Abstract
Al fine di studiare i meccanismi molecolari della malattia di Parkinson (PD) e di sviluppare nuove strategie terapeutiche, ricercatori scientifici si basano su modelli animali. L'identificazione di geni PD-associata ha portato allo sviluppo di modelli di PD genetiche. modelli murini α-SYN più transgenici sviluppano progressiva patologia α-SYN, ma non riescono a visualizzare perdita di cellule dopaminergiche chiaro e deficit comportamentali dopamina-dipendente. Questo ostacolo è stato superato con il targeting diretto della substantia nigra con vettori virali sovraesprimono geni PD-associata. Locale consegna del gene utilizzando vettori virali fornisce un modo interessante per esprimere transgeni nel sistema nervoso centrale. Regioni specifiche del cervello possono essere mirati (ad esempio, la substantia nigra), espressione può essere indotta nella cornice adulti e alti livelli di espressione può essere raggiunto. Inoltre, possono essere utilizzati diversi sistemi di vettori basati su vari virus. Il protocollo descrive tutti i passi fondamentali per eseguire un vettore viraleiniezione nella substantia nigra del ratto di sviluppare un modello animale virale basato su vettori alfa-sinucleina per il morbo di Parkinson.
Introduction
Per studiare la fisiopatologia del PD e di sviluppare nuove strategie terapeutiche, vi è un urgente bisogno di modelli animali che assomigliano da vicino le neuropatologia, fisiologia e motorie sintomi di PD umana. Più alto è il valore predittivo, il meglio che possiamo tradurre le nuove terapie da modelli animali per i pazienti.
La scoperta di alfa-sinucleina (α-SYN) come primo gene PARCO nel 1997 ha portato allo sviluppo dei primi modelli di PD genetiche. Molti topi transgenici che sovraesprimono wild-type umana (WT) o mutante (A30P, A53T) α-SYN sono stati generati negli ultimi dieci anni. I livelli di α-SYN sovraespressione hanno dimostrato di essere cruciale nello sviluppo della patologia. Anche il ceppo di topi, la presenza o l'assenza di endogena α-SYN e se la lunghezza o una forma troncata si esprime, gioca un ruolo (APPROFONDIMENTI DI Magen e Chesselet 1). Sovraespressione di entrambi WT e diversi mutanti clinici di umana &# 945; -SYN in topi transgenici induce accumulo patologico di α-SYN e disfunzione neuronale 2-6. Tuttavia, fino a modelli murini α-SYN ora la maggior parte transgenici non sono riusciti a visualizzare perdita di cellule dopaminergiche chiaro e deficit comportamentali dopamina-dipendente.
Questo ostacolo è stato superato con il targeting diretto della substantia nigra (SN) con vettori virali sovraesprimono α-SYN. vettori virali sono derivati da virus che possono facilmente infettare cellule, introdurre materiale genetico nel loro genoma dell'ospite e forzare la cellula ospite per replicare il genoma virale per produrre nuove particelle virali. I virus possono essere progettati per i vettori non virali-replicanti che mantengono la loro capacità di entrare nelle cellule e di introdurre geni. Eliminando parti del genoma virale e sostituirli con i geni di interesse, applicazione del vettore si tradurrà in una singola infezione rotonda senza replica nella cellula ospite, generalmente designato come 'trasduzione'. vettori virali cun essere utilizzati sia per la sovraespressione e il silenziamento genico. Il transgene espresso può essere una proteina reporter (ad esempio, la proteina fluorescente verde o lucciola luciferasi) 7, una proteina terapeutica per applicazioni di terapia genica 8-10 o, come ci concentreremo su in questo articolo, una proteina correlata alla malattia usato per la malattia di modellazione 11 -14.
Vettore virale mediata consegna del gene fornisce un modo alternativo per esprimere transgeni nel SNC con diversi vantaggi. Utilizzando la consegna transgene locali, le regioni specifiche del cervello possono essere mirati. Inoltre, l'espressione del transgene può essere indotta durante l'età adulta diminuire il rischio di meccanismi di compensazione durante lo sviluppo. Inoltre, i modelli possono essere creati in diverse specie e ceppi. Infine, diversi transgeni possono facilmente essere combinati. Utilizzando vettori virali, i livelli di espressione del transgene alta possono essere raggiunti, che potrebbe essere fondamentale poiché l'insorgenza della malattia e la gravità di frequente dipendono dal livello di Sovraespression.
Sono stati sviluppati vari sistemi di vettori basati sul virus diversi. La scelta del sistema vettore dipende dalle dimensioni del gene di interesse, la durata desiderata di espressione genica, la cellula bersaglio e biosicurezza. Per il trasferimento di geni stabile nel cervello, lentivirale (LV) e ricombinante virale adeno-associato (rAAV) vettori sono ormai considerati i sistemi vettoriali di scelta dato che portano ad espressione genica efficace e di lungo termine nel cervello dei roditori. Per specifico orientamento dei neuroni dopaminergici (DN) della SN, vettori rAAV sono gradualmente outcompeted vettori LV causa dei loro titoli più alti e l'efficienza di trasduzione del DN.
I migliori modelli di roditori basato α-SYN attualmente disponibili sono stati sviluppati da un approccio combinato utilizzando più recenti sierotipi di AAV (rAAV 1, 5, 6, 7, 8) e ottimizzato costrutti vettoriali, titoli, e la purezza 15,16. Il vettore titolo nonché il vettore purezza influenza direttamenteil risultato fenotipica del modello. Eccessive titoli vettoriali o lotti vettore non sufficientemente purificate possono causare tossicità non-specifica. Pertanto, opportuni vettori di controllo sono indispensabili. investimento di tempo considerevole nel vettore di produzione, upscaling, e le procedure di purificazione virali hanno anche dimostrato essenziale per ottenere lotti riproducibili e di alta qualità di vettore.
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Protocol
Tutti gli esperimenti sugli animali sono svolte in conformità con la Direttiva del Consiglio Comunità europee del 24 novembre 1986 (86/609 / CEE) e approvati dal Comitato di Bioetica dell'Università di Lovanio (Belgio).
1. ricombinante AAV produzione e purificazione
Nota: la produzione di vettore rAAV e purificazione è stata eseguita dal Leuven Viral Vector core (LVVC) come descritto in precedenza 17.
- Brevemente, transfect subconfluenti bassa (<50) passaggio cellule HEK 293T aderenti utilizzando lineare polietilenimmina 25kD 150 soluzione trasfezione nM NaCl e tre differenti plasmidi in un rapporto di 1: 1: 1 in terreno DMEM 2% di siero fetale bovino. Dopo 24 h di incubazione a 37 ° C in 5% CO 2, sostituire il mezzo con mezzo DMEM 2% di siero fetale bovino fresco.
Nota: I plasmidi sono i costrutti per sierotipo AAV7, il plasmide transfer AAV che codifica il mutante A53T umano α-SYN sotto il controllo del CMVie migliorata synapspromotore in1 e il pAdvDeltaF6 adenovirale aiutante plasmide 17. - Raccogliere le medie 5 giorni dopo la trasfezione transiente e concentrarsi con filtrazione a flusso tangenziale 17.
- Purificare le particelle di vettore rAAV dal mezzo di concentrato utilizzando un passo iodixanolo gradiente 17.
- Utilizzare le tecniche standard di real-time PCR per genomica copia (GC) determinazione. In questo protocollo, un titolo vettore di 3.0 E11 GC / ml è stato utilizzato per sviluppare un modello di ratto basato α-SYN per PD 17.
2. iniezione stereotassica di α-SYN rAAV vettore nel SN del Topo (Figura 2)
- Casa otto settimane ratti Wistar femmine del peso di circa 200-250 g sotto un normale / ciclo buio 12 ore di luce con libero accesso a cibo pellet e l'acqua del rubinetto.
- Sottoporre il topo per via intraperitoneale (ip) anestesia contenente una miscela di ketamina (60 mg / kg) e medetomidina (0,4 mg / kg). Una volta che il ratto è anestetizzato e non reagiscequando comprimendo i diversi zampe, somministrare una via sottocutanea micro-transponder sul retro del ratto per un riconoscimento ulteriore utilizzando un implanter micro-transponder. Controllare se il micro-transponder è posizionata correttamente e può essere letto dal dispositivo di lettura.
- Tagliare i capelli sulla sommità del cuoio capelluto. Applicare un anestetico locale sia sul cuoio capelluto e le orecchie. Eseguire il resto della procedura chirurgica sotto flusso laminare utilizzando tecniche asettiche.
- Mettere i topi in una cornice testa stereotassica utilizzando due barre orecchio, una bocca e un bar naso. Coprire il corpo del ratto con una coperta di carta per evitare un calo della temperatura corporea. Applicare un lubrificante oculare per evitare gli occhi secchi.
- Disinfettare il cuoio capelluto con jodium 1% in isopropanolo 70% e fare una piccola incisione sulla linea mediana del cuoio capelluto. Delicatamente raschiare via le membrane sul cranio e risciacquare con soluzione salina. Lasciare il cranio asciugare per alcuni minuti. Osservare le suture craniche ed i due punti di riferimento: Bregma e Lambda. Per iniettare il vettore rAAV nella SN, definire le coordinate verso Bregma (antero-posteriore 5,3 mm; mediolaterale 2,0 mm e dorsoventrale: 7,2 mm calcolati dalla dura).
Nota: Le tre coordinate tridimensionali per ciascuna regione di interesse può essere calcolato utilizzando un stereotassiche atlante del cervello di ratto, applicando Bregma come punto di riferimento anatomici. - Riempire una siringa da 10 ml microiniezione (30 gauge 20 mm) con rAAV vettoriale e posizionarlo nello strumento stereotassico collegata ad una pompa microiniezione motorizzato. Controllare il volume rilasciando una goccia di vettore ed eliminare in polivalente pulizia detergente a pH 9 (es RBS).
- Controllare visivamente se la testa è fissata direttamente al telaio di testa e valutare l'asse sinistra-destra. Cura di definire visivamente le antero-posteriore e medio-laterale coordinate per Bregma e Lambda e misurare la loro altezza usando un ago da 30 mm calibro 20 nel braccio dorsoventrale del telaio stereotassico.
- consentire amassimo di differenza 0,3 millimetri in altezza tra bregma e lambda. Posizionare l'ago sulla Bregma e applicare il antero-posteriore e le coordinate mediolaterale spostando il antero-posteriore e il braccio medio-laterale del telaio stereotassico.
- Nel luogo di iniezione, misurare l'altezza del cranio e assicurarsi che non si discosta di più di 0,3 mm dalla altezza del bregma. Praticare un foro nel cranio con un diametro di circa 2 mm. Misurare l'altezza della dura, questo servirà come punto di riferimento per applicare la coordinata dorsoventrale. Alternativamente sottrarre uno spessore fisso per il cranio (0,9 mm).
- Penetrare la dura madre utilizzando un ago calibro 26 e assorbire il sangue con un fazzoletto di carta sterile. Attendere fino a quando tutto il sanguinamento si è fermato prima di procedere.
- Lentamente inserire la microiniezione siringa da 10 ml pre-caricato con soluzione di vettore nel cervello alla profondità predeterminata (dorsoventrale coordinate). Attendere 1 min con l'ago in posizione. Iniettare 3 mldi soluzione di vettore (3,0 E11 genoma copie / ml (dose vettore media) o 1.0 E12 GC / ml (dose alta vettore) di rAAV2 / 7 α-SYN o eGFP controllo vettoriale) utilizzando la pompa microiniezione motorizzata con un rendimento di 0,25 ml / min.
- Dopo l'iniezione, tenere l'ago in posizione per altri 5 minuti prima di rimuoverlo lentamente. Stitch il cuoio capelluto con poliestere intrecciato rivestito 3.0, disinfettare con 1% jodium nel 70% isopropanolo e rimuovere delicatamente l'animale dallo strumento stereotassico. In primo luogo allentare la barra di naso e la bocca, poi le due barre per le orecchie.
- Per invertire l'anestesia, iniettare il ratto per via intraperitoneale con 0,5 mg / kg atipamezolo e posizionare il ratto in una gabbia pulita su una piastra riscaldante a 38 ° C finché non si sveglia. Coprire il ratto con una coperta carta per evitare un calo della temperatura corporea.
- Fornire un facile accesso a cibo e acqua per le prime ore. Monitorare il ratto per i primi giorni. Se necessario applicare l'analgesia.
Nota: Non vi è alcuna necessità di rimuovere i punti di sutura da tha il cranio. Dopo 1-2 settimane il cranio è completamente riparato e le cuciture si allenti.
3. Valutazione della rAAV2 / 7 α-SYN ratti iniettati Utilizzo non invasiva PET Imaging, test comportamentali e analisi immunoistochimica
- Per seguire la cinetica di nigrostriatale dopaminergica neurodegenerazione in modo non invasivo nel corso del tempo nei singoli animali, quantificare trasportatore della dopamina (DAT) rilegatura utilizzando piccoli animali tomografia ad emissione di positroni (PET) e un tracciante del DA Transporter ad esempio [18 F] -FECT 16 .
- Per verificare se il livello di dopaminergico neurodegenerazione è sufficiente per indurre difficoltà motorie nei ratti, sottoporre i ratti al test del cilindro per valutare l'uso degli arti anteriori spontanea.
- Posizionare il topo in un 20 cm di larghezza chiaro cilindro di vetro e videotape il comportamento durante i movimenti verticali lungo il muro e l'atterraggio dopo un posteriore. Nota il numero di contatti effettuati da ciascuna zampa per un totale di 20contatti. Per una descrizione dettagliata dei criteri di punteggio vedere Schallert et al. 18 esprimere il numero di contatti arti anteriori deteriorati (ad esempio, delle zampe anteriori di sinistra) in percentuale del totale dei contatti arti anteriori (sinistra più zampa anteriore destra).
Nota: ratti di controllo non lesionati con entrambe le zampe altrettanto dovrebbe segnare circa il 50% in questo test.
- Posizionare il topo in un 20 cm di larghezza chiaro cilindro di vetro e videotape il comportamento durante i movimenti verticali lungo il muro e l'atterraggio dopo un posteriore. Nota il numero di contatti effettuati da ciascuna zampa per un totale di 20contatti. Per una descrizione dettagliata dei criteri di punteggio vedere Schallert et al. 18 esprimere il numero di contatti arti anteriori deteriorati (ad esempio, delle zampe anteriori di sinistra) in percentuale del totale dei contatti arti anteriori (sinistra più zampa anteriore destra).
- Eseguire immunoistochimica (IHC) analisi per valutare il livello di espressione del transgene e perdita di cellule dopaminergiche.
- Nelle diverse fasi finali, sacrificare i ratti con una overdose di pentobarbital sodico (60 mg / kg, ip) ed eseguire una perfusione intracardial con soluzione salina fredda seguita da 4% paraformaldeide in PBS 19. Fissare i cervelli notte a 4 ° C e tagliare 50 micron di spessore sezioni di cervello coronali utilizzando un microtomo vibrante.
- Eseguire IHC colorazione su sezioni free-floating utilizzando anticorpi contro α-SYN e tirosina idrossilasi per analizzare i livelli di espressione di α-SYN e il LEvel di neurodegenerazione 16.
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Representative Results
Lo schema generale di questo esperimento è raffigurato in figura 1
sovraespressione rAAV 2/7 mediata di A53T α-SYN induce deficit motori dopamina-dipendente.
Per verificare se il livello di α-SYN sovraespressione è sufficiente per indurre difficoltà motorie nei ratti, abbiamo sottoposto i topi al test del cilindro per valutare l'uso degli arti anteriori spontanea (Figura 3A). A partire da 3 settimane dopo l'iniezione, una significativa compromissione del motore è stato visto in ratti che hanno ricevuto una dose di 3.0 E11 GC / ml di A53T α-SYN rAAV2 / 7 vettoriale. A 4 settimane dopo l'iniezione è stata osservata una diminuzione del 50% nel controlaterale (a sinistra) l'uso delle zampe anteriori spontanea, mentre il controllo eGFP rAAV2 / 7 iniettato animali non ha mostrato alcuna asimmetria in uso zampa anteriore (Figura 3B). I ratti che hanno ricevuto un rAAV2 / 7 dosi vettore superiore A53T α-SYN hanno mostrato un più pronunciato impairment dell'uso zampa (70%) a 29 giorni dopo l'iniezione (Figura 3C). Per dimostrare che il danno motorio osservato era dopamina-dipendente, abbiamo somministrato una singola dose di L-dopa (6 mg / kg ip) per i ratti iniettati con una dose elevata di vettore. Quando abbiamo ripetuto il cilindro 45 minuti dopo la somministrazione di L-DOPA, un recupero completo sull'utilizzazione zampe anteriori nella A53T α-SYN rAAV2 / 7 iniettato animali è stato osservato (Figura 3C).
PET permette di imaging non invasiva di α-SYN indotta neurodegenerazione progressiva.
Per seguire la cinetica di nigrostriatale dopaminergica neurodegenerazione in modo non invasivo nel corso del tempo nei singoli animali, abbiamo quantificato trasportatore della dopamina (DAT) rilegatura utilizzando piccoli animali tomografia ad emissione di positroni (PET), con [18 F] -FECT come radioligand. DAT legame significativamente diminuito negli omolaterale caudato-putamen di A53T α-SYN rAAV2 / 7 INIEZratti ted nel tempo, ma è rimasta stabile nel controllo degli animali eGFP (Figura 4A - 4B). Quantificazione del DAT legame di A53T α-SYN rAAV2 / 7 iniettato animali ha mostrato una velocità massima di nigrostriatale degenerazione dopaminergica tra il giorno 7 e 21 dopo l'iniezione. Dopo 32 giorni, una diminuzione DAT vincolante fino al 85% è stata osservata (Figura 4C). Come controllo positivo, iniezione della neurotossina 6-OHDA nel SN indotta perdita del 90% del DAT vincolante entro 7 giorni (Figura 4B - 4C).
Iniezione stereotassica di rAAV2 / 7 A53T α-SYN nel SN del ratto induce nigrale morte delle cellule dopaminergiche e la formazione di aggregati insolubili positivi α-SYN.
Per analizzare il livello di sovraespressione e perdita di cellule dopaminergiche α-SYN abbiamo sacrificato gli animali in diversi momenti. IHC è stata eseguita su sezioni libero di fluttuare usando un anticorpo against α-sinucleina (policlonale di coniglio 1: 5.000). Questo anticorpo in grado di rilevare sia umani che di ratto α-sinucleina, ma i livelli endogeni di ratto α-sinucleina erano al di sotto dei limiti di rilevazione all'interno somata cellule nigrale, a causa della sua localizzazione predominante in membrane sinaptiche. Per la perdita di cellule asini abbiamo utilizzato un anticorpo contro TH (policlonale di coniglio 1: 1.000).
Quattro giorni dopo l'iniezione vettore rAAV, α-SYN o l'espressione eGFP è stato rilevato nel SN (Figura 5A - 5C) dei ratti. La maggior parte (> 90%) del DN è efficiente trasdotto ed entrambe le proteine transgeniche sono stati localizzati nei corpi cellulari e assoni. A 29 giorni è stato osservato dopo l'iniezione (pi) una sostanziale riduzione dell'espressione α-SYN nel SNPC, mentre era ancora rilevabile nelle zone che circondano il SN (Figura 5B - 5C). Successivamente, abbiamo analizzato il livello di perdita di cellule nigrale. Una rapida e progressiva perdita of fino al 80% dei neuroni TH-positivi è stato rilevato nel corso di 29 giorni nei ratti iniettati con A53T α-SYN rAAV2 / 7 (Figura 5D - 5H). Da segnalare, l'iperespressione di tipo selvaggio, invece di A53T α-SYN provocato simile neurodegenerazione dopaminergica (dati non riportati). La perdita della DN nella SN è stata accompagnata da una robusta diminuzione di terminali nervosi TH-positivi nello striato (STR) (Figura 5F). Per escludere effetti specifici vettore lotti, diverse α-SYN preparati vettore sono stati testati nel SN con risultati simili. Nessuna riduzione della TH colorazione è stata osservata nel SN o STR di eGFP rAAV2 / 7 iniettato animali di controllo (Figura 5E-5H). Accanto a dopaminergica neurodegenerazione, la presenza di α-synucleinopathy è una seconda importante caratteristica del PD. Nonostante il periodo di tempo breve del nostro modello (quattro settimane), abbiamo osservato entrambi gli aggregati citoplasmatici α-SYN-positivi nel SN e neuriti distrofici nel STR (Figura 5I ong>). Immunoreattività ubiquitina è una caratteristica distinta di Lewy patologia del corpo nel cervello umano 20-22. Abbiamo osservato co-localizzazione di α-SYN e ubiquitina a 29 giorni pi in una frazione (± 20%) del α-SYN esprimendo neuroni nigrali (Figura 5J). La natura fibrillare degli aggregati α-SYN è stata valutata mediante Thioflavin S (Thio S) colorazione 23. Thio S cellule positive sono state rilevate nel SN da 17 giorni in poi (Figura 5J).
Figura 1:. Iniezione stereotassica di rAAV2 / 7 α-SYN vettore risultati nella neurodegenerazione progressiva iniezione stereotassica di rAAV2 / 7 α-SYN vettore nel SN del ratto induce neurodegenerazione dopaminergica misurata attraverso l'analisi del comportamento (test del cilindro), PET non invasivo imaging e di analisi IHC.d / 53670 / 53670fig1large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: iniezione stereotassica di codifica rAAV2 / 7 vettoriale α-SYN nel SN del ratto. (A, B, E) Le suture craniche sul cranio ratto, che definiscono i due punti di riferimento: Bregma e Lambda. (C) Un atlante stereotassiche del cervello di ratto presentando regione dell'iniezione cioè il SN. (D) Un Wistar ratto posizionato in una cornice di testa stereotassica utilizzando due barre orecchio, una bocca e un bar naso. (F) L'ago 30 gauge riempito di vettore viene collocato in posizione per substantia nigra. (G) Una piccola intero è forato al sito di iniezione e l'ago viene inserito in posizione. (H) Dopo l'iniezione del cuoio capelluto è stitched e disinfettati. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: rAAV sovraespressione 2/7 mediata di A53T α-SYN induce deficit motori dopamina-dipendente (A, B) prova cilindro in diversi momenti dopo l'iniezione di rAAV2 / 7 A53T α-SYN.. (Media ± DS, * p <0,05 rispetto a 17 giorni, # p <0.05 controlli eGFP di ANOVA e Tukey test post hoc, n = 5). (C) Test cilindro in diversi momenti dopo l'iniezione di rAAV2 / 7 A53T α-syn (dose elevata di vettore). (Media ± DS, * p <0,05 4 giorni contro i 29 giorni di ANOVA e Tukey post hoc di prova, n = 5). La prova è stata eseguita con o senza somministrazione di Levodopa (L-dopa). (Media ± DS, * p <0.05 non trattati contro animali trattati mediante ANOVA e Tukey test post hoc, n = 5). Ristampato da Neurobiologia di invecchiamento, vol. 36, Van der Perren et al., Follow-up longitudinale e caratterizzazione di un modello di ratto robusto per il morbo di Parkinson sulla base di sovraespressione di alfa-sinucleina con vettori virali adeno-associati, 1543-1558, (2015), con il permesso di Elsevier. clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4:. Di imaging non invasiva di A53T α-SYN morte cellulare dopaminergica indotta utilizzando DAT PET Imaging (A - B) Serie di fette orizzontali e coronali raffiguranti media striatale DAT legame di (A) rAAV2 / 7 A53T α-SYN iniettato animali a differenpunti t tempo dopo l'iniezione (n = 7) e (B) rAAV2 / 7 eGFP iniettato (n = 1) o 6-OHDA trattati animali di controllo (n = 1) 79 giorni dopo l'iniezione. barre di colore indicano potenzialità vincolanti per la DAT. (C) Quantificazione del DAT legame di rAAV2 / 7 A53T α-SYN, rAAV2 / 7 eGFP e 6-OHDA iniettato animali misurati in diversi momenti (i dati rappresentano media ± DS). Ristampato da Neurobiologia di invecchiamento, vol. 36, Van der Perren et al., Follow-up longitudinale e caratterizzazione di un modello di ratto robusto per il morbo di Parkinson sulla base di sovraespressione di alfa-sinucleina con vettori virali adeno-associati, 1543-1558, (2015), con il permesso di Elsevier. clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5: rAAV 2/7 mediata sovraespressione di A53T α-SYN induce la morte delle cellule dopaminergiche e la formazione di insolubili aggregati positivi α-SYN. (A - B) colorazione IHC dimostrando α-SYN sovraespressione 4 giorni e 29 giorni dopo il trasferimento rAAV mediato in rat SN. Inserti mostrano ingrandimenti della zona selezionata. Scala bar = 400 (foto panoramica a sinistra) micron, 70 micron e 200 micron (inserti a destra). (C) IHC colorazione dimostrando eGFP sovraespressione 4 giorni e 29 giorni dopo il trasferimento rAAV mediato in SN ratto. Barra di scala = 400 micron. (D - G) IHC colorazione per TH nel SN e STR in diversi momenti dopo l'iniezione di (D, F) rAAV2 / 7 α-SYN o 29 giorni dopo l'iniezione di (E, G) rAAV2 / 7 eGFP nel SN . Scale bar a, c = 400 micron, b, d = 1,000 micron. (H) quantificazione stereologica del intorpiditoer dei neuroni TH-positivi nel SN nel tempo dopo l'iniezione rAAV2 / 7 A53T α-SYN o rAAV2 / 7 eGFP controllo vettoriale (media ± DS, * p <0,05 rispetto a 8 giorni, # p <0.05 rispetto ai controlli eGFP di ANOVA e test di Tukey hoc postale, n = 5). (I) IHC colorazione dimostrando α-SYN patologia, tra cui aggregati citoplasmatici in SN e distrofici e neuriti sporgenti in STR, dopo intranigral rAAV2 / 7 A53T α-SYN iniezione. (J) immagini confocale rappresentativi di fluorescenti doppie immunostainings per α-SYN (verde) e ubiquitina (rosso) mostrano un aumento di co-localizzazione nel tempo (frecce). Scala bar c = 50 micron. Thioflavin S colorazione dei SN 29 giorni dopo l'iniezione di rAAV2 / 7 A53T α-SYN. Barra di scala D = 30 micron. Ristampato da Neurobiologia di invecchiamento, vol. 36, Van der Perren et al., Follow-up longitudinale e caratterizzazione di un modello di ratto robusto per il morbo di Parkinson sulla base di sovraespressione di alfa-sinucleina con ADeno-associato vettori virali, 1543-1558, (2015), con il permesso di Elsevier. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Ci sono diversi passaggi critici all'interno del protocollo. Il titolo di vettore e la purezza vettoriale influenza direttamente l'esito fenotipica del modello. Eccessive titoli vettoriali o lotti vettore non sufficientemente purificate possono causare tossicità non-specifica. Pertanto, l'uso di lotti vettoriali di alta qualità e appropriati vettori di controllo è indispensabile. Inoltre, l'esatto posizionamento della testa del ratto nel telaio stereotassico e la determinazione accurata delle coordinate è essenziale nel targeting substantia nigra. Dopo il foro nel cranio nel sito di iniezione, è importante inserire l'ago direttamente nel cervello del ratto senza toccare alcuna margini. L'ago deve essere rimosso lentamente dopo l'iniezione del vettore virale, per evitare perdite di vettore. Infine, dopo la cucitura, il cuoio capelluto deve essere disinfettata con 1% jodium nel 70% di isopropanolo per evitare pungente delle cuciture da altri animali. In alternativa altri reagenti antisettichepuò essere utilizzata.
Il metodo descritto può essere utilizzato anche per sviluppare un modello topi rAAV2 / 7 α-SYN base per la malattia di Parkinson 24. Nei topi si inietta un volume di 2 ml rAAV vettore nella SN. Rispetto ai ratti, topi DN sembra essere leggermente meno sensibili ad a-SYN sovraespressione, causando una manifestazione ritardata della neurodegenerazione. Inoltre, altre regioni del cervello (per esempio corpo striato, ippocampo, corteccia, ecc) possono essere mirati. Le coordinate per le diverse regioni del cervello si trovano nell'atlante stereotassica. Ottimizzazione delle coordinate può essere fatto da inchiostro cinese o utilizzando un vettore virale codificante un gene reporter (es eGFP). Diversi sistemi vettori (rAAV, LV, etc.) possono essere utilizzate a seconda dell'applicazione.
Questa tecnica ha la limitazione che ciascun animale deve essere iniettato singolarmente. Quindi una persona formata deve effettuare le iniezioni al fine di minvariazioni imize tra animali diversi. Un'altra limitazione è che il metodo è in termini di tempo (quando viene eseguito da una persona esperta si impiegano circa 45 minuti per ogni animale). Solo otto a dieci animali possono essere iniettati in un solo giorno.
Vettore virale mediata consegna gene permette la specifica il targeting di regioni cerebrali. Utilizzando vettori virali, i livelli di espressione del transgene alta possono essere raggiunti, che è cruciale dal momento che l'insorgenza della malattia e la gravità dipende dal livello di espressione α-SYN. Inoltre, diverse dosi possono essere applicati che si tradurrà in un modello animale visualizzazione cinetica più o meno veloce di neurodegenerazione. Infine, questa tecnica può essere usato per creare modelli in diverse specie animali e ceppi utilizzando la stessa preparazione vettoriale.
Questa procedura può essere utilizzata per fornire vettori virali e tossine (ad esempio 6-OHDA) in diverse regioni del transgene brain.The codificata dal vettore può essere una proteina reporter, un p terapeuticarotein per applicazioni di terapia genica 8-10 o una proteina correlata alla malattia usato per la malattia di modellazione 11-14. Questa tecnica può essere usata per sviluppare nuovi modelli animali che consentono droga test preclinico e può essere utile nello studio del meccanismo molecolare del morbo di Parkinson, così come molte altre malattie neurodegenerative.
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Disclosures
Gli autori dichiarano che non vi è alcun conflitto reale o potenziale di interesse.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano Joris Van Asselberghs e Ann Van Santvoort per la loro eccellente assistenza tecnica. La ricerca è stata finanziata dal IWT-Vlaanderen (IWT SBO / 80020), la FWO Vlaanderen (G.0768.10), dal programma EC-FP6 'Dimi' (LSHB-CT-2005-512.146), il progetto del 7 ° PQ di RST MEFOPA (HEALTH -2.009-241.791), il programma del 7 ° PQ 'inmind' (HEALTH-F2-2011-278850), la KU Leuven (IOF-KP / 07/001, OT / 08 / 052A, IMIR PF / 10/017), e la MJFox Foundation (validazione del target 2010). A. Van der Perren e C. Casteels sono un post-dottorato compagni del Fondo fiamminga della ricerca scientifica. K. Van Laere è un collega clinica di alto livello del Fondo fiammingo della ricerca scientifica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Female 8 weeks old Wistar rats | Janvier | / | 200-250 g |
| Ketamine (Nimatek) | Eurovet animal health | 804132 | |
| Medetomidine (Dormitor) | Orion-Pharma/ Janssen Animal Health | 1070-499 | |
| Local anesthetic for scalp and ears: Xylocaïne 2% gel | Astrazeneca | 0137-547 | |
| Terramycine | Pfizer | 0132-472 | |
| Buprénorphine (Vetergesic) | Ecuphar | 2623-627 | |
| Jodium 1% isopropanol | VWR | 0484-0100 | |
| stereotactic head frame | Stoeling | / | |
| Hamilton Syringe (30 gauge -20 mm -pst 2) | Hamilton/ Filter Service | 7803-07 | |
| atipamezole (Antisedan) | Orion-Pharma/Elanco | 1300-185 | |
| rAAV A53T α-SYN vector | LVVC, KU Leuven | / | https://gbiomed.kuleuven.be/english/research/50000715/laboratory-of-molecular-virology-and-gene-therapy/lvvc/ |
| sodium pentobarbital (Nembutal) | Ceva Santé | 0059-444 | |
| microtome | Microm | HM650 | |
| rabbit polyclonal synuclein Ab | Chemicon | 5038 | 1:5,000 |
| rabbit polyclonal TH Ab | Chemicon | 152 | 1:1,000 |
| Lutetium oxyorthosilicate detector-based FOCUS 220 tomograph | Siemens/ Concorde Microsystems | / | |
| radioligand: 18F-FECT | In house | / | |
| L-dopa: Prolopa 125 | Roche | 6 mg/kg i.p. | |
| DMEM, Glutamax | Life Technologies | N° 31331-093 | |
| Foetal bovine serum | Life Technologies | N° 10270-106 | |
| 25 kD linear polyethylenimine (PEI) | Polysciences | / | |
| OptiPrep Density Gradient Medium: Iodixanol | Sigma | D1556-250ML | |
| Optimen | Life Technologies | N° 51985-026 | |
| Paxinos 1 watston steretactic atlas, fourth Edition | Elsevier | / |
References
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