Разработка альфа-синуклеина основе Rat модели для лечения болезни Паркинсона с помощью стереотаксической инъекции рекомбинантного аденосателлитные вирусного вектора
Summary
This manuscript describes how viral vector-mediated local gene delivery provides an attractive way to express transgenes in the central nervous system. The protocol outlines all crucial steps to perform a viral vector injection in the substantia nigra of the rat to develop a viral vector-based animal model for Parkinson’s disease.
Abstract
Для изучения молекулярных путей, болезни Паркинсона (PD) и разработки новых терапевтических стратегий, научные исследователи полагаются на животных моделях. Идентификация PD-ассоциированных генов привело к разработке генетических моделей PD. Наиболее трансгенные модели α-SYN мыши развивать постепенное α-SYN патологии, но не могут отображать четкую потерю дофаминергическая клеток и допамин зависит от поведенческих проблем. Этот барьер был преодолен путем прямого нацеливания черной субстанции с вирусными векторами избыточно экспрессирующих PD-ассоциированных генов. Локальная доставка гена с использованием вирусных векторов обеспечивает привлекательный способ выразить трансгенов в центральной нервной системе. Конкретные области мозга могут быть ориентированы (например , черной субстанции), экспрессия может быть индуцирована в обстановке взрослых и высокие уровни экспрессии могут быть достигнуты. Кроме того, можно использовать различные векторные системы на основе различных вирусов. Протокол описывает все важные шаги для выполнения вирусного вектораинъекции в черной субстанции у крысы разработать вирусный вектор на основе альфа-синуклеина животной модели болезни Паркинсона.
Introduction
Для изучения патофизиологии PD и для разработки новых терапевтических стратегий, существует настоятельная потребность в животных моделях, которые близко напоминают невропатологии, физиологии и двигательных симптомов человека PD. Чем выше прогностическая ценность, тем лучше мы можем перевести новые методы лечения от животных моделей для пациентов.
Обнаружение альфа-синуклеина (α-SYN) в качестве первого гена парк в 1997 году привело к разработке первых генетических моделей PD. Многие трансгенные мыши сверхэкспрессией человека дикого типа (WT) или мутантного (A30P, A53T) α-SYN были получены за последнее десятилетие. Уровни α-син сверхэкспрессии оказались решающими в развитии патологии. Кроме того , штамм мыши, наличие или отсутствие эндогенного альфа-син и будет ли полная длина или укороченная форма выражается, играет определенную роль (подробный обзор Маген и Chesselet 1). Сверхэкспрессия как WT и нескольких клинических мутантов человека &# 945; -SYN у трансгенных мышей вызывает патологическое накопление альфа-син и нейронной дисфункции 2-6. Тем не менее, до сих пор наиболее трансгенные модели α-син мышь не удалось отобразить четкие потери дофаминергическая клеток и допамин-зависимых поведенческих дефицитов.
Этот барьер был преодолен путем прямого нацеливания черной субстанции (SN) с вирусными векторами избыточно экспрессирующих альфа-син. Вирусные векторы являются производными от вирусов, которые могут легко инфицировать клетки, вводят генетический материал в их геном хозяина и заставить клетки-хозяина для репликации вирусного генома с целью получения новых вирусных частиц. Вирусы могут быть сконструированы для не-тиражирование вирусных векторов, которые сохраняют свою способность проникать в клетки и ввести гены. При удалении части вирусного генома, и заменяя их генами, представляющие интерес, применение вектора приведет к одной круглой инфекции без репликации в клетке-хозяине, в целом обозначенный как '' трансдукции. Вирусные векторы сиспользоваться как для избыточной экспрессии и молчанием генов. Выраженная трансген может быть репортером белок (например , зеленый флуоресцентный белок или люциферазы светляков) 7, терапевтический белок для генной терапии приложений 8-10 или, как мы сосредоточимся в этой статье, это болезнь , связанных с белком , используемым для моделирования заболевания 11 -14.
Вирусный вектор-опосредованной доставки генов обеспечивает альтернативный способ выразить трансгенов в ЦНС с несколькими преимуществами. Использование локальной доставки трансгена, специфические области мозга могут быть направлены. Кроме того, экспрессия трансгенов может быть вызван во взрослую жизнь уменьшая риск появления компенсаторных механизмов в процессе развития. Кроме того, модели могут быть созданы в различных видов и штаммов. И, наконец, различные трансгены могут быть легко объединены. С помощью вирусных векторов, уровни экспрессии высокого трансгенные может быть достигнуто, что может иметь решающее значение, так как начало заболевания и тяжесть часто зависит от уровня Переэксression.
Было разработано несколько векторных систем, основанных на различных вирусов. Выбор векторной системы зависит от размера представляющего интерес гена, необходимого продолжительности экспрессии гена, клетки-мишени и вопросы биологической безопасности. Для получения стабильного переноса генов в головном мозге, лентивирусов (LV) и рекомбинантный адено-ассоциированный Viral (Раав) векторов в настоящее время считаются векторные системы выбора, так как они приводят к эффективному и долгосрочному экспрессии генов в мозге грызунов. Для конкретного нацеливания дофаминергических нейронов (DN) в SN, Раав векторы постепенно outcompeted векторы ЛЖ из-за их более высоких титрах и эффективности трансдукции DN.
Лучшие модели , основанные на грызунах α-SYN , доступные в настоящее время были разработаны на основе комбинированного подхода с использованием более новых AAV серотипов (Раав 1, 5, 6, 7, 8) и оптимизированы векторные конструкции, титры и чистота 15,16. Вектор титра, а также чистота вектор непосредственно влияетфенотипический результат модели. Чрезмерные векторные титры или недостаточно очищенные векторные партии могут приводить к неспецифической токсичностью. Поэтому соответствующие управляющие векторы являются обязательными. Значительные инвестиции время в вирусный вектор производства, укрупнения и процедуры очистки также доказали важное значение для получения воспроизводимых и высококачественные векторные партии.
Protocol
Representative Results
Discussion
Есть несколько важных шагов в рамках протокола. Вектор титра, а также чистота вектор непосредственно влияет на фенотипическое исход модели. Чрезмерные векторные титры или недостаточно очищенные векторные партии могут приводить к неспецифической токсичностью. Таким образом, использо…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят Йорис Ван Asselberghs и Энн Ван Santvoort за отличную техническую помощь. Исследование финансировалось ИВТ-Vlaanderen (ИВТ SBO / 80020), в FWO Фландрии (G.0768.10), программой EC-FP6 'Dimi' (LSHB-CT-2005-512146), проект MEFOPA FP7 RTD (Health -2009-241791), программа FP7 "InMind" (ЗДОРОВЬЕ-F2-2011-278850), Ку-Лёвен (IOF-KP / 07/001, OT / 08 / 052A, IMIR PF / 10/017), а также MJFox Foundation (Целевая проверка 2010). А. Ван дер Перрен и С. Casteels являются постдокторской фламандского фонда научно-исследовательских работ. К. Ван Laere является старшим клинический сотрудник фламандского фонда научных исследований.
Materials
| Female 8 weeks old Wistar rats | Janvier | / | 200-250 g |
| Ketamine (Nimatek) | Eurovet animal health | 804132 | |
| Medetomidine (Dormitor) | Orion-Pharma/ Janssen Animal Health | 1070-499 | |
| Local anesthetic for scalp and ears: Xylocaïne 2% gel | Astrazeneca | 0137-547 | |
| Terramycine | Pfizer | 0132-472 | |
| Buprénorphine (Vetergesic) | Ecuphar | 2623-627 | |
| Jodium 1% isopropanol | VWR | 0484-0100 | |
| stereotactic head frame | Stoeling | / | |
| Hamilton Syringe (30 gauge -20mm -pst 2) | Hamilton/ Filter Service | 7803-07 | |
| atipamezole (Antisedan) | Orion-Pharma/Elanco | 1300-185 | |
| rAAV A53T α-SYN vector | LVVC, KU Leuven | / | https://gbiomed.kuleuven.be/english/research/50000715/laboratory-of-molecular-virology-and-gene-therapy/lvvc/ |
| sodium pentobarbital (Nembutal) | Ceva Santé | 0059-444 | |
| microtome | Microm | HM650 | |
| rabbit polyclonal synuclein Ab | Chemicon | 5038 | 1:5000 |
| rabbit polyclonal TH Ab | Chemicon | 152 | 1:1000 |
| Lutetium oxyorthosilicate detector-based FOCUS 220 tomograph | Siemens/ Concorde Microsystems | / | |
| radioligand: 18F-FECT | In house | / | |
| L-dopa: Prolopa 125 | Roche | 6mg/kg i.p. | |
| DMEM, Glutamax | Life Technologies | N° 31331-093 | |
| Foetal bovine serum | Life Technologies | N° 10270-106 | |
| 25 kD linear polyethylenimine (PEI) | Polysciences | / | |
| OptiPrep Density Gradient Medium: Iodixanol | Sigma | D1556-250ML | |
| Optimen | Life Technologies | N° 51985-026 | |
| Paxinos 1 watston steretactic atlas, fourth Edition | Elsevier | / |
References
- Magen, I., Chesselet, M. F. Genetic mouse models of Parkinson’s disease The state of the art. Prog Brain Res. 183, 53-87 (2010).
- Masliah, E., et al. Dopaminergic loss and inclusion body formation in alpha-synuclein mice: implications for neurodegenerative disorders. Science. 287, 1265-1269 (2000).
- Freichel, C., et al. Age-dependent cognitive decline and amygdala pathology in alpha-synuclein transgenic mice. Neurobiol Aging. 28, 1421-1435 (2007).
- Fleming, S. M., Fernagut, P. O., Chesselet, M. F. Genetic mouse models of parkinsonism: strengths and limitations. NeuroRx. 2, 495-503 (2005).
- Kahle, P. J., et al. Selective insolubility of alpha-synuclein in human Lewy body diseases is recapitulated in a transgenic mouse model. Am J Pathol. 159, 2215-2225 (2001).
- Chesselet, M. F., Richter, F. Modelling of Parkinson’s disease in mice. Lancet Neurol. 10, 1108-1118 (2011).
- Deroose, C. M., Reumers, V., Debyser, Z., Baekelandt, V. Seeing genes at work in the living brain with non-invasive molecular imaging. Curr Gene Ther. 9, 212-238 (2009).
- Manfredsson, F. P., et al. rAAV-mediated nigral human parkin over-expression partially ameliorates motor deficits via enhanced dopamine neurotransmission in a rat model of Parkinson’s disease. Exp Neurol. 207, 289-301 (2007).
- Vercammen, L., et al. Parkin protects against neurotoxicity in the 6-hydroxydopamine rat model for Parkinson’s disease. Mol Ther. 14, 716-723 (2006).
- Winklhofer, K. F. The parkin protein as a therapeutic target in Parkinson’s disease. Expert opinion on therapeutic targets. 11, 1543-1552 (2007).
- Kirik, D., et al. Parkinson-like neurodegeneration induced by targeted overexpression of alpha-synuclein in the nigrostriatal system. J Neurosci. 22, 2780-2791 (2002).
- Kirik, D., et al. Nigrostriatal alpha-synucleinopathy induced by viral vector-mediated overexpression of human alpha-synuclein: a new primate model of Parkinson’s disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 2884-2889 (2003).
- Lauwers, E., et al. Neuropathology and neurodegeneration in rodent brain induced by lentiviral vector-mediated overexpression of alpha-synuclein. Brain pathology. 13, 364-372 (2003).
- Klein, R. L., King, M. A., Hamby, M. E., Meyer, E. M. Dopaminergic cell loss induced by human A30P alpha-synuclein gene transfer to the rat substantia nigra. Hum Gene Ther. 13, 605-612 (2002).
- Vander Perren, A., Van den Haute, C., Baekelandt, V. Viral Vector-Based Models of Parkinson’s Disease. Curr Top Beh Neurosci. , (2014).
- Van der Perren, A., et al. Longitudinal follow-up and characterization of a robust rat model for Parkinson’s disease based on overexpression of alpha-synuclein with adeno-associated viral vectors. Neurobiol Aging. , (2014).
- Van der Perren, A., et al. Efficient and stable transduction of dopaminergic neurons in rat substantia nigra by rAAV 2/1, 2/2, 2/5, 2/6.2, 2/7, 2/8 and 2/9. Gene Ther. , (2011).
- Schallert, T., Fleming, S. M., Leasure, J. L., Tillerson, J. L., Bland, S. T. CNS plasticity and assessment of forelimb sensorimotor outcome in unilateral rat models of stroke, cortical ablation, parkinsonism and spinal cord injury. Neuropharmacology. 39, 777-787 (2000).
- Soueid, J., Nokkari, A., Makoukji, J. Techniques and Methods of Animal Brain Surgery: Perfusion, Brain Removal, and Histological Techniques. Brain Neurotrauma: Molecular, Neuropsychological, and Rehabilitation Aspects. Frontiers in Neuroengineering. , (2015).
- Dale, G. E., et al. Relationships between Lewy bodies and pale bodies in Parkinson’s disease. Acta Neuropathol. 83, 525-529 (1992).
- Dawson, V. L. Neurobiology of flies and mice. Science. 288, 631-632 (2000).
- Dawson, T., Mandir, A., Lee, M. Animal models of PD: pieces of the same puzzle?. Neuron. 35, 219-222 (2002).
- LeVine, H. Quantification of beta-sheet amyloid fibril structures with thioflavin T. Methods Enzymol. 309, 274-284 (1999).
- Oliveras-Salva, M., et al. rAAV2/7 vector-mediated overexpression of alpha-synuclein in mouse substantia nigra induces protein aggregation and progressive dose-dependent neurodegeneration. Mol Neurodegener. 8, (2013).
