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Desarrollo de un modelo basado en la rata alfa-sinucleína para la enfermedad de Parkinson mediante inyección estereotáctica de un vector viral adeno-asociado recombinante

Published: February 28, 2016 doi: 10.3791/53670
Automatic Translation
1, 2, 2, 3,4, 1,4, 1
1Laboratory for Neurobiology and Gene Therapy, Department of Neurosciences, KU Leuven, 2Division of Nuclear Medicine, Leuven University Hospital - KU Leuven, 3Laboratory for Molecular Virology and Gene Therapy, Department of Pharmaceutical and Pharmacological Sciences, KU Leuven, 4Leuven Viral Vector Core, KU Leuven

Abstract

Con el fin de estudiar las vías moleculares de la enfermedad de Parkinson (PD) y el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas, investigadores científicos se basan en modelos animales. La identificación de genes asociada a la DP ha llevado al desarrollo de modelos de PD genéticos. modelos de ratón α-SYN la mayoría transgénicos desarrollan la patología progresiva α-SYN, pero no se muestran pérdida de células dopaminérgicas clara y déficits de comportamiento de dopamina dependiente. Este obstáculo fue superado por la orientación directa de la sustancia negra con vectores virales que sobreexpresan genes asociada a la DP. la entrega de genes usando vectores virales local ofrece una forma atractiva para expresar transgenes en el sistema nervioso central. Regiones específicas del cerebro pueden ser dirigidos (por ejemplo, la sustancia negra), la expresión puede ser inducida en la configuración de adultos y los niveles de expresión altos se puede lograr. Además, diferentes sistemas de vectores basados ​​en diferentes virus pueden ser utilizados. El protocolo describe todos los pasos cruciales para llevar a cabo un vector viralinyección en la sustancia negra de la rata para desarrollar un modelo animal alfa-sinucleína basadas en vector viral para la enfermedad de Parkinson.

Introduction

Para el estudio de la fisiopatología de la EP y el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas, existe una necesidad urgente de modelos animales que se parecen mucho a los síntomas de neuropatología, fisiología y motores de la EP humano. Cuanto mayor sea el valor predictivo, mejor que se puede traducir nuevas terapias de modelos animales para los pacientes.

El descubrimiento de la alfa-sinucleína (α-SYN) como el primer gen PARQUE en 1997 condujo al desarrollo de los primeros modelos de PD genéticos. Muchos ratones transgénicos que sobreexpresan humanos de tipo salvaje (WT) o mutante (A30P, A53T) α-SYN se han generado en la última década. Los niveles de sobreexpresión de α-SYN han demostrado ser crucial en el desarrollo de la patología. También la cepa de ratón, la presencia o ausencia de endógeno α-SYN y si la longitud completa o una forma truncada se expresa, juega un papel (revisión detallada por Magen y Chesselet 1). La sobreexpresión tanto de WT y varios mutantes clínicos de humano y# 945; -SYN en ratones transgénicos induce la acumulación patológica de α-SYN y la disfunción neuronal 2-6. Sin embargo, hasta modelos de ratón α-SYN ahora más transgénicos no lograron mostrar la pérdida de células dopaminérgicas clara y déficits de comportamiento de dopamina dependiente.

Este obstáculo fue superado por la orientación directa de la sustancia negra (SN) con vectores virales que sobreexpresan α-SYN. Los vectores virales se derivan de virus que pueden infectar fácilmente células, introducir material genético en su genoma del huésped y la fuerza de la célula huésped para replicar el genoma vírico con el fin de producir nuevas partículas de virus. Los virus pueden ser diseñados para vectores no replicantes virales que retienen su capacidad para entrar en las células e introducir genes. Al eliminar partes del genoma viral y su sustitución por los genes de interés, la aplicación del vector se traducirá en una sola infección ronda sin replicación en la célula huésped, designado en general como "transducción". Los vectores virales cun ser utilizado tanto para la sobreexpresión y silenciamiento de genes. El transgén puede ser expresado una proteína indicadora (por ejemplo, proteína verde fluorescente o luciferasa de luciérnaga) 7, una proteína terapéutica para aplicaciones de terapia génica 8-10 o, como nos centraremos en en este documento, una proteína relacionada con la enfermedad utilizada para modelar la enfermedad 11 -14.

la entrega de genes mediada por vectores virales proporciona una forma alternativa de expresar transgenes en el SNC con varias ventajas. El uso de la entrega transgén locales, regiones específicas del cerebro pueden ser dirigidos. Además, la expresión del transgen puede ser inducida durante la edad adulta disminuyendo el riesgo de mecanismos de compensación durante el desarrollo. Además, los modelos se pueden crear en diferentes especies y cepas. Y, por último, los distintos transgénicos pueden combinarse con facilidad. El uso de vectores virales, los niveles de expresión de transgenes alta se puede lograr, lo que podría ser crucial ya que el inicio de la enfermedad y la gravedad con frecuencia dependen del nivel de Sobreexpresión.

Varios sistemas de vectores basados ​​en diferentes virus se han desarrollado. La elección del sistema de vector depende del tamaño del gen de interés, la duración requerida de la expresión génica, la célula diana y la seguridad biológica. Para la transferencia génica estable en el cerebro, lentiviral (LV) y viral adeno-asociado recombinante (rAAV) vectores ahora se consideran los sistemas de vectores de elección ya que conducen a la expresión génica eficaz y a largo plazo en el cerebro de roedores. Para la orientación específica de las neuronas dopaminérgicas (DN) de la SN, vectores rAAV han outcompeted gradualmente vectores LV debido a sus mayores títulos y la eficacia de transducción de DN.

Los mejores modelos de roedores basado α-SYN disponibles en la actualidad se han desarrollado a partir de un enfoque combinado usando nuevos serotipos de AAV (rAAV 1, 5, 6, 7, 8) y construcciones de vectores, los títulos, y pureza 15,16 optimizado. El título de vector, así como la pureza vector influye directamenteel resultado fenotípico del modelo. títulos de vector excesivas o lotes vector insuficientemente purificadas pueden dar lugar a toxicidad no específica. Por lo tanto, los vectores de control adecuados son indispensables. la inversión un tiempo considerable en la producción de vectores, ampliación de la escala, y los procedimientos de purificación viral también han demostrado ser esenciales para obtener lotes de vectores reproducibles y de alta calidad.

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Protocol

Todos los experimentos con animales se llevan a cabo de conformidad con la Directiva del Consejo Comunidades Europeas de 24 de noviembre de 1986 (86/609 / CEE) y aprobados por el Comité de Bioética de la Universidad de Lovaina (Bélgica).

1. recombinante AAV Producción y Purificación

Nota: rAAV producción del vector y la purificación se realizó por el Lovaina Viral Vector Core (LVVC) como se describió anteriormente 17.

  1. Brevemente, transfectar subconfluent baja (<50) paso células HEK 293T adherentes utilizando una polietilenimina lineal 25 kD 150 nM NaCl solución de transfección y tres plásmidos diferentes en una proporción de 1: 1: 1 en suero bovino fetal medio DMEM 2%. Después de 24 horas de incubación a 37 ° C en un 5% de CO 2, sustituir el medio con suero fresco medio DMEM 2% fetal bovino.
    Nota: Los plásmidos incluyen las construcciones para el serotipo AAV7, el plásmido de transferencia de AAV que codifica el mutante A53T humano α-SYN bajo el control de la CMVIE mejorada synapspromotor in1 y el pAdvDeltaF6 adenoviral plásmido auxiliar 17.
  2. Cosechar el medio 5 días después de la transfección transitoria y concentrarse usando filtración de flujo tangencial 17.
  3. Purificar las partículas de vectores de rAAV de la media concentrados utilizando un paso gradiente de iodixanol 17.
  4. Utilice los métodos estándar de PCR en tiempo real para la copia genómica determinación (GC). En este protocolo, un vector título de 3,0 E11 GC / ml se utilizó para desarrollar un modelo de rata con base α-SYN para la EP 17.

2. inyección estereotáctica de rAAV α-SYN vectorial en el SN de la rata (Figura 2)

  1. Casa ocho semanas de edad ratas Wistar con un peso aproximado de 200-250 g en virtud de un 12 horas de luz normales / oscuridad ciclo con acceso libre al alimento granulado y el agua del grifo.
  2. Presentar la rata para intraperitoneal (ip) de anestesia que contiene una mezcla de ketamina (60 mg / kg) y medetomidina (0,4 mg / kg). Una vez que la rata se anestesia y no reaccionaal apretar las diferentes patas, administrar una vía subcutánea micro-transpondedor en la parte posterior de la rata para un nuevo reconocimiento utilizando un implantador micro-transpondedor. Compruebe si el micro-transpondedor está situado correctamente y se puede leer por el dispositivo de lectura.
  3. Cortar el cabello en la parte superior del cuero cabelludo. Aplicar un anestésico local tanto en el cuero cabelludo y las orejas. Realizar el resto del procedimiento quirúrgico bajo un flujo laminar utilizando técnicas asépticas.
  4. Coloque las ratas en un marco en la cabeza estereotáctica utilizando dos barras para los oídos, la boca y la nariz de un bar. Cubrir el cuerpo de la rata con una manta de papel para evitar una caída de la temperatura corporal. Aplicar un lubricante ocular para evitar que los ojos se sequen.
  5. Desinfectar el cuero cabelludo con jodium 1% en isopropanol al 70% y hacer una pequeña incisión en la línea media del cuero cabelludo. raspar suavemente las membranas en el cráneo y enjuague con solución salina. Dejar que el cráneo seco durante varios minutos. Tenga en cuenta las suturas craneales y los dos puntos de referencia: bregma y lambda. Para inyectar el vector de rAAV en el SN, definir las coordenadas hacia el bregma (anteroposterior: 5,3 mm; mediolateral: 2,0 mm y dorsoventral: 7.2 mm calculados a partir de la duramadre).
    Nota: Las coordenadas tridimensionales de cada región de interés se pueden calcular utilizando un atlas estereotáxico del cerebro de la rata, aplicando bregma como punto de referencia anatómica.
  6. Llene una jeringa de 10 l microinyección (calibre 30 a 20 mm) con el vector de rAAV y colocarlo en el instrumento estereotáxico conectada con una bomba de microinyección motorizado. Controlar el volumen mediante la liberación de una gota de vectores y eliminar en un polivalente pH 9 detergente de limpieza (por ejemplo, RBS).
  7. Compruebe visualmente si la cabeza se fija directamente en el marco de la cabeza y evaluar el eje izquierda-derecha. Cuidadosamente definen visualmente los anteroposterior y mediolateral coordenadas para bregma y lambda y medir su altura usando una aguja de calibre 30 de 20 mm en el brazo dorsoventral del marco estereotáxico.
    1. Permitir amAximum de 0,3 mm de diferencia de altura entre bregma y lambda. Coloque la aguja de nuevo en bregma y aplicar el anteroposterior y mediolateral coordenadas moviendo el anteroposterior y mediolateral el brazo del marco estereotáxico.
  8. En el lugar de la inyección, medir la altura del cráneo y asegurarse de que no difiere más de 0,3 mm de la altura del bregma. Perforar un agujero en el cráneo con un diámetro de aproximadamente 2 mm. Medir la altura de la duramadre, esto servirá como referencia para aplicar la coordenada dorsoventral. Alternativamente restar un espesor fijo para el cráneo (0,9 mm).
  9. Penetrar la duramadre con una aguja de calibre 26 y absorber la sangre con un tejido estéril. Espere hasta que todo sangrado se ha detenido antes de proceder.
  10. Lentamente inserte el 10 l jeringa microinyección pre-cargado con una solución de vector en el cerebro a la profundidad predeterminada (dorsoventral de coordenadas). Espere 1 minuto con la aguja en su lugar. Inyectar 3 lde solución de vector (3.0 E11 genoma copias / ml (dosis de vector media) o 1.0 E12 GC / ml (dosis alta vector) de rAAV2 / 7 α-SYN o eGFP control de vector) usando la bomba de microinyección motorizado con un caudal de 0,25 l / min.
  11. Después de la inyección, mantener la aguja en su lugar durante otros 5 minutos antes de retirar poco a poco. Cosa el cuero cabelludo con recubrimiento de poliéster trenzada 3.0, desinfectar con un 1% jodium en isopropanol al 70% y retire con cuidado el animal del instrumento estereotáctica. Primero afloje la barra de la nariz y la boca, y luego las dos barras de oído.
  12. Para invertir la anestesia, inyectar a la rata por vía intraperitoneal con 0,5 mg / kg atipamezol y colocar la rata en una jaula limpia en una placa de calentamiento de 38 ° C hasta que se despierte. Cubrir la rata con una manta de papel para evitar una caída de la temperatura corporal.
  13. Facilitar el acceso a alimentos y agua durante las primeras horas. Monitorear la rata durante los primeros días. Si es necesario aplicar la analgesia.
    Nota: No hay necesidad de quitar los puntos de tél cráneo. Después de 1-2 semanas, el cráneo está totalmente reparado y los puntos de sutura se suelte.

3. Evaluación de rAAV2 / 7 α-SYN ratas inyectadas Uso no invasiva de imágenes PET, pruebas de comportamiento y análisis inmunohistoquímico

  1. Para el seguimiento de la cinética de la neurodegeneración dopaminérgica nigroestriatal de forma no invasiva con el tiempo en los animales individuales, cuantificar transportador de dopamina (DAT) de unión usando pequeños animales tomografía por emisión de positrones (PET) y un trazador de la DA Transporter por ejemplo, [18 F] -FECT 16 .
  2. Para examinar si el nivel de la neurodegeneración dopaminérgica es suficiente para inducir deficiencias motoras en las ratas, las ratas someter a la prueba del cilindro para evaluar el uso de la extremidad anterior espontánea.
    1. Coloque la rata en unos 20 cm de ancho claro tubo de vidrio y cinta de vídeo el comportamiento durante los movimientos verticales a lo largo de la pared y el suelo después de un trasero. Anotar el número de contactos realizados por cada una de sus patas delanteras para un total de 20contactos. Para una descripción detallada de los criterios de puntuación ver Schallert et al. 18 Expresar el número de contactos de las extremidades anteriores deteriorados (por ejemplo, las patas delanteras izquierda) como porcentaje del total de los contactos de las extremidades anteriores (a la izquierda, más la pata delantera derecha).
      Nota: Las ratas de control no lesionado utilizando las dos patas por igual deben anotar en torno al 50% en esta prueba.
  3. Realizar análisis de inmunohistoquímica (IHC) para evaluar el nivel de expresión del transgen y la pérdida de células dopaminérgicas.
    1. En las etapas finales diferentes, sacrificar a las ratas con una sobredosis de pentobarbital sódico (60 mg / kg, ip) y realizar una perfusión intracardiaca con solución salina fría, seguido de 4% de paraformaldehído en PBS 19. Fijar el cerebro durante la noche a 4 ° C y corte 50 micras secciones cerebrales coronales gruesas utilizando un micrótomo de vibración.
    2. Realizar tinción IHC en libre flotación secciones utilizando anticuerpos contra la α-SYN y la tirosina hidroxilasa para analizar α-SYN niveles de expresión y la level de la neurodegeneración 16.

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Representative Results

El esquema general del experimento se muestra en la Figura 1

sobreexpresión mediada por 7 rAAV 2 / A53T de α-SYN induce déficits motores de dopamina dependiente.
Para examinar si el nivel de α-SYN sobreexpresión es suficiente para inducir deficiencias motoras en las ratas, las ratas hemos sometido a la prueba del cilindro para evaluar el uso de la extremidad anterior espontánea (Figura 3A). A partir de 3 semanas después de la inyección, una alteración motora significativa se observó en las ratas que recibieron una dosis de 3,0 E11 GC / ml de α-syn A53T rAAV2 / 7 vectorial. A las 4 semanas después de la inyección se observó una disminución del 50% en contralateral (izquierda) uso pata espontánea, mientras que el control eGFP rAAV2 / 7 inyecta animales no mostró asimetría en uso pata delantera (Figura 3B). Las ratas que recibieron una rAAV2 / 7 dosis más alta de vectores A53T α-SYN mostraron una impairm más pronunciadaent de uso pata delantera (70%) a los 29 días después de la inyección (Figura 3C). Para demostrar que el deterioro motor observada fue dependiente de la dopamina, se administró una dosis única de L-DOPA (6 mg / kg ip) a las ratas inyectadas con una dosis alta del vector. Cuando se repitió el cilindro de prueba 45 minutos después del tratamiento con L-DOPA, una recuperación completa del uso de sus patas delanteras en el A53T α-SYN rAAV2 / 7 inyecta animales se observó (Figura 3C).

La PET permite obtener imágenes no invasiva de la α-SYN neurodegeneración progresiva inducida.
Para el seguimiento de la cinética de la neurodegeneración dopaminérgica nigroestriatal de forma no invasiva con el tiempo en los animales individuales, cuantificamos transportador de dopamina (DAT) de unión usando pequeños animales tomografía por emisión de positrones (PET) con [18 F] -FECT como radioligando. DAT unión disminuyó significativamente en los ipsilaterales caudado-putamen de A53T α-SYN rAAV2 / 7 injecratas ted lo largo del tiempo, pero se mantuvo estable en el animal de control eGFP (Figura 4A - 4B). La cuantificación de la unión de DAT A53T α-SYN rAAV2 / 7 inyecta animales mostró una tasa máxima de degeneración dopaminérgica nigroestriatal entre el día 7 y 21 después de la inyección. Después de 32 días, se observó una disminución de la DAT unión de hasta un 85% (Figura 4C). Como control positivo, la inyección de la neurotoxina 6-OHDA en el SN indujo pérdida de 90% de DAT de unión dentro de los 7 días (Figura 4B - 4C).

Inyección estereotáctica de rAAV2 / 7 A53T α-SYN en el SN de la rata induce la muerte de células dopaminérgicas sustancia negra y la formación de agregados insolubles positivos α-SYN.
Para analizar el nivel de sobreexpresión y la pérdida de células dopaminérgicas α-SYN que sacrificaron los animales en diferentes puntos de tiempo. IHC se realizó en secciones de libre flotación usando un anticuerpo against α-sinucleína (policlonal de conejo 1: 5000). Este anticuerpo puede detectar tanto humanos como de rata α-sinucleína, pero los niveles endógenos de rata α-sinucleína estaban por debajo de los límites de detección dentro de somata de células nigral, debido a su localización predominante en las membranas sinápticas. Para evaluar la pérdida de células se utilizó un anticuerpo contra TH (policlonal de conejo 1: 1.000).

Cuatro días después de la inyección del vector rAAV, se detectó α-SYN o expresión eGFP en el SN (Figura 5A - 5C) de las ratas. La mayoría (> 90%) de la DN fue transducida de forma eficiente y ambas proteínas transgénicas fueron localizados en los cuerpos celulares y axones. A los 29 días se observó después de la inyección (pi) una reducción sustancial en la expresión de α-SYN en la SNpc, cuando todavía era detectable en las áreas que rodean la SN (Figura 5B - 5C). A continuación, analizamos el nivel de pérdida de células sustancia negra. Una rápida y progresiva pérdida ose detectó f hasta 80% de las neuronas TH-positivas más de 29 días en ratas inyectadas con A53T α-SYN rAAV2 / 7 (Figura 5D - 5H). De nota, la sobreexpresión de tipo silvestre en lugar de A53T α-SYN resultó en la neurodegeneración dopaminérgica similar (datos no mostrados). La pérdida de la DN en el SN fue acompañado de un robusto disminución de los terminales nerviosos TH-positivas en el cuerpo estriado (STR) (Figura 5F). Para descartar efectos específicos vector lotes, diferentes preparaciones de vector α-SYN se ensayaron en el SN con resultados similares. No se observó reducción en la tinción de TH en la SN o STR de eGFP rAAV2 / 7 inyecta animales de control (Figura 5E-5H). Siguiente a la neurodegeneración dopaminérgica, la presencia de α-sinucleinopatía es un segundo sello importante de PD. A pesar de la evolución en el tiempo corto de nuestro modelo (cuatro semanas), se observó tanto en los agregados citoplasmáticos α-SYN-positivas en el SN y neuritas distróficas en el STR (Figura 5I ong>). Inmunorreactividad La ubiquitina es una característica distintiva de la patología de cuerpos de Lewy en el cerebro humano 20-22. Hemos observado co-localización de α-SYN y ubiquitina a los 29 días pi en una fracción (± 20%) de la α-SYN neuronas que expresan la sustancia negra (Figura 5J). La naturaleza fibrilar de los agregados α-SYN se evaluó por tioflavina S (Thio S) tinción 23. Tio S se detectaron células positivas en el SN de 17 días en adelante (Figura 5J).

Figura 1
Figura 1:. La inyección estereotáctica de rAAV2 / 7 α-SYN vector da como resultado la neurodegeneración progresiva inyección estereotáctica de rAAV2 / 7 α-SYN vectorial en el SN de la rata induce la neurodegeneración dopaminérgica medido a través de análisis de comportamiento (la prueba del cilindro), el PET no invasiva de formación de imágenes y el análisis IHC.d / 53670 / 53670fig1large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2: inyección estereotáctica de rAAV2 / 7 vector que codifica α-SYN en el SN de la rata. (A, B, E) Las suturas craneales en el cráneo de la rata, que definen los dos puntos de referencia: Bregma y Lambda. (C) Un atlas estereotáxico del cerebro de rata que presenta la región de la inyección a saber, el SN. (D) A Wistar rata colocada en un marco estereotáctico de cabeza usando dos barras de oído, una boca y un bar nariz. (F) La aguja de calibre 30 lleno de vector se coloca en posición para la sustancia negra. (G) Un pequeño conjunto está perforado en el lugar de la inyección y la aguja se coloca en posición. (H) Después de la inyección del cuero cabelludo es STIencend da y desinfectado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3: rAAV sobreexpresión mediada por 7 2 / A53T de α-SYN induce déficit motor de dopamina dependiente de (A, B) de prueba de cilindro en diferentes puntos temporales después de la inyección de rAAV2 / 7 A53T α-SYN.. (Media ± desviación estándar, * p <0,05 frente a 17 días, # p <0,05 eGFP controles por ANOVA y prueba de Tukey post hoc, n = 5). (C) Cilindro de prueba en diferentes puntos de tiempo después de la inyección de rAAV2 / 7 A53T α-syn (altas dosis de vector). (Media ± desviación estándar, * p <0,05 4 días frente a 29 días por ANOVA y Tukey post hoc de ensayo, n = 5). La prueba se realizó con o sin la administración de Levodopa (L-DOPA). (Media ± desviación estándar, * p <0.05 no tratados en comparación con los animales tratados por ANOVA y prueba de Tukey post hoc, n = 5). Reimpresión de Neurobiología del envejecimiento, vol. 36, Van der Perren et al., Seguimiento longitudinal y caracterización de un modelo de rata robusta para la enfermedad de Parkinson basado en la sobreexpresión de alfa-sinucleína con vectores virales adeno-asociados, 1543-1558, (2015), con permiso de Elsevier. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4:. De formación de imágenes no invasiva de la A53T α-SYN muerte inducida de células dopaminérgicas usando DAT PET de formación de imágenes (A - B) de la serie de las rebanadas horizontales y coronal que representan media estriatal DAT unión de (A) rAAV2 / 7 A53T α-SYN animales inyectados en difepuntos t de tiempo después de la inyección (n = 7) y (B) rAAV2 / 7 eGFP inyecta (n = 1) o 6-OHDA tratados los animales de control (n = 1) 79 días después de la inyección. barras de colores indican los potenciales de unión para la DAT. (C) La cuantificación de la unión de DAT rAAV2 / 7 A53T α-SYN, rAAV2 / 7 eGFP y 6-OHDA animales inyectados medidos en diferentes puntos de tiempo (datos representan la media ± DE). Reimpresión de Neurobiología del envejecimiento, vol. 36, Van der Perren et al., Seguimiento longitudinal y caracterización de un modelo de rata robusta para la enfermedad de Parkinson basado en la sobreexpresión de alfa-sinucleína con vectores virales adeno-asociados, 1543-1558, (2015), con permiso de Elsevier. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5
Figura 5: rAAV 2/7 mediada por la sobreexpresión de A53T α-SYN induce la muerte de células dopaminérgicas y formación de agregados positivos insolubles α-SYN. (A - B) IHC tinción demuestra α-SYN sobreexpresión 4 días y 29 días después de rAAV mediada por la transferencia en SN rata. Los insertos muestran aumentos de la zona seleccionada. Barra de escala = 400 (foto izquierda visión general) micras, 70 micras y 200 micras (inserciones derecha). (C) la tinción IHC demostrando eGFP sobreexpresión 4 días y 29 días después de rAAV mediada por la transferencia de SN rata. Barra de escala = 400 micras. (D - G) tinción IHC para TH en el SN y STR en diferentes puntos temporales después de la inyección de (D, F) rAAV2 / 7 α-SYN o 29 días después de la inyección de (E, G) rAAV2 / 7 eGFP en el SN . Barra de escala a, c = 400 m, b, d = 1,000 micras. (H) la cuantificación de la Estereológico entumecidaer de las neuronas TH-positivas en el SN con el tiempo después de la inyección rAAV2 / 7 A53T α-SYN o rAAV2 / 7 eGFP control de vectores (media ± desviación estándar, * p <0,05 frente a 8 días, # p <0,05 frente a los controles eGFP por ANOVA y prueba post hoc de Tukey, n = 5). (I) IHC tinción demuestra patología SYN-α, incluyendo los agregados citoplasmáticos en la SN y distrófica y neuritas abultados en el STR, después de la inyección intranigrales rAAV2 / 7 A53T α-SYN. (J) imágenes confocales representativos de immunostainings dobles fluorescentes para α-SYN (verde) y ubiquitina (rojo) muestran un aumento de co-localización en el tiempo (flechas). Barra de escala c = 50 micras. Tioflavina S tinción de SN 29 días después de la inyección de rAAV2 / 7 A53T α-SYN. La barra de escala D = 30 micras. Reimpresión de Neurobiología del envejecimiento, vol. 36, Van der Perren et al., Seguimiento longitudinal y caracterización de un modelo de rata robusta para la enfermedad de Parkinson basado en la sobreexpresión de alfa-sinucleína con el anuncioeno-asociado vectores virales, 1543-1558, (2015), con permiso de Elsevier. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Hay varios pasos críticos dentro del protocolo. El título de vector, así como la pureza vector influye directamente en el resultado fenotípico del modelo. títulos de vector excesivas o lotes vector insuficientemente purificadas pueden dar lugar a toxicidad no específica. Por lo tanto, el uso de lotes de vectores de alta calidad y vectores de control apropiadas es indispensable. Además, la colocación exacta de la cabeza de la rata en el marco estereotáxico y la determinación precisa de las coordenadas es esencial en la selección de la sustancia negra. Después de taladrar el agujero en el cráneo en el sitio de inyección, es importante insertar la aguja directamente en el cerebro de la rata sin tocar los márgenes. La aguja debe ser retirado lentamente después de la inyección del vector viral, para evitar fugas de vector. Por último, después de las puntadas, el cuero cabelludo debe ser desinfectada con un 1% jodium en isopropanol al 70% para evitar la mordida de los puntos de sutura por otros animales. Alternativamente otros reactivos antisépticaspuede ser usado.

El método descrito también se puede utilizar para desarrollar una α-SYN modelo de ratones basado rAAV2 / 7 para la enfermedad de Parkinson 24. En ratones se inyecta un volumen de 2 l vector de rAAV en el SN. En comparación con las ratas, los ratones DN parece ser algo menos sensible a alfa-SYN sobreexpresión, resultando en una manifestación tardía de la neurodegeneración. Por otra parte, otras regiones en el cerebro (por ejemplo, cuerpo estriado, hipocampo, corteza, etc.) pueden ser dirigidos. Las coordenadas para las diferentes regiones del cerebro pueden ser encontrados en el atlas estereotáxico. Optimización de las coordenadas se puede hacer por la tinta china o mediante el uso de un vector viral que codifica un gen reportero (por ejemplo, EGFP). Los diferentes sistemas de vectores (rAAV, LV, etc.) se pueden utilizar dependiendo de la aplicación.

Esta técnica tiene la limitación de que cada animal tiene que ser inyectada de forma individual. Por lo tanto una persona capacitada debe realizar las inyecciones con el fin de minimize variaciones entre los diferentes animales. Otra limitación es que el método es mucho tiempo (cuando es ejecutado por una persona entrenada se tarda alrededor de 45 minutos por animal). Sólo ocho a diez animales se pueden inyectar en un día.

la entrega de genes mediada por vector viral permite una orientación específica de las regiones del cerebro. El uso de vectores virales, los niveles de expresión de transgenes alta se puede lograr, que es crucial ya que aparición de la enfermedad y la gravedad depende del nivel de expresión α-SYN. Además, diferentes dosis se pueden aplicar lo que se traducirá en un modelo animal presentan cinética más lenta o más rápida de la neurodegeneración. Por último, esta técnica puede ser utilizada para crear modelos en diferentes especies animales y cepas utilizando la misma preparación de vector.

Este procedimiento se puede utilizar para entregar vectores virales, así como toxinas (por ejemplo, 6-OHDA) en diferentes regiones del transgén brain.The codificada por el vector puede ser una proteína indicadora, un p terapéuticorotein para aplicaciones de terapia de genes 8-10 o una proteína relacionada con la enfermedad utilizado para el modelado de la enfermedad 11-14. Esta técnica se puede utilizar para desarrollar nuevos modelos animales que permitan las pruebas de drogas preclínica y puede ser beneficioso en el estudio del mecanismo molecular de la enfermedad de Parkinson, así como muchos otros trastornos neurodegenerativos.

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Disclosures

Los autores declaran que no existe un conflicto real o potencial de intereses.

Acknowledgments

Los autores agradecen a Joris van Asselberghs y Ann Van Santvoort por su excelente asistencia técnica. La investigación fue financiada por el IWT-Vlaanderen (TVN SBO / 80020), la FWO Vlaanderen (G.0768.10), por el programa CE-6PM 'Dimi' (LSHB-CT-2005-512146), el proyecto MEFOPA 7PM de IDT (SALUD -2009-241791), el programa FP7 'inMind' (SALUD-F2-2011-278850), la Universidad Católica de Lovaina (IOF-PK / 07/001, OT / 08 / 052A, IMIR PF / 10/017), y el Fundación MJFox (validación de dianas 2010). A. Van der Perren y C. Casteels son un postdoctorantes del Fondo Flamenco de Investigaciones Científicas. K. Van Laere es miembro clínico de alto rango del Fondo Flamenco de Investigaciones Científicas.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Female 8 weeks old Wistar rats Janvier / 200-250 g
Ketamine (Nimatek) Eurovet animal health 804132
Medetomidine (Dormitor) Orion-Pharma/ Janssen Animal Health 1070-499
 Local anesthetic for scalp and ears: Xylocaïne 2% gel Astrazeneca 0137-547
Terramycine Pfizer 0132-472
Buprénorphine (Vetergesic) Ecuphar 2623-627
Jodium 1% isopropanol VWR 0484-0100
stereotactic head frame Stoeling /
Hamilton Syringe (30 gauge -20 mm -pst 2) Hamilton/ Filter Service 7803-07
atipamezole (Antisedan) Orion-Pharma/Elanco 1300-185
rAAV A53T α-SYN vector LVVC, KU Leuven / https://gbiomed.kuleuven.be/english/research/50000715/laboratory-of-molecular-virology-and-gene-therapy/lvvc/
sodium pentobarbital (Nembutal) Ceva Santé 0059-444
microtome Microm HM650
rabbit polyclonal synuclein Ab Chemicon 5038 1:5,000
rabbit polyclonal TH Ab Chemicon 152 1:1,000
Lutetium oxyorthosilicate detector-based FOCUS 220 tomograph Siemens/ Concorde Microsystems /
radioligand: 18F-FECT In house /
L-dopa: Prolopa 125 Roche 6 mg/kg i.p.
DMEM, Glutamax Life Technologies N° 31331-093
Foetal bovine serum Life Technologies N° 10270-106
25 kD linear polyethylenimine (PEI) Polysciences /
OptiPrep Density Gradient Medium: Iodixanol Sigma D1556-250ML
Optimen Life Technologies N° 51985-026
Paxinos 1 watston steretactic atlas, fourth Edition Elsevier /

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References

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Medicina Número 108 los vectores de rAAV el modelo animal la enfermedad de Parkinson la alfa-sinucleína inyecciones estereotácticas la transducción de cerebro
Desarrollo de un modelo basado en la rata alfa-sinucleína para la enfermedad de Parkinson mediante inyección estereotáctica de un vector viral adeno-asociado recombinante
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Van der Perren, A., Casteels, C., Van Laere, K., Gijsbers, R., Van den Haute, C., Baekelandt, V. Development of an Alpha-synuclein Based Rat Model for Parkinson's Disease via Stereotactic Injection of a Recombinant Adeno-associated Viral Vector. J. Vis. Exp. (108), e53670, doi:10.3791/53670 (2016).

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