Abstract
For å studere de molekylære veier av Parkinsons sykdom (PD) og for å utvikle nye terapeutiske strategier, vitenskapelig undersøkere stole på dyremodeller. Identifiseringen av PD-assosierte gener har ført til utvikling av genetiske PD-modeller. De fleste transgene α-SYN musemodeller utvikle gradvis α-SYN patologi, men ikke klarer å vise tydelig dopaminerge celle tap og dopaminavhengige atferds underskudd. Dette hinderet ble overvunnet ved direkte målretting av substantia nigra med virale vektorer overekspresjon PD-assosiert gener. Lokal genavlevering ved hjelp av virale vektorer gir en attraktiv måte å uttrykke transgener i sentralnervesystemet. Bestemte områder av hjernen kan være målrettet (f.eks substantia nigra), kan ekspresjon bli indusert i den voksne omgivelser og høye ekspresjonsnivåer kan oppnås. Videre kan forskjellige vektor-systemer basert på ulike virus anvendes. Protokollen skisserer alle avgjørende skritt for å utføre en viral vektorinjeksjon i substantia nigra fra rotte for å utvikle en viral vektor-baserte alpha-synuclein dyremodell for Parkinsons sykdom.
Introduction
Å studere patofysiologien av PD og for å utvikle nye terapeutiske strategier, er det et stort behov for dyremodeller som tett ligner de nevropatologi, fysiologi og motoriske symptomer på menneskelig PD. Jo høyere prediktiv verdi, jo bedre kan vi oversette nye behandlingsformer fra dyremodeller til pasienter.
Oppdagelsen av alpha-synuclein (α-SYN) som den første PARK genet i 1997 førte til utviklingen av de første genetiske PD-modeller. Mange transgene mus overekspresjon human villtype (WT) eller mutant (A30P, A53T) α-SYN har blitt generert over det siste tiåret. Nivåene av α-SYN overekspresjon har vist seg å være viktig i utviklingen av patologien. Også musestamme, tilstedeværelse eller fravær av endogen α-SYN og hvorvidt den fulle lengde eller en trunkert form uttrykkes, spiller en rolle (detaljert gjennomgang av Magen og Chesselet 1). Overekspresjon av både WT og flere kliniske mutanter av menneskelig &# 945; -SYN i transgene mus induserer patologisk akkumulering av α-SYN og neuronal dysfunksjon 2-6. Men inntil nå har de fleste transgene α-SYN musemodeller ikke klarte å vise klart dopaminerge celle tap og dopaminavhengige atferds underskudd.
Dette hinderet ble overvunnet ved direkte målretting av substantia nigra (SN) med virale vektorer overekspresjon α-SYN. Virale vektorer som er avledet fra virus som lett kan infisere celler, innføre genetisk materiale inn i vertsgenomet og tvinge vertscellen for å gjenskape det virale genomet for å danne nye viruspartikler. Virus kan være konstruert for å ikke reproduserende virale vektorer som beholder sin evne til å gå inn celler og introdusere gener. Ved å slette deler av det virale genom og erstatte dem av gener av interesse, vil anvendelse av vektoren resulterer i en enkelt runde infeksjon uten replikasjon i vertcellen, generelt betegnet som "transduksjon". Virale vektorer cen brukes til både overekspresjon og genet demping. Det uttrykte transgenet kan være en reporter protein (f.eks grønt fluorescerende protein eller ildflue luciferase) 7, et terapeutisk protein for genterapianvendelser 8-10 eller, som vi vil fokusere på i denne artikkelen, en sykdomsrelatert protein som brukes for sykdom modellering 11 -14.
Viral vector-genavlevering gir en alternativ måte å uttrykke transgener i CNS med flere fordeler. Ved hjelp av lokale transgen levering, kan bestemte områder av hjernen være målrettet. Videre kan transgene uttrykk induseres i voksen alder redusere risikoen for kompenserende mekanismer under utvikling. Dessuten kan modellene lages i ulike arter og stammer. Og til slutt, ulike transgener kan lett kombineres. Ved hjelp av virale vektorer, kan transgene høye ekspresjonsnivåer bli oppnådd, noe som kan være avgjørende, fordi sykdomsutbruddet og alvorlighetsgraden ofte avhenge av nivået av overexpression.
Flere vektorsystemer basert på forskjellige virus er blitt utviklet. Valg av vektorsystem avhenger av størrelsen av det aktuelle genet, den ønskede varigheten av genekspresjon, målcellen og biologisk problemer. For stabil genoverføring i hjernen, lentiviral (LV) og rekombinant adeno-assosiert viral (rAAV) vektorer er nå betraktet vektorsystemer valg siden de fører til effektiv og langsiktig genuttrykk i gnager hjernen. For spesifikk målretting av dopaminerge nevroner (DN) av SN, har rAAV vektorer gradvis utkonkurrert LV vektorer på grunn av deres høye titre og transduksjon effektiviteten av DN.
De beste α-SYN basert gnagermodeller som er tilgjengelige har blitt utviklet fra en kombinert tilnærming ved hjelp av nyere AAV serotyper (rAAV 1, 5, 6, 7, 8) og optimalisert vektorkonstruksjoner, titre og renhet 15,16. Vektoren titer samt vektoren renhet direkte påvirkerden fenotypiske utfallet av modellen. Overdreven vektor titere eller mangelfullt rensede vektor partier kan føre til ikke-spesifikk toksisitet. Derfor egnede kontroll vektorer er uunnværlig. Betydelig investering i viral vektor produksjon, oppskalering og rensemetoder har også vist seg viktig å få reproduserbare og høy kvalitet vektor grupper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøk er utført i samsvar med europeiske fellesskap rådsdirektiv av 24 november 1986 (86/609 / EEC) og godkjent av Bioetisk Utvalget ved Universitetet i Leuven (Belgia).
1. rekombinant AAV Produksjon og rensing
Merk: rAAV vektor produksjon og rensing ble utført ved Leuven viral vektor Kjerne (LVVC) som tidligere beskrevet 17.
- I korthet, transfeksjon Subkonfluente lav (<50) passasje adherente HEK 293T-celler ved hjelp av et 25kD lineær polyetylenimin 150 nM NaCl-løsning transfeksjon og tre forskjellige plasmider i et forhold på 1: 1: 1 i DMEM-medium 2% føtalt bovint serum. Etter 24 timers inkubering ved 37 ° C i en 5% CO2, erstatte mediet med friskt DMEM-medium 2% føtalt bovint serum.
Merk: plasmider innbefatter konstruksjonene for AAV7 serotype, AAV overføring plasmid som koder for humant A53T mutant α-SYN under kontroll av den CMVie forbedrede synapsin1 promoteren og pAdvDeltaF6 adenovirus hjelperen plasmid 17. - Høste mellom 5 dager etter transient transfeksjon og konsentrere hjelp tangentialfiltrering 17.
- Rense rAAV vektorpartikler fra det konsentrerte medium ved hjelp av en iodixanol trinngradient 17.
- Bruk standard teknikker for real-time PCR for genomisk kopi (GC) besluttsomhet. I denne protokollen, en vektor titer på 3,0 E11 GC / ml ble brukt til å utvikle en α-SYN basert rottemodell for PD-17.
2. stereotaktisk injeksjon av rAAV α-SYN Vector i SN av Rat (Figur 2)
- Hus åtte uker gamle Wistar hunnrotter som veier omtrent 200-250 g under en normal 12 timers lys / mørke syklus med fri tilgang til pelletert mat og vann fra springen.
- Sende rat til intraperitoneal (ip) anestesi inneholdende en blanding av ketamin (60 mg / kg) og medetomidin (0,4 mg / kg). Når rotten bedøvet og ikke reagererved å klemme de forskjellige labber, administrere en mikro-transponder subkutant på baksiden av rotte for ytterligere gjenkjennelse ved hjelp av en mikro-transponder implanteringsapparat. Sjekk om mikro-transponder er riktig plassert og kan leses ut av avlesningsutstyret.
- Klipp håret på toppen av hodebunnen. Anvende et lokalanestetikum både på hodebunnen og ørene. Utfør resten av den kirurgiske prosedyren under en laminær ved bruk av aseptiske teknikker.
- Plasser rotter i et stereohoderamme ved hjelp av to øre barer, en munn og en nese bar. Dekke kroppen av rotten med et papir teppe for å unngå et fall i kroppstemperatur. Påfør en okulær smøremiddel for å unngå at øynene tørker ut.
- Desinfiser hodebunnen med jodium 1% i isopropanol 70% og lage et lite snitt i midtlinjen av hodebunnen. Forsiktig skrape bort membraner på skallen og skyll med saltvann. La skallen tørke i flere minutter. Observer kraniale suturer og de to referansepunkter: Bregma og Lambda. Å injisere rAAV vektoren inn i SN, definere koordinatene mot Bregma (anteroposterior: 5,3 mm; mediolateral: 2,0 mm og dorsoventral: regnet fra dura 7,2 mm).
Merk: tredimensjonale koordinater for hver region av interesse kan beregnes ved hjelp av en stereotaxic atlas av rottehjernen, søker Bregma som anatomiske referansepunkt. - Fyll en 10 mL mikroinjeksjon sprøyte (30 sporvidde 20 mm) med rAAV vektor og legg den i stereotaxic instrument forbundet med en motorisert mikroinjeksjon pumpe. Kontrollere volumet ved å slippe en dråpe vektor og eliminere i en flerverdig rengjøring vaskemiddel pH 9 (f.eks RBS).
- Visuelt sjekke om hodet er festet rett i hodet rammen og evaluere venstre-høyre akse. Nøye visuelt definere anteroposterior og mediolateral koordinater for Bregma og Lambda og måle høyden ved hjelp av en 30 måler 20 mm nål i dorsoventral arm av stereotaktisk ramme.
- Tillat amaximum på 0,3 mm høydeforskjell mellom Bregma og Lambda. Sett nålen tilbake på Bregma og bruke anteroposterior og mediolateral koordinatene ved å flytte anteroposterior og mediolateral arm av stereotaktisk ramme.
- I stedet for injeksjon, måle høyden på hodeskallen og sørge for at det ikke avviker mer enn 0,3 mm fra høyden på Bregma. Bore et hull i skallen med en diameter på ca. 2 mm. Måle høyden på dura, vil dette tjene som en referanse for å påføre dorsoventral koordinat. Alternativt kan trekke en fast tykkelse for skallen (0,9 mm).
- Trenge inn i dura ved anvendelse av en 26 gauge nål og absorbere blod med et sterilt vev. Vent til all blødningen har stoppet før du fortsetter.
- Sakte setter 10 mL mikroinjeksjon sprøyte forhåndslastet med vektor-løsning inn i hjernen til forhåndsbestemt dybde (dorsoventral koordinere). Vent 1 min med nålen på plass. Sprøyt 3 plav vektor-løsning (3,0 E11 genom kopier / ml (medium vektordose) eller 1,0 E12 GC / ml (høy vektor dose) av rAAV2 / 7 α-SYN eller EGFP kontroll vektor) ved hjelp av den motordrevne mikroinjeksjon pumpe med en gjennomstrømning på 0,25 ul / min.
- Etter injeksjon, holde nålen på plass for en annen 5 min før sakte fjerner den. Stitch hodebunnen ved hjelp belagt flettet polyester 3,0, desinfisere med 1% jodium i 70% isopropanol og forsiktig fjerne dyret fra stereoinstrument. Først løsne nese og munn bar, deretter de to øre barer.
- Hvis du vil snu anestesi, injisere rotte intraperitonealt med 0,5 mg / kg atipamezole og plassere rotte i en ren bur på en varmeplate på 38 ° C før den våkner. Dekk rotte med et papir teppe for å hindre et fall i kroppstemperatur.
- Gir enkel tilgang til mat og vann for de første timene. Overvåk rotte for de første dagene. Påfør analgesi.
Merk: Det er ikke nødvendig å fjerne stingene fra than skallen. Etter 1-2 uker skallen er fullstendig reparert og sømmene løsne.
3. Vurdering av rAAV2 / 7 α-SYN Støpt Rats bruk av ikke-invasiv PET Imaging, adferdstester og Immunhistokjemisk analyse
- For å følge opp kinetikken nigrostriatal dopaminerge nevrodegenerasjon non-invasiv over tid i enkelte dyr, kvantifisere dopamin transporter (DAT) binding ved hjelp av små-dyr positronemisjonstomografi (PET) og en tracer av DA Transporter f.eks [18 F] -FECT 16 .
- For å undersøke om nivået av dopaminerge nevrodegenerasjon er tilstrekkelig til å indusere motoriske vansker i rottene, utsette rottene til sylinderen test for å evaluere spontan forbena bruk.
- Plasser rotte i en 20 cm bred klart glass sylinder og videobånd oppførselen under vertikale bevegelser langs veggen og landing etter en bak. Resultat antall kontakter gjort av hver forpoten for totalt 20kontakter. For nærmere beskrivelse av scoring kriterier se Schallert et al. 18 Uttrykk antall svekket forbena kontakter (f.eks venstre forpotens) i prosent av totale forbena kontakter (venstre pluss høyre forpoten).
Merk: Ikke-skadede kontrollrottene med begge labbene like bør scorer rundt 50% i denne testen.
- Plasser rotte i en 20 cm bred klart glass sylinder og videobånd oppførselen under vertikale bevegelser langs veggen og landing etter en bak. Resultat antall kontakter gjort av hver forpoten for totalt 20kontakter. For nærmere beskrivelse av scoring kriterier se Schallert et al. 18 Uttrykk antall svekket forbena kontakter (f.eks venstre forpotens) i prosent av totale forbena kontakter (venstre pluss høyre forpoten).
- Utfør immunhistokjemisk (IHC) analyse for å vurdere graden av transgene uttrykk og dopaminerge celle tap.
- Ved forskjellige sluttstadier, ofre rottene med en overdose av natriumpentobarbital (60 mg / kg, ip) og utføre en intracardial perfusjon med kald saltoppløsning, etterfulgt av 4% paraformaldehyd i PBS 19. Fikserer hjernene over natten ved 4 ° C og kuttet 50 um tykke koronalsnitt hjerneseksjoner ved hjelp av en vibrerende mikrotom.
- Utfør IHC flekker på frittflytende seksjoner som bruker antistoffer mot α-SYN og tyrosin hydroksylase å analysere α-SYN uttrykk nivåer og leVEL av neurodegeneration 16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den generelle ordningen av forsøket er vist i figur 1
rAAV 2/7-mediert overekspresjon av A53T α-SYN induserer dopamin-avhengig motoriske underskudd.
For å undersøke hvorvidt nivået av α-SYN overekspresjon er tilstrekkelig til å indusere motoriske svekkelser i rottene, vi utsettes rottene for sylinderen test for å evaluere spontan forbena bruk (figur 3A). Fra 3 uker etter injeksjon, ble en betydelig motor svekkelse hos rotter som fikk en dose 3,0 E11 GC / ml A53T α-SYN rAAV2 / 7 vektor. Ved 4 uker etter injeksjonen ble det observert en 50% reduksjon i spontan kontralaterale (venstre) forpoten bruk, mens styre EGFP rAAV2 / 7 injiserte dyrene ikke viste noen asymmetri i forpoten bruk (figur 3B). Rotter som mottok en høyere A53T α-SYN rAAV2 / 7-vektoren dose viste en mer uttalt impairment av forpoten bruk (70%) på 29 dager etter injeksjonen (figur 3C). For å bevise at den observerte motorfunksjon var dopamin-avhengige, vi administrert en enkelt dose av L-DOPA (6 mg / kg ip) til rottene injisert med et høyt vektor dose. Når vi gjentok sylinderen test 45 minutter etter L-DOPA-behandling, en full gjenoppretting av forpoten anvendelse ved A53T α-SYN rAAV2 / 7 injiserte dyr ble observert (figur 3C).
PET billeddiagnostikk gjør at ikke-invasiv avbildning av α-SYN indusert progressiv neurodegeneration.
For å følge opp kinetikken nigrostriatal dopaminerge nevrodegenerasjon non-invasiv over tid i enkelte dyr, kvantifisert vi dopamin transporter (DAT) binding ved hjelp av små-dyr positronemisjonstomografi (PET) med [18 F] -FECT som radioligand. DAT binding betydelig redusert i ipsilaterale caudatus-putamen av A53T α-SYN rAAV2 / 7 injected rotter over tid, men holdt seg stabil i EGFP kontroll dyr (Figur 4A - 4B). Kvantifisering av DAT binding av A53T α-SYN rAAV2 / 7 injisert dyr viste en maksimal hastighet på nigrostriatal dopaminerge degenerasjon mellom dag 7 og 21 etter injeksjon. Etter 32 dager ble en nedgang i DAT binding av opptil 85% observert (Figur 4C). Som en positiv kontroll, injeksjon av neurotoksinet 6-OHDA i SN induserte 90% tap av DAT-binding innen 7 dager (Figur 4B - 4C).
Stereotactic injeksjon av rAAV2 / 7 A53T α-SYN i SN av rotte induserer nigral dopaminerge celledød og danne uløselige α-SYN positive aggregater.
For å analysere nivået av α-SYN overekspresjon og dopaminerge celletap vi avlives dyrene ved forskjellige tidspunkter. IHC ble utført på frittflytende delene med et antistoff against α-synuclein (kanin polyklonale 1: 5000). Dette antistoffet kan detektere både humane og rotte α-synuclein, men endogene nivåer av rotte α-synuclein var under deteksjonsgrensene innenfor nigral celle somata, på grunn av sin dominerende lokalisering på synaptiske membraner. For å asses celle tap brukte vi et antistoff mot TH (kanin polyklonale 1: 1000).
Fire dager etter rAAV vektor injeksjon ble α-SYN eller EGFP ekspresjon detektert i SN (figur 5A - 5C) av rottene. Majoriteten (> 90%) av DN var effektivt transdusert og begge transgene proteinene ble lokalisert på cellelegemene og aksoner. På 29 dager ble observert etter injeksjon (pi) en betydelig reduksjon i α-SYN uttrykk i SNpc, mens det var fortsatt påvises i områdene rundt SN (Figur 5B - 5C). Deretter analyserte vi nivået av nigral celletap. En rask og progressiv tap of opp til 80% av TH-positive neuroner ble oppdaget i løpet av 29 dager i rotter injisert med A53T α-SYN rAAV2 / 7 (Figur 5D - 5H). Av notatet, overekspresjon av villtype i stedet for A53T α-SYN resulterte i lignende dopaminerge nevrodegenerasjon (data ikke vist). Tapet av DN i SN Parallelt med en robust nedgang på TH-positive nerveterminaler i striatum (STR) (figur 5F). For å utelukke bestemte vektor batch effekter, ble ulike α-SYN vektorpreparater testet i SN med lignende resultater. Ingen reduksjon i TH farging ble observert i SN eller STR av EGFP rAAV2 / 7 injiserte kontrolldyr (figur 5E-5H). tilstedeværelsen av α-synucleinopathy ved siden av dopaminerge nevrodegenerasjon, er en annen viktig kjennetegn på PD. Til tross for den korte tiden løpet av vår modell (fire uker), observerte vi både α-SYN-positive cytoplasmatiske aggregater i SN og dystrofe neurites i STR (Figur 5I ong>). Ubiquitin immunoreaktivitets er et tydelig trekk ved Lewy legeme patologi i den menneskelige hjerne 20-22. Vi har observert ko-lokalisering av α-SYN og ubiquitin ved 29 dager pi i en fraksjon (± 20%) av α-SYN uttrykk nigral neuroner (figur 5J). Den fibrillære art av α-SYN aggregater ble evaluert ved Thioflavin S (Thio S) farging 23. Tio S positive celler ble detektert i SN fra 17 dager fremover (Figur 5J).
Fig. 1: stereotaktisk injeksjon av rAAV2 / 7 α-SYN vektor resulterer i progressiv nevrodegenerasjon stereotaktisk injeksjon av rAAV2 / 7 α-SYN vektor i SN av rotte induserer dopaminerge nevrodegenerasjon målt via oppførsel analyse (sylinder-test), ikke-invasiv PET bildebehandling og IHC analyse.d / 53670 / 53670fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: stereotaktisk injeksjon av rAAV2 / 7-vektoren som koder for α-SYN i SN til rotten. (A, B, E) De kraniale suturer på rotte skallen, som definerer de to referansepunkter: Bregma og Lambda. (C) En stereotaksiske atlas av rottehjernen presentere området for injeksjonen nemlig SN. (D) En Wistar rotte plassert i et stereohoderammen med to øre barer, en munn og en nese bar. (F) Et 30 gauge nål fylt med vektoren er plassert i stilling for substantia nigra. (G) En liten hele blir boret ved injeksjonsstedet, og nålen er plassert i posisjon. (H) Etter injeksjon hodebunnen er stisys og desinfiseres. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: rAAV 2/7-mediert overekspresjon av A53T α-SYN induserer dopaminavhengige motoriske mangler (A, B) Cylinder test ved forskjellige tidspunkter etter injeksjon av rAAV2 / 7 A53T α-SYN.. (Mean ± SD, * p <0,05 versus 17 dager, # p <0,05 EGFP kontroller av ANOVA og Tukey post hoc test, n = 5). (C) Sylinder test ved forskjellige tidspunkter etter injeksjon av rAAV2 / 7 A53T α-SYN (høy dose) vektor. (Gjennomsnitt ± SD, * p <0,05 versus 4 dager 29 dager ved ANOVA og Tukey post hoc test, n = 5). Testen ble utført med eller uten administrering av levodopa (L-DOPA). (Mean ± SD, * p <0.05 ikke-behandlede versus behandlede dyr ved ANOVA og Tukey post hoc test, n = 5). Gjengitt fra nevrobiologi på aldring, vol. 36, Van der Perren et al., Longitudinell oppfølging og karakterisering av en robust rottemodell for Parkinsons sykdom basert på overekspresjon av alfa-synuclein med adeno-assosiert virale vektorer, 1543-1558, (2015), med tillatelse fra Elsevier. klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Fig. 4: Ikke-invasiv avbildning av A53T α-SYN indusert dopaminerge celledød ved hjelp av DAT PET avbildning (A - B) serie av horisontale og koronale snitt som viser midlere striatal DAT binding av (A) rAAV2 / 7 A53T α-SYN injiserte dyr på different tidspunkter etter injeksjon (n = 7) og (B) rAAV2 / 7 EGFP injisert (n = 1) eller 6-OHDA behandlede kontrolldyr (n = 1) 79 dager etter injeksjon. Fargelinjene angir bindende potensialer for DAT. (C) Kvantifisering av DAT binding av rAAV2 / 7 A53T α-SYN, rAAV2 / 7 EGFP og 6-OHDA injisert dyr målt på ulike tidspunkter (data representerer gjennomsnitt ± SD). Gjengitt fra nevrobiologi på aldring, vol. 36, Van der Perren et al., Longitudinell oppfølging og karakterisering av en robust rottemodell for Parkinsons sykdom basert på overekspresjon av alfa-synuclein med adeno-assosiert virale vektorer, 1543-1558, (2015), med tillatelse fra Elsevier. klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: rAAV 2/7-mediert overekspresjon av A53T α-SYN induserer dopaminerge celledød og dannelse av uoppløselige α-SYN positive aggregater. (A - B) IHC-farging som viser α-SYN overekspresjon 4 dager og 29 dager etter at rAAV mediert overføring i rotte SN. Setter inn viser forstørrelser av det valgte området. Scale bar = 400 mikrometer (oversiktsbildet til venstre), 70 mikrometer og 200 mikrometer (inserts høyre). (C) IHC-farging som viser EGFP overekspresjon 4 dager og 29 dager etter at rAAV mediert overføring i rotte SN. Scale bar = 400 mikrometer. (D - G) IHC-farging for TH i SN og STR ved forskjellige tidspunkter etter injeksjon av (D, F) rAAV2 / 7 α-SYN eller 29 dager etter injeksjon av (E, G) rAAV2 / 7 EGFP i SN . Scale bar a, c = 400 pm, b, d = 1,000 um. (H) Stereological kvantifisering av nummeneh av TH-positive nevroner i SN over tid etter rAAV2 / 7 A53T α-SYN injeksjon eller rAAV2 / 7 EGFP kontroll vektor (Mean ± SD, * p <0,05 versus åtte dager, # p <0,05 versus EGFP kontroller av ANOVA og Tukey post hoc test, n = 5). (I) IHC farging demonstrere α-SYN patologi, inkludert cytoplasmatiske aggregater i SN og dystrofe og svulmende neurites i STR, etter intranigral rAAV2 / 7 A53T α-SYN injeksjon. (J) Representative confocal bilder av fluorescerende doble immunostainings for α-SYN (grønn) og ubiquitin (rød) viser en økning i samlokalisering over tid (piler). Scale bar c = 50 mikrometer. Thioflavin S farging av SN 29 dager etter injeksjon av rAAV2 / 7 A53T α-SYN. Scale bar D = 30 mikrometer. Gjengitt fra nevrobiologi på aldring, vol. 36, Van der Perren et al., Longitudinell oppfølging og karakterisering av en robust rottemodell for Parkinsons sykdom basert på overekspresjon av alfa-synuclein med annonseneno-assosiert virale vektorer, 1543-1558, (2015), med tillatelse fra Elsevier. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det er flere viktige trinnene i protokollen. Vektoren titer samt vektoren renhet direkte påvirker fenotypiske utfallet av modellen. Overdreven vektor titere eller mangelfullt rensede vektor partier kan føre til ikke-spesifikk toksisitet. Derfor er bruken av høykvalitets vektor grupper og egnede kontroll vektorer uunnværlig. Videre er den nøyaktige plassering av rotte hode i den stereotaksisk ramme og nøyaktig bestemmelse av koordinatene vesentlig i målretting substantia nigra. Etter boring av hull i skallen på injeksjonsstedet, er det viktig å sette nålen rett inn i rottehjerne uten å berøre noen marginer. Nålen bør sakte fjernet etter injisering av viral vektor, for å hindre vektor lekkasje. Til slutt, etter søm, hodebunnen bør desinfiseres med 1% jodium i 70% isopropanol for å unngå biting av sømmene av andre dyr. Alternativt andre antiseptiske reagenserkan bli brukt.
Fremgangsmåten som er beskrevet kan også brukes til å utvikle en rAAV2 / 7 α-SYN basert mus-modellen for Parkinsons sykdom 24. Hos mus injisere vi et volum på 2 pl rAAV vektor i SN. Sammenlignet med rotter, mus DN synes å være noe mindre følsom for a-SYN overekspresjon, noe som resulterer i en forsinket manifestasjon av neurodegenerasjon. Videre kan andre regioner i hjernen (f.eks striatum, hippocampus, cortex, etc.) være målrettet. Koordinatene for de ulike områder av hjernen kan bli funnet i stereotaxic atlas. Optimalisering av koordinatene kan gjøres ved kinesisk blekk eller ved hjelp av en viral vektor som koder for et reporter-gen (f.eks EGFP). Ulike vektorer systemer (rAAV, LV, etc.) kan brukes, avhengig av programmet.
Denne teknikk har den begrensning at hvert dyr har til å bli injisert enkeltvis. Derfor utdannet person skal utføre injeksjoner for å MINimize variasjoner mellom forskjellige dyr. En annen begrensning er at metoden er tidkrevende (når utført av en utdannet person tar det rundt 45 minutter per dyr). Bare åtte til ti dyr kan injiseres i en dag.
Viral vektor-mediert genet levering åpner for spesifikk målretting av hjerneregioner. Ved hjelp av virale vektorer, kan transgene høye ekspresjonsnivåer kan oppnås, noe som er avgjørende siden sykdomsutbruddet og alvorlighetsgraden avhenger av nivået av α-SYN uttrykk. Dessuten kan forskjellige doser anvendes som vil resultere i en dyremodell som viser langsommere eller raskere kinetikk for nevrodegenerasjon. Til slutt kan denne teknikken brukes til å lage modeller i forskjellige dyrearter og belastninger ved hjelp av den samme vektoren fremstillingen.
Denne fremgangsmåten kan brukes til å levere virale vektorer, så vel som toksiner (for eksempel 6-OHDA) inn i forskjellige regioner av brain.The transgenet kodet for av vektoren kan være en reporter protein, et terapeutisk protein for genterapianvendelser 8-10, eller en sykdom relatert protein som brukes for sykdom modellering 11-14. Denne teknikken kan brukes til å utvikle nye dyremodeller som gir mulighet for preklinisk testing og narkotika kan være fordelaktig i å studere den molekylære mekanisme av Parkinsons sykdom, så vel som mange andre nevrodegenerative lidelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne hevder at det ikke er noen reell eller potensiell interessekonflikt.
Acknowledgments
Forfatterne takker Joris Van Asselberghs og Ann Van Santvoort for deres utmerkede teknisk assistanse. Forskningen ble finansiert av den IWT-Vlaanderen (IWT SBO / 80020), den FWO Vlaanderen (G.0768.10), av EF-FP6 programmet «Dimi '(LSHB-CT-2005-512146), den FP7 RTD prosjektet MEFOPA (HELSE -2009-241791), den FP7 program 'inmind' (HELSE-F2-2011-278850), KU Leuven (IOF-KP / 07/001, OT / 08 / 052A, Imir PF / 10/017), og MJFox Foundation (Target validering 2010). A. Van der Perren og C. Casteels er en postdoktorer av den flamske Fund of Scientific Research. K. Van Laere er senior klinisk stipendiat av den flamske Fund of Scientific Research.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Female 8 weeks old Wistar rats | Janvier | / | 200-250 g |
| Ketamine (Nimatek) | Eurovet animal health | 804132 | |
| Medetomidine (Dormitor) | Orion-Pharma/ Janssen Animal Health | 1070-499 | |
| Local anesthetic for scalp and ears: Xylocaïne 2% gel | Astrazeneca | 0137-547 | |
| Terramycine | Pfizer | 0132-472 | |
| Buprénorphine (Vetergesic) | Ecuphar | 2623-627 | |
| Jodium 1% isopropanol | VWR | 0484-0100 | |
| stereotactic head frame | Stoeling | / | |
| Hamilton Syringe (30 gauge -20 mm -pst 2) | Hamilton/ Filter Service | 7803-07 | |
| atipamezole (Antisedan) | Orion-Pharma/Elanco | 1300-185 | |
| rAAV A53T α-SYN vector | LVVC, KU Leuven | / | https://gbiomed.kuleuven.be/english/research/50000715/laboratory-of-molecular-virology-and-gene-therapy/lvvc/ |
| sodium pentobarbital (Nembutal) | Ceva Santé | 0059-444 | |
| microtome | Microm | HM650 | |
| rabbit polyclonal synuclein Ab | Chemicon | 5038 | 1:5,000 |
| rabbit polyclonal TH Ab | Chemicon | 152 | 1:1,000 |
| Lutetium oxyorthosilicate detector-based FOCUS 220 tomograph | Siemens/ Concorde Microsystems | / | |
| radioligand: 18F-FECT | In house | / | |
| L-dopa: Prolopa 125 | Roche | 6 mg/kg i.p. | |
| DMEM, Glutamax | Life Technologies | N° 31331-093 | |
| Foetal bovine serum | Life Technologies | N° 10270-106 | |
| 25 kD linear polyethylenimine (PEI) | Polysciences | / | |
| OptiPrep Density Gradient Medium: Iodixanol | Sigma | D1556-250ML | |
| Optimen | Life Technologies | N° 51985-026 | |
| Paxinos 1 watston steretactic atlas, fourth Edition | Elsevier | / |
References
- Magen, I., Chesselet, M. F. Genetic mouse models of Parkinson's disease The state of the art. Prog Brain Res. 183, 53-87 (2010).
- Masliah, E., et al. Dopaminergic loss and inclusion body formation in alpha-synuclein mice: implications for neurodegenerative disorders. Science. 287, 1265-1269 (2000).
- Freichel, C., et al. Age-dependent cognitive decline and amygdala pathology in alpha-synuclein transgenic mice. Neurobiol Aging. 28, 1421-1435 (2007).
- Fleming, S. M., Fernagut, P. O., Chesselet, M. F. Genetic mouse models of parkinsonism: strengths and limitations. NeuroRx. 2, 495-503 (2005).
- Kahle, P. J., et al. Selective insolubility of alpha-synuclein in human Lewy body diseases is recapitulated in a transgenic mouse model. Am J Pathol. 159, 2215-2225 (2001).
- Chesselet, M. F., Richter, F.
- Deroose, C. M., Reumers, V., Debyser, Z., Baekelandt, V. Seeing genes at work in the living brain with non-invasive molecular imaging. Curr Gene Ther. 9, 212-238 (2009).
- Manfredsson, F. P., et al. rAAV-mediated nigral human parkin over-expression partially ameliorates motor deficits via enhanced dopamine neurotransmission in a rat model of Parkinson's disease. Exp Neurol. 207, 289-301 (2007).
- Vercammen, L., et al. Parkin protects against neurotoxicity in the 6-hydroxydopamine rat model for Parkinson's disease. Mol Ther. 14, 716-723 (2006).
- Winklhofer, K. F. The parkin protein as a therapeutic target in Parkinson's disease. Expert opinion on therapeutic targets. 11, 1543-1552 (2007).
- Kirik, D., et al. Parkinson-like neurodegeneration induced by targeted overexpression of alpha-synuclein in the nigrostriatal system. J Neurosci. 22, 2780-2791 (2002).
- Kirik, D., et al. Nigrostriatal alpha-synucleinopathy induced by viral vector-mediated overexpression of human alpha-synuclein: a new primate model of Parkinson's disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 2884-2889 (2003).
- Lauwers, E., et al. Neuropathology and neurodegeneration in rodent brain induced by lentiviral vector-mediated overexpression of alpha-synuclein. Brain pathology. 13, 364-372 (2003).
- Klein, R. L., King, M. A., Hamby, M. E., Meyer, E. M. Dopaminergic cell loss induced by human A30P alpha-synuclein gene transfer to the rat substantia nigra. Hum Gene Ther. 13, 605-612 (2002).
- Vander Perren, A., Van den Haute, C., Baekelandt, V. Viral Vector-Based Models of Parkinson's Disease. Curr Top Beh Neurosci. , (2014).
- Van der Perren, A., et al. Longitudinal follow-up and characterization of a robust rat model for Parkinson's disease based on overexpression of alpha-synuclein with adeno-associated viral vectors. Neurobiol Aging. , (2014).
- Van der Perren, A., et al. Efficient and stable transduction of dopaminergic neurons in rat substantia nigra by rAAV 2/1, 2/2, 2/5, 2/6.2, 2/7, 2/8 and 2/9. Gene Ther. , (2011).
- Schallert, T., Fleming, S. M., Leasure, J. L., Tillerson, J. L., Bland, S. T. CNS plasticity and assessment of forelimb sensorimotor outcome in unilateral rat models of stroke, cortical ablation, parkinsonism and spinal cord injury. Neuropharmacology. 39, 777-787 (2000).
- Soueid, J., Nokkari, A., Makoukji, J. Techniques and Methods of Animal Brain Surgery: Perfusion, Brain Removal, and Histological Techniques. Brain Neurotrauma: Molecular, Neuropsychological, and Rehabilitation Aspects. Frontiers in Neuroengineering. , (2015).
- Dale, G. E., et al. Relationships between Lewy bodies and pale bodies in Parkinson's disease. Acta Neuropathol. 83, 525-529 (1992).
- Dawson, V. L.
- Dawson, T., Mandir, A., Lee, M. Animal models of PD: pieces of the same puzzle? Neuron. 35, 219-222 (2002).
- LeVine, H. 3rd Quantification of beta-sheet amyloid fibril structures with thioflavin T. Methods Enzymol. 309, 274-284 (1999).
- Oliveras-Salva, M., et al. rAAV2/7 vector-mediated overexpression of alpha-synuclein in mouse substantia nigra induces protein aggregation and progressive dose-dependent neurodegeneration. Mol Neurodegener. 8, (2013).
