Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

פיתוח של מודל עכברוש מבוסס אלפא-synuclein עבור מחלת פרקינסון באמצעות הזרקת stereotactic של וקטור ויראלי הקשורים מוקטורים

Published: February 28, 2016 doi: 10.3791/53670
Automatic Translation
1, 2, 2, 3,4, 1,4, 1
1Laboratory for Neurobiology and Gene Therapy, Department of Neurosciences, KU Leuven, 2Division of Nuclear Medicine, Leuven University Hospital - KU Leuven, 3Laboratory for Molecular Virology and Gene Therapy, Department of Pharmaceutical and Pharmacological Sciences, KU Leuven, 4Leuven Viral Vector Core, KU Leuven

Abstract

על מנת ללמוד את המסלולים המולקולריים של מחלת פרקינסון (PD) ולפתח אסטרטגיות טיפוליות חדשניות, חוקרים מדעיים להסתמך על מודלים של בעלי חיים. זיהוי של גנים הקשורים PD הוביל פיתוח מודלים PD גנטי. רוב הדגמים עכבר מהונדס α-SYN לפתח פתולוגיה הדרגתית α-SYN אך אינם מצליחים להציג הפסד התא דופאמין ברור וגירעונות התנהגותי תלויים דופמין. המשוכה הזאת נתקפה טיווח ישיר של nigra substantia עם וקטורים ויראליים overexpressing גנים הקשורים PD. למסירת גן מקומית באמצעות וקטורים ויראליים מספקת דרך אטרקטיבית להביע transgenes במערכת העצבים המרכזית. איזורים מסוימים במוח יכולים להיות ממוקדים (למשל nigra substantia), ביטוי יכול להיגרם בסביבה המבוגרת ורמות ביטוי גבוהות יכולות להיות מושגת. יתר על כן, מערכות וקטור שונות המבוססות על וירוסים שונים ניתן להשתמש. הפרוטוקול מתאר את כל שלבים המכריעים לבצע וקטור ויראליזריקת nigra substantia של החולדה לפתח מודל חית אלפא-synuclein מבוסס וקטור ויראלי לטיפול במחלת הפרקינסון.

Introduction

כדי לחקור את פתופיזיולוגיה של PD ולפתח אסטרטגיות טיפוליות חדשניות, יש צורך דחוף במודלים של בעלי החיים כי דומה בנוירופתולוגיה, סימפטומי פיזיולוגית מנוע של PD אדם. את הערך המנבא הגבוה יותר, כך ניטיב יכול לתרגם טיפולים חדשים מ במודלים של בעלי חיים לחולים.

הגילוי-synuclein אלפא (α-SYN) כמו גן PARK לראשונה ב -1997 הוביל לפיתוח של מודלי PD הגנטיים הראשונים. עכברים מהונדסים רבים overexpressing wild-type אדם (WT) או מוטציה (A30P, A53T) α-SYN נוצרו בעשור האחרון. רמות ביטוי יתר α-SYN הוכיחו להיות מכריע בהתפתחות של הפתולוגיה. גם זן העכבר, קיומו או אי קיומו של אנדוגני α-SYN והאם באורך מלא או בגרסה מקוצרת מתבטא, ממלא תפקיד (סקירה מפורטת על ידי מגן Chesselet 1). התבטאות יתר של שניהם WT וכמה מוטציות קליניות של אדם &# 945; -SYN בעכברים טרנסגניים גורם הצטברות פתולוגית של α-SYN וחוסר תפקוד עצבי 2-6. עם זאת, עד במודלים של עכברים α-SYN עכשיו המהונדסים ביותר לא הצליחו להציג פסד תא דופאמין ברור וגירעונות התנהגותי תלוי דופמין.

המשוכה הזאת נתקפה טיווח ישיר של nigra substantia (SN) עם וקטורים ויראליים overexpressing α-SYN. וקטורים ויראליים נגזרים וירוסים שיכולים להדביק תאים בקלות, מציגים את החומר גנטי לתוך הגנום המארח שלהם ולהכריח את התא המארח לשכפל את הגנום הנגיפי על מנת לייצר חלקיקי נגיף חדשים. וירוסים יכולים להיות מהונדסים שאינם משכפלים וקטורים ויראליים כי לשמור על יכולתם לחדור לתאים ולהציג גנים. על ידי מחיקת חלקים של הגנום הויראלי והחליף על ידי הגנים של עניין, יישום של הווקטור יגרום זיהום סיבוב בודד ללא שכפול בתוך התא המארח, המיועד בדרך כלל כמו 'תמרה'. ג וקטורים ויראלייםלשמש ביטוי יתר שניהם להשתקת גנים. את הגן הביע יכול להיות חלבון כתב (חלבון פלואורסצנטי ירוק למשל או בלוציפראז גחלילית) 7, חלבון טיפולי עבור יישומי ריפוי גנטי 8-10 או, כפי נתמקד במאמר זה, חלבון הקשור למחלות המשמש מודלי מחלה 11 -14.

למסירה גן וקטור בתיווך ויראלי מספק דרך חלופית להביע transgenes של מערכת העצבים המרכזית עם מספר יתרונות. באמצעות משלוח transgene מקומי, איזורים מסוימים במוח יכולים להיות ממוקדים. יתר על כן, ביטוי transgene יכול להיגרם במהלך הבגרות בהפחתת הסיכון מנגנוני פיצוי במהלך הפיתוח. כמו כן, ניתן ליצור מודלי מיני זנים שונים. ולבסוף, transgenes השונה ניתן לשלב בקלות. באמצעות וקטורים ויראליים, רמות ביטוי transgene גבוהה יכולה להיות מושגת, אשר עשוי להיות חיוני מאז תחילת וחומרת המחלה תלויה לעתים קרובות על רמת overexpression.

מערכות וקטור כמה מבוססות על וירוסים שונים פותחו. הבחירה של מערכת הווקטור תלוי בגודל של הגן של עניין, את משך הזמן הנדרש של ביטוי גנים, תא המטרה ובעיות בטיחות ביולוגית. עבור העברת גנים יציבה במוח, lentiviral (LV) ו ויראלי adeno הקשורים רקומביננטי (rAAV) וקטורים נחשבים כיום מערכות וקטור בחירה שכן הם להוביל ביטוי גנים יעיל לטווח ארוך במוח המכרסם. עבור מיקוד ספציפי של נוירונים דופאמינרגיים (DN) של SN, וקטורי rAAV יש outcompeted וקטורי LV בהדרגה בגלל טיטר ויעילות התמרה הגבוהה שלהם של DN.

המודלים המכרסמים הכי הטובים מבוסס α-SYN הזמינים כרגע פותחו מתוך גישה משולבת באמצעות קפסיד AAV החדש (1 rAAV, 5, 6, 7, 8) ו אופטימיזציה בונה וקטור, טיטר, וטוהר 15,16. כייל וקטור וכן טוהר וקטור משפיע ישירותהתוצאה פנוטיפי של המודל. titers וקטור מוגזמת או קבוצות וקטור מטוהרים מספיק עלול לגרום לרעילות הלא ספציפית. לכן, וקטורי בקרה נאותים הכרחיים. השקעת זמן ניכרת בייצור, upscaling וקטור ויראלי, ואת הליכי הטיהור גם הוכיחה חיונית להשיג יצוות וקטור איכות לשחזור גבוה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הניסויים בבעלי החיים מבוצעים בהתאם להוראת מועצת הקהילות האירופיות מיום 24 בנובמבר 1986 (86/609 / EEC) ואושרו על ידי הוועדה ביו-האתית של אונ' הלובן (בלגיה).

1. רקומביננטי AAV הפקה וטיהור

הערה: הייצור וטיהור וקטור rAAV בוצע על ידי Core וקטור ויראלי לובן (LVVC) כפי שתואר לעיל 17.

  1. בקצרה, transfect subconfluent נמוך (<50) מעבר חסיד תאים HEK 293T באמצעות polyethylenimine ליניארי 25kD 150 פתרון transfection ננומטר NaCl ושלושה פלסמידים שונים על יחס של 1: 1: 1 ב DMEM בינוני 2% בסרום שור העובר. לאחר 24 שעות של דגירה על 37 מעלות צלזיוס 5% CO 2, להחליף את המדיום עם סרום שור עובר 2% DMEM בינוני טרי.
    הערה: פלסמידים כוללים בונה עבור סרוטיפ AAV7, הפלסמיד העברת AAV קידוד מוטצית A53T האדם α-SYN בשליטה של ​​CMVie משופר synapsהאמרגן in1 ואת הפלסמיד עוזר adenoviral pAdvDeltaF6 17.
  2. קציר 5 ימים בינוני לאחר transfection חולף ולהתרכז באמצעות סינון תזרים משיק 17.
  3. לטהר את חלקיקי וקטור rAAV מהמדיום המרוכז באמצעות שיפוע צעד iodixanol 17.
  4. להשתמש בטכניקות מקובלות של PCR בזמן אמת עבור עותק גנומי (GC) ונחישות. בפרוטוקול זה, כייל וקטור של 3.0 GC E11 / מ"ל שימש לפיתוח מודל עכברוש מבוסס α-SYN עבור 17 PD.

2. הזרקת stereotactic של α-SYN rAAV וקטור ב SN של עכברוש (איור 2)

  1. חולדות Wistar נקבה בת שמונה שבועות בית במשקל של כ 200-250 גרם תחת מחזור אור רגיל 12 hr / כהה עם גישה חופשית למזון pelleted ו מי ברז.
  2. שלח את החולדה הזרקה (IP) הרדמה המכיל תערובת של קטמין (60 מ"ג / ק"ג) ו medetomidine (0.4 מ"ג / ק"ג). לאחר העכברוש הוא מורדם אינו מגיבכאשר לסחוט את הכפות שונים, לנהל מתחת לעור מיקרו-משדר על גב של עכברוש להכרה נוספת באמצעות implanter מיקרו-טרנספונדר. בדוק אם טרנספונדר מייקרו ממוקם כראוי וניתן לקרוא על ידי מכשיר הקריאה.
  3. חותכים את השיער על גבי הקרקפת. החל בהרדמה מקומית משני הקרקפת והאוזניים. בצע את שאר הליך כירורגי תחת זרימה למינרית תוך שימוש בטכניקות aseptic.
  4. מניח את החולדות בתוך מסגרת ראש stereotactic באמצעות שני ברי אוזניים, פה ובר אף. מכסים את הגוף של החולדה בשמיכה נייר כדי למנוע ירידה בחום הגוף. החל סיכה עינית כדי למנוע את העיניים מפני התייבשות.
  5. לחטא את הקרקפת עם 1% jodium ב isopropanol 70% ולעשות חתך קטן קו האמצע של הקרקפת. בעדינות לגרד ממנו את הקרומים על הגולגולת ולשטוף עם מי מלח. תן יבש הגולגולת במשך כמה דקות. שים את התפרים הגולגולת ואת שתי נקודות התייחסות: גבחת ו למבדה. כדי להזריק את וקטור rAAV לתוך SN, להגדיר את הקואורדינטות כלפי גבחת (anteroposterior: 5.3 מ"מ; mediolateral: 2.0 מ"מ ו dorsoventral: 7.2 מ"מ שנמדדות דורה).
    הערה: שלוש הקואורדינטות הממדיות עבור כל אזור של אינטרס יכולות להיות מחושבות באמצעות אטלס stereotaxic של מוח העכברוש, החלת גבחת כנקודת התייחסות אנטומיים.
  6. ממלאים מזרק microinjection 10 μl (30 מד 20 מ"מ) עם וקטור rAAV ולמקם אותו המכשיר stereotaxic מחובר עם משאבה microinjection ממונע. לשלוט בעוצמת הקול על ידי שחרור טיפת וקטור ולחסל בתוך pH חומר ניקוי ניקוי רב ערכי 9 (למשל RBS).
  7. ראייה לבדוק אם הראש מקובע ישר בפריים הראש ולהעריך את ציר ימין-שמאל. בזהירות חזותית להגדיר את הקואורדינטות anteroposterior ו mediolateral עבור גבחת ו למבדה ו למדוד את גובהם באמצעות מחט מ"מ 30 מד 20 בזרוע dorsoventral של מסגרת stereotactic.
    1. אפשר לפנות בוקרaximum הבדל 0.3 מ"מ גובה בין גבחת ו למבדה. מניחים את המחט חזרה על גבחת ולהחיל את anteroposterior קואורדינטות mediolateral ידי הזזת anteroposterior והזרוע mediolateral של מסגרת stereotactic.
  8. במקום ההזרקה, למדוד את גובהם של הגולגולת ולהבטיח שזה לא שונה יותר מ -0.3 מ"מ מגובה של גבחת. לקדוח חור בגולגולת בקוטר של כ -2 מ"מ. מדדו את הגובה של דורה, זה ישמש כנקודת התייחסות ליישם את dorsoventral לתאם. לחלופין לחסר בעובי קבוע עבור הגולגולת (0.9 מ"מ).
  9. לחדור הדורה באמצעות מחט מד 26 ו לספוג את הדם עם רקמה סטרילית. חכו עד שכל דימום הפסיק לפני שתמשיך.
  10. לאט להכניס את המזרק microinjection 10 μl טעון מראש עם פתרון וקטור לתוך המוח לעומק שנקבע מראש (dorsoventral לתאם). מתן 1 דקות עם המחט במקום. להזריק 3 μlשל פתרון וקטור (מיליליטר / עותקים בגנום 3.0 E11 (מנת וקטור בינונית) או 1.0 מיליליטר E12 GC / (מנת וקטור גבוהה) של וקטור מלא מרמת rAAV2 / 7 α-SYN או eGFP) באמצעות משאבת microinjection הממונעת עם תפוקה של 0.25 μl / דקות.
  11. לאחר הזרקה, לשמור את המחט במקום במשך 5 דקות אחרות לפני הסרתו לאט. לתפור את הקרקפת בעזרת קלוע פוליאסטר מצופה 3.0, לחטא עם 1% jodium ב 70% isopropanol בעדינות להסיר את החיה מן מכשיר stereotactic. ראשית לשחרר את הבר האף והפה, ואחר כך את שני ברים אוזניים.
  12. להיפוך הרדמה, להזריק עכברוש intraperitoneally עם 0.5 מ"ג / ק"ג atipamezole ומניחים החולדה בכלוב נקי על צלחת חימום של 38 מעלות צלזיוס עד שהוא מתעורר. מכסים את החולדה בשמיכה נייר כדי למנוע ירידה בחום הגוף.
  13. לספק גישה קלה מזון ומי השעות הראשונות. צג החולדה עבור הימים הראשונים. במידת הצורך ליישם שיכוך כאבים.
    הערה: אין צורך להסיר את התפרים מ tהוא גולגולת. לאחר 1-2 שבועות הגולגולת תתוקן לחלוטין ואת stiches תשתחרר.

3. הערכה מרמת rAAV2 / 7 חולדות מוזרקות α-SYN שימוש לא פולשני הדמית PET, בדיקות התנהגותיות וניתוח immunohistochemical

  1. כדי להמשיך את קינטיקה של ניוון עצבי דופאמין nigrostriatal הלא פולשני לאורך זמן בחיות הפרט, לכמת נשא דופמין (DAT) מחייב באמצעות טומוגרפיית פליטת פוזיטרונים קטן-חיה (PET) נותב של Transporter DA למשל [18 F] -FECT 16 .
  2. המחקר היה לבדוק האם רמת מוחיי דופאמין היא מספיק כדי לגרום לקויות מוטוריות בחולדות, לייחד חולדות במבחן הגליל להעריך שימוש forelimb ספונטני.
    1. מניח את החולדה בתוך 20 סנטימטרי רוחב זכוכית שקוף גליל ווידאוטייפ ההתנהגות במהלך תנועות אנכיות לאורך הקיר והנחיתה לאחר אחורי. ציון מספר אנשי הקשר שנעשה על ידי כל בכפו עבור סכום כולל של 20אנשי קשר. לקבלת תיאור מפורט של קריטריוני הניקוד לראות Schallert et al. 18 לבטא את מספר אנשי קשר forelimb הלקוי (בכפו למשל משמאל) כאחוז קשר forelimb הכולל (משמאל בתוספת התקינה בכפו).
      הערה: חולדות שליטה ללא lesioned באמצעות שני הכפות באותה מידה צריכות להבקיע סביב 50% במבחן הזה.
  3. בצע immunohistochemical (IHC) ניתוח כדי להעריך את רמת הביטוי transgene ואובדן התא דופאמין.
    1. בשלבים קצה שונים, להקריב את החולדות עם ממנת יתר של נתרן pentobarbital (60 מ"ג / ק"ג, IP) ולבצע זלוף intracardial עם מי מלח קר ואחריו paraformaldehyde 4% ב PBS 19. לקבע את המוח לילה ב 4 ° C ופצע 50 מיקרומטר חלקים במוח העטרה עבה באמצעות microtome רוטט.
    2. בצע מכתים IHC על סעיפים "פנויות" באמצעות נוגדנים כנגד α-SYN ו טירוזין hydroxylase לנתח רמות הביטוי α-SYN ואת level מוחיים 16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

התכנית הכוללת של הניסוי מתוארת באיור 1

rAAV 2 / ביטוי יתר בתיווך 7 של A53T α-SYN גורם גירעונות מנוע תלוי דופמין.
מחקר היה לבדוק האם רמת ביטוי יתר α-SYN היא מספיק כדי לגרום לקויות מוטוריות בחולדות, חשפנו חולדות במבחן הגליל להעריך שימוש forelimb ספונטני (איור 3 א). מעל 3 שבועות לאחר ההזרקה, ליקוי מנוע משמעותי נתפסה אצל חולדות שקיבלו מינון 3.0 E11 GC / מ"ל ​​של α-SYN A53T מרמת rAAV2 / 7 וקטור. ב 4 שבועות לאחר הזרקת ירידה של 50% ב נגדי ספונטני (משמאל) שימוש בכפו נצפתה, ואילו שליטת eGFP מרמת rAAV2 / 7 מוזרק חיות לא הראתה אסימטריה בשימוש בכפו (איור 3 ב). חולדות שקיבלו A53T גבוה α-SYN מרמת rAAV2 / מנה וקטור 7 הראה impairm בולטת יותראף אוזן גרון שימוש בכפו (70%) ב -29 ימים לאחר ההזרקה (איור 3 ג). כדי להוכיח כי הלקויות המוטוריות הנצפות היו דופמין-תלוי, אנו מנוהלים במנה אחת של L-DOPA (6 מ"ג / קילו ip) אל החולדות הזריקו מנת וקטור גבוהה. כאשר אנו חוזרים על גליל מבחן 45 דקות לאחר טיפול L-DOPA, החלמה מלאה של השימוש בכפו ב A53T α-SYN מרמת rAAV2 / 7 מוזרק חיות נצפתה (איור 3 ג).

הדמית PET מאפשרת הדמיה לא פולשנית של ניוון עצבי פרוגרסיבית מושרה α-SYN.
כדי להמשיך את קינטיקה של ניוון עצבי דופאמין nigrostriatal הלא פולשני לאורך זמן בחיות הפרט, אנו לכמת נשא דופמין (DAT) מחייב באמצעות טומוגרפיית פליטת פוזיטרונים קטן-חיה (PET) עם [18 F] -FECT כמו radioligand. DAT כריכת ירדו באופן משמעותי-putamen caudate ipsilateral של A53T α-SYN מרמת rAAV2 / 7 injecחולדות טד לאורך זמן אך נותרה יציבה החיה מלאה eGFP (איור 4 א - 4B). כימות של DAT עקדת A53T α-SYN מרמת rAAV2 / 7 מוזרק חיות הראו שיעור מקסימלי של ניוון דופאמין nigrostriatal בין יום 7 ו -21 לאחר ההזרקה. לאחר 32 ימים, ירידת DAT המחייבת של עד 85% נצפתה (4C איור). כביקורת חיובית, הזרקת רעלן עצבי 6-OHDA ב SN המושרה 90% אובדן DAT מחייב תוך 7 ימים (איור 4 ב - 4C).

הזרקת stereotactic של מרמת rAAV2 / 7 A53T α-SYN ב SN של החולדה גורמת מוות של תאי דופאמינרגיים nigral היווצרות של מסיס אגרגטים חיובי α-SYN.
כדי לנתח את רמת α-SYN אובדן תא ביטוי יתר ו דופאמין הקרבנו חיות בנקודות זמן שונות. IHC בוצע על סעיפים "פנויות" באמצעות AG נוגדןainst-synuclein α (ארנב polyclonal 1: 5,000). נוגדן זה יכול לזהות הן α-synuclein אדם העכברוש, אבל רמות אנדוגני של synuclein α חולדה היו מתחת לתחום גילוי בתוך somata תא nigral, בשל הלוקליזציה השולטת שלה ב ממברנות הסינפטי. כדי ישבנים תא הפסד השתמשנו נוגדן כנגד TH (ארנב polyclonal 1: 1,000).

ארבעה ימים לאחר ההזרקה וקטור rAAV, α-SYN או ביטוי eGFP זוהה SN (איור 5 א - 5C) של חולדות. הרוב (> 90%) של DN היה transduced ביעילות הוא חלבונים מהונדסים היו נקודות של גופי תא אקסונים. בגיל 29 ימים לאחר ההזרקה (pi) להפחתה ניכרת בביטוי α-SYN נצפתה SNpc, בזמן שהוא היה עדיין להבחין באזורים המקיפים את SN (איור 5 ב - 5 ג). לאחר מכן, ניתחנו את רמת אובדן התא nigral. עיגול אובדן מהיר ומתקדםf עד 80% של נוירונים TH-חיובי זוהה מעל 29 ימים בחולדות הזריקו α-SYN A53T מרמת rAAV2 / 7 (איור 5D - 5H). מן הראוי לציין כי ביטוי יתר של סוג בר במקום A53T α-SYN הביא ניוון מוחיים דופאמין דומים (מידע לא מוצג). ההפסד של DN ב SN היה מקביל לירידה חזקה של מסוף עצב TH-חיובי בסטריאטום (STR) (איור 5F). כדי לשלול תופעות יצוו וקטור ספציפיים, הכנות וקטור α-SYN שונים נבדקו SN עם תוצאות דומות. אי הפחתת מכתים TH נצפתה SN או STR של eGFP מרמת rAAV2 / 7 מוזרק חיות בקרה (איור 5E-5H). ליד ניוון מוחיה דופאמין, בנוכחות α-synucleinopathy הוא סימן היכר חשוב שני של PD. למרות כמובן זמן קצר של המודל שלנו (ארבעה שבועות), צפינו בשני α-SYN-חיובי אגרגטים cytoplasmic ב את המספר הסידורי וגילו neurites דיסטרופי ב STR (איור 5i אונג>). Immunoreactivity יוביקוויטין היא תכונה ייחודית של פתולוגיה גופיפי לוי במוח האנושי 20-22. צפינו שיתוף לוקליזציה של α-SYN ו היוביקוויטין ב pi 29 ימים בשבריר (± 20%) של α-SYN להביע עצב nigral (איור 5 'י). האופי הסיבי של אגרגטים α-SYN הוערך על ידי Thioflavin S (Thio S) מכתים 23. Thio S תאים חיוביים אותרו SN מ -17 ימים ואילך (איור 5 'י).

איור 1
איור 1:. הזרקת stereotactic של תוצאות וקטור מרמת rAAV2 / 7 α-SYN בתהליכי ניוון מוחיים מתקדמת הזרקת stereotactic של וקטור מרמת rAAV2 / 7 α-SYN ב SN של חולדה גורם ניוון מוחיים דופאמין נמדד באמצעות ניתוח התנהגות (מבחן צילינדר), לא פולשנית PET הדמיה וניתוח IHC.ד / 53,670 / 53670fig1large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2: הזרקת stereotactic של קידוד מרמת rAAV2 / 7 וקטור α-SYN ב SN של החולדה. (A, B, E) תפרי הגולגולת על גולגולת העכברוש, המגדירים את שתי נקודות ציון: גבחת ו למבדה. (C) אטלס stereotaxic של המוח עכברוש הצגת באזור ההזרקה כלומר SN. (ד) Wistar חולדה ממוקמת בתוך מסגרת ראש stereotactic באמצעות שני ברי אוזניים, פה ובר אף. (F) המחט 30 מד מלא וקטור מושם למצב של nigra substantia. (ז) כל ​​קטן הוא קדח באתר הזרקה ואת המחט ממוקמת בעמדה. (H) לאחר הזרקת הקרקפת היא Stitched ולחטא. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3: rAAV 2/7 בתיווך ביטוי יתר של A53T α-SYN גורם גירעונות מנוע תלויי דופמין (A, B) מבחן צילינדר בנקודות זמן שונות לאחר ההזרקה של מרמת rAAV2 / 7 A53T α-SYN.. (ממוצע ± סטיית תקן, * p <0.05 לעומת 17 ימים, # p <0.05 שולטת eGFP ידי ANOVA ו Tukey פוסט הוק הבדיקה, n = 5). (C) בדיקת צילינדר בנקודות זמן שונה לאחר ההזרקה של מרמת rAAV2 / 7 α-SYN A53T (מנת וקטור גבוהה). (ממוצע ± סטיית תקן, * p <0.05 4 ימים לעומת 29 ימים על ידי ANOVA ו Tukey פוסט הוק הבדיקה, n = 5). המבחן בוצע עם או ללא ניהול של Levodopa (L-DOPA). (ממוצע ± סטיית תקן, * p <0.05 שאינם מטופלים לעומת חיות שטופלו על ידי ANOVA ו Tukey פוסט הוק הבדיקה, n = 5). נדפס מן לנוירוביולוגיה של הזדקנות, Vol. 36, ואן דר Perren et al., מעקב ואפיון אורכית מודל עכברוש חזק למחלת פרקינסון מבוססת על ביטוי יתר של אלפא-synuclein עם וקטורים ויראליים adeno קשור, 1543-1558, (2015), באישור Elsevier. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4:. לא פולשני הדמיה של A53T α-SYN מוות של תאים דופאמינרגיים המושרה שימוש בבדיקת PET DAT (A - B) סדרה של חתכים אופקיים ו העטרה המתארים DAT striatal ממוצע עקדת (א) מרמת rAAV2 / 7 A53T α-SYN מוזרק חיות ב בידולt זמן נקודות לאחר ההזרקה (n = 7) ו- (ב) מרמת rAAV2 / 7 eGFP המוזרק (n = 1) או 6-OHDA מטופלי חיות בקרה (n = 1) 79 ימים לאחר ההזרקה. ברי צבע מצביעים פוטנציאלים מחייבים את DAT. (C) כימות של DAT עקדת מרמת rAAV2 / 7 A53T α-SYN, מרמת rAAV2 / 7 eGFP ו -6-OHDA מוזרק חיות נמדד בנקודות זמן שונות (הנתונים מייצגים ממוצע ± סטיית תקן). נדפס מן לנוירוביולוגיה של הזדקנות, Vol. 36, ואן דר Perren et al., מעקב ואפיון אורכית מודל עכברוש חזק למחלת פרקינסון מבוססת על ביטוי יתר של אלפא-synuclein עם וקטורים ויראליים adeno קשור, 1543-1558, (2015), באישור Elsevier. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
איור 5: ביטוי יתר בתיווך 7 rAAV 2 / של A53T α-SYN גורם מוות של תאי דופאמינרגיים היווצרות מסיסים אגרגטים חיוביים α-SYN. (A - B) מכתים IHC הוכחת α-SYN ביטוי יתר 4 ימים ו -29 ימים לאחר העברה בתיווך rAAV ב SN חולדה. הוספת להראות בהגדלה של האזור הנבחר. סרגל קנה מידה = 400 מיקרומטר (תמונת סקירה משמאל), 70 מיקרומטר ו -200 מיקרומטר (מוסיף מימין). (C) מכתים IHC הוכחת ביטוי יתר eGFP 4 ימים ו -29 ימים לאחר העברת בתיווך rAAV ב SN חולדה. סרגל קנה מידה = 400 מיקרומטר. (D - G) מכתים IHC עבור TH ב SN ו STR בנקודות זמן שונות לאחר ההזרקה של (D, F) מרמת rAAV2 / 7 α-SYN או 29 ימים לאחר ההזרקה של (E, G) מרמת rAAV2 / 7 eGFP ב SN . סולם בר, c = 400 מיקרומטר, ב, ד = 1,000 מיקרומטר. (H) כימות stereological של תחושהאה של נוירונים TH-חיובי SN לאורך זמן לאחר מרמת rAAV2 / 7 A53T α-SYN זריקה או מרמת rAAV2 / 7 וקטור מלאה eGFP (ממוצע ± סטיית תקן, * p <0.05 לעומת 8 ימים, # p <0.05 לעומת שולטת eGFP ידי ANOVA ו מבחן הוק Tukey פוסט, n = 5). (I) מכתים IHC הוכחת פתולוגיה α-SYN, לרבות אגרגטים cytoplasmic ב את המספר הסידורי וגילו דיסטרופי ו neurites בולטות ב STR, לאחר intranigral מרמת rAAV2 / 7 A53T הזרקת α-SYN. (J) תמונות confocal נציג של immunostainings כפול ניאון עבור α-SYN (ירוק) היוביקוויטין (אדום) להראות עלייה שיתוף לוקליזציה לאורך זמן (חיצים). ג בר סולם = 50 מיקרומטר. Thioflavin S מכתים של SN 29 ימים לאחר ההזרקה של מרמת rAAV2 / 7 A53T α-SYN. סרגל קנה מידה D = 30 מיקרומטר. נדפס מן לנוירוביולוגיה של הזדקנות, Vol. 36, ואן דר Perren et al., עד-מעקב אורך ואפיון של מודל עכברוש חזקים למחלת פרקינסון מבוסס על ביטוי יתר של synuclein-אלפא עם המודעהEno הקשורים וקטורים ויראליים, 1543-1558, (2015), באישור Elsevier. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ישנם מספר שלבים קריטיים בתוך הפרוטוקול. כייל וקטור וכן טוהר וקטור השפיע באופן ישיר על התוצאה פנוטיפי של המודל. titers וקטור מוגזמת או קבוצות וקטור מטוהרים מספיק עלול לגרום לרעילות הלא ספציפית. לכן, השימוש של אצוות וקטור באיכות גבוהה וקטורי בקרה נאותים הוא הכרחי. יתר על כן, המיקום המדויק של ראשו של החולדה בתוך מסגרת stereotaxic ואת הקביעה המדויקת של הקואורדינטות חיוני מיקוד nigra substantia. לאחר קידוח החור בגולגולת באתר הזרקה, חשוב להכניס את המחט ישר לתוך המוח של העכברים, אך לא נגע שוליים. המחט צריכה להסירו לאט לאחר הזרקת וקטור ויראלי, כדי למנוע דליפת וקטור. לבסוף, לאחר תפרים, הקרקפת יש לחטא עם 1% jodium ב isopropanol 70%, כדי למנוע נשיכה של stiches ידי בעלי חיים אחרים. לחלופין ריאגנטים חיטוי אחריםניתן להשתמש.

השיטה המתוארת יכול לשמש גם כדי לפתח מודל עכברים מבוסס מרמת rAAV2 / 7 α-SYN למחלת הפרקינסון 24. בעכברים אנו מזריקים בהיקף של וקטור rAAV 2 μl של SN. לעומת חולדות, עכברים DN נראה קצת פחות רגיש אלפא-SYN ביטוי יתר, וכתוצאה מכך ביטוי מתעכב מוחיים. יתר על כן, אזורים אחרים במוח (למשל הסטריאטום, ההיפוקמפוס, קליפה, וכו ') יכולים להיות ממוקדים. את הקואורדינטות של אזורי המוח השונים ניתן למצוא באטלס stereotaxic. אופטימיזציה של הקואורדינטות יכול להיעשות על ידי דיו סיני או באמצעות וקטור ויראלי קידוד גן כתב (למשל eGFP). מערכות וקטורים שונים (rAAV, LV, וכו ') ניתן להשתמש בהתאם ליישום.

טכניקה זו יש מגבלה כל חיה חייבת להיות מוזרקת בנפרד. לכן אדם מאומן צריך לבצע את הזריקות כדי לקבוע מינימוםוריאציות imize בין בעלי חיים שונים. מגבלה נוספת היא כי השיטה היא גוזל זמן (כשיוצא לפועל ע"י אדם מאומן זה לוקח בערך 45 דקות לכל בעל חיים). רק שמונה עד עשר חיות ניתן להזריק ביום אחד.

למסירת גן וקטור בתיווך ויראלי מאפשרת לך לבצע מיקוד ספציפי של אזורים במוח. באמצעות וקטורים ויראליים, רמות ביטוי transgene גבוהה יכולות להיות מושגות, שהוא חיוני מאז התפרצות חומרת מחלה תלויה ברמת ביטוי α-SYN. כמו כן, ניתן ליישם מינונים שונים אשר יגרמו במודל חיה מוצגת קינטיקה איטית או מהירה יותר של ניוון עצבי. לבסוף, טכניקה זו יכולה לשמש כדי ליצור מודלים מיני בעלי חיים שונים זני שימוש באותו הכנת הווקטור.

הליך זה יכול לשמש כדי לספק וקטורים ויראליים וכן רעלים (למשל 6-OHDA) לאזורים שונים של transgene brain.The המקודד על ידי הווקטור יכול להיות חלבון כתב, עמ 'טיפוליrotein ליישומי ריפוי גנטי 8-10 או חלבון הקשורים למחלות המשמש מודלי מחלה 11-14. טכניקה זו יכולה לשמש לפיתוח מודלים של בעלי חי רומן המאפשרים בדיקות סמים פרה יכולה להיות מועיל בלימוד את המנגנון המולקולרי של מחלת פרקינסון, כמו גם רבי הפרעות ניווניות אחרות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

החוקרים מצהירים כי אין ניגוד עניינים ממשי או פוטנציאלי.

Acknowledgments

המחברים מודים יוריס ון Asselberghs ואן ואן Santvoort לקבלת הסיוע הטכני המעולה שלהם. המחקר מומן על ידי IWT-Vlaanderen (IWT SBO / 80,020), את Vlaanderen FWO (G.0768.10), על ידי תוכנית EC-FP6 "דימי" (LSHB-CT-2005-512,146), את MEFOPA פרויקט FP7 RTD (HEALTH -2,009-241,791), התוכנית FP7 'INMiND' (HEALTH-F2-2011-278850), לובן KU (צה"ל-KP / 07/001, OT / 08 / 052A, Imir PF / 10/017), ואת MJFox קרן (אימות יעד 2010). א ואן דר Perren ו Casteels ג הם עמיתים הבתר של הקרן הפלמי של מחקר מדעי. ק ואן Laere הוא עמית קליני בכיר של הקרן הפלמי של מחקר מדעי.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Female 8 weeks old Wistar rats Janvier / 200-250 g
Ketamine (Nimatek) Eurovet animal health 804132
Medetomidine (Dormitor) Orion-Pharma/ Janssen Animal Health 1070-499
 Local anesthetic for scalp and ears: Xylocaïne 2% gel Astrazeneca 0137-547
Terramycine Pfizer 0132-472
Buprénorphine (Vetergesic) Ecuphar 2623-627
Jodium 1% isopropanol VWR 0484-0100
stereotactic head frame Stoeling /
Hamilton Syringe (30 gauge -20 mm -pst 2) Hamilton/ Filter Service 7803-07
atipamezole (Antisedan) Orion-Pharma/Elanco 1300-185
rAAV A53T α-SYN vector LVVC, KU Leuven / https://gbiomed.kuleuven.be/english/research/50000715/laboratory-of-molecular-virology-and-gene-therapy/lvvc/
sodium pentobarbital (Nembutal) Ceva Santé 0059-444
microtome Microm HM650
rabbit polyclonal synuclein Ab Chemicon 5038 1:5,000
rabbit polyclonal TH Ab Chemicon 152 1:1,000
Lutetium oxyorthosilicate detector-based FOCUS 220 tomograph Siemens/ Concorde Microsystems /
radioligand: 18F-FECT In house /
L-dopa: Prolopa 125 Roche 6 mg/kg i.p.
DMEM, Glutamax Life Technologies N° 31331-093
Foetal bovine serum Life Technologies N° 10270-106
25 kD linear polyethylenimine (PEI) Polysciences /
OptiPrep Density Gradient Medium: Iodixanol Sigma D1556-250ML
Optimen Life Technologies N° 51985-026
Paxinos 1 watston steretactic atlas, fourth Edition Elsevier /

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Magen, I., Chesselet, M. F. Genetic mouse models of Parkinson's disease The state of the art. Prog Brain Res. 183, 53-87 (2010).
  2. Masliah, E., et al. Dopaminergic loss and inclusion body formation in alpha-synuclein mice: implications for neurodegenerative disorders. Science. 287, 1265-1269 (2000).
  3. Freichel, C., et al. Age-dependent cognitive decline and amygdala pathology in alpha-synuclein transgenic mice. Neurobiol Aging. 28, 1421-1435 (2007).
  4. Fleming, S. M., Fernagut, P. O., Chesselet, M. F. Genetic mouse models of parkinsonism: strengths and limitations. NeuroRx. 2, 495-503 (2005).
  5. Kahle, P. J., et al. Selective insolubility of alpha-synuclein in human Lewy body diseases is recapitulated in a transgenic mouse model. Am J Pathol. 159, 2215-2225 (2001).
  6. Chesselet, M. F., Richter, F. Modelling of Parkinson's disease in mice. Lancet Neurol. 10, 1108-1118 (2011).
  7. Deroose, C. M., Reumers, V., Debyser, Z., Baekelandt, V. Seeing genes at work in the living brain with non-invasive molecular imaging. Curr Gene Ther. 9, 212-238 (2009).
  8. Manfredsson, F. P., et al. rAAV-mediated nigral human parkin over-expression partially ameliorates motor deficits via enhanced dopamine neurotransmission in a rat model of Parkinson's disease. Exp Neurol. 207, 289-301 (2007).
  9. Vercammen, L., et al. Parkin protects against neurotoxicity in the 6-hydroxydopamine rat model for Parkinson's disease. Mol Ther. 14, 716-723 (2006).
  10. Winklhofer, K. F. The parkin protein as a therapeutic target in Parkinson's disease. Expert opinion on therapeutic targets. 11, 1543-1552 (2007).
  11. Kirik, D., et al. Parkinson-like neurodegeneration induced by targeted overexpression of alpha-synuclein in the nigrostriatal system. J Neurosci. 22, 2780-2791 (2002).
  12. Kirik, D., et al. Nigrostriatal alpha-synucleinopathy induced by viral vector-mediated overexpression of human alpha-synuclein: a new primate model of Parkinson's disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 2884-2889 (2003).
  13. Lauwers, E., et al. Neuropathology and neurodegeneration in rodent brain induced by lentiviral vector-mediated overexpression of alpha-synuclein. Brain pathology. 13, 364-372 (2003).
  14. Klein, R. L., King, M. A., Hamby, M. E., Meyer, E. M. Dopaminergic cell loss induced by human A30P alpha-synuclein gene transfer to the rat substantia nigra. Hum Gene Ther. 13, 605-612 (2002).
  15. Vander Perren, A., Van den Haute, C., Baekelandt, V. Viral Vector-Based Models of Parkinson's Disease. Curr Top Beh Neurosci. , (2014).
  16. Van der Perren, A., et al. Longitudinal follow-up and characterization of a robust rat model for Parkinson's disease based on overexpression of alpha-synuclein with adeno-associated viral vectors. Neurobiol Aging. , (2014).
  17. Van der Perren, A., et al. Efficient and stable transduction of dopaminergic neurons in rat substantia nigra by rAAV 2/1, 2/2, 2/5, 2/6.2, 2/7, 2/8 and 2/9. Gene Ther. , (2011).
  18. Schallert, T., Fleming, S. M., Leasure, J. L., Tillerson, J. L., Bland, S. T. CNS plasticity and assessment of forelimb sensorimotor outcome in unilateral rat models of stroke, cortical ablation, parkinsonism and spinal cord injury. Neuropharmacology. 39, 777-787 (2000).
  19. Soueid, J., Nokkari, A., Makoukji, J. Techniques and Methods of Animal Brain Surgery: Perfusion, Brain Removal, and Histological Techniques. Brain Neurotrauma: Molecular, Neuropsychological, and Rehabilitation Aspects. Frontiers in Neuroengineering. , (2015).
  20. Dale, G. E., et al. Relationships between Lewy bodies and pale bodies in Parkinson's disease. Acta Neuropathol. 83, 525-529 (1992).
  21. Dawson, V. L. Neurobiology of flies and mice. Science. 288, 631-632 (2000).
  22. Dawson, T., Mandir, A., Lee, M. Animal models of PD: pieces of the same puzzle? Neuron. 35, 219-222 (2002).
  23. LeVine, H. 3rd Quantification of beta-sheet amyloid fibril structures with thioflavin T. Methods Enzymol. 309, 274-284 (1999).
  24. Oliveras-Salva, M., et al. rAAV2/7 vector-mediated overexpression of alpha-synuclein in mouse substantia nigra induces protein aggregation and progressive dose-dependent neurodegeneration. Mol Neurodegener. 8, (2013).

Tags

רפואה גיליון 108 וקטורי rAAV במודל חיה מחלת פרקינסון אלפא-synuclein זריקות stereotactic תמרת המוח
פיתוח של מודל עכברוש מבוסס אלפא-synuclein עבור מחלת פרקינסון באמצעות הזרקת stereotactic של וקטור ויראלי הקשורים מוקטורים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Van der Perren, A., Casteels, C.,… More

Van der Perren, A., Casteels, C., Van Laere, K., Gijsbers, R., Van den Haute, C., Baekelandt, V. Development of an Alpha-synuclein Based Rat Model for Parkinson's Disease via Stereotactic Injection of a Recombinant Adeno-associated Viral Vector. J. Vis. Exp. (108), e53670, doi:10.3791/53670 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter