC / OB גם כן.
- צנטריפוגה 3 מבודדת תת-אוכלוסיות ב 400 XG במשך 7 דקות. לשאוב ולזרוק supernatant אז בנפרד resuspend כדורים ב 1 מיליליטר תקשורת מחוממת מראש. תאים מוכנים להיות הועמס על עמודת G10.
5. טוען משותף התרבות תאים על גבי טור G10
הערה: הפוך ברזלים בטוחים סגורה לחלוטין לפני הוספת תאים המכילים תקשורת לעמודת G10. כמו כן, כל תת-אוכלוסייה חייבת להיות דרסה טור G10 נפרד כך שלא introducדואר הטיות בין אוכלוסיות בניתוח במורד הזרם.
- בעזרת פיפטה 1,000 μl, להוסיף 1 מ"ל של כל תת-אוכלוסייה תא התקשורת מחומם מראש ל טור G10 נפרד טיפה חכם. ודא שהמדיה המכיל את התאים נשאר על גבי או בתוך גלולה G10. אפשר תאים כדי לדגור על גלולת G10 במשך 20 דקות ב RT.
הערה: ברזלים נותר סגור משך הדגירה.
6. איסוף תאי leukemic מעמודת G10
- להוסיף 1-3 מ"ל מראש לחמם התקשורת כל עמודה G10. שסתום ברזלים להרחיב ולאפשר תקשורת כדי לצאת לאט בעמודת טיפה חכמה.
הערה: זה חיוני כדי לשמור על קצב זרימה איטית מהעמודה או גלולת G10 המכילה BMSC / OB יכול לשטוף את הטור ולזהם את תאי leukemic המבודדים. - המשך להוסיף מדיה מחוממת מראש במרווחים קטנים (1-2 מיליליטר) לעמודת G10 עד סך של 15 עד 20 מיליליטר יש להפעיל באמצעות עמודה נאסף. va שסתום הקרובצינור איסוף lve וכובע.
הערה: אם גלולת חלקיקי G10 נתפסת בתחתית צינור איסוף, להסיר בעדינות תקשורת מהצינור עוזב G10 חלקיקים הגלולים באין מפריע ולהעביר צינור חדש. - צנטריפוגה שנאספו מדיה ב 400 XG במשך 7 דקות ב RT. הסר supernatant ו resuspend תא גלול במאגר מתאים לשימוש עבור במורד זרם.
- תאים הם עכשיו אוכלוסייה טהורה של תאים leukemic ללא BMSC או זיהום OB והם מוכנים להיות מיושם על יישומים במורד הזרם לפי שיקול למשתמש.
הערה: כדאיויות תא leukemic צריכות להישאר ללא שינוי כאשר עוברים תאים דרך עמודות G10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ההתקנה ותרבות מוצלח של מודל שיתוף תרבות זו תגרום להקמת 3 תת-אוכלוסיות של תאים leukemic ביחס בשכבה BMSC או OB חסיד. איור 1 מראה כיצד כל התאים זורעים לתוך בשכבה BMSC בתחילה מופיעים רק מאוכלוסיה אחת של מושעה תאי leukemic. במהלך 4 ימים תאים leukemic אינטראקציה עם BMSC להיווצר 3 תת-אוכלוסיות המרחבי של תאים leukemic (מושעה (S), שלב בהיר (PB), ואפלולי שלב (PD)). בעוד ש -3 תת-האוכלוסיות של תאים סרטניים ניתן לראות בדרך כלל לאחר 24 שעות של תרבות משותפת עם BMSC או OB אנו שיתוף תרבות התאים למשך 4 ימים, כדי לאפשר את הדינמיקה ואת האינטראקציות המלאות בין תאי leukemic ו BMSC / OB התאים להתקיים לפני כל מניפולציה או ניסויים מתקיים (איור 1). כמו כן, יש לציין כי אנו מקיימים את שיתוף התרבויות לעבר מתח חמצן של 5% לשחזר פיזיולוגית מח עצם, אשר יש דבוריםn דווח נע בין 1% -7% 16-18.
רוב המכריע של ניתוח במורד זרם דורש הפרדת תאי leukemic מן BMSC או OB. כדי להשיג זאת אנו משתמשים עמודות G10 למסוק אוכלוסייה טהורה של תאים leukemic (איור 2 א). בעקבות trypsinization של תאים BMSC ו PD Reh אוכלוסייה מעורבת נתפסת על ידי שתי קבוצות אוכלוסיה נפרדות קדימה / הצד ידי cytometry זרימה (תרשים 2B, הפאנל העליון). בעקבות הפרדת G10 אוכלוסייה טהורה של Reh כל תאים רק הוא התאושש, אשר אושר על ידי קדימה / פיזור צד cytometry זרימה (איור 2 ב, פנל תחתון).
השימוש במודל שיתוף התרבות הזה ואת היכולת לבודד תאים leukemic מ 3 תת-אוכלוסיות כאשר שיתוף תרבות עם BMSC או OB מאפשר לחקירה של פנוטיפ התא leukemic ביחס ביחס המיקום המרחבי שלה אל BMSC חסיד או OBבשכבה. מעניינת במיוחד, הוא כי כל התאים התאושש מן האוכלוסייה PD של תרבות שיתוף יש BMSC או OB לא מעט על מנת מוות של תאים בעקבות חשיפה ציטוטוקסיות כימותרפיה (איור 3 א ', ב').
איור 1. כל תאי שיתוף תרבות עם אוכלוסיות מרחבית שלושה טופס BMSC או OB. המעבדה שלנו משתמש מערכת שיתוף תרבות במבחנת מודל אינטראקציות תא leukemic עם תאי סטרומה נגזרו microenvironment מח עצם (BMSC או OB). כדי להקים שיתוף תרבות, תאים leukemic (אדום) הם זורעים על גבי monolayer ומחוברות 80% -90% של BMSC או OB (כחול), אשר מסומן כ"זמן 0 '. Co-תרבויות מתוחזקים על 37 מעלות צלזיוס ב החמצן 5% כדי להגיע לקירוב תנאי במיקרו-סביבה של מח העצם. תאים leukemic יתחילו להיווצר 3 תת-אוכלוסיות מוקדם ככל 24 שעות, אבל כדי לאפשר אינטראקציות מוחלטת FOrm נאפשר ימי שיתוף תרבויות 4 להקים לפני ניצול תאי leukemic לניסויים. במשך היום 4 (לוחות מימין), שלוש תת-אוכלוסיות של תאי leukemic תהווינה ביחס monolayer החסיד. סכמטית (למעלה מימין) ואת מיקרוסקופ לעומת שלב (מימין למטה) להראות את מושעה (S) תאים leukemic צף בחופשיות בתקשורת; בהיר שלב (PB) תאי leukemic אשר מודבקים על משטח של monolayer BMSC או OB; ואת עמום השלב (PD) תאי leukemic כי הגרו מתחת בשכבת BMSC או OB. סרגל קנה מידה מייצג 10 מיקרון. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
השתמש באיור 2. העמודות G10 מאפשרת הפרדה של כל התאים מן BMSC / OB. (א) הפגנה של תהליך באמצעות col G10טור ה להפריד תאים ALL מ BMSC / OB שיתוף תרבות להשיג אוכלוסייה טהורה של תאים סרטניים לניתוח במורד הזרם. משמאל לימין, תערובת של כל תאי BMSC / OB תאים מתווספת בראש עמודת G10; (מרכז) תערובת תאים יהיה להתיישב סלארי G10 וצריך וטופחו על RT במשך 20 דקות (הערה: ברזלים נמצא במצב סגור לאורך שני השלבים הראשונים); (מימין) תאי leukemic הם התאוששו על ידי פתיחת השסתום ושטיפת טור עם התקשורת מחוממת מראש. (ב) פנל למעלה מראה לפני הפרדת G10 כי יש אוכלוסייה מעורבת של תאים המכילים BMSC (שער כחול) Reh תאי ALL (השער אדום ) על ידי הערכה קדימה (FSC) ולפזר בצד (ניתוח SSC). פנל תחתון, לאחר פרידת G10 רק האוכלוסייה הטהורה של Reh תאי ALL (שער אדום) להישאר עם פחות מ 1% זיהום תא סטרומה (שער כחול). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של תי הדמות של.
איור 3. PD תאי leukemic גדלו התנגדות לחשיפת כימותרפיה. SD-1 תאי leukemic התאוששו מן האוכלוסייה PD של שיתוף תרבות BMSC (א) לא להציג כדאיות מופחתת בעקבות חשיפת 4 יום עארה-C [1 מיקרומטר] , MTX [50 מיקרומטר], או VCR [25 מיקרומטר], בדומה לקבוצת ביקורת שלא טופלה (לציין כי מנה השנייה של Ara-C הוסיפה 48 שעות לתת דין וחשבון על כל אובדן תרופה בשל יציבות). תאי leukemic מהתקשורת לבד, S, ואוכלוסיות PB צמצמו כדאיות משמעותית כפי שנקבע על ידי תאי leukemic הכחולים exclusion.SD-1 trypan שיתוף תרבותי עם תאי OB להציג מגמות דומות הכדאי (B). תוצאות מבוטאות ממוצע ± SEM. (*) מציינת p <0.05, ביחס מבחן t מזווג לבקרות מטופל.5fig3large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מחלה שארית מינימלית (MRD) התורמת הישנות של המחלה ממשיכה להיות אתגר קליני מהותי בטיפול עקשן אגרסיבי ALL, כמו גם, שורה של ממאירויות המטולוגיות אחרות. במיקרו-סביבה של מח העצם הוא האתר הנפוץ ביותר של ההתקפים ALL 3,8. ככזה, מודלים שהמודל במיקרו-סביבה של מח העצם הם כלים חיוניים כדי לבחון את ההשערות הקשורות להישרדות ותחזוקה תאים סרטניים leukemic של MRD במהלך החשיפה כימותרפיה. בעוד מודלי עכבר להגדיר את תקן הזהב עבור שאלות בדיקות הקשורות יעילה תרופה, שיתוף תרבות 2D ממשיך להיות מתודולוגיה חסכונית לבחון השערות ואסטרטגיות סמים הקשורים תמיכת microenvironment עצם למחרת הישרדות תא leukemic. קבוצות רבות הראו כי שיתוף התרבות של תאים leukemic עם BMSC או OB מספק יתרון הישרדותי כאשר קרא תיגר עם תרופות כימותרפיות 9,10,12-14,19-21. דוגמנות עבודת CD34 בשלה רגילה + המהתאי topoietic ב שיתוף תרבות עם בתאים גזע mesenchymal (MSC) גילו כי תאי hematopoietic יפעלו עם monolayer החסיד של MSCs להקים שלוש אוכלוסיות מובחנות של תאי hematopoietic 22,23. הפצת נשק והתמיינות של תאי CD34 + נעשתה ביחס למיקום שלהם בתוך שיתוף תרבות 22. הרחבנו על תצפית זו לבחון שאלות הקשורות תמיכת תא סטרומה microenvironment מח עצם של אוכלוסייה עמידה של תאים סרטניים תוך שיתוף תרבות 2D והבידוד שלה לניתוח במורד זרם.
בניגוד למודלים שיתוף תרבות 2D סטנדרטי אשר בדרך כלל מדגם תאים leukemic ידי הסרת הגידול מושעה, המודל שלנו מראה כי שיתוף התרבות מייצג אינטראקציה דינמית יותר שבה תאים leukemic ב שיתוף תרבות עם BMSC או טופס OB שלושה תת-אוכלוסיות יחסית BMSC או בשכבת OB (איור 1). Subpopulations גידול היוצרות מושעה (S) גידול, WHICH הוא צף בחופשיות בתקשורת; שלב בהיר (PB) כי היא דבקה פני השטח של BMSC או OB; ואת עמום שלב (PD) אשר קבור מתחת BMSC או בשכבה OB (איור 1). במודל זה, מצאו כי האכלה קפדנית ולוח זמני זריעה מחדש חשובה להשיג תוצאות עקביות במודל שיתוף תרבות ולכן אנו להאכיל את השיתוף תרבויות ב 4 במרווחי יום ולהעביר גידול monolayers BMSC או OB חדש בכל 12 ימים. זה עשוי לדרוש שינוי עבור סוגי גידולים חלופיים במידת הצורך. מספר התאים הסרטניים כי יהגר מתחת BMSC או OB כדי ליצור את אוכלוסיית PD עשויה להשתנות בין תאי leukemic השונים. זה יכול להיות מגבלה של המודל, כאשר מספר תאים סרטניים PD נמוכים ולכן קשה לאסוף מספיק תאים לניתוח במורד הזרם. במקרים מסוימים בעיה זו ניתן להתגבר על ידי הקמת לשכפל שיתוף תרבויות כדי לאפשר איחוד של שלוש תת-אוכלוסיות הפרט.
כפי מחדש את המודל הזהשוכן על אינטראקצית תאים סרטנית עם BMSC או אוב חשוב יש שיטה יעילה להסרת זיהום תא סטרומה להתייחס ביולוגיה ספציפית של תאי leukemic. כדי להשיג הפרדה זו של תאים סרטניים מ stroma אנו משתמשים עמודות G10. להתקנה ושימוש תקין עמודות אלה הוא קריטי עבור בידוד של אוכלוסיות גידול טהורות לניתוח במורד זרם. מודגש כמו תרשים 2B, ביצוע נאה של תוצאות הפרדת עמודת G10 בהחלמה של תאים סרטניים על יותר מ -99% טוהרים. זה מאפשר ניתוח במורד זרם של תאי leukemic ללא סיבוך של פרשנות של תוצאות שהיו נובעים זיהום תא סטרומה. חשוב לציין שכל סוגי תאי leukemic אם שורות תאים או דגימות חולה עיקריות תשתנינה מעט ביכולתם לעבור דרך עמודות G10. לפני שימוש בניסויים בקנה מידה גדול משתמשים צריכים לקבוע את מספר תאי leukemic הם חייבים קלטו לשחזר את f צורך הכמות הרצויהאו לצרכים במורד הספציפיים שלהם. בנוסף, את כמות חומר הכביסה דרס הדגירה פוסט העמודה G10 ניתן להגדיל לנסות ולהגדיל את מספר התאים התאושש. יש להקפיד על מנת להבטיח כי שטיפות נוספות אינן גורמות לזיהום תאים סטרומה שאותה ניתן לקבוע לשטוף פוסט ידי ספירת תאים או ניתוח תזרים cytometry הזרימה דרך.
בקביעת מודל זה, צפינו כי תאי leukemic התאוששו מן האוכלוסייה PD גדלו כדאיות לעומת תאי leukemic גדל בתקשורת לבד, כמו גם לאלה התאוששו אוכלוסיות S או PB באותה התרבות שיתוף כאשר הם נחשפים ציטוטוקסיות כימותרפיה (איור 3 AB). זה משמעותי משום שהוא מייצג אוכלוסייה של תאים leukemic במבחנה הנובעים הגנה בולטת מהכימותרפיה. זה מספק כלי שימושי כדי לבדוק אסטרטגיות טיפול מכוונות כלפי אוכלוסיית גידול העמיד ביותר, אשר נתמכו על ידיבמיקרו-סביבה של מח העצם. זאת ועוד, מאחר תאי leukemic אלה כל כך טובים מוגן על ידי BMSC או OB שיתוף תרבות זה ניתן אסטרטגיות טיפול משולבים חוץ גופייה, כי תקשורת לבד או מודלי שיתוף תרבות סטנדרטיים לכאורה או יהרגו את הגידול לחלוטין אשר אינו נציג של תופעות שתמיד אפיינתי את אוכלוסיות leukemic עמידות נתמך microenvironment.
לבסוף, אנו מאמינים כי השימוש במודל זה יכול לספק תובנה חשובה אינטראקציות בין BMSC / OB, ותאי leukemic שאחראים עמידות לטיפול כימותרפיה, להוביל MRD, ובהמשך להרע. מודל זה מספק פלטפורמה במבחנה לעצב ניסויים אשר מוטב יודיע מודלים פרה-קליניים במורד הזרם. למרות שאנו מציגים שימוש במודל זה כדי לבדוק אינטראקציות בין תאי סטרומה מח עצם ובכל תאי leukemic נגזר, ואנו תקווה כי כיווני יישומים עתידיים של המודל הזה יהיו לנוeful במגוון ממאירויות שבו במיקרו-סביבה של מח עצם מספק האתר של מקלט עבור גידולים במהלך התערבות כימותרפיות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| G10 sephadex beads | Sigma | G10120 | Referred to in manuscript as gel type 10 cross-linked dextran particles |
| 10 ml sterile syringe | BD | 309604 | |
| Glass wool | Pyrex | 3950 | |
| 1-way stopcocks | World Precision Instruments, Inc. | 14054-10 | |
| 50 ml conical centrifuge tubes | World Wide Medical Products | 41021039 | Used as collection tubes |
| 15 ml conical centrifuge tubes | World Wide Medical Products | 41021037 | Used for cell collection |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F6178 | |
| 0.05% Trypsin | Mediatech, Inc. | 25-053-CI | |
| 100 x 20 mm Cell Culture Dishes | Greiner Bio-One | 664160 | |
| Culture media | |||
| Osteoblast culture media | PromoCell | C-27001 | For human osteoblast media |
| RPMI 1640 media | Mediatech, Inc. | 15-040 | For tumor media prepation |
| Cell lines | |||
| Adherent Cells: | |||
| Human Osteoblasts | PromoCell | C-12720 | Human osteoblast were cultured according to the supplier’s recommendations. |
| Human Bone Morrow Stromal Cells | WVU Biospecimen Core | De-identified primary human leukemia and bone marrow stromal cells (BMSC) were provided by the Mary Babb Randolph Cancer Center (MBRCC) Biospecimen Processing Core and the West Virginia University Department of Pathology Tissue Bank. BMSC cultures were established as previously described (*) | |
| Leukemic Cells: | |||
| REH | ATCC | ATCC-CRL-8286 | REH cells were cultured according to the supplier’s recommendations and recommended media. |
| SD-1 | DSMZ | ACC 366 | SD-1 were cultured according to the supplier’s recommendations and recommended media. |
| (*) Gibson LF, Fortney J, Landreth KS, Piktel D, Ericson SG, Lynch JP. Disruption of bone marrow stromal cell function by etoposide. Biol Blood Marrow Transplant J Am Soc Blood Marrow Transplant. 1997 Aug;3(3):122–32. | |||
References
- Ayala, F., Dewar, R., Kieran, M., Kalluri, R. Contribution of bone microenvironment to leukemogenesis and leukemia progression. Leukemia. 23 (12), 2233-2241 (2009).
- Coustan-Smith, E., Sancho, J., et al. Clinical importance of minimal residual disease in childhood acute lymphoblastic leukemia. Blood. 96 (8), 2691-2696 (2000).
- Gaynon, P. S., Qu, R. P., et al. Survival after relapse in childhood acute lymphoblastic leukemia. Cancer. 82 (7), 1387-1395 (1998).
- Kikuchi, M., Tanaka, J., et al. Clinical significance of minimal residual disease in adult acute lymphoblastic leukemia. Int. J. Hematol. 92 (3), 481-489 (2010).
- Krause, D. S., Scadden, D. T., Preffer, F. I. The hematopoietic stem cell niche-home for friend and foe? Cytometry B Clin. Cytom. 84 (1), 7-20 (2013).
- Meads, M. B., Hazlehurst, L. A., Dalton, W. S. The Bone Marrow Microenvironment as a Tumor Sanctuary and Contributor to Drug Resistance. Clin. Cancer Res. 14 (9), 2519-2526 (2008).
- Nguyen, K., Devidas, M., et al. Factors Influencing Survival After Relapse From Acute Lymphoblastic Leukemia: A Children's Oncology Group Study. Leuk. Off. J. Leuk. Soc. Am. Leuk. Res. Fund UK. 22 (12), 2142-2150 (2008).
- Szczepanek, J., Styczyński, J., Haus, O., Tretyn, A., Wysocki, M. Relapse of Acute Lymphoblastic Leukemia in Children in the Context of Microarray Analyses. Arch. Immunol. Ther. Exp. (Warsz.). 59 (1), 61-68 (2011).
- Boyerinas, B., Zafrir, M., Yesilkanal, A. E., Price, T. T., Hyjek, E. M., Sipkins, D. A. Adhesion to osteopontin in the bone marrow niche regulates lymphoblastic leukemia cell dormancy. Blood. 121 (24), 4821-4831 (2013).
- Bradstock, K., Bianchi, A., Makrynikola, V., Filshie, R., Gottlieb, D. Long-term survival and proliferation of precursor-B acute lymphoblastic leukemia cells on human bone marrow stroma. Leukemia. 10 (5), 813-820 (1996).
- Clutter, S. D., Fortney, J., Gibson, L. F. MMP-2 is required for bone marrow stromal cell support of pro-B-cell chemotaxis. Exp. Hematol. 33 (10), 1192-1200 (2005).
- Manabe, A., Murti, K. G., et al. Adhesion-dependent survival of normal and leukemic human B lymphoblasts on bone marrow stromal cells. Blood. 83 (3), 758-766 (1994).
- Mudry, R. E., Fortney, J. E., York, T., Hall, B. M., Gibson, L. F. Stromal cells regulate survival of B-lineage leukemic cells during chemotherapy. Blood. 96 (5), 1926-1932 (2000).
- Tesfai, Y., Ford, J., et al. Interactions between acute lymphoblastic leukemia and bone marrow stromal cells influence response to therapy. Leuk. Res. 36 (3), 299-306 (2012).
- Hathcock, K. S. Depletion of Accessory Cells by Adherence to Sephadex G-10. Curr. Protoc. , (2001).
- Berniakovich, I., Giorgio, M. Low oxygen tension maintains multipotency, whereas normoxia increases differentiation of mouse bone marrow stromal cells. Int. J. Mol. Sci. 14 (1), 2119-2134 (2013).
- Chow, D. C., Wenning, L. A., Miller, W. M., Papoutsakis, E. T. Modeling pO(2) distributions in the bone marrow hematopoietic compartment. II. Modified Kroghian models. Biophys. J. 81 (2), 685-696 (2001).
- Holzwarth, C., Vaegler, M., et al. Low physiologic oxygen tensions reduce proliferation and differentiation of human multipotent mesenchymal stromal cells. BMC Cell Biol. 11, (2010).
- O'Leary, H., Akers, S. M., et al. VE-cadherin Regulates Philadelphia Chromosome Positive Acute Lymphoblastic Leukemia Sensitivity to Apoptosis. Cancer Microenviron. Off. J. Int. Cancer Microenviron. Soc. 3 (1), 67-81 (2010).
- Wang, L., Chen, L., Benincosa, J., Fortney, J., Gibson, L. F. VEGF-induced phosphorylation of Bcl-2 influences B lineage leukemic cell response to apoptotic stimuli. Leukemia. 19 (3), 344-353 (2005).
- Wang, L., Coad, J. E., Fortney, J. M., Gibson, L. F. VEGF-induced survival of chronic lymphocytic leukemia is independent of Bcl-2 phosphorylation. Leukemia. 19 (8), 1486-1487 (2005).
- Jing, D., Fonseca, A. V., et al. Hematopoietic stem cells in co-culture with mesenchymal stromal cells--modeling the niche compartments in vitro. Haematologica. 95 (4), 542-550 (2010).
- Jing, D., Wobus, M., Poitz, D. M., Bornhäuser, M., Ehninger, G., Ordemann, R. Oxygen tension plays a critical role in the hematopoietic microenvironment in vitro. Haematologica. 97 (3), 331-339 (2012).
