Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Udvikling og validering af en kvantitativ PCR Metode til hovdyrets herpesvirus-2 Diagnose i Respiratory Væsker

Published: March 17, 2016 doi: 10.3791/53672
Automatic Translation
1,2,3, 1,3, 1, 1, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3
1LABÉO Frank Duncombe, 2Unité de Risques Microbiens (U2RM, EA 4655), Normandy University, 3Hippolia Foundation

Introduction

Hovdyrets herpesvirus-2 (EHV-2) er involveret i en respiratorisk syndrom, med potentielle kliniske manifestationer såsom næseflåd, pharyngitis og hævede lymfeknuder 1-3. Denne virus er også mistænkt for at være forbundet med den ringe ydeevne af heste, hvilket kan resultere i en betydelig og negativ økonomisk virkning for hesten industrien 2.

Indtil nu, den gyldne standard for gamma-EHV (γ-EHV) detektion var cellekulturen metoden. Den første ulempe af denne procedure var der ikke foreligger forskelsbehandling mellem EHV-2 og andre γ-EHV s (f.eks EHV-5). Den anden ulempe var den langsomme udvikling af cytopatisk proces, som tager fra 12 til 28 dage at manifestere 4,5.

Udvikling af en valideret og normaliseret kvantitativ real-time polymerasekædereaktion (QRT-PCR) -metoden vil bidrage til hurtigt påvise virus, for at skelne mellem EHV-2 og EHV-5 og at undersøge forholdet mellem det virale genom belastningen og sygdommen takket være kvantificering aspekt.

Polymerasekædereaktion (PCR) blev beskrevet for første gang i 1986 af Mullis 6 og er ved at blive den nye guld standard i de fleste af felterne af biologisk diagnose (human, miljø og veterinær). Denne metode, som er baseret på amplifikation af en del af genomet af patogener, som indebærer mange fordele: specificitet, følsomhed og hurtighed. Endvidere er risikoen for amplicon kontaminering aftaget siden indførelsen af QRT-PCR og kvalitetssikring 7. Ikke desto mindre er anerkendelsen af ​​PCR som en ny guldstandard metode nødvendiggjorde mere end blot forbedret ydeevne data, men også demonstration af styring af udvikling og validering trin i hele metode uden forringelse af ydeevnen over tid.

De første molekylære værktøjer, der anvendes til påvisning af EHV-2 var tid consuming og involverede ikke-specifik amplifikation med nestede PCR efterfulgt af sekventering 8. De målrettede gener for herpes-vira var deoxyribonukleinsyre (DNA) polymerase og DNA emballage 9. Men nested PCR præsenterer, en høj risiko for forurening med amplikoner. Siden da har konventionelle PCR-test er designet til at forstærke interleukin 10-lignende gen eller glycoprotein B genet, revideret i 2009 2. For nylig blev real-time PCR egenskaber beskrevet til kvantificering af EHV-2 10, men ingen data var tilgængelige om validering af hele metoden herunder udtræk proces.

I denne protokol, er udviklings- og valideringsprocedurer beskrevet for en kvantitativ PCR-metode til påvisning og kvantificering af EHV-2 DNA i heste respiratoriske væsker ifølge Sammenslutningen française de normalisering (AFNOR) norm NF U47-600 3,11,12, som er den franske repræsentant iden internationale normalisering udvalget. Denne norm beskriver "Krav og anbefalinger til gennemførelse, udvikling og validering af veterinære PCR i dyresundhed analysemetode" 11,12, i henhold til NF EN ISO / CEI 17025, 2005 13 og OIE (Verdensorganisationen for Dyresundhed) . anbefalinger, 2010 14 EHV-2 QRT-PCR valideringsprotokollen indebærer en tredelt fremgangsmåde: (a) udvikling af QRT-PCR assay, (b) karakterisering af QRT-PCR assay alene og (c) karakterisering af det hele analysemetode (fra ekstraktion af nukleinsyrer fra den biologiske prøve til PCR-analyse).

Karakteriseringen af ​​QRT-PCR assay og af hele analysemetoden omfatter definitionen af ​​to grænser: detektionsgrænsen (LOD) og kvantificeringsgrænsen (LOQ). LOD 95% PCR repræsenterer det laveste antal nukleinsyre kopier pr volumen, der kan påvises i 95% af alle cases. Den LOQ 95% PCR repræsenterer den laveste mængde af nukleinsyre kopier, der kan bestemmes under hensyntagen til de usikkerheder.

Dette QRT-PCR-fremgangsmåden muliggør nøjagtig detektering og hurtig kvantificering af EHV-2 i respiratoriske væsker. Desuden kunne fremgangsmåden anvendes i andre laboratorier for at sikre en standardiseret procedure og som generel skabelon for udvikling af andre nye QRT-PCR-assays.

Protocol

Bemærk: Se alle de forskellige trin, der er illustreret i figur 1.

1. Ekstraktion af nukleinsyrer

Bemærk: Udfør ekstraktion under en emhætte at begrænse luftvejene kontaminering med nucleinsyrer. Omfatter en ekstraktion negativ kontrol med DEPC-behandlet vand for at sikre, at ingen af ​​reagenserne er forurenet med uønskede DNA.

  1. Uddrag nukleinsyrer fra den biologiske prøve i overensstemmelse med en tidligere beskrevet protokol 15 og fabrikantens protokol.
    1. Tilføj 140 pi biologisk prøve til 560 pi lysis opløsning (AVL puffer) og inkuberes i 10 minutter ved stuetemperatur. Tilføj 560 pi ethanol. Anvende første 630 pi af denne opløsning (prøve + lyseopløsning + ethanol) til en silicasøjle og centrifuge.
    2. Anvende de resterende 630 ul af denne opløsning til samme silicasøjle og centrifuge. Derefter vaskes søjlen med 500 piaf 2 forskellige vaskebuffere (AW1 og AW2).
  2. Eluere nukleinsyre med 50 pi elueringsbuffer (AVE buffer) og tempereres til stuetemperatur. Luk hætten og inkuber ved stuetemperatur i 1 min. Der centrifugeres ved 6.000 g i 1 min.

2. Forstærkning Procedure

  1. Forbered 22,5 pi reaktionsblanding for hver reaktion. Tilføj 12,5 pi PCR Master mix, x pi 20 pM forward primer, x pi 20 pM reverse primer, y pi 10 pM probe og z pi ultrarent vand som krævet for at nå 22,5 pi (x, opnås y og z volumener efter titrering, se afsnit 3.2.3 og 3.2.6).
  2. Aliquot 22,5 pi af den passende reaktionsblanding til hver reaktion brønd i en 96-brønds plade.
    Bemærk: inkluder negative kontroller for ekstraktion og for PCR for at sikre, at ingen af ​​reagenserne er forurenet med uønskede DNA.
  3. Tilføj 2,5 pi af prøven, 2,5 ul udvinding negative kontrol, 2,5 pi PCR negativ kontrol og 2,5 pi positiv prøve (referencestamme eller plasmid) til den tilsvarende reaktion godt. Efter fordeling, dække pladen med et klæbende plade forsegling. Centrifugeres pladen i 10 sekunder ved 6.000 g.
  4. Pladen anbringes i et Real-Time PCR-system. Vælg den skabelon til assayet layout og starte kørslen. Bruge programmet indstillingen PCR: 10 min ved 95 ° C efterfulgt af 45 cykler af 15 sekunder ved 95 ° C og 1 min ved 60 ° C (tabel 1).
  5. Overfør rådata fra Real-Time PCR-system til et regneark. Indstil tærsklen til amplifikation plots over baseline og inden for den eksponentielle vækst område for at få den tærskel cyklus for hver prøve. Plot hvert punkt standard indstillet som en standardkurve for at opnå linearitet. Beregn kopitallet for de forskellige prøver baseret på standardkurven.

3. Udvikling af kvantitativ RT-PCR

Bemærk: Udviklingen af ​​en QRT-PCR test kræver referencestammer, en specifik titreret plasmid, og forskellige kontroller og indebærer titrering af primerne og sonde.

  1. Indledende test
    1. Design primere og prober med specifik software i henhold til tidligere henstillinger 16.
    2. Uddrag referencestammer som beskrevet i afsnit 1.
    3. Forstærke som beskrevet i afsnit 2 med 900 nM for den endelige koncentration af primere og 250 nM for den endelige koncentration af probe. Analyser signalet som beskrevet i afsnit 2.5.
    4. Samtidig, udføre amplifikation af referencestammer DNA (som beskrevet i afsnit 3.1.3) uden prober. Sekventere amplikoner opnået ved Sanger-metoden 17,18. Analyser sekvenserne ved at køre en nukleotid BLAST 19.
  2. Titrering af Primere og probe
    1. Forbered 3 forskellige blandinger med 250 nM slutkoncentration af sonden og med forskellige endelige concentrtioner af fremad- og revers-primere (50 nM / 50 nM, 300 nM / 300 nM, 900 nM / 900 nm) for de 3 replikater af den positive prøve og en negativ kontrol. For hver blanding, tilføje det samme passende volumen af ​​20 uM fremadrettet primer og 20 uM revers primer (0,25 pi at opnå 50 nM slutkoncentration, 1,5 pi at opnå de 300 nm slutkoncentration eller 4,5 pi at opnå 900 nM slutkoncentration) , 50 pi PCR Master mix, 2,5 pi 10 uM sonde og ultrarent vand efter behov for at nå 90 pi.
    2. Udfør forstærkning procedure som beskrevet i afsnit 2.
    3. Vælg den bedste tilstand til at opnå den højeste grad af amplifikation, tidligste tærskelcyklus (Ct) og bedste repeterbarhed mellem de 3 betingelser. Bestemme den bedste koncentration og den tilsvarende volumen × pi af den forreste og reverse primere.
    4. Forbered 5 forskellige blandinger til de 4 prøver (3 gentagelser af den positive prøve og en negativ kontrol)med 5 forskellige slutkoncentrationer af sonden (50 nM, 100 nM, 150 nM, 200 nM, 250 nM). For hver blanding tilsættes x pi 20 pM forward primer og x pi 20 pM reverse primer (tidligere bestemt, i afsnit 3.2.3), 50 pi PCR Master mix, passende volumen af ​​10 pM probe (0,5 pi at opnå 50 nM koncentration, 1 pi for at opnå den 100 nM koncentration, 1,5 pi at opnå den 150 nM koncentration, 2 pi at opnå 200 nM koncentration eller 2,5 pi at opnå den 250 nM koncentration) og ultrarent vand som kræves for at nå 90 pi.
    5. Udfør forstærkning procedure som beskrevet i afsnit 2.
    6. Vælg den bedste tilstand til at opnå den højeste grad af amplifikation, tidligste tærskelcyklus (Ct) og bedste repeterbarhed mellem de 5 betingelser. Bestemme den bedste koncentration og den tilsvarende volumen y pi for sonden.

4. Karakterisering af Quantitative Real-time PCR (QRT-PCR)

Bemærk: Efter udviklingen skridt, og bestemmelse af de bedste betingelser for at bruge, karakterisering trin i PCR omfatter specificitet, detektionsgrænse, linearitet rækkevidde og grænsen for kvantificering af QRT-PCR.

  1. Fremstilling og Titrering af plasmid
    1. Bestille kommerciel plasmid indeholdende det relevante fragment af DNA målgen valgt til PCR (i denne protokol, nukleotider 2081-2381 af EHV-2 glycoprotein-genet, se tabel 1).
      Bemærk: For at begrænse risikoen for luftvejene forurening med syntetisk DNA, udføre serielle fortyndinger af plasmider under en emhætte i et separat rum og arbejde med fortyndet DNA under alle trin i udvikling og validering procedure.
    2. Resuspender plasmidet med ultrarent vand for at fremstille en stamopløsning på 50 ng / ml. Vortex og centrifugeres kortvarigt plasmidet stamopløsning.
      Bemærk: Bestem den virkelige koncentration af plasmidet stock opløsning efter resuspension for at beregne kopien antallet af plasmidet.
    3. Tilsæt 1 pi plasmid til spektrofotometret. Læs den optiske densitet (OD) ved 230 nm, 260 nm og 280 nm. Aflæs DNA-koncentration på spektrofotometer software (OD, 260 nm).
    4. Beregn kopitallet af plasmidet under anvendelse af Avogadros tal (N A) og formlen:
      Kopiantal / pl = (N A [plasmid i ng / pl]) / (plasmid længde x 10 9 x gennemsnitlige vægt af en basepar) = (6.022 x 10 23 x [plasmid]) / (plasmid længde x 10 9 x 660)
  2. Test af specificitet (Involvering og Eksklusivitet) af QRT-PCR
    1. Test inklusivitet af PCR-system. Vælg EHV-2 positive DNA-prøver, der tidligere karakteriseret ved sekventering (etableret positiv status).
    2. Udfør forstærkning procedure som beskrevet i afsnit 2.
    3. AnalysérPCR-data for hver prøve som beskrevet i afsnit 2.5. Kontroller tilstedeværelsen af ​​en eksponentiel kurve for alle prøver valgt i afsnit 4.2.1 og bekræft inklusivitet af PCR.
    4. Test eksklusivitet af PCR systemet ved hjælp af DNA-ekstrakter fra patogener med genetiske ligheder til målet (i dette tilfælde, andre hovdyret herpesvirus såsom EHV-1, EHV-4, EHV-3, EHV-5 og tåbelige herpesvirus-5, som beskrevet i tabel 2) og andre patogener involveret i luftvejssygdomme i værtslandet (i dette tilfælde, heste arteritis virus, hesteinfluenzavirus, Coxiella burnetii, Rhodococcus equi, Streptococcus equi equi, Streptococcus equi zooepidemicus, Chlamydophila abortus og Klebsiella pneumoniae, se tabel 2).
    5. Udfør forstærkning procedure som beskrevet i afsnit 2.
    6. Analyser PCR-data for hver prøve som beskrevet i afsnit 2.5. Check for fraværet af en eksponentiel kurve for alle prøver valgtafsnit 4.2.4 for at bekræfte eksklusivitet af PCR.
  3. Detektionsgrænse QRT-PCR
    1. Dispensere 90 pi ultrarent vand i 6 rør.
    2. Udfør 6 ti-fold seriefortyndinger af plasmidet til at målrette den nedsættelse zone (tab af Ct-detektion). Transfer 10 pi fra plasmidet arbejdsfortyndingen til røret med 90 pi ultrarent vand. Vortex og centrifugeres kortvarigt røret. Gentag trin 4.3.2 til sidste rør i seriefortynding har modtaget plasmidet.
    3. Udfør amplifikation af de 6 ti-fold seriefortyndinger af plasmidet som beskrevet i afsnit 2.
    4. Bestem den nedsættelse zone: zonen mellem den sidste fortynding af plasmid præsentere et positivt signal og den første fortynding uden påvisning (se figur 2).
    5. For at starte de 6 to-fold serielle fortyndinger, vælge den sidste fortynding af plasmid, der giver et positivt signal (se afsnit 4.3.4).
      Bemærk: Udfør tre uafhængige trials at bestemme detektionsgrænse QRT-PCR (LOD 95% PCR)
    6. Dispensere 25 pi ultrarent vand i 6 rør.
    7. Udfør 6 to ganges seriefortyndinger af plasmidet. Overfør 25 ul fra plasmidet arbejdsfortyndingen, som bestemt i punkt 4.3.5, til røret med 25 pi ultrarent vand. Vortex og centrifugeres kortvarigt røret. Gentag trin 4.3.7 til sidste rør i seriefortynding har modtaget plasmidet.
    8. Udfør amplifikation af de 6 to ganges seriefortyndinger af plasmidet som beskrevet i afsnit 2. Gentag trin 4.3.7 til 4.3.8 to gange, til opnåelse af 3 forsøg med 8 gentagelser (24 gentagelser) af hver af de 6 ti gange seriefortyndinger af plasmidet.
      Bemærk: Detektionsgrænsen for QRT-PCR (LOD 95% PCR) er defineret som den laveste DNA-kopier nummer i volumen enhed, der er påvist i 95% af tilfældene.
    9. Beregne antallet af positive replikater ud af 24 replikater for hvert niveau af plasmid koncention.
    10. Bestem LOD 95% PCR. LOD 95% PCR er det niveau, som resulterer i påvisning af 23 positive replikater ud af 24 replikater.
  4. Linearitet Range og kvantifikationsgrænse af QRT-PCR
    Bemærk: Udfør 4 uafhængige forsøg med 6 ti-fold seriefortyndinger af plasmidet for at sikre, at den laveste koncentration anvendes i området svarer til LOD 95% PCR tidligere bestemt i 4.3.10.
    1. Dispensere 45 pi ultrarent vand i 6 rør.
    2. Start de 6 ti-fold seriefortyndinger med koncentrationen af plasmid arbejdsfortyndingen svarende til 10 7 LOD 95% PCR.
    3. Udfør 6 ti-fold seriefortyndinger af plasmidet. Overfør 5 pi fra plasmidet arbejder fortynding (bestemt i punkt 4.4.2) til rør med 45 ul ultrarent vand. Vortex og centrifugeres kortvarigt røret. Gentag trin 4.4.3 til sidste rør i seriefortynding har modtaget plasmid.
    4. Forstærk de 6 ti-fold serielle fortyndinger af plasmidet, som beskrevet i afsnit 2.
    5. Spore den lineære regression y = ax + b med en for hældningen og b for den skæringspunktet (figur 3).
    6. Beregn amplificeringseffektiviteten (E) fra hældningen a af standardkurve (se 4.4.5) under anvendelse af ligningen:
      4.4.6 .
      Gentag trin 4.4.1 til 4.4.6 tre gange.
      Bemærk: Forstærkning effektivitet repræsenterer den mængde PCR-produkt øges efter hver cyklus. En ideel reaktion når effektivitet tæt på 100%. I praksis E (%) var mellem 75% og 125%. Højere E kan indikere amplifikation af ikke-specifikke produkter eller en pipetteringsfejl i seriefortynding. Lavere E kan også indikere en pipetteringsfejl i seriefortynding, dårlig primer design eller ikke-optimale reaktionsbetingelser.
    7. Beregn bias (tabel3). Efterprøve for hvert plasmid niveau, at den absolutte forudindtagethed værdi er mindre end den kritiske biasværdi (0,25 log10). Bestem den gennemsnitlige bias og linearitet usikkerheder (U Lini) for hver plasmid niveau (tabel 3) at evaluere resultaterne af lineær regression for EHV-2 qPCR (figur 4). U Lini er linearitet usikkerhed bestemmes for hvert i plasmid niveau beregnet fra standardafvigelse (SD'i) og betyder bias. Bestem den kombinerede linearitet usikkerhed (U LIN) af EHV-2 qPCR givet ved formlen:
      4.4.7
      Bemærk: Accept af bias angivet af laboratoriet (i almindelighed absolut skævhed 0,25 log 10) og svarer til forskellen mellem den laveste værdi og den højeste værdi på 0,5 log 10 (mængde målt i log 10 kopier nummer). U LIN
    8. Bestem grænsen for kvantificering af QRT-PCR (LOQ PCR): LOQ PCR er den laveste koncentration med en bias 0,25 log10 bruges til linearitet område (tabel 3).

5. Karakterisering af Whole analysemetode (fra DNA Extraction til QRT-PCR Resultat)

Bemærk: karakterisering af hele metode er validering af alle nødvendige for at opnå QRT-PCR-data (dvs. trin, fra udvinding af DNA fra luftvejene prøve (se afsnit 1) til forstærkning og kvantificering af målet (se afsnit 2 )).

  1. Etablere overensstemmelse mellem kopier nummer i PCR-reaktionen og kopier nummer til stede i den biologiske prøve med formlen:
    5,1-1 .
    Det 5,1-2 er rumfanget af prøve tilsat til PCR-blanding til amplifikation, 5,1-4 er mængden af ​​Buffer AVE anvendes til eluering af nukleinsyrer og 5,1-5 er rumfanget af den ekstraherede prøve.
  2. Test Følsomhed og specificitet Whole analysemetode
    Bemærk: Kun kendte EHV-2 positive (eller negative) prøver anvendes i denne sektion.
    1. Test "følsomhed" af QRT-PCR-metoden ved at analysere positive prøver for målet (EHV-2).
      1. Vælg EHV-2 positive DNA-prøver, der tidligere karakteriseret (positiv status).
      2. Uddrag den nukleinsyre som beskrevet i afsnit 1. Udfør en forstærkning procedure som beskrevet i afsnit 2.
      3. Bestem antallet af reelle positive (positive prøversom er positive med denne RT-PCR), og antallet af falske negativer (kendt positive prøver, der er negative med dette RT-PCR).
    2. Teste "specificitet" af QRT-PCR-fremgangsmåden ved at analysere negative prøver
      1. Vælg EHV-2 negative DNA-prøver (negativ status).
      2. Uddrag den nukleinsyre som beskrevet i afsnit 1. Udfør en forstærkning procedure som beskrevet i afsnit 2.
      3. Bestem antallet af reelle negativer (negative prøver, der vides at være negative med dette RT-PCR), og antallet af falske positive (kendte negative prøver, som er positive med denne RT-PCR).
    3. Beregn den "diagnostiske følsomhed" (Se) og "diagnostisk specificitet" (Sp) af hele fremgangsmåden (tabel 4) som følger: Se = antal reelle positiver / (antal reelle positiver + falske negativer) og Sp = antal reelle negativer / (antal reelle negatives + falske positiver) (se tabel 4).
    4. Beregn 95% konfidensintervallet for sensitivitet og specificitet af hele metoden med formlen for Greiner og Gardner relation 12,20:
      5.2.4
      hvor e er den estimerede fejl, θ er Se (eller Sp) og n antallet af analyserede prøver.
      Bemærk: For et lille antal prøver, skal du bruge Schwartz tabellen i henhold til AFNOR norm 12 til beregning af 95% konfidensintervallet for sensitivitet og specificitet af hele metoden.
  3. Udarbejdelse af Negativ Resource Materiale til karakterisering af Whole analysemetode
    ADVARSEL: For at bestemme grænserne for detektion og kvantificering af hele fremgangsmåden (LOD Metode og LOQ Method), der tilsættes kendte koncentrationer af plasmid til de biologiske prøver, der vides at være friaf målet (EHV-2 i dette tilfælde). Disse prøver, sammen med den kvantificerede plasmid, udgør positive standarder med til at bestemme LOD Metode og LOQ Method.
    1. Bekræft fraværet af mål (EHV-2) i de biologiske prøver, der anvendes til at konstruere positive standarder.
      1. Vælge forskellige kendte negative biologiske prøver.
      2. Uddrag biologiske prøver som beskrevet i afsnit 1. Udfør forstærkning procedure som beskrevet i afsnit 2.
      3. Bekræfte fravær af målet ved fravær af PCR signal i disse prøver.
        Bemærk: Brug den samme negative ressource materiale til alle trin mellem 5,4 og 5,5.
    2. Samle forskellige negative prøver at opnå 15 ml negativ ressource materiale (et volumen nødvendig til fuldstændig validering). Dispensér 135 pi af denne negative ressource materiale i 100 rør. Holde rørene ved 4 ° C eller ved -80 ° C i lang opbevaring.
  4. Limit Påvisning af Whole analysemetode
    1. Bestem nedskæring zone hele metoden.
      1. Dispensere 45 pi ultrarent vand i 6 rør.
      2. Udfør 6 ti-fold seriefortyndinger af plasmidet. Overførsel 5 pi fra plasmidet arbejdsfortyndingen svarende til 10 7 LOD 95% PCR (som bestemt i punkt 4.3.10) til rør med 45 pi ultrarent vand. Vortex og centrifugeres kortvarigt røret. Gentag trin 5.4.1.2 til sidste rør i seriefortynding har modtaget plasmid.
      3. Overfør 5 pi fra hver fortynding af plasmid til 2 rør med 135 pi af den negative ressource materiale til opnåelse 2 replikater for de 6 positive standarder. Vortex og kortvarigt centrifuge.
      4. Udfør ekstraktion af 2 replikater for de 6 positive standarder som beskrevet i afsnit 1. Udfør forstærkning procedure som beskrevet i afsnit 2.
      5. Bestem nedskæring zone: zonen mellem den sidste koncentration af plasmid giver et positivt signal og den første koncentration, der viser noget signal.
    2. Detektionsgrænse af metode (LOD Method) Bestemt ved 2 uafhængige Trials
      Bemærk: Udfør 2 uafhængige forsøg til bestemmelse af detektionsgrænsen af hele fremgangsmåden (LOD Method).
      1. Start de 6 to ganges seriefortyndinger med plasmidet arbejdsfortyndingen der er 4 gange mere koncentreret, at den sidste koncentration af plasmidet, der gav et positivt signal (se afsnit 5.4.1.5).
      2. Dispensere 25 pi ultrarent vand i 6 rør.
      3. Udfør 5 to ganges seriefortyndinger af plasmidet. Overfør 25 ul fra plasmidet arbejdsfortyndingen (som bestemt i punkt 5.4.2.1) til rør med 25 pi ultrarent vand. Vortex og centrifugeres kortvarigt røret. Gentag trin 5.4.2.3 til sidste rør i seriefortynding har modtaget plasmid.
      4. Overfør 5 pi fra hver fortynding af plasmid til 4 rør med 135 pi af den negative ressource materiale til opnåelse 4 replikater af de 5 positive standarder. Vortex og kort centrifugere rørene.
      5. Udfør udvinding af de 4 replikater for de 5 positive standarder som beskrevet i afsnit 1. Udfør forstærkning procedure som beskrevet i afsnit 2.
      6. Gentag trin 5.4.2.1 til 5.4.2.5 gang for at opnå 8 gentagelser for hvert niveau af plasmid koncentration.
      7. Tæl antallet af positive gentagelser af 8 gentagelser for hvert niveau af plasmid koncentration.
      8. Bestem LOD Method. LOD Method er det sidste niveau, hvor 8 replikater af 8 gentagelser er positive (som beskrevet i afsnit 5.4.2.7).
  5. Linearitet Range og kvantifikationsgrænse af Whole analysemetode
    Bemærk: For at bestemme grænsen for kvantificering af hele metoden (LOQ Method), tilsættes kendte koncentrationer af plasmidet til biologiskeprøver, der vides at være fri for målet (EHV-2 i dette tilfælde). Disse prøver udgør positive standarder for at bestemme LOQ Method.
    1. Dispensere 45 pi ultrarent vand i 6 rør.
    2. Udfør 6 ti-fold seriefortyndinger af plasmidet. Overfør 5 pi fra plasmidet arbejdsfortyndingen svarende til 10 7 LOD Method (som bestemt i punkt 5.4.2.8) til rør med 45 ul ultrarent vand. Vortex og centrifugeres kortvarigt røret. Gentag trin 5.5.2 til sidste rør i seriefortynding har modtaget plasmidet.
    3. Overfør 5 pi fra hver fortynding af plasmidet til 2 rør med 135 pi negativ biologisk ressource materiale til opnåelse 2 gentagelser af de 6 positive standarder. Vortex og kortvarigt centrifuge.
    4. Udfør ekstraktion af 2 replikater for de 6 positive standarder som beskrevet i afsnit 1. Udfør forstærkning procedure som beskrevet i afsnit 2. Gentag trin 5.5.1til 5.5.4 tre gange.
    5. Definer en Accuracy profil for at vurdere og validere den kvantitative resultater af metoden.
      1. Definer acceptkriterier grænserne for hele metode til laboratoriet. I denne protokol, er acceptkriterier grænser defineret som ± 0,75 Log 10 af Labeo Frank Duncombe.
      2. For én retssag, spore en første lineær regression y = ax + b (a er hældningen og b er skæringspunktet) med en gentagelse af Ct-værdier svarende til hver anslåede værdi af standardkurven. Med denne første lineær regression, beregne den eksperimentelle værdi af kopiantallet for gentagelser af Ct-værdier, der anvendes til denne første standardkurve. Gentag trin 5.5.5.2 med det andet replikater af Ct-værdier til opnået en anden lineær regression og beregne den eksperimentelle værdi af kopiantallet for andet replikater af Ct-værdier anvendes for den anden standardkurve.
      3. Beregn præcision, korrekthed og nøjagtighed grænser for hver plasmid niveau i henhold til NF U47-600-2 12.
      4. Opret et regneark til at indsamle oplysninger til alle standard punkter (5.5.5.4) og oprette en nøjagtighed profil med de tidligere definerede acceptkriterier grænser i 5.5.5.1 og korrekthed af data sammen med den nedre og den øvre nøjagtighedsgrænserne som beregnet i 5,5 .5.4 (figur 5).
    6. Bestem LOQ Metode: Dette svarer til den laveste koncentration af en standardkurve med korrekthed 0,75 log 10 som anvendes til linearitet område beregnes i 5.5.5.5.
  6. Evaluering af repeterbarhed og reproducerbarhed
    Bemærk: Kontroller repeterbarhed og reproducerbarhed ved at anvende forholdet mellem standardafvigelsen og middelværdien af ​​gentagne målinger (variationskoefficienten eller CV = standardafvigelse /betyde).
    1. Vurdere Repeterbarhed af hele metoden med 1 Analytiker:
      1. Vælg 3 biologiske prøver med 3 forskellige virale genom belastninger (tidligere testet i PCR for eksempel).
      2. Uddrag 8 replikater af de 3 prøver som beskrevet i afsnit 1. Udfør forstærkning procedure som beskrevet i afsnit 2.
      3. Beregne middelværdien og standardafvigelsen for Ct-værdi opsamlet for hver prøve.
      4. Beregn intra-assay CV anvendelse af formlen CV = standardafvigelse / middelværdi.
    2. Vurdere Reproducerbarhed af Whole Metode ved 3 Analytikere:
      1. Vælg 3 biologiske prøver med 3 forskellige virale genom belastninger (tidligere testet i PCR for eksempel)
      2. Uddrag 2 replikater af de 3 udvalgte eksemplarer i 5.6.2.1 (som beskrevet i afsnit 1). Udfør forstærkning procedure som beskrevet i afsnit 2. Gentag trin 5.6.2.2 af 2 uafhængige analytikere.
      3. Beregn middelværdi og standardafvigelseaf Ct-værdi opsamlet for hver prøve.
      4. Beregn den inter-assay CV ved hjælp af formlen CV = standardafvigelse / betyder.

Representative Results

Den kvantitative RT-PCR-metode, som beskrevet ovenfor, blev gennemført for at påvise og kvantificere hovdyret herpesvirus-2 i respiratoriske væsker. Figur 1 illustrerer et skematisk workflow diagram for udvikling og validering af en kvantitativ RT-PCR-metode ifølge AFNOR normen NF U47-600. Specificiteten af ​​primerne og proberne blev valideret under trin-for-trin udvikling af PCR. Kun EHV-2-stammer blev opformeret i dette system. Efterfølgende udførelsen af ​​QRT-PCR måtte karakteriseres.

For det første at estimere LOD PCR, en 6 ti gange seriel fortynding blev udført for at fastlægge den nedsættelse zone (figur 2). I dette eksempel blev 6 ti-fold seriefortyndinger mellem 10 -5 og 10 -10 (mellem 26.000 og 0,26 kopier / 2,5 pi prøve) at estimere LOD PCR. Den nedskæring zone lerne mellem fortyndinger af 10 -9 og 10 -10 (mellem 2,6 og 0,26 kopier / 2,5 pi prøve). For at bestemme LOD PCR værdi i dette tilfælde blev 6 to ganges seriefortyndinger af plasmidet sted i dette nedslag zone mellem 5,2 og 0,16 kopier / 2,5 pi prøve. LOD PCR-værdien var 2,6 kopier / 2.5 pi prøve.

For at bestemme linearitetsområdet og LOQ PCR blev LOD PCR værdi, der anvendes til at starte intervallet 6 ti-fold seriefortyndinger, mellem 2,6 (LOD PCR) og 260.000 kopier / 2,5 pi prøve. Figur 3 illustrerer en lineær regression for EHV2 QRT-PCR fra en retssag. Forestillingerne af lineær regression (figur 4) er valideret i fire ved hjælp af beregninger, der er beskrevet i tabel 3. Beregningerne udføres for at definere linearitet rækkevidde i henhold til kriterierne absolut Bias i value ≤0.25 log 10, uanset graden i af plasmid belastning. I dette tilfælde range linearitet lå mellem 2,6 og 260.000 kopier / 2,5 pi prøve. Den LOQ PCR er den laveste koncentration i linearitet interval (dvs. 2,6 kopier / 2,5 pi prøve i dette tilfælde). U LIN blev bestemt til at være 0,12 log10 i området 2.6-260,000 kopier / 2,5 pi DNA.

Efter udvikling (figur 1, blå) og karakterisering af QRT-PCR (figur 1, gul), den AFNOR NF U47-600 normen anbefaler karakterisering af hele analysemetoden fra DNA-ekstraktion til QRT-PCR (figur 1, orange). Den diagnostiske følsomhed og specificitet blev beregnet som beskrevet i tabel 4. De kvantitative ydeevne QRT-PCR hele analysemetoden blev evalueret og valideret med en nøjagtighed profil (

Denne protokol, som bruger state-of-the-art molekylære teknologi, tilladt os at påvise og bestemme EHV-2 virale genom belastning i 172 nasale prøver podninger opnået fra heste med luftvejslidelser og / eller klinisk mistanke om infektion. Forekomsten af ​​EHV-2 fra marken (biologiske) prøver var 50% (86/172) i denne population. De kvantitative analyser viste, at virale genom belastninger af EHV-2 var signifikant højere hos unge heste og fordelingen af virale genom belastninger faldt med alderen (figur 6). I den foreliggende undersøgelse blev den højeste EHV-2 virale genom belastning (1,9 x 10 11 kopier / ml) påvist i føl (figur 6).

figur 1
Figur 1: Arbejdsgang kurve for udvikling (blå), karakterisering af den kvantitative RT-PCR(gul) og karakterisering af hele analysemetoden fra DNA-ekstraktion til QRT-PCR (orange) i henhold til AFNOR normen NF U47-600-2. Arbejdsgangen diagram genoptager de forskellige trin for udvikling, karakterisering af den kvantitative RT -PCR og karakterisering af hele analysemetoden fra DNA-ekstraktion til QRT-PCR. For hvert trin, workflow diagram viser antallet af nødvendige kørsler, der fortyndinger skal udføre, og antallet af nødvendige analytikere. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2: Bestemmelse af den nedsættelse zone med repræsentative resultater fra real-time PCR-kurver opnået med 6 ti-gange serielle fortyndinger af plasmid. For at estimere den nedsættelse zone, 6 ti gange serielfortyndinger er lavet mellem 10 -5 (26.000 kopier / 2,5 pi prøve) og 10 -10 (0,26 kopier / 2,5 pi prøve). Den nedskæring zone ligger mellem fortyndinger af 10 -9 (2,6 kopier / 2,5 pi prøve) og 10 -10 (0,26 kopier / 2,5 pi prøve). I dette tilfælde blev 6 to-fold serielle fortyndinger af plasmid der i denne nedskæring zone til at bestemme LOD 95% PCR, mellem 5,2 og 0,16 kopier / 2,5 pi prøve. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3:. Lineær regression for EHV2 QRT-PCR linearitet kvantitativ testning er evnen til at generere resultater, som er proportional med koncentrationen af target stede i et bestemt interval. Dette kan modelleres vedlineær regression (y = ax + b) mellem instrumentale respons (cyklus tærskel eller Ct) og logaritmen af mængden af målet (antal target kopier / 2,5 pi prøve). Klik her for at se en større version af dette tal .

Figur 4
Figur 4:. Udførelse af lineær regression af EHV-2 qPCR Mean skævhed repræsenterer middelværdien forskellen mellem den målte plasmid mængde ( fig4-1 ) Og den teoretiske plasmid mængde (x 'i) for hver plasmid niveau. Lodrette søjler repræsenterer linearitet usikkerhed (U Lini) givet ved formlen
fig4-2
hvor SD'i er standardafvigelsen o f målt plasmid mængde. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5
Figur 5:. Nøjagtighed profiler baseret på valideringsresultaterne af EHV-2 QRT-PCR-metode Den grønne linje (cirkler) repræsenterer korrekthed af data (systematiske fejl, eller bias). Accepten grænser er defineret på ± 0,75 Log 10 af laboratoriet (stiplede linjer). De nederste og øverste nøjagtighedsgrænserne blev bestemt for hver plasmid belastning niveau fra betyde skævhed ± dobbelte standardafvigelse af pålidelighed data (røde linjer). Klik her for at se en større version af dette tal.

1 "> Figur 6
Figur 6:. Kvantificering af virale genom masser af EHV-2 efter alder Den virale genom load distribution af EHV-2 påvises i prøver næsepodning er repræsenteret i de forskellige aldersgrupper. De vandrette linjer repræsenterer medianværdier inden standardafvigelsen (m = måned). * Signifikant forskellig fra ANOVA med Newman-Keuls post-hoc test (p <0,05). Klik her for at se en større version af dette tal.

målgen Primere, probe og plasmide sekvenser (5'-3 ') nukleotidposition Produkt størrelse (nukleotider) Referencer
EHV2 gB
(HQ247755.1) 		Fremad: GTGGCCAGCGGGGTGTTC 2113-2130 78 95 ° C 5 min 11
Omvendt: CCCCCAAAGGGATTYTTGAA 2189-2170 95 ° C 15 sek 45 cykler
Probe: FAM-CCCTCTTTGGGAGCATAGTCTCGGGG-MGB 2132-2157 60 ° C 1 min
Plasmid:
ACCTGGGCACCATAGGCAAGGTGGTGGTCA
ATGTGGCCAGCGGGGTGTTCTCCCTCTTTG
GGAGCATAGTCTCGGGGGTGATAAGCTTTTT
CAAAAATCCCTTTGGGGGCATGCTGCTCATA
GTCCTCATCATAGCCGGGGTAGTGGTGGTG
TACCTGTTTATGACCAGGTCCAGGAGCATAT
ACTCTGCCCCCATTAGAATGCTCTACCCCGG
GGTGGAGAGGGCGGCCCAGGAGCCGGGCG
CGCACCCGGTGTCAGAAGACCAAATCAGGA
ACATCCTGATGGGAATGCACCAATTTCAG 		2081-2381

Tabel 1:. Sekvenser af primere, prober og positive syntetiske DNA kontroller anvendes i denne protokol Sekvensen af plasmid (positiv syntetisk DNA) svarer til nukleotid positionerne 2081-2381 af EHV2gB sekvens (HQ247755.1). Udformningen af ​​primere og prober anvendt i denne protokol blev opnået ved anvendelse af specifik software.

PATOGENER Reference (oprindelse) Antallet af stammer RESULTATER
EHV-2
EHV-2 VR701 (ATCC) Positiv
20 prøver (FDL samling)
EHV-5 KD05 (GERC) 20 Negativ
20 prøver (FDL samling)
EHV-3 VR352 (ATCC) 2 Negativ
T934 WSV (GERC)
EHV-1 Kentucky-stamme Ky A (ATCC) 3 Negativ
2 prøver (FDL samling)
EHV-4 VR2230 (ATCC) 1 Negativ
Tåbelige herpesvirus AHV5 FDL Collection 1 Negativ
Equineinfluenza virus A / hest / Jouars / 4/2006 (H3N8) 1 Negativ
(Adgangsnummer JX091752)
Equin Arteritis Virus VR796 (ATCC) 2 Negativ
Rhodococcus equi FDL Collection 1 Negativ
Streptococcus equi subsp. zooepidemicus FDL Collection 1 Negativ
Streptococcus equi subsp. equi FDL Collection 1 Negativ
Coxiella burnetii ADI-142-100 (Adiagene) 1 Negativ
Chlamydophila abortus ADI-211-50 (Adiagene) 1 Negativ
Klebsiella pneumoniae FDL Collection 1 Negativ

Tabel 2: Analytisk specificitet QRT-PCR for EHV-2.

tabel 3
Tabel 3: Beregning af bias og linearitet usikkerhed (tilpasset fra NF U47-600-2 12). For hvert forsøg, opførelser af lineær regression (y = ax + b) valideres ved hjælp af tabellen, hvor y er tærskelcyklen opnåede a er hældningen opnåede. X er plasmidet niveau og b er skæringspunktet i er plasmidet niveau (i varierer fra 1 til k niveauer) k er antallet af plasmid niveauer anvendt (fx k = 6 i thans bord); j er forsøget (j varierer fra 1 til I forsøg), jeg er antallet af forsøg på mellem 3 og 6 forsøg (f.eks I = 4 i denne tabel) xi er den anslåede plasmid mængde for hver. jeg plasmid niveau. x 'i er den teoretiske plasmid mængde opnås med ligningen x' i = log 10 (x i) for hvert i plasmid niveau. Under hver j forsøg, tærsklen cyklus opnået for hvert i plasmid niveau beregnes med lineær regression y i, j = en j x i, j + b j. table3-1 er den målte plasmid mængde under retssagen j. Bias i sub> er forskellen observeret mellem den målte plasmid mængde og den teoretiske plasmid mængde for hvert forsøg og hvert plasmid niveau. table3-2 er gennemsnittet af table3-3 af hvert i plasmid niveau SD "i er standardafvigelsen for afmålt mængde table3-4 for hvert i plasmid niveau Mean bias er gennemsnittet af Bias i; U Lini er linearitet usikkerhed bestemmes for hvert i plasmid niveau beregnet ud fra SD'i og betyder bias. Klik her for at se en større version af dette tal.

1 "fo: holde-together.within-side =" 1 "fo: holde-med-next.within-page =" altid "> Rigtig status prøve Positiv Negativ Resultater opnået med hele metode Positiv RP (reel positiv) FP (falsk positiv) Negativ FN (falsk negativ) RN (real negativ) Total RP + FN FP + RN Se = RP / (RP + FN) Sp = RN / (RN + FP)

Tabel 4:. Beregning af diagnostisk sensitivitet (Se) og specificitet (Sp) af hele metode A Schwartz tabel blev anvendt til at beregne confidning interval på 95% af følsomheden og specificiteten af ​​hele fremgangsmåden som beskrevet i NF U47-600-2.

Discussion

Siden 2000'erne har real-time PCR afløst guld standard teknikker (cellekultur og bakterier dyrkningsmetoder) i et stigende antal laboratorier. Gennemførelse af teknikken er forholdsvis let. Men validering af laboratoriemetoder er afgørende for molekylær påvisning og kvantificering af patogener for at sikre nøjagtige, reproducerbare og pålidelige data.

Da ekstraktionstrinnet er den primære kilde til tab af biologisk materiale, kan det betragtes som den vigtigste kilde til fejl for kvantificering mellem en protokol og en anden. Som sådan, oprettelse af en standardkurve for DNA-plasmid under QRT-PCR, hovedsagelig rapporteret i litteraturen, angiver det virale genom belastning, men tager ikke højde for ekstraktionstrinet.

Beskrivelse af en de novo strategi for en hel metodevalidering proces i AFNOR norm NF U47-600-2 udgør et betydeligt fremskridt på dette område. Som illustreret idette papir til EHV-2 hos heste, eller ved andre i bier 21, dette kræver klar differentiering mellem udviklingen trin og valideringen trin med karakterisering af PCR og karakterisering af hele fremgangsmåden. En begrænsning i denne interessante tilgang er, at enhver ændring i protokollen, vil resultere i en forpligtelse til at forny den komplette proces, der kan være meget dyrt. Denne begrænsning blev også understreget af det faktum, at for grænserne af kvantificering afhænger af kilden, hvorfra virusset ekstraheres (fx respiratoriske væsker, organer, blod eller urin). Faktisk hver matrice viser forskellige specificiteter i deres fysisk-kemiske egenskaber, og det er vigtigt at definere uafhængigt hver forskellig anvendte matrix for viral påvisning og kvantificering af QRT-PCR. Således kan det virale genom belastning af hver biologisk prøve kvantificeres mere præcist fra udvinding. Karakteriseringen tager også hensyn til thermocycler model og når brugen af en tidligere velkarakteriseret metode (f.eks EHV-2 qPCR metoden beskrevet i dette papir) nødvendiggør en ny type maskine i moderselskabet laboratorium eller andet laboratorium, må man bekræfte effektiviteten af dette instrument. Bekræftelsen af ​​udførelsen af ​​en qPCR-analysen er en forudsætning for alle tests sætter et laboratorium. Dette opnås normalt ved at analysere en reference prøve med kendte egenskaber. En sådan kontrol er en forudsætning og betragtes som obligatoriske som krævet af NF 47-600-1 AFNOR norm for at validere resultaterne af qPCR (LOD, LOQ effektivitet) og robustheden af ​​hele metoden (LOD, LOQ). Ikke kun i udviklings- og karakterisering trin, men også når de anvendes i forskning eller til diagnostiske formål, kan de risikofaktorer identificeres og godt kontrolleres for at sikre standardisering af protokollen. Af særlig interesse er tilstrækkelig uddannelse af personale, højt kvalificeret personale, kvalitetskontrol af forbrugsstofferanvendes og deres opbevaring, styring af de umiddelbare miljøforhold og bevidsthed om måletekniske forhold, der kan påvirke ydeevnen af ​​de videnskabelige instrumenter, der er involveret i analysen. Anvendelse af referenceprøver for sammenligninger mellem forskellige laboratorier kan også hjælpe med at kontrollere usikkerheden. På denne måde kan sammenligning af data mellem laboratorier lettes. Faktisk mellem laboratorier præstationsprøvninger er afgørende for at vurdere og bekræfte metodens reproducerbarhed.

Virale genom belastning resultater, der er udtrykt i internationale enheder (IE) af den analyserede biologiske matrix (IU: kopier / ml for væsker eller kopier / g for væv) er lettere at bruge for at sammenligne resultater mellem forskellige laboratorier. Alle resultater over LOQ er udtrykt som kopier / ml og et resultat mellem LOD og LOQ er taget som et ikke kvantificerbare positivt resultat. Præsentere quantificational data af genomet på denne måde i overensstemmelse mere præcist til process analyser (opformering af genom). Faktisk i celledyrkningsforsøg, ekspression af virale belastning ved TCID50 (median vævskultur infektiøs dosis) er afhængig af naturen af ​​cellerne og virusstammer. Hver stamme linje besidder sine unikke infektion kinetik og nogle vira som EHV-2 kan tage flere dage, før den første cytopatogen effekt er tydelig.

Afslutningsvis bør denne nye metode til karakterisering af QRT-PCR lette harmoniseringen af ​​data præsentation og fortolkning mellem laboratorier. Dette vil være meget nyttigt for eventuelle nye anvendelser af QRT-PCR i fremtiden som oprettelsen af ​​en cut-off værdi for angivelse af status sygdom i stedet for blot tilstedeværelsen eller fraværet af patogenet.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AB-1900 natural color ABgene 96 well plate  Dutsher 16924
Adhesive film qPCR Absolute  Dutsher 16629 Adhesive film used for sealing the plate prior to the qRT-PCR run
0.5 ml microtubes, skirted, caps Dutsher 039258
Ethanol 98% Sodipro SAF322941000
Primers Eurofins Custom order
Probe Life Technologies Custom order
Plasmid Eurofins Custom order
QIAamp  RNA viral Mini Kit
(containing: QIAamp Mini column, AVL  buffer,  AW1 buffer, AW2 buffer, AVE buffer, collection tubes) 		 Qiagen 52906 AVL buffer: pre-warm 5 min at 72 °C
Sequencing by Sanger method Eurofins Custom order
Taqman Universal PCR Master Mix Life Technologies 4364340
Tris-EDTA buffer solution Santa Cruz sc-296653A
NanoDrop 2000c Spectrophotometer Thermoscientific ND-2000C
StepOnePlus Real-Time PCR systems Life Technologies 4376600 pre-warm 15 min 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brault, S. A., et al. The immune response of foals to natural infection with equid herpesvirus-2 and its association with febrile illness. Vet.Immunol.Immunopathol. 137 (1-2), 136-141 (2010).
  2. Fortier, G., Van Erck, E., Pronost, S., Lekeux, P., Thiry, E. Equine gammaherpesviruses: pathogenesis, epidemiology and diagnosis. Vet.J. 186 (2), 148-156 (2010).
  3. Hue, E. S., et al. Detection and quantitation of equid gammaherpesviruses (EHV-2, EHV-5) in nasal swabs using an accredited standardised quantitative PCR method. J Virol.Methods. 198 (1), 18-25 (2014).
  4. Diallo, I. S., et al. Multiplex real-time PCR for the detection and differentiation of equid herpesvirus 1 (EHV-1) and equid herpesvirus 4 (EHV-4). Vet.Microbiol. 4 (1-3), 93-103 (2007).
  5. Williams, K. J., et al. Equine multinodular pulmonary fibrosis: a newly recognized herpesvirus-associated fibrotic lung disease. Vet.Pathol. 44 (6), 849-862 (2007).
  6. Mullis, K., et al. Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. Cold Spring Harb.Symp.Quant.Biol. 51 (1), 263-273 (1986).
  7. EPA Office of Water (4607). EPA-815-B-04-001. Quality Assurance/Quality Control Guidance for Laboratories Performing PCR Analyses on Environmental Samples. , (2004).
  8. Telford, E. A., et al. Equine herpesviruses 2 and 5 are gamma-herpesviruses. Virology. 195 (2), 492-499 (1993).
  9. Fortier, G., et al. Identification of equid herpesvirus-5 in respiratory liquids: A retrospective study of 785 samples taken in 2006-2007. Vet.J. 182 (2), 346-348 (2009).
  10. Brault, S. A., Bird, B. H., Balasuriya, U. B., MacLachlan, N. J. Genetic heterogeneity and variation in viral load during equid herpesvirus-2 infection of foals. Vet.Microbiol. 147 (3-4), 253-261 (2011).
  11. Association Francaise de Normalisation. NFU 47-600-1. Animal health analysis methods-PCR-Part 1: Requirements and recommandations for the implementation of veterinary PCR. , (2015).
  12. Association Francaise de Normalisation. NFU 47-600-2. Animal health analysis methods-PCR-Part 2: Requirements and recommendations for the development and the validation of veterinary PCR. , (2015).
  13. ISO. EN ISO-CEI 17025. General requirements for the competence of testing and calibration laboratories. , (2005).
  14. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals 2010. Chapter1.1.1.4/ 5. Principles and Methods of Validation of Diagnostic Assay for Infectious Diseases. , This thoroughly revised chapter replaces Chapter 1.1.4 Principles of validation of diagnostic assays for infectious diseases and Chapter 1.1.5 Validation and quality control of polymerase chain reaction methods used for the diagnosis of infectious diseases from the sixth edition of the OIE Terrestrial Manual (2009).
  15. Apaza, S., et al. Detection and genogrouping of noroviruses from children's stools by Taqman One-step RT-PCR. J Vis.Exp. (65), e3232 (2012).
  16. Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J Vis.Exp. (63), e3998 (2012).
  17. Sanger, F., Coulson, A. R. A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. J Mol.Biol. 94 (3), 441-448 (1975).
  18. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 74 (12), 5463-5467 (1977).
  19. NCBI. BLAST Homepage and Selected Search Pages. Introducing the BLAST homepage and form elements/functions of selected search pages. , (2015).
  20. Greiner, M., Gardner, I. A. Application of diagnostic tests in veterinary epidemiologic studies. Prev.Vet Med. 45 (1-2), 43-59 (2000).
  21. Blanchard, P., Regnault, J., Schurr, F., Dubois, E., Ribiere, M. Intra-laboratory validation of chronic bee paralysis virus quantitation using an accredited standardised real-time quantitative RT-PCR method. J Virol.Methods. 180 (1-2), 26-31 (2012).

Tags

Immunologi kvantitativ RT-PCR PCR normen titrering detektionsgrænser grænser for kvantificering linearitet følsomhed specificitet validering hovdyrets herpesvirus-2 hest
Udvikling og validering af en kvantitativ PCR Metode til hovdyrets herpesvirus-2 Diagnose i Respiratory Væsker
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hue, E. S., Fortier, C. I., Laurent, … More

Hue, E. S., Fortier, C. I., Laurent, A. M., Quesnelle, Y. F., Fortier, G. D., Legrand, L. J., Pronost, S. L. Development and Validation of a Quantitative PCR Method for Equid Herpesvirus-2 Diagnostics in Respiratory Fluids. J. Vis. Exp. (109), e53672, doi:10.3791/53672 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter